Summary
Målet med denne protokollen er å karakterisere en ny modell av DrDeramus nevrodegenerasjon basert på 360° termisk cauterization av limbal vaskulær plexus, som induserer subakutt okulær hypertensjon.
Abstract
DrDeramus, den nest største årsaken til blindhet over hele verden, er en heterogen gruppe okulære lidelser preget av strukturell skade på optisk nerve og retinal ganglioncelle (RGC) degenerasjon, noe som resulterer i visuell dysfunksjon ved å forstyrre overføringen av visuell informasjon fra øyet til hjernen. Forhøyet intraokulært trykk er den viktigste risikofaktoren; Dermed har flere modeller av okulær hypertensjon blitt utviklet hos gnagere ved enten genetiske eller eksperimentelle tilnærminger for å undersøke årsakene og effektene av sykdommen. Blant disse er det rapportert om noen begrensninger som kirurgisk invasivitet, utilstrekkelig funksjonsvurdering, krav om omfattende trening og svært variabel forlengelse av netthinneskade. Det foreliggende arbeidet karakteriserer en enkel, billig og effektiv metode for å indusere okulær hypertensjon hos gnagere, basert på lavtemperatur, fullsirkel cauterization av limbal vaskulær plexus, en viktig komponent i vandig humordrenering. Den nye modellen gir en teknisk enkel, ikke-invasiv og reproduserbar subakutt okulær hypertensjon, assosiert med progressiv RGC og optisk nervedegenerasjon, og en unik postoperativ klinisk utvinningsgrad som tillater in vivo funksjonelle studier ved både elektrofysiologiske og atferdsmetoder.
Introduction
Medisinsk litteratur forstår DrDeramus som en heterogen gruppe optiske nevropatier preget av progressiv degenerasjon av retinale ganglionceller (RGC), dendritter, soma og axoner, noe som resulterer i strukturell cupping (utgravning) av optisk plate og funksjonell forverring av optisk nerve, noe som fører til amaurose i ukontrollerte tilfeller ved å avbryte overføringen av visuell informasjon fra øyet til hjernen1. DrDeramus er for tiden den vanligste årsaken til irreversibel blindhet over hele verden, spådd å nå ca 111,8 millioner mennesker i 20402, og dermed dypt påvirke pasientens livskvalitet (QoL) og fører til betydelige sosioøkonomiske bekymringer3.
Forhøyet intraokulært trykk (IOP) er en av de viktigste og den eneste modifiserbare risikofaktoren for utvikling og progresjon av glaukom. Blant de mange typer DrDeramus er alle, bortsett fra normal spenningsglaukom (NTG), forbundet med forhøyet IOP på et tidspunkt i sykdommens kliniske historie. Til tross for bemerkelsesverdige kliniske og kirurgiske fremskritt for å målrette IOP og redusere eller stoppe sykdomsprogresjon, mister pasientene fortsatt synet på grunn av DrDeramus 4,5. Derfor er en grundig forståelse av den komplekse og multifaktorielle patofysiologien til denne sykdommen avgjørende for utviklingen av mer effektive behandlinger, spesielt for å gi nevrobeskyttelse mot RGC.
Blant en rekke eksperimentelle tilnærminger for forståelse av sykdomsmekanismer, ligner dyremodeller basert på okulær hypertensjon (OHT) mest menneskelig DrDeramus. Gnagermodeller er spesielt nyttige da de er billige, er enkle å håndtere, kan manipuleres genetisk, har kort levetid og presenterer okulære anatomiske og fysiologiske egenskaper som kan sammenlignes med mennesker, for eksempel vandig humorproduksjon og drenering 6,7,8,9,10,11,12,13 . For tiden brukte modeller inkluderer sklerose i trabekulært nett etter injeksjon av hypertont saltvann i episklerale vener 14, intrakameral injeksjon av mikroperler 15 eller viskoelastiske stoffer 16, cauterization av virvelvener 17, fotokoagulering av trabekulært nett med argonlaser18, circumlimbal sutur 19 og bruk av en transgen modell av aldersrelatert OHT (DBA/2J-mus)8. Imidlertid er invasivitet, postoperativ opasifisering av hornhinnen, fremre segmentforstyrrelser, omfattende læringskurver, dyrt utstyr og svært variable postoperative IOPer blant få av de rapporterte fallgruvene knyttet til dagens modeller, noe som gjør utviklingen av en alternativ modell av OHT et krav for å overvinne disse problemene20,21,22.
Den nåværende protokollen formaliserer en ny kirurgisk prosedyre for å indusere OHT som en proxy til DrDeramus, basert på limbal plexus cauterization (LPC) hos gnagere23. Dette er en enkel, reproduserbar, tilgjengelig og ikke-invasiv modell som gir høy effektivitet og lav variasjon av IOP-økning, assosiert med en unik høy grad av full klinisk utvinning, og gir derfor in vivo funksjonell evaluering i et redusert antall dyr som brukes i hvert forsøk. Operasjonsteknikken induserer subakutt OHT med gradvis retur til baselinenivåer i løpet av få dager, som modellerer det hypertensive angrepet sett ved akutt trangvinkelglaukom. Videre følges IOP-utvinningen i modellen av kontinuerlig DrDeramus neurodegenerasjon, noe som er nyttig for fremtidige mekanistiske studier av sekundær degenerasjon av RGC, som forekommer i flere tilfeller av human DrDeramus til tross for tilstrekkelig kontroll av IOP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer ble utført i samsvar med erklæringen om bruk av dyr i oftalmisk og visuell forskning fra Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) og godkjent av etisk komité for bruk av dyr i vitenskapelig eksperimentering fra Health Sciences Center, Federal University of Rio de Janeiro (protokoll 083/17). I dette arbeidet ble Lister Hooded rotter av begge kjønn brukt, i alderen 2-3 måneder og veier 180-320 g. Prosedyren kan imidlertid tilpasses i forskjellige rottestammer i forskjellige aldersgrupper.
