Summary
이 프로토콜의 목표는 아급성 안구 고혈압을 유발하는 변연 혈관 신경총의 360° 열 소작을 기반으로 하는 녹내장 신경 퇴행의 새로운 모델을 특성화하는 것입니다.
Abstract
전 세계적으로 실명의 두 번째 주요 원인인 녹내장은 시신경 및 망막 신경절 세포(RGC) 변성의 구조적 손상을 특징으로 하는 이질적인 안구 질환군으로, 눈에서 뇌로의 시각 정보 전달을 방해하여 시각 기능 장애를 초래합니다. 안압 상승은 가장 중요한 위험 요소입니다. 따라서 안구 고혈압의 여러 모델은 질병의 원인과 효과를 조사하기 위해 유전적 또는 실험적 접근 방식으로 설치류에서 개발되었습니다. 그 중 외과적 침습성, 부적절한 기능 평가, 광범위한 교육의 필요성, 망막 손상의 매우 다양한 확장과 같은 몇 가지 제한 사항이 보고되었습니다. 본 연구는 수액 배출의 주요 구성 요소인 윤부 혈관 신경총의 저온, 전원형 소작을 기반으로 설치류에서 안구 고혈압을 유도하는 간단하고 저렴하며 효율적인 방법을 특성화합니다. 새로운 모델은 진행성 망막 신경절 암 및 시신경 변성과 관련된 기술적으로 쉽고 비침습적이며 재현 가능한 아급성 안구 고혈압과 전기 생리학적 및 행동적 방법 모두에 의한 생체 내 기능 연구를 가능하게 하는 독특한 수술 후 임상 회복률을 제공합니다.
Introduction
의학 문헌에서는 녹내장을 망막 신경절 세포(RGC), 수상돌기, 소마, 축삭돌기의 점진적인 변성을 특징으로 하는 이질적인 시신경병증 그룹으로 이해하며, 이로 인해 시신경의 구조적 부항(굴착)과 시신경의 기능적 저하가 발생하여 눈에서 뇌로의 시각 정보 전달을 방해하여 조절되지 않는 경우 무뇨증을 유발합니다1. 녹내장은 현재 전 세계적으로 돌이킬 수 없는 실명의 가장 흔한 원인으로, 2040년에는 약 1억 1,180만 명이 이를 것으로 예상됩니다2 따라서 환자의 삶의 질(QoL)에 큰 영향을 미치고 심각한 사회경제적 문제를 야기합니다3.
안압 상승(IOP)은 녹내장의 발병과 진행에 있어 가장 중요하고 유일하게 수정할 수 있는 위험 요인 중 하나입니다. 여러 유형의 녹내장 중에서 정상 긴장성 녹내장(NTG)을 제외한 모든 녹내장은 질병의 임상 병력에서 어느 시점에 상승된 안압과 관련이 있습니다. IOP를 표적으로 삼고 질병 진행을 늦추거나 멈추기 위한 임상 및 수술의 놀라운 발전에도 불구하고 환자들은 여전히 녹내장으로 인해 시력을 잃습니다 4,5. 따라서 이 질환의 복잡하고 다인자적인 병태생리학에 대한 철저한 이해는 보다 효과적인 치료법의 개발, 특히 망막 신경절 세포에 대한 신경 보호를 제공하는 데 필수적입니다.
질병 메커니즘을 이해하기 위한 다양한 실험적 접근 방식 중에서 안구 고혈압(OHT)을 기반으로 하는 동물 모델은 인간 녹내장과 가장 유사합니다. 설치류 모델은 비용이 저렴하고, 다루기 쉽고, 유전자 조작이 가능하고, 수명이 짧고, 수액 생성 및 배액과 같은 인간과 유사한 안구 해부학적 및 생리학적 특징을 나타내기 때문에 특히 유용합니다 6,7,8,9,10,11,12,13 . 현재 사용되는 모델로는 상피 정맥에 고긴장성 식염수를 주입한 후 섬유주 그물망의 경화증(14), 마이크로비드(15) 또는 점탄성 물질(16)의 카메라 내 주입, 와류 정맥(17)의 소작, 아르곤 레이저(18)를 이용한 섬유주 그물망의 광응고(18), 주위 봉합사(19), 연령 관련 OHT(DBA/2J 마우스)의 형질전환 모델 사용8. 그러나 침습성, 수술 후 각막의 혼탁, 전방 분절 파괴, 광범위한 학습 곡선, 고가의 장비 및 매우 가변적인 수술 후 IOP는 현재 모델과 관련된 보고된 함정 중 몇 가지에 속하므로 이러한 문제를 극복하기 위해 OHT의 대체 모델 개발이 필요합니다20,21,22.