1. Okulær hypertensjon kirurgi og klinisk oppfølging
- Husdyr i et kontrollert temperaturmiljø og 12 t lys / mørk syklus (6 am: lys på / 6 pm: lys av) med standard pelletert gamma-bestrålt mat (Nuvilab® CR-1, Quimtia S / A, Brasil) og vann (trippelfilter, med giftfri aktivt kull) tilgjengelig ad libitum.
- Forbered en stambedøvende cocktailblanding sammensatt av tre deler 10% ketaminhydroklorid og en del 2% xylazinhydroklorid (fortynningsmiddel: sterilt vann).
- Hold dyret forsiktig fast ved å holde i rygghuden og indusere anestesi ved intraperitoneal administrering av 1 μL/g kroppsvekt av blandingen (ketamin: 75 mg/kg; xylazin: 5 mg/kg). Sjekk for riktig bedøvelse etter ca 5 min ved å utføre en tåklemmerespons.
- Lokalbedøve begge øyeflater ved å sette inn proxymetakainhydroklorid 0,5% øyedråpe. Vent i 30-60 s og fjern den gjenværende løsningen fra det fremre aspektet av kloden, ved forsiktig å berøre nese- eller lateral bulbar conjunctiva med en liten steril bomullspinne.
- Mål baseline IOP av både eksperimentelle og kontralaterale kontrolløyne ved å plassere dyret i en ventral decubitusposisjon på benkeplaten slik at hornhinnens overflate er lett tilgjengelig for tuppen av tonometeret.
- Bruk enten applanation eller rebound håndholdt tonometer (figur 1A). Plasser tonometerspissen slik at den berører den sentrale hornhinnen vinkelrett. Skaff og gjennomsnitt 3-5 pålitelige maskingenererte gjennomsnitt. Hvert gjennomsnitt beregnes automatisk av enheten etter seks vellykkede individuelle målinger.
- Legg rebound-tonometeret med en sonde og trykk på måleknappen en gang for å slå den på, mens du plasserer spissen av enheten oppover for å unngå at sonden faller. Etter at du har slått på, viser displayet 00 som indikerer at utstyret er klart til å måle.
- Plasser enheten med sondens spiss i en avstand på 1-4 mm fra hornhinnen og ta målinger ved raskt og forsiktig å trykke på måleknappen uten å flytte utstyret. Hvert vellykket mål identifiseres med et kort pip, og etter seks ganger vises gjennomsnittet på enhetens skjerm.
MERK: Til tross for lang erfaring med applanasjonstonometer, for å optimalisere hele prosedyren, anbefaler forfatterne bruk av et rebound-tonometer, noe som gir lettere oppkjøp av pålitelig IOP-måling.
- Plasser dyret på en liten lateral decubitusposisjon under et stereomikroskop, og planlegg operasjonen nøye ved å inspisere det eksperimentelle øyet ved 40x forstørrelse. Ikke glem å opprettholde det kontralaterale kontrolløyet smurt under prosedyren ved å sette inn en dråpe karmellosenatrium eller natriumhyaluronat.
- Ved hjelp av buede tanger skyver du forsiktig frem det eksperimentelle øyeeplet for å eksponere vaskulaturen som omgir 360° av limbus13. Med den annen hånd, forsiktig cauterize fartøyene rundt hornhinnen med en lavtemperatur oftalmisk cautery (1,300 ° F; Bovie Medical, USA) (figur 1B-E).
MERK: Den nevnte cautery har en rund spiss som skal berøre limbal vaskulatur i lengderetningen. - Vær forsiktig så du ikke cauterize hornhinnen periferien, da dette kan resultere i postoperativ hornhinde opasifisering, som utelukker in vivo vurdering av retinal funksjon.
- Vær oppmerksom på fremveksten av små sirkulære merker av cauterization på skleral limbus, utslettelse av limbal vaskulatur og elevutvidelse i det opererte øyet, som er tegn på en vellykket kirurgisk prosedyre.
MERK: Siden den limbale vaskulaturen til rotter og mus er anatomisk lik13,24 og kauteriet som brukes har en mild liten spiss, kan denne protokollen også fungere for museøyet uten tilpasning. - Etter operasjonen, kontroller den umiddelbare postoperative IOP i begge øynene, som beskrevet i trinn 1.5.
- Påfør en dråpe oftalmisk prednisolonacetat (1,2 mg / ml) og hold dette i kontakt med den fremre overflaten av det eksperimentelle øyet i rundt 40 s, og erstatt det med en oftalmisk salve av antibiotika (oksytetracyklinhydroklorid 30 mg / g pluss polymyksin B 10 000 U / g; eller ciprofloxacin 3,5 mg / g). Utfør intramuskulær injeksjon av tramadolhydroklorid (enkeltdose, 2 mg/kg) for å forhindre smerte etter inngrepet.
- Følg nøye dyrets utvinning fra anestesi, helst i et varmt miljø som en varmepute eller inne i buret med riktig sengetøy. Vær oppmerksom på luftveiene.
- Utfør en daglig klinisk oppfølging av det eksperimentelle øyet med aktuelle medisiner sammensatt av et ikke-steroidalt antiinflammatorisk legemiddel (NSAID, f.eks. ketorolactrometamol 0,5% øyedråpe) og antibiotisk salve (helst den samme som brukes umiddelbart etter operasjonen).
MERK: Bruk av NSAID i stedet for steroide antiinflammatoriske øyedråper anbefales fordi sistnevnte kan indusere OHT og brukes regelmessig for glukokortikoidinduserte DrDeramus-modeller hos gnagere.- Under lett sedasjon (ketamin: 18,75 mg/kg; xylazin: 1,25 mg/kg) måles IOP fortrinnsvis i samme periode på dagen for å unngå skjevhet på grunn av fysiologiske sirkadiske IOP-svingninger.
- Under den okulære undersøkelsen, legg merke til sjeldne kliniske intercurrences, som hyphema, hornhinnefibrose eller skleral tynning assosiert med uveal prolaps. Hornhinneødem, kjemose og konjunktivhyperemi er vanlige, men midlertidige.
- Legg merke til full klinisk bedring rundt postoperativ dag 7. Limbal revaskularisering begynner vanligvis i løpet av de to første dagene etter operasjonen, i tråd med forventet gradvis retur til baseline.
2. Analyse av optomotorisk respons (OMR)
MERK: For denne prosedyren ble et spesifikt system brukt25.
- Ordne fire dataskjermer i en firkant, som avgrenser en arena med en plattform i midten. På skjermene vises bildet av en virtuell sylinder med vertikalt orienterte sinusbølgegitter (alternative svarte og hvite striper), som roterer rundt plattformen med en fast hastighet (12 grader/s) og kontrast (100 %).
- Plasser et videokamera over plattformen, slik at eksperimentøren kan se dyrets bevegelser. Utfør testen under fotopiske forhold og sett programvaren fortrinnsvis på manuell / separat modus for å evaluere hvert øye separat.
- La dyrene tilvenne seg i ca. 2 min på plattformen. Oppretthold den røde trådkorsmarkøren på videorammen mellom øynene til det fritt bevegelige dyret, da det indikerer midten av den virtuelle sylinderen (figur 1G)25.
- Vær oppmerksom på OMR, bestående av en refleksiv sporing av dyrets hode og nakke fremkalt av de roterende gitterene. Test venstre og høyre visuelle veier ved å rotere retningene til sinusbølgegitterene henholdsvis med klokken og mot klokken.
- Innledningsvis presentere en stimulus med lav romlig frekvens (0,042 sykluser / grad). Deretter øker du frekvensen gradvis til sporingsbevegelsen ikke blir lagt merke til lenger. Den høyeste romlige frekvensen der en klar OMR fremkalles, tilsvarer terskelens romlige frekvens for det evaluerte øyet.
- Hvis dyret til slutt faller av plattformen under eksamen, returner det umiddelbart til plattformen og fortsett testen.
3. Registrering av mønster-elektroretinogram (PERG)
MERK: Elektroretinogrammet ble registrert ved hjelp av et spesifikt system for signalbehandling og tilhørende programvare for lagring og analyse av bølgeformene.
- Dypt bedøve dyr ved intramuskulær injeksjon av ketaminhydroklorid og xylazinhydroklorid (henholdsvis 75 mg / kg og 5 mg / kg). Dyp anestesi (kirurgisk plan) reduserer sjansene for gjenstander ved ufrivillige muskelbevegelser eller alternative støykilder under eksamen. Sjekk for riktig bedøvelse ved å utføre en tåklemmerespons.
MERK: De nevnte bedøvelsesmidlene påvirker ikke amplituden til responsen26. Siden en liten nål satt inn i hornhinnen ble brukt som den aktive elektroden, foretrekkes intramuskulær anestesi i stedet for intraperitoneal, da det er lettere å injisere på nytt i tilfelle rotten trenger en boosterdose (1/2 av startdosen), med lavere sjanser til å endre elektrodeposisjonen og dermed føre til mer reproduserbare registreringer under hele forsøket, som kan vare opptil 60 min. - Lokalbedøve hornhinnen med en dråpe proxymetakainhydroklorid 0,5%, og hold det andre øyet fuktet med oftalmiske smøremidler.
- Sett forsiktig den aktive elektroden (rustfritt stålnål 0,25 mm × 15 mm) i hornhinnenes temporale periferi. I tillegg setter du referanse- og jordelektrodene (nål i rustfritt stål 0,4 mm × 37 mm) inn i det subkutane vevet i henholdsvis ipsilateral temporal canthus og i en av bakre lemmer (figur 1I).
- For PERG, sett stimulansen til et svart-hvitt reserveringsbrett, vekslende ved 15 reverseringer/s med konstant gjennomsnittlig luminans (250 cd/m2). Sett båndpassfilteret til 1 Hz–100 Hz.
MERK: Den raske reverseringsstimulansen genererer steady-state PERG, en stabil og reproduserbar sinusoid som samler bølgekomponenten som mest sannsynlig er forbundet med RGC bioelektrisk respons: NII-avbøyning av transient-state PERG. - Plasser dyret på 20 cm fra stimulusskjermen (LCD-skjerm 0,58 m; Figur 1I), overvåke signalgrunnlinjen og starte PERG-innsamling ved å trykke på analyseknappen på innsamlingssystemet.
- Under prosedyren, hold dyrene tilpasset miljølys (hvitt lys på ~ 140 lux). Her ble seks distinkte romlige frekvenser (i sykluser per grad: 0,018, 0,037, 0,073, 0,146, 0,292, 0,585) presentert i tilfeldig rekkefølge.
MERK: Programvaren som brukes til signalbehandling utfører automatisk gjennomsnitt. Gjennomsnittet av 200-300 individuelle bølger ble ansett som tilstrekkelig til å skille seg ut fra støyen og analysere bølgeamplitude.
4. Kvantifisering av retinal ganglionceller somas
MERK: Følgende prosedyre er for kvantifisering av RGC somas, basert på immunhistokjemisk farging av retinal flat-mounts med et antistoff mot hjerne-spesifikke homeobox / POU domene protein 3A (Brn3a).
- Utsette forsøksdyr for eutanasi fra livmorhalsen, innledet med innånding av karbondioksid for å indusere bevisstløshet.
- Umiddelbart etter eutanasi, dissekere begge øynene under et stereomikroskop, ved hjelp av tanntang og buet saks.