본 프로토콜은 설치류의 변연신경총 소작(LPC)에 기초하여 녹내장의 대용물로서 OHT를 유도하기 위한 새로운 수술 절차를 공식화한다23. 이는 쉽고, 재현 가능하고, 접근 가능하고, 비침습적인 모델로, IOP 상승의 높은 효율성과 낮은 변동성을 제공하며, 유일하게 높은 전체 임상 회복률과 관련되어 있어 각 실험에 사용되는 동물의 수를 줄여 생체 내 기능 평가를 제공합니다. 이 수술 기법은 며칠 내에 점진적으로 기준선 수준으로 복귀하여 아급성 OHT를 유도하며, 이는 급성 폐쇄각 녹내장에서 볼 수 있는 고혈압 발작을 모델링합니다. 또한, 모델에서 IOP 회복 후에는 지속적인 녹내장 신경퇴행이 뒤따르며, 이는 IOP의 적절한 조절에도 불구하고 인간 녹내장의 여러 사례에서 발생하는 망막 신경절 세포의 이차 변성에 대한 향후 기계론적 연구에 유용합니다.
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Protocol
모든 절차는 시력 및 안과 연구 협회(ARVO)의 안과 및 시각 연구에서의 동물 사용에 대한 성명서에 따라 수행되었으며 리우데자네이루 연방 대학교 보건 과학 센터의 과학 실험에서의 동물 사용에 관한 윤리 위원회(프로토콜 083/17)의 승인을 받았습니다. 본 연구에서는 생후 2-3개월, 체중 180-320g의 리스터 후드 쥐를 사용했다. 그러나 이 절차는 다양한 연령대의 다양한 쥐 균주에 적용할 수 있습니다.
1. 고안압증 수술 및 임상적 추적 관찰
- 표준 펠릿화 감마선 조사 식품(Nuvilab® CR-1, Quimtia S/A, 브라질) 및 물(삼중 필터, 무독성 활성탄 포함)을 사용하여 제어된 온도 환경 및 12시간 조명/어둠 주기(오전 6시: 조명 켜기/오후 6시: 조명 끄기)에서 동물을 사육합니다.
- 10% 케타민 염산염 3부와 2% 자일라진 염산염 1부(희석제: 멸균수)로 구성된 마취제 혼합물을 준비합니다.
- 등쪽 피부를 잡고 동물을 부드럽게 제지하고 혼합물 체중의 1μL/g(케타민: 75mg/kg, 자일라진: 5mg/kg)을 복강내 투여하여 마취를 유도합니다. 약 5분 후 발가락 꼬집기 반응을 수행하여 적절한 마취를 확인하십시오.
- 프록시메타카인 염산염 0.5% 점안액을 주입하여 양쪽 눈 표면을 국소적으로 마취합니다. 30-60초 동안 기다렸다가 작은 멸균 면봉으로 비강 또는 외측 구근 결막을 부드럽게 만져 지구의 앞쪽에서 남은 용액을 제거합니다.
- 각막 표면이 안압계 끝에 쉽게 접근할 수 있도록 동물을 벤치탑의 복부 욕창 위치에 놓아 실험 및 반대측 대조 눈의 기준선 IOP를 측정합니다.
- 압평 또는 리바운드 휴대용 안압계를 사용합니다(그림 1A). 안압계 팁이 중앙 각막 영역에 수직으로 약간 닿도록 배치합니다. 3-5개의 신뢰할 수 있는 기계 생성 평균을 획득하고 평균화합니다. 각 평균은 6번의 성공적인 개별 측정 후 장치에 의해 자동으로 계산됩니다.
- 리바운드 안압계에 프로브를 장착하고 프로브가 떨어지는 것을 방지하기 위해 장치 끝을 위쪽으로 놓고 측정 버튼을 한 번 눌러 전원을 켭니다. 전원을 켜면 디스플레이에 00이 표시되어 장비가 측정할 준비가 되었음을 나타냅니다.
- 프로브 끝으로 장치를 각막에서 1-4mm 떨어진 곳에 놓고 장비를 움직이지 않고 측정 버튼을 빠르고 조심스럽게 눌러 측정값을 얻습니다. 성공한 각 측정은 짧은 경고음으로 식별되고 6회 후에 평균이 장치 화면에 표시됩니다.
참고: 압평 안압계에 대한 오랜 경험에도 불구하고 전체 절차를 최적화하기 위해 저자는 신뢰할 수 있는 IOP 측정을 더 쉽게 얻을 수 있는 반동 안압계의 사용을 권장합니다.
- 실체 현미경으로 동물을 약간 측면 욕창 자세로 놓고 40배 배율로 실험 눈을 검사하여 수술 계획을 신중하게 세웁니다. 시술 중에 카멜로스 나트륨 또는 히알루론산 나트륨 한 방울을 주입하여 반대쪽 대조 눈을 윤활하는 것을 잊지 마십시오.
- 구부러진 집게를 사용하여 실험용 안구를 부드럽게 앞으로 밀어 림버스13의 360°를 둘러싸고 있는 혈관을 노출시킵니다. 다른 손으로 저온 안과 소작(1,300°F; Bovie Medical, 미국)(그림 1B-E).
알림: 언급된 소작에는 가장자리 혈관에 세로로 닿아야 하는 둥근 끝이 있습니다. - 각막 주변부를 소작하면 수술 후 각막 혼탁이 발생하여 망막 기능의 생체 내 평가가 불가능해질 수 있으므로 주의하십시오.
- 성공적인 수술 절차의 징후인 공막 변두리에 작은 원형 소작 자국이 나타나고, 윤부 혈관이 소멸되고, 수술된 눈의 동공 확장이 나타나는 것을 관찰하십시오.
참고: 쥐와 생쥐의 윤부 혈관은 해부학적으로 유사하고13,24 사용된 소작에는 부드러운 작은 팁이 있기 때문에 이 프로토콜은 적응 없이 생쥐의 눈에도 작용할 수 있습니다. - 수술 후 1.5단계에서 설명한 것과 같이 양쪽 눈의 수술 직후 IOP를 확인합니다.
- 안과용 프레드니솔론 아세테이트(1.2mg/mL) 한 방울을 바르고 약 40초 동안 실험용 눈의 앞쪽 표면과 접촉한 상태를 유지한 다음 항생제(옥시테트라사이클린 염산염 30mg/g과 폴리믹신 B 10,000U/g 또는 시프로플록사신 3.5mg/g)의 안과 연고로 교체합니다. 시술 후 통증을 예방하기 위해 트라마돌염산염(1회 투여량, 2mg/kg)을 근육 주사합니다.
- 마취 후 동물이 회복되는 과정을 면밀히 관찰하고, 가급적 가열 패드와 같은 따뜻한 환경이나 적절한 침구가 있는 하우징 케이지 내부에서 회복하십시오. 호흡 패턴에 주의하십시오.
- 비스테로이드성 항염증제(NSAID, 예: 케토롤락 트로메타몰 0.5% 점안액)와 항생제 연고(가급적 수술 직후에 사용하는 것과 동일한 약물)로 구성된 국소 약물로 실험 눈의 임상 추적 관찰을 수행합니다.
참고: 스테로이드성 항염증제 점안액보다는 NSAID를 사용하는 것이 권장되는데, 이는 스테로이드성 항염증제 점안액이 OHT를 유발할 수 있고 설치류의 글루코코르티코이드 유발 녹내장 모델에 정기적으로 적용되기 때문입니다.- 약간의 진정제(케타민: 18.75mg/kg, 자일라진: 1.25mg/kg) 하에서 생리적 일주기 IOP 변동으로 인한 편향을 피하기 위해 하루 중 같은 시간에 우선적으로 IOP를 측정합니다.
- 안구 검사 중에 포도막 탈출증과 관련된 hyphema, 각막 섬유증 또는 공막 얇아짐과 같은 드문 임상 재발을 기록하십시오. 각막 부종, 화학요법, 결막 충혈은 흔하지만 일시적입니다.
- 수술 후 7일경에 완전한 임상적 회복을 알 수 있습니다. 윤부 혈관재생술은 일반적으로 수술 후 첫 이틀 동안 시작되며, 이는 IOP가 기준선으로 점진적으로 복귀할 것으로 예상됩니다.
2. 광모터 응답(OMR) 분석
참고: 이 절차에서는 특정 시스템이 사용되었습니다25.
- 4개의 컴퓨터 모니터를 사각형으로 배열하여 중간에 플랫폼이 있는 경기장을 구분합니다. 모니터에 고정 속도(12도/s) 및 대비(100%)로 플랫폼 주위를 회전하는 수직 방향의 사인파 격자(흑백 줄무늬가 번갈아 가며 있음)가 있는 가상 실린더의 이미지를 표시합니다.
- 플랫폼 위에 비디오 카메라를 배치하여 실험자가 동물의 움직임을 볼 수 있도록 합니다. 사진 조건에서 테스트를 수행하고 각 눈을 개별적으로 평가하기 위해 소프트웨어를 수동/분리 모드로 우선적으로 설정합니다.
- 동물이 플랫폼에서 약 2분 동안 습관을 들이도록 합니다. 자유롭게 움직이는 동물의 눈 사이의 비디오 프레임에 빨간색 십자형 커서를 유지하여 가상 실린더의 중심을 나타냅니다(그림 1G)25).
- 회전하는 격자에 의해 유도된 동물의 머리와 목에 대한 반사적 추적으로 구성된 OMR을 관찰합니다. 사인파 격자의 방향을 각각 시계 방향과 시계 반대 방향으로 회전하여 왼쪽과 오른쪽 시각 경로를 테스트합니다.
- 처음에는 낮은 공간 주파수(0.042 cycles/degree)로 자극을 나타냅니다. 그런 다음 추적 움직임이 더 이상 감지되지 않을 때까지 주파수를 점진적으로 증가시킵니다. 명확한 OMR이 유도되는 가장 높은 공간 주파수는 평가된 눈의 임계값 공간 주파수에 해당합니다.
- 동물이 시험 중 플랫폼에서 떨어지면 즉시 플랫폼으로 돌려보내고 테스트를 재개하십시오.
3. 패턴-망막전전도(PERG) 기록
참고: 망막전도는 신호 처리를 위한 특정 시스템과 파형의 저장 및 분석을 위한 관련 소프트웨어를 사용하여 기록되었습니다.
- 케타민 염산염과 자일라진 염산염(각각 75mg/kg 및 5mg/kg)을 근육 주사하여 동물을 심층 마취합니다. 심부 마취(수술 평면)는 검사 중 비자발적인 근육 움직임 또는 대체 소음원에 의한 인공물의 가능성을 줄입니다. 발가락 꼬집기 반응을 수행하여 적절한 마취를 확인하십시오.