- Utfør nøye disseksjon slik at både den distale delen av de ekstraokulære musklene og karunkelen forblir festet til kloden, da de er viktige landemerker for topografisk orientering av netthinnen (beskrevet i trinn 4.5). Prøv å lagre en strekning av optisk nerve festet til kloden så lenge som mulig for fremtidig analyse.
- Etter enukleasjon, plasser øynene i en 1 ml løsning av 4% paraformaldehyd (4% PFA) i 0,1 M fosfatbuffer (PBS) og hold den i 24 timer for riktig kjemisk fiksering.
- Separat netthinnen fra resten av det okulære vevet.
- Under et dissekerende mikroskop plasser øyebollet i en petriskål dekket med 1x PBS, og vær oppmerksom på viktige landemerker som nesekarunkel, choroidfissurer og sklerale avtrykk fra hvirvelårer for riktig topografisk orientering27.
- Penetrer det fremre kammeret fra den sentrale hornhinnen ved å bruke tanntang og buet saks (westcott). Lag to radiale kutt til det overlegne (dorsale) aspektet av sclera, mot skleralt foramen av synsnerven, for å avgrense øyebollets dorsale kvadrant.
- Separer hornhinnen fra resten av kloden gjennom en langsgående 360 ° kutt ved skleral limbus. Fjern linsen og irisen og avgrens den dorsale retinale kvadranten med de samme sklerale radiale avgrensningene som beskrevet ovenfor (trinn 4.5.2).
- Forsiktig løsne retinalvevet fra choroid og sclera, unngå både tilfeldige lacerasjoner i hele vevet og eventuelt topografisk tap av orientering.
- Separat ciliary kroppen fra retinal ora serrata. Fjern forsiktig den gjenværende glasslegemet fra retinalkoppen ved å bruke både buede ikke-tannede tang pluss buet saks (trekk glasslegemet og dissekere det nær den indre begrensningsmembranen) og en liten børste.
MERK: Fjerning av glassaktig humor er et viktig skritt for å oppnå et sterkt og rent immunhistokjemisk signal.
- Overfør isolerte retina til en 24-brønns kulturplate (en retina per brønn) som inneholder 1 ml 1x PBS og hold den indre retina vendt oppover.
- Permeabiliser vev ved å vaske 3x i 10 minutter med et ikke-ionisk overflateaktivt middel 0,5% fortynnet i 1x PBS (0,3 ml). Hold deretter vevet forsiktig ristende i 5% bovint serumalbumin (BSA) i ikke-ionisk overflateaktivt middel 2% og 1x PBS (blokkeringsløsning; 0,25 ml) i 60 minutter ved romtemperatur.
- I trinn 4.7 klargjøres Brn3a primærantistoffoppløsningen ved å fortynne 1:200 i ikke-ionisk surfaktant 0,5 % og 1x PBS pluss 5 % BSA, og oppbevar den ved 4 °C.
- Etter 60 minutter med vevsblokkering, inkuber retina i 0,2 ml primær antistoffoppløsning ved 4 °C i 72 timer med lett risting.
- Vask vevet 3x i 10 minutter med 1x PBS, inkuber deretter vevet i 2 timer ved romtemperatur i 0,2 ml av den sekundære antistoffoppløsningen fortynnet 1:750 i 1x PBS pluss 5% BSA.
- Videre inkuberer vevet i 10 minutter i nukleær motflekkløsning for fluorescerende kjernefarging. Avslutt immunhistokjemi med et siste vasketrinn med 1x PBS (0,3 ml) gjentatt 3x.
- Overfør netthinner ved hjelp av to små børster på glassmikroskoplysbilder, og oppretthold glasslegemesiden opp. Plasser den dorsale netthinnekvadranten opp på mikroskoplysbildene (tidligere avgrenset i trinn 4.5.3). Gjør ytterligere to radiale kutt mot optisk nervehode for å avgrense de andre 3 kvadrantene (nasal, ventral og temporal).
MERK: Kuttdimensjonene er ikke faste. De bør ikke være for korte som svekker en effektiv flattning av netthinnen på lysbildet og bør ikke være for lang slik at den når optisk nerveforamen og helt skiller den avgrensede retinalkvadranten fra resten av vevet. - Påfør til slutt 0,2 ml antifademonteringsmedium på et glassdeksel og legg dette på den flatmonterte netthinnen for vevsmikroskopisk analyse. For å estimere RGCs tetthet, undersøk de flate festene under et konfokal epifluorescensmikroskop ved hjelp av et 40x / 1.3-mål.
- For hver kvadrant av netthinnen, ta åtte bilder: to fra den sentrale retina (~ 0, 9 mm fra optisk plate), tre fra midten av retina (~ 2, 0 mm fra optisk plate) og tre fra perifer retina (~ 3, 7 mm fra optisk plate), totalt til 32 bilder per netthinne. Bruk FIJI-programvaren til å telle Brn3a-positive celler og estimere gjennomsnittlig celletetthet.
5. Undersøkelse av synsnerven
- Etter eutanasi og øyeeple-enukleasjon (trinn 4,1-4,3), fjern det proksimale segmentet av den intraorbitale delen av synsnerven (1-2 mm), inkludert en del av den intraokulære delen, og legg prøvene umiddelbart i hetteglass/rør inneholdende 0,2-0,3 ml kaldfikserende middel (2,5% glutaraldehydoppløsning i 0,1 M natriumkakodylatbuffer (pH 7,4)) i 2 timer.
MERK: Følgende trinn for synsnerveprosessering utføres i de samme hetteglassene/rørene fra trinn 5.1 - Vask materialet 3x i 5 min med kald 0,1 M natriumkakodylatbuffer. Postfiksert vev i 1 time under lett risting i en oppløsning av 1,0 % osmiumtetroxid i 0,8 % kaliumferrocyanid og 5 nM kalsiumklorid fortynnet i 0,1 M natriumkakodylatbuffer ved 4 °C (0,1-0,2 ml).