참고: 언급된 마취제는 반응 진폭에 영향을 미치지 않는다(26). 각막에 삽입된 작은 바늘을 활성 전극으로 사용했기 때문에 복강내 마취 대신 근육 내 마취가 선호되는데, 이는 쥐가 부스터 용량(초기 용량의 1/2)을 필요로 하는 경우 재주입이 더 쉽고, 전극 위치를 수정할 가능성이 낮아 전체 실험 동안 더 재현 가능한 기록으로 이어지기 때문입니다. 최대 60분 동안 지속될 수 있습니다. - 프록시메타카인 염산염 0.5% 한 방울로 각막을 국소 마취하고 안과 윤활제로 상대방 눈을 촉촉하게 유지합니다.
- 활성 전극(스테인리스 스틸 바늘 0.25mm × 15mm)을 각막의 측두부에 조심스럽게 삽입합니다. 또한 기준 전극과 접지 전극(스테인리스 스틸 바늘 0.4mm × 37mm)을 동측 측두안각의 피하 조직과 뒷다리 중 하나에 각각 삽입합니다(그림 1I).
- PERG의 경우 자극을 흑백 예약 바둑판으로 설정하고 일정한 평균 휘도(250cd/m2)로 초당 15회 반전으로 번갈아 가며 설정합니다. 대역 통과 필터를 1Hz-100Hz로 설정합니다.
참고: 빠른 반전 자극은 RGC 생체 전기 반응과 가장 관련이 있을 가능성이 높은 파동 성분을 수집하는 안정적이고 재현 가능한 정현파인 정상 상태 PERG를 생성합니다. - 자극 화면에서 20cm 떨어진 곳에 동물을 배치합니다(LCD 모니터 0.58m; 그림 1I)에서 신호 베이스라인을 모니터링하고 수집 시스템의 Analysis 버튼을 눌러 PERG 수집을 시작합니다.
- 절차 중에 동물을 환경 조명(~140lux의 백색광)에 적응하도록 유지하십시오. 여기서는 6개의 서로 다른 공간 주파수(각도당 주기: 0.018, 0.037, 0.073, 0.146, 0.292, 0.585)가 무작위 순서로 표시되었습니다.
알림: 신호 처리에 사용되는 소프트웨어는 자동으로 평균화를 수행합니다. 평균 200-300개의 개별 파동은 노이즈에서 눈에 띄고 파동 진폭을 분석하기에 적합한 것으로 간주되었습니다.
4. 망막 신경절 세포 somas의 정량화
참고: 다음 절차는 뇌 특이적 호메오박스/POU 도메인 단백질 3A(Brn3a)에 대한 항체가 있는 망막 편평산의 면역조직화학적 염색을 기반으로 망막 신경절 체종을 정량화하기 위한 것입니다.
- 실험 동물에게 자궁경부 탈구 안락사를 실시하고, 이산화탄소를 흡입하여 의식을 잃게 한다.
- 안락사 직후에는 실체현미경으로 이빨이 있는 집게와 구부러진 가위를 사용하여 양쪽 눈을 해부합니다.
- 외안근의 원위 부분과 눈 빼돌기는 망막의 지형 방향에 중요한 이정표이므로 구체에 부착된 상태로 유지되도록 조심스럽게 절개합니다(4.5단계에서 설명). 향후 분석을 위해 지구본에 부착된 시신경의 스트레칭을 가능한 한 오래 보관하십시오.
- 적출 후 0.1M 인산염 완충액(PBS)에 포함된 4% 파라포름알데히드(4% PFA)가 함유된 1mL 용액에 눈을 넣고 적절한 화학적 고정을 위해 24시간 동안 유지합니다.
- 망막을 나머지 안구 조직과 분리합니다.
- 해부 현미경 아래에서 안구를 1x PBS로 덮인 페트리 접시에 놓고 적절한 지형 방향을 위해 비강 카벙클, 맥락막 균열 및 소용돌이 정맥의 공막 각인과 같은 중요한 랜드마크에 주의를 기울인다27.
- 톱니가 있는 집게와 구부러진 가위(westcott)를 사용하여 중앙 각막에서 전방을 관통합니다. 안구의 등쪽 사분면을 구분하기 위해 시신경의 공막 구멍을 향해 공막의 상부(등쪽) 측면을 두 번 방사형으로 절단합니다.
- 공막에서 세로 360° 절단을 통해 각막을 나머지 부분과 분리합니다. 수정체와 홍채를 제거하고 위에서 설명한 것과 동일한 공막 방사형 경계를 사용하여 등쪽 망막 사분면을 구분합니다(4.5.2단계).
- 맥락막과 공막에서 망막 조직을 조심스럽게 분리하여 조직 전체의 무작위 열상과 궁극적인 지형적 방향 상실을 방지합니다.
- 섬모체를 망막 ora serrata에서 분리합니다. 구부러진 톱니가 없는 집게와 구부러진 가위(유리체를 당겨 내부 제한막 가까이에서 절개)와 작은 브러시를 사용하여 망막 컵에서 나머지 유리체를 조심스럽게 제거합니다.
참고: 유리체액을 제거하는 것은 강력하고 깨끗한 면역조직화학적 신호를 얻기 위한 중요한 단계입니다.
- 분리된 망막을 1x PBS 1mL가 들어 있는 24웰 배양 플레이트(웰당 망막 1개)에 옮기고 내부 망막이 위를 향하도록 유지합니다.
- 1x PBS(0.3mL)에 희석한 비이온성 계면활성제 0.5%로 10분 동안 3번 세척하여 조직을 투과시킵니다. 그런 다음 비이온성 계면활성제 2%와 1x PBS(차단 용액, 0.25mL)에 포함된 5% 소 혈청 알부민(BSA)을 넣고 실온에서 60분 동안 조직을 부드럽게 흔들어 조직을 유지합니다.
- 단계 4.7 동안, 비이온성 계면활성제 0.5% 및 1x PBS에 5% BSA를 더한 1:200을 희석하여 Brn3a 1차 항체 용액을 제조하고, 4°C에서 보관한다.
- 조직 차단 60분 후 망막을 1차 항체 용액 0.2mL에 넣고 4°C에서 72시간 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다.
- 1x PBS로 조직을 3x 10분 동안 세척한 다음 1x PBS에 5% BSA를 더한 1:750으로 희석한 2차 항체 용액 0.2mL에서 실온에서 2시간 동안 조직을 배양합니다.
- 또한, 형광 핵 염색을 위해 핵 대조염색 용액에서 조직을 10분 동안 배양합니다. 1x PBS(0.3mL)를 3회 반복하여 최종 세척 단계로 면역조직화학을 마무리합니다.
- 두 개의 작은 브러시를 사용하여 유리체 면을 위로 유지하면서 유리 현미경 슬라이드에 망막을 옮깁니다. 등쪽 망막 사분면을 현미경 슬라이드 위로 배치합니다(이전에는 4.5.3단계에서 구분됨). 다른 3개의 사분면(비강, 복부 및 측두)을 구분하기 위해 시신경두를 향해 두 번 더 방사형 절단을 합니다.
알림: 절단 치수는 고정되어 있지 않습니다. 슬라이드에서 망막의 효율적인 평평함을 손상시킬 정도로 너무 짧아서는 안 되며, 시신경 구멍에 도달하여 분리된 망막 사분면을 나머지 조직과 완전히 분리할 수 있도록 너무 길어서는 안 됩니다. - 마지막으로 유리 커버슬립에 0.2mL의 페이드 방지 장착 배지를 바르고 조직 현미경 분석을 위해 평평하게 장착된 망막에 놓습니다. 망막 신경절 세포의 밀도를 추정하려면 40x/1.3 대물렌즈를 사용하여 컨포칼 형광 현미경으로 평면 마운트를 검사하십시오.
- 망막의 각 사분면에 대해 중앙 망막에서 2장(시신경 디스크에서 ~0.9mm), 중간 망막에서 3장(시신경 디스크에서 ~2.0mm), 주변 망막에서 3장(시신경 디스크에서 ~3.7mm) 등 총 8장의 사진을 촬영하여 망막당 총 32장의 사진을 찍습니다. FIJI 소프트웨어를 사용하여 Brn3a 양성 세포의 개수를 세고 평균 세포 밀도를 추정합니다.
5. 시신경 검사
- 안락사 및 안구 적출 후(4.1-4.3단계) 안구 내 부분을 포함하여 시신경 안와내 부분(1-2mm)의 근위 부분을 제거하고 즉시 샘플을 0.2-0.3mL의 냉고정제(0.1M 카코딜산나트륨 완충액(pH 7.4)의 2.5% 글루타르알데히드 용액)이 들어 있는 바이알/튜브에 2시간 동안 넣습니다.
알림: 시신경 처리를 위한 다음 단계는 5.1단계와 동일한 바이알/튜브에서 수행됩니다. - 차가운 0.1M 카코딜레이트 나트륨 완충액으로 재료를 3분 동안 5회 세척합니다. 4°C(0.1-0.2mL)에서 0.1M 나트륨 카코딜레이트 완충액에 희석한 0.8% 페로시아나이드 칼륨 및 5nM 염화칼슘 용액에 1.0% 오스뮴 테트라옥사이드를 넣고 부드럽게 흔들면서 1시간 동안 고정 조직을 사후 처리합니다.
- 시신경 절편을 차가운 0.1M 카코딜레이트 나트륨 완충액으로 5분 동안 3번 세척한 후 차가운 증류수로 1분 동안 3번 세척합니다. 4°C(0.1-0.2mL)에서 염색하기 위해 증류수에 1.0% 우라닐 아세테이트 용액을 넣고 부드럽게 흔들면서 재료를 밤새 보관합니다. 차가운 증류수로 조각을 3번 씻으십시오.
- 등급이 매겨진 아세톤 시리즈(각각 0.5mL)로 조직을 점진적으로 탈수하고 증류수에 다음 희석액을 교체합니다: 2% 얼음처럼 차가운 아세톤에서 7x 15분 배양; 2% 얼음처럼 차가운 아세톤에서 7x 30분 배양; 2 % 얼음처럼 차가운 아세톤에서 7x 50 분 배양; 70 % 얼음처럼 차가운 아세톤에서 2x 7 분 배양; 2% 얼음처럼 차가운 아세톤에서 7분 80회 배양; 2% 얼음처럼 차가운 아세톤에서 7분 90회 배양; 실온(RT)에서 100% 아세톤으로 2x 15분 배양.