- Vask optiske nervefragmenter 3x i 5 min med kald 0,1 M natriumkakodylatbuffer og deretter med kaldt destillert vann, 3x i 1 min. Materialet skal holdes over natten under forsiktig risting i en oppløsning av 1,0 % uranylacetat i destillert vann for farging ved 4 °C (0,1-0,2 ml). Vask fragmenter 3x med kaldt destillert vann.
- Dehydrer vevet gradvis med en gradert acetonserie (0,5 ml hver), med påfølgende erstatninger av følgende fortynninger i destillert vann: 2x 7 min inkubasjon i 15% iskald aceton; 2x 7 min inkubasjon i 30% iskald aceton; 2x 7 min inkubasjon i 50% iskald aceton; 2x 7 min inkubasjon i 70% iskald aceton; 2x 7 min inkubasjon i 80% iskald aceton; 2x 7 min inkubasjon i 90% iskald aceton; 2x 15 min inkubasjon i 100% aceton ved romtemperatur (RT).
- Utfør 3 infiltrasjons- / innebyggingstrinn, med påfølgende utskifting av følgende løsninger: 1 del epoksyharpiks: 2 deler aceton (totalt volum: 0,5 ml), ved RT i 12 timer; 1 del epoksyharpiks: 1 del aceton (totalt volum: 0,5 ml), ved RT i 12 timer; 2 deler epoksyharpiks: 1 del aceton (totalt volum: 0,5 ml), ved RT i 12 timer. Til slutt infiltrerer du vev i ren epoksyharpiks ved RT i 24 timer.
- Fjern prøver fra prøvebæreren, overfør dem til støpeformer, og la den polymerisere i 48 timer ved 60 °C. Klipp tverrgående halvtynne seksjoner (300-400 nm) av optiske nervefragmenter ved hjelp av en ultramikrotom, samle og overfør dem til et mikroskopglassglass. Beis seksjoner med toluidinblå og bilde ved hjelp av optisk mikroskop ved 100x forstørrelse.
- For ultrastrukturell analyse, utfør ultratynne tverrsnitt (70 nm), samle dem på kobbergitter og flekker dem med uranylacetat og blycitrat. Undersøk seksjonene i et transmisjonselektronmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De kvantitative variablene uttrykkes som gjennomsnitt ± standardfeil av gjennomsnittet (SEM). Bortsett fra sammenligningen av IOP-dynamikk mellom OHT og kontrollgrupper (figur 1F), ble statistisk analyse utført ved hjelp av toveis ANOVA etterfulgt av Sidaks multiple sammenligningstest. P-verdi < 0,05 ble vurdert som statistisk signifikant.
Figur 1 illustrerer kirurgiske trinn i fullsirkel limbal plexus cauterization (LPC)-modellen, med viktige landemerker som 360° termisk indusert forsvinning av limbale kar, samt mild til moderat mydriasis i det opererte øyet ved slutten av prosedyren.
I den nåværende serien på 131 rotter induserte fullsirkel limbal plexus cauterization (LPC) IOP-økning umiddelbart etter operasjonen fra 13,0 ± 0,2 mmHg ved baseline til 22,7 ± 0,4 mmHg. Maksimal postoperativ IOP ble observert den første dagen etter kirurgi (25,3 ± 0,6 mmHg), etterfulgt av en gradvis retur til baselinenivåer ved 6. postoperative dag (statistisk analyse: multippel t-test korrigert for multiple sammenligninger ved hjelp av Holm-Sidak-metoden; Figur 1F). Hornhinnefibrose eller ødem var kliniske intercurrences som potensielt kunne kompromittere nøyaktig IOP-måling. Den første var på den ene siden sjelden, påvirket 3,92% av dyrene og ble lagt merke til sent under den postoperative oppfølgingen, og sparte dermed de første 5 dagene med okulær hypertensjon og bevarte den subakutte OHT-profilen beskrevet23. Hornhinneødem var derimot en mer vanlig komplikasjon sett i løpet av de første dagene etter operasjonen (1-3 dager), men for det meste mild og midlertidig, og påvirket derfor ikke IOP23 robust.
Netthinnefunksjonen ble evaluert både atferdsmessig og elektrofysiologisk ved hjelp av henholdsvis optomotorisk refleks og mønster-ERG (figur 1G-J). Begge parametrene viste to faser med nedsatt funksjonsevne: en okulær hypertensjon akutt fase 3. dag etter operasjonen, og en sekundær degenerasjonsfase ved 30. dag etter operasjonen (figur 1H, figur J og tabell 1). Innimellom ble det påvist en periode med funksjonell bedring, som tidligere omtalt andre steder23.
Sammenlignet med kontroll-andre optiske nerver, viste aksonale tall i halvtynne transversale optiske nerveseksjoner progressiv reduksjon etter kirurgi (3. dag: 68,3% ± 0,9%; 7. dag: 59,2% ± 2,6%; 14. dag: 45,4% ± 2,2%; 30. dag: 28,2 % ± 3,0%; toveis ANOVA: p < 0,0001; Figur 2A). Ultrastrukturelt presenterte synsnerver fra kontrolløyne tettpakkede myeliniserte fibre, adskilt av tynne gliacelleprosesser, og tydelige aksonale mikrotubuli og nevrofilamenter (figur 2B). I kontrast, 3 dager etter OHT, fant vi fokal forstyrrelse av aksonbunter, noen få degenererte fibre, cytoplasmatisk vakuolisering i gliacelleprosesser og kondensert kromatin i glialcellekjerner. Etter 7 dager med OHT-induksjon var det en økning i degenererte aksonale fibre, hypertrofiske gliacelleprosesser og hevelse og hulrom i individuelle aksonale fibre. På 14 dager var en av de mest fremtredende endringene en større disarrangement av optiske nervefibre, assosiert med invasjonen av glialcelleprosesser blant axonene. Filamentbunter fylte disse prosessene og mørke degenererte fibre, og myelinnedbrytning var vanligere, assosiert med frittliggende og vakuoliserte lameller (figur 2B).