- 3 침투 / 매립 단계를 수행하고 후속 용액을 교체하십시오 : 1 파트 에폭시 수지 : 2 파트 아세톤 (총 부피 : 0.5 mL), 12 시간 동안 RT에서; 에폭시 수지 1부: 아세톤 1부(총 부피: 0.5mL), 상온에서 12시간; 에폭시 수지 2부: 아세톤 1부(총 부피: 0.5mL), 상온에서 12시간 동안. 마지막으로 24시간 동안 RT에서 순수 에폭시 수지에 조직을 침투시킵니다.
- 시료 캐리어에서 샘플을 꺼내 매립형 금형으로 옮기고 60°C에서 48시간 동안 중합합니다. 초박편자를 사용하여 시신경 절편(300-400nm)의 횡단 반박형 절편을 절단하고 수집하여 현미경 유리 슬라이드에 옮깁니다. 톨루이딘 블루로 섹션을 염색하고 광학 현미경을 사용하여 100x 배율로 이미지를 만듭니다.
- 초미세 구조 분석의 경우 초박형 단면(70nm)을 수행하고 구리 그리드에 수집한 다음 우라닐 아세테이트와 구연산납으로 염색합니다. 투과 전자 현미경으로 단면을 검사합니다.
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Representative Results
정량적 변수는 평균의 평균 ± 표준 오차(SEM)로 표현됩니다. OHT와 대조군 간의 IOP 역학 비교(그림 1F)를 제외하고, 통계 분석은 양원 분산 분석(two-way ANOVA)을 사용한 후 Sidak의 다중 비교 테스트를 사용하여 수행되었습니다. p-값 < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.
그림 1 은 360° 열에 의한 윤부 혈관의 소실과 수술 종료 시 수술된 눈의 경증에서 중등도의 근육증과 같은 중요한 이정표와 함께 전원 변측신경총 소작(LPC) 모델의 수술 단계를 보여줍니다.
131마리의 쥐를 대상으로 한 이번 연구에서 전원형 변연신경총 소작술(LPC)은 수술 직후 기준선에서 13.0 ± 0.2mmHg에서 22.7 ± 0.4mmHg로 IOP 상승을 유도했습니다. 수술 후 첫날(25.3 ± 0.6 mmHg)에 최대 수술 후 IOP가 관찰되었고,수술 후 6 일째에 점진적으로 기준선 수준으로 복귀했습니다(통계 분석: Holm-Sidak 방법을 사용하여 다중 비교를 위해 보정된 다중 t-검정; 그림 1F). 각막 섬유증 또는 부종은 정확한 IOP 측정을 잠재적으로 손상시킬 수 있는 임상적 재발이었습니다. 첫 번째는 드물게 나타났으며, 3.92%의 동물에게 영향을 미쳤고, 수술 후 추적 관찰 중에 늦게 발견되어 안구 고혈압의 첫 5일을 절약하고23에 기술된 아급성 OHT 프로파일을 보존했다. 반면, 각막 부종은 수술 후 처음 며칠(1-3일)에 나타나는 더 흔한 합병증이었지만 대부분 경미하고 일시적이어서 IOP23에 큰 영향을 미치지 않았습니다.
망막 기능은 각각 광운동 반사 및 패턴 ERG를 사용하여 행동 및 전기 생리학적으로 평가되었습니다(그림 1G-J). 두 파라미터 모두 수술 후 3일째에 안구 고혈압 급성기와 수술 후 30일째에 이차성 퇴행의 두 가지 장애 단계를 보여주었습니다(그림 1H, 그림 J 및 표 1). 그 사이에, 이전에 다른 곳에서 논의된 바와 같이, 기능적 회복의 기간이 감지되었다23.
대조군 동료 시신경과 비교했을 때, 반박형 횡단 시신경 절편의 축삭 수는 수술 후 점진적인 감소를 보였다(3일째: 68.3% ± 0.9%, 7일째: 59.2% ± 2.6%, 14일째: 45.4% ± 2.2%; 30일째: 28.2% ± 3.0%; 양방향 분산 분석: p < 0.0001; 그림 2A). 초구조적으로, 대조군의 시신경은 얇은 신경교세포(glial cell) 돌기와 명백한 축삭 미세소관(axonal microtubules) 및 신경필라멘트(neurofilaments)에 의해 분리된 조밀하게 포장된 수초화 섬유(myelinated fibers)를 보여주었습니다(그림 2B). 대조적으로, OHT 3일 후, 우리는 축삭 다발의 국소 파괴, 몇 개의 퇴화된 섬유, 신경교세포 과정에서의 세포질 진공, 신경교세포핵의 응축된 염색질을 발견했습니다. OHT 유도 7일 후, 퇴행성 축삭 섬유, 비후성 신경교 세포 과정, 개별 축삭 섬유의 팽창 및 공극이 증가했습니다. 14일째 되는 날, 가장 두드러진 변화 중 하나는 시신경 섬유의 더 큰 분열이었는데, 이는 축삭돌기 사이의 신경교세포 돌기의 침범과 관련이 있습니다. 필라멘트 다발은 이러한 과정과 어두운 퇴화 섬유를 채웠고, 미엘린 분해는 분리되고 진공화된 라멜라와 관련된 더 흔했습니다(그림 2B).