Tettheten av Brn3a+-profiler avtok over tid (figur 2C), hovedsakelig i dorsale og temporale retinale kvadranter, ned til henholdsvis 32,4 % ± 9,6 % og 35,7 % ± 9,1 % etter 30 dager (figur 2D-G og tabell 2).
Figur 1: Termisk cauterization av limbal vaskulær plexus og konsekvenser for retinal funksjon in vivo. (A) Alternative metoder for å måle IOP hos rotter: rebound tonometry (superior) og applanation tonometry (inferior). (VG Nett) Kirurgisk prosedyre; pilspiss: limbal vaskulær plexus; pil: buet tang som brukes til å eksponere fremre overflate av øyebollet og optimalisere kirurgisk vurdering til limbale kar; hash: den runde spissen av lavtemperatur oftalmisk cautery; stjerne: cauterization. Vekt bar: 2 mm. Innfelt i (D) viser i høyere forstørrelse den limbale vaskulaturen som skal kauteriseres. (F) Tidsforløp for IOP-målinger i OHT (rød) og kontrollør (svarte) øyne (n = 131). Vertikal pil ned: LPC kirurgi. * = p < 0,05 (G) Arena for optomotorisk responsanalyse, bestående av fire dataskjermer arrangert i en firkant, med en plattform i midten. Skjermene viser bildet av en virtuell sylinder bestående av vertikale alternative svarte og hvite striper som beveger seg rundt dyret med konstant rotasjonshastighet og variable romlige frekvenser. Det røde krysshåret tilsvarer midten av den virtuelle sylinderen. (H) Optomotoriske responser. Ved kirurgisk oppfølging skilles to distinkte faser: OHT-fasen (0-5 dager) og sekundær degenerasjonsfase (6-30 dager). = p < 0,0001. (I) Elektroder og dyreposisjonering for mønster-ERG (PERG) oppkjøp: den aktive elektroden ved hornhinnens temporale periferi, og referanse- og jordelektrodene inn i det subkutane vevet i henholdsvis den ipsilaterale temporale kantusen og en av baklemmene. Dyret er plassert på 20 cm fra stimulusskjermen. (J) PERG-amplitude ved stimuli med forskjellige romlige frekvenser. I likhet med optomotorisk respons viser PERG-evaluering også to forskjellige faser av respons etter operasjonen: okulær hypertensiv 3 dager etter operasjonen, etterfulgt av utvinning på dag 7 og 14, men fortsatt statistisk lavere enn naive responser, og en påfølgende reduksjon på dag 30 etter operasjonen. c/d = sykluser per grad. Naiv gruppe: øynene til dyr som ikke er utsatt for tidligere eksperimentell manipulasjon. (H) og (J) viser gjennomsnittlig ± SEM, pluss individuelle replikater i (H). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Strukturell vurdering av nervus retina og opticus etter limbal vaskulær plexus cauterization (LPC) med lavtemperatur oftalmisk cautery. (A) Aksontall på forskjellige tidspunkter etter OHT (n = 3). = p = 0,0005, **** = p < 0,0001. (B) Elektronmikrografer av optisk nervedegenerasjon etter OHT. Det venstre bildet viser kontrolloptisk nerve, og de følgende bildene illustrerer den progressive degenerasjonen etter 3, 7 og 14 dager med OHT. Pilspiss: normale myeliniserte fibre; tynne piler: degenererte fibre; stjerne: cytoplasmatisk vakuolisering; hashes: gliaceller prosess; og Nu: gliacellekjerne. (C) Fotomikrografer av representative tellefelt av RGC merket med et antistoff mot Brn3a (rød) og TO-PRO3-merkede kjerner (blå); skala bar: 50μm. (D-G) Fordeling av gjennomsnittlig Brn3a + celletetthet i de fire kvadrantene i netthinnen etter 3-30 dager med kirurgi. Grafene viser individuelle gjennomsnitt av RGC-tettheter for 3-11 dyr per gang etter inngrepet. * = p < 0,05; ** = p < 0,01; = p < 0,001; = p < 0,0001. Kvantitative data er ment ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Statistisk analyse av PERG-data. Toveis ANOVA etterfulgt av Sidaks flere sammenligningstest. P-verdi mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. c/d = sykluser per grad. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 2: Regionalt tap av RGC etter LPC. SEM: standardfeil av gjennomsnittet. Kontroll: medøye. P-verdier mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikante (*). Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Limbal plexus cauterization (LPC) er en ny posttrabekulær modell med den fordelen at den retter seg mot lett tilgjengelige vaskulære strukturer som ikke krever konjunktival eller tenondisseksjon17,28. Forskjellig fra virvelvens cauterization-modellen, en kjent OHT-modell basert på kirurgisk svekkelse til choroid venøs drenering, forventes venøs overbelastning ikke å påvirke IOP-stigning i LPC-modellen, da limbale vener ligger oppstrøms i vandig humorutstrømning. Det er også teknisk enkelt å lære og billig, og krever for det meste en termisk kauteri med lav temperatur. Videre er det forbundet med en unik rate av OHT-induksjon og full klinisk utvinning (> 90%, som tidligere rapportert)23, noe som reduserer antall dyr som er nødvendige for eksperimenter og muliggjør både elektrofysiologisk og atferdsanalyse. Endelig er DrDeramus degenerasjon tilstede i både RGC-laget og optisk nerve i en relativt kort tidsramme etter operasjonen, noe som muliggjør enten kortsiktige eller midtveis eksperimentelle design23. Fremtidige studier er nødvendige for ytterligere å belyse virkningen av fullsirkel limbal vaskulatur cauterization på individuelle retinale lag.