Brn3a+ 프로파일의 밀도는 주로 등쪽 및 측두엽 망막 사분면에서 시간이 지남에 따라 감소했으며(그림 2C), 30일 후 각각 32.4%± 9.6%, 35.7% ± 9.1%로 감소했습니다(그림 2D-G 및 표 2).
그림 1: 변연 혈관신경총의 열 소작 및 생체 내 망막 기능에 대한 결과. (A) 쥐의 IOP를 측정하는 대체 방법: 리바운드 안압계(상부) 및 압평 안압계(하부). (B-E) 수술; 화살촉: Limbal vascular plexus; 화살표: 안구의 전방 표면을 노출시키고 변부 혈관에 대한 외과적 평가를 최적화하는 데 사용되는 곡선형 겸자; 해시: 저온 안과 소작의 둥근 끝; 별표: 소작 표시. 척도 막대: 2mm. (D)에 삽입된 것은 소작할 윤부 혈관을 더 높은 배율로 보여줍니다. (F) OHT(적색) 및 대조군(검은색) 눈(n = 131)에서 IOP 측정의 시간 경과. 수직 아래쪽 화살표: LPC 수술. * = p < 0.05 (G) 광운동 응답 분석을 위한 경기장으로, 사각형으로 배열된 4개의 컴퓨터 모니터로 구성되어 있으며 중간에 플랫폼이 있습니다. 모니터는 일정한 회전 속도와 가변 공간 주파수로 동물 주위를 움직이는 수직, 번갈아 가며 흑백 줄무늬로 구성된 가상 실린더의 이미지를 표시합니다. 빨간색 십자선은 가상 원통의 중심에 해당합니다. (H) 광운동 반응. 수술 추적 관찰 시 OHT 단계(0-5일)와 2차 변성 단계(6-30일)의 두 가지 뚜렷한 단계가 구분됩니다. = p < 0.0001입니다. (I) 패턴-ERG(PERG) 획득을 위한 전극 및 동물 위치 지정: 각막의 측두엽 주변부의 활성 전극과 동측 측두엽 및 뒷다리 중 하나의 피하 조직으로의 기준 전극 및 접지 전극. 동물은 자극 스크린에서 20cm 떨어진 곳에 위치합니다. (J) 공간 주파수가 다른 자극에 대한 PERG 진폭. 광운동 반응과 유사하게, PERG 평가는 수술 후 반응의 두 가지 뚜렷한 단계를 보여줍니다: 수술 후 3일째에 안구 고혈압, 7일과 14일에 회복, 통계적으로 여전히 순진한 반응보다 낮음, 수술 후 30일째에 감소. c/d = 도당 사이클. 순진한 그룹: 이전의 실험적 조작에 노출되지 않은 동물의 눈. (H)와 (J)는 SEM± 평균과 (H)의 개별 반복실험을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 저온 안과 소작술을 사용한 변연 혈관신경총 소작술(LPC) 후 망막 및 시신경의 구조적 평가. (A) 축삭돌기는 OHT (n = 3) 이후 뚜렷한 시간에 계산됩니다. = p = 0.0005, **** = p < 0.0001. (B) OHT 후 시신경 변성의 전자 현미경 사진. 왼쪽 이미지는 대조 시신경을 보여주며, 다음 이미지는 OHT 3일, 7일, 14일 후의 점진적인 퇴행을 보여줍니다. 화살촉: 정상적인 수초화 섬유; 가는 화살표: 퇴화된 섬유; 별표: 세포질 액포; 해시 : 신경 교세포 과정; 및 Nu : 신경교 세포핵. (C) Brn3a(빨간색) 및 TO-PRO3 표지된 핵(파란색)에 대한 항체로 표지된 망막 신경절 세포의 대표 계수 분야의 현미경 사진; 눈금 막대: 50μm. (D-G) 수술 3-30일 후 망막의 4사분면에 있는 평균 Brn3a+ 세포 밀도 분포. 그래프는 시술 후 시간당 3-11마리의 동물에 대한 망막 신경절 밀도의 개별 평균을 보여줍니다. * = p < 0.05; ** = p < 0.01; = p < 0.001; = p < 0.0001입니다. 정량적 데이터는 SEM± 평균입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: PERG 데이터의 통계 분석. 이원 분산 분석(Two-way ANOVA)에 이어 Sidak의 다중 비교 검정을 수행합니다. 0.05 미만의 p-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다. c/d = 도당 사이클. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: LPC 후 망막 신경절 세포의 국소 손실. SEM: 평균의 표준 오차. 컨트롤: 동료의 눈. 0.05 미만의 p-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다(*). 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
Limbal plexus cauterization(LPC)은 결막 또는 장부 절제가 필요하지 않은 쉽게 접근할 수 있는 혈관 구조를 표적으로 한다는 장점이 있는 새로운 섬유주 후 모델입니다17,28. 맥락막 정맥 배액에 대한 외과적 장애를 기반으로 하는 유명한 OHT 모델인 와류 정맥 소작 모델과 달리 LPC 모델에서는 변부 정맥이 수액 유출의 상류에 위치하기 때문에 정맥 울혈이 IOP 상승에 영향을 미치지 않을 것으로 예상됩니다. 또한 기술적으로 배우기 쉽고 비용이 저렴하여 대부분 저온 열 소작이 필요합니다. 또한, OHT 유도 및 완전한 임상 회복(이전에 보고된 바와 같이 > 90%)23의 고유한 비율과 관련이 있으며, 이는 실험에 필요한 동물의 수를 줄이고 전기 생리학적 및 행동 분석을 모두 가능하게 합니다. 마지막으로, 녹내장 변성은 수술 후 비교적 짧은 시간 내에 망막 신경절 층과 시신경 모두에 존재하므로 단기 또는 중기 실험 설계가 가능하다23. 전체 원형 변연 혈관 소작이 개별 망막층에 미치는 영향을 추가로 설명하기 위해 향후 연구가 필요합니다.