Kritiske trinn i den kirurgiske protokollen er: (1) cauterization-spissen må forsiktig berøre skleral limbus parallelt med fartøyaksen; (2) Hornhinnevev må spares, ikke bare under cauterization, men også under dyremanipulasjon. Utfør regelmessig øyedråpeinstillasjon og fjerning av overflødig løsning fra øyets overflate med en bomullspinne (vær forsiktig så du ikke skrubber bomullspinnen på hornhinnen mens du fjerner væske, da det fører til hornhinneepitelial slitasje og eventuelle komplikasjoner etter operasjonen); (3) en full sirkel av sammenhengende cauterization merker bør visualiseres; (4) Ikke forsøm postoperativ klinisk oppfølging med et ikke-steroidalt antiinflammatorisk legemiddel og antibiotikasalve, i hvert fall til den 5. dagen etter operasjonen.
Den subakutte IOP-forhøyningen sett i den beskrevne modellen skiller seg fra trykkdynamikken til åpenvinklet glaukom, men er beslektet med akutt trangvinkelglaukom, neovaskulær glaukom eller flere typer posttrabekulær glaukom med forhøyet episkleralt venetrykk29. Dette er en stor begrensning av denne metoden, da åpenvinklet glaukom er den mest utbredte fenotypen av sykdommen, preget av kronisk OHT og sakte progressiv RGC-degenerasjon. Ikke desto mindre representerer foreningen av progressiv normalisering av IOP med kontinuerlig RGC-degenerasjon en unik mulighet til å studere, i samme dyremodell, både de biologiske mekanismene som knytter okulær hypertensjon med utvikling og progresjon av DrDeramus, samt den sekundære degenerative prosessen som hovedsakelig observeres i åpenvinklet DrDeramus-tilfeller, hvorpå pasienter presenterer DrDeramus-fremgang til tross for klinisk eller kirurgisk suksess med å nå målet IOP30. Dermed representerer denne modellen en mulighet til bedre å belyse dette fenomenet gjennom kortsiktige eller midtveis eksperimentelle design, og til slutt utvikle trykkuavhengige nevrobeskyttende terapier til fordel for pasienter som fortsatt mister synet til tross for beste IOP-kontrollbehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi anerkjenner våre laboratorieteknikere José; Nilson dos Santos, Daianne Mandarino Torres, José Francisco Tibúrcio, Gildo Brito de Souza og Luciano Cavalcante Ferreira. Denne forskningen ble finansiert av FAPERJ, CNPq og CAPES.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Isofar | 201 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Active electrode for electroretinography | Hansol Medical Co | - | Stainless steel needle 0.25 mm × 15 mm |
| Anestalcon | Novartis Biociências S/A | MS-1.0068.1087 | Proxymetacaine hydrochloride 0.5% |
| Calcium chloride | Vetec | 560 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Cautery Low Temp Fine Tip 10/bx | Bovie Medical Corporation | AA00 | Low-temperature ophthalmic cautery |
| Cetamin | Syntec do Brasil Ltda | 000200-3-000003 | Ketamine hydrochloride 10% |
| DAKO | Dako North America | S3023 | Antifade mounting medium |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 28718-90-3 | diamidino-2-phenylindole; blue fluorescent nuclear counterstain; emission at 452±3 nm |
| Ecofilm | Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda | MS-1.0298.0487 | Carmellose sodium 0.5% |
| EPON Resin | Polysciences, Inc. | - | Epoxy resin used for electron microscopy, composed of a mixture of four reagents: Poly/Bed 812 Resin (CAT#08791); DDSA - Dodecenylsuccinic Anhydride (CAT#00563); NMA - Nadic Methyl Anhydride (CAT#00886); DMP-30 - 2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol (CAT#00553) |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16110 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Hyabak | União Química Farmacêutica Nacional S/A | MS-8042140002 | Sodium hyaluronate 0.15% |
| Icare Tonolab | Icare Finland Oy | TV02 (model number) | Rebound handheld tonometer |
| IgG donkey anti-mouse antibody + Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A31570 | Secondary antibody solution |
| LCD monitor 23 inches | Samsung Electronics Co. Ltd. | S23B550 | Model LS23B550, for electroretinogram recording |
| LSM 510 Meta | Carl Zeiss | - | Confocal epifluorescence microscope |
| Maxiflox | Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda | MS-1.0298.0489 | Ciprofloxacin 3.5 mg/g |
| MEB-9400K | Nihon Kohden Corporation | - | System for electroretinogram recording |
| monoclonal IgG1 mouse anti-Brn3a | MilliporeSigma | MAB-1585 | Brn3a primary antibody solution |
| Neuropack Manager v08.33 | Nihon Kohden Corporation | - | Software for electroretinogram signal processing |
| Optomotry | CerebralMechanics | - | System for optomotor response analysis |
| Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19100 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Potassium ferrocyanide | Electron Microscopy Sciences | 20150 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Reference and ground electrodes for electroretinography | Chalgren Enterprises | 110-63 | Stainless steel needles 0.4 mm × 37 mm |
| Sodium cacodylate buffer | Electron Microscopy Sciences | 12300 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Ster MD | União Química Farmacêutica Nacional S/A | MS-1.0497.1287 | Prednisolone acetate 0.12% |
| Terolac | Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda | MS-1.0497.1286 | Ketorolac trometamol 0.5% |
| Terramicina | Laboratórios Pfizer Ltda | MS-1.0216.0024 | Oxytetracycline hydrochloride 30 mg/g + polymyxin B 10,000 U/g |
| Tono-Pen XL | Reichert Technologies | 230635 | Digital applanation handheld tonometer |
| TO-PRO-3 | Thermo Fisher Scientific | T3605 | Far red-fluorescent nuclear counterstain; emission at 661 nm |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 | Non-ionic surfactant |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Xilazin | Syntec do Brasil Ltda | 7899 | Xylazine hydrochloride 2% |
| Carl Zeiss | - | Stereo microscope for surgery and retinal dissection |
References
- Weinreb, R. N., Aung, T., Medeiros, F. A. The Pathophysiology and Treatment of Glaucoma A Review. JAMA. 311 (8), 1901-1911 (2014).
- Tham, Y. C., et al. Global prevalence of glaucoma and projections of glaucoma burden through 2040: A systematic review and meta-analysis. Ophthalmology. 121 (11), 2081-2090 (2014).
- Quaranta, L., et al. Quality of Life in Glaucoma: A Review of the Literature. Advances in Therapy. 33 (6), 959-981 (2016).
- Heijl, A., et al. Reduction of intraocular pressure and glaucoma progression: results from the Early Manifest Glaucoma Trial. Archives of Ophthalmology. 120 (10), Chicago, Ill. 1268-1279 (2002).
- Susanna, R., De Moraes, C. G., Cioffi, G. A., Ritch, R. Why Do People (Still) Go Blind from Glaucoma. Translational Vision Science & Technology. 4 (2), 1 (2015).
- Fujikawa, K., et al. VAV2 and VAV3 as candidate disease genes for spontaneous glaucoma in mice and humans. PLoS One. 5 (2), 9050 (2010).
- Mao, M., Hedberg-Buenz, A., Koehn, D., John, S. W., Anderson, M. G. Anterior segment dysgenesis and early-onset glaucoma in nee mice with mutation of Sh3pxd2b. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2679-2688 (2011).
- John, S. W., et al. Essential iris atrophy, pigment dispersion, and glaucoma in DBA/2J mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (6), 951-962 (1998).
- Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N. Ocular hypertension in mice with a targeted type I collagen mutation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (4), 1581-1585 (2003).
- Chou, T. H., Tomarev, S., Porciatti, V. Transgenic mice expressing mutated Tyr437His human myocilin develop progressive loss of retinal ganglion cell electrical responsiveness and axonopathy with normal iop. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (9), 5602-5609 (2014).
- vander Zypen, E. Experimental morphological study on structure and function of the filtration angel of the rat eye. Ophthalmologica. 174 (5), 285-298 (1977).
- Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N.
- Morrison, J. C., Fraunfelder, F. W., Milne, S. T., Moore, C. G.
- Morrison, J. C., et al. A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage. Experimental Eye Research. 64 (1), 85-96 (1997).
- Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: A paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (1), 207-216 (2010).
- Zhu, M. D., Cai, F. Y. Development of experimental chronic intraocular hypertension in the rabbit. Australian and New Zealand Journal of Ophthalmology. 20 (3), 225-234 (1992).
- Shareef, S. R., Garcia-Valenzuela, E., Salierno, A., Walsh, J., Sharma, S. C. Chronic ocular hypertension following episcleral venous occlusion in rats. Experimental Eye Research. 61 (3), 379-382 (1995).
- Levkovitch-Verbin, H., et al. Translimbal laser photocoagulation to the trabecular meshwork as a model of glaucoma in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43 (2), 402-410 (2002).
- Zhao, D., et al. Characterization of the Circumlimbal Suture Model of Chronic IOP Elevation in Mice and Assessment of Changes in Gene Expression of Stretch Sensitive Channels. Frontiers in Neuroscience. 11, (2017).
- Biswas, S., Wan, K. H. Review of rodent hypertensive glaucoma models. Acta Ophthalmologica. 97 (3), 331-340 (2019).
- Pitha, I., et al. Sustained Dorzolamide Release Prevents Axonal and Retinal Ganglion Cell Loss in a Rat Model of IOP-Glaucoma. Translational Vision Science & Technology. 7 (2), 13 (2018).
- Grozdanic, S. D., et al. Temporary elevation of the intraocular pressure by cauterization of vortex and episcleral veins in rats causes functional deficits in the retina and optic nerve. Experimental Eye Research. 77 (1), 27-33 (2003).
- Lani, R., et al. A subacute model of glaucoma based on limbal plexus cautery in pigmented rats. Scientific Reports. 9 (1), 16286 (2019).
- vander Merwe, E. L., Kidson, S. H. The three-dimensional organisation of the post-trabecular aqueous outflow pathway and limbal vasculature in the mouse. Experimental Eye Research. 125, 226-235 (2014).
- Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (12), 4611-4616 (2004).
- Sasovetz, D. Ketamine hydrochloride: an effective general anesthetic for use in electroretinography. Annals of Ophthalmology. 10 (11), 1510-1514 (1978).
- Stabio, M. E., et al. A novel map of the mouse eye for orienting retinal topography in anatomical space. The Journal of Comparative Neurology. 526 (11), 1749-1759 (2018).
- Blanco, R., et al. A Chronic Ocular-Hypertensive Rat Model induced by Injection of the Sclerosant Agent Polidocanol in the Aqueous Humor Outflow Pathway. International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3209 (2019).
- Paranhos, A., Prata, J. A., de Mello, P. A., da Silva, F. A. Post-Trabecular Glaucomas with Elevated Episcleral Venous Pressure. Mechanisms of the Glaucomas. , Humana Press. 139-157 (2008).
- Ou, Y., Jo, R. E., Ullian, E. M., Wong, R. O. L., Della Santina, L. Selective Vulnerability of Specific Retinal Ganglion Cell Types and Synapses after Transient Ocular Hypertension. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of The Society for Neuroscience. 36 (35), 9240-9252 (2016).