수술 프로토콜의 중요한 단계는 다음과 같습니다: (1) 소작 팁은 혈관 축과 평행한 공막 림부에 부드럽게 닿아야 합니다. (2) 각막 조직은 소작 중뿐만 아니라 동물 조작 중에도 보존되어야 합니다. 정기적으로 점안액을 점안하고 면봉으로 눈 표면에서 과도한 용액을 제거합니다(액체를 제거하는 동안 면봉을 각막 표면에 문지르면 각막 상피 찰과상 및 수술 후 합병증이 발생할 수 있으므로 주의하십시오). (3) 연속적인 소작 표시의 전체 원을 시각화해야 합니다. (4) 수술 후5일째 까지는 비스테로이드성 소염제와 항생제 연고를 사용한 수술 후 임상적 추적관찰을 소홀히 하지 않는다.
기술된 모델에서 볼 수 있는 아급성 IOP 상승은 개방각 녹내장의 압력 역학과는 다르지만, 급성각 폐쇄각 녹내장, 신생혈관 녹내장 또는 상피 정맥압이 상승된 여러 유형의 섬유주후 녹내장과 유사하다29. 개방각 녹내장은 만성 OHT와 서서히 진행되는 망막 신경절 세포 변성을 특징으로 하는 가장 흔한 표현형이기 때문에 이 방법의 주요 한계입니다. 그럼에도 불구하고, IOP의 점진적 정상화와 지속적인 망막 신경절 변성의 연관성은 동일한 동물 모델에서 안구 고혈압과 녹내장의 발병 및 진행을 연결하는 생물학적 메커니즘뿐만 아니라 개방각 녹내장 사례에서 주로 관찰되는 이차적 퇴행성 과정을 모두 연구할 수 있는 독특한 기회를 제공합니다. 따라서 이 모델은 단기 또는 중기 실험 설계를 통해 이 현상을 더 잘 설명할 수 있는 기회를 나타내며, 궁극적으로 최상의 IOP 제어 치료에도 불구하고 여전히 시력을 잃는 환자에게 도움이 되는 압력 독립적 신경 보호 요법을 개발할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 실험실 기술자 José를 인정합니다. 닐손 도스 산토스, 다이안느 만다리노 토레스, 호세 프란시스코 티부르시오, 질도 브리토 데 수자, 루치아노 카발칸테 페레이라. 이 연구는 FAPERJ, CNPq 및 CAPES의 자금 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Isofar | 201 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Active electrode for electroretinography | Hansol Medical Co | - | Stainless steel needle 0.25 mm × 15 mm |
| Anestalcon | Novartis Biociências S/A | MS-1.0068.1087 | Proxymetacaine hydrochloride 0.5% |
| Calcium chloride | Vetec | 560 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Cautery Low Temp Fine Tip 10/bx | Bovie Medical Corporation | AA00 | Low-temperature ophthalmic cautery |
| Cetamin | Syntec do Brasil Ltda | 000200-3-000003 | Ketamine hydrochloride 10% |
| DAKO | Dako North America | S3023 | Antifade mounting medium |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 28718-90-3 | diamidino-2-phenylindole; blue fluorescent nuclear counterstain; emission at 452±3 nm |
| Ecofilm | Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda | MS-1.0298.0487 | Carmellose sodium 0.5% |
| EPON Resin | Polysciences, Inc. | - | Epoxy resin used for electron microscopy, composed of a mixture of four reagents: Poly/Bed 812 Resin (CAT#08791); DDSA - Dodecenylsuccinic Anhydride (CAT#00563); NMA - Nadic Methyl Anhydride (CAT#00886); DMP-30 - 2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol (CAT#00553) |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16110 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Hyabak | União Química Farmacêutica Nacional S/A | MS-8042140002 | Sodium hyaluronate 0.15% |
| Icare Tonolab | Icare Finland Oy | TV02 (model number) | Rebound handheld tonometer |
| IgG donkey anti-mouse antibody + Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A31570 | Secondary antibody solution |
| LCD monitor 23 inches | Samsung Electronics Co. Ltd. | S23B550 | Model LS23B550, for electroretinogram recording |
| LSM 510 Meta | Carl Zeiss | - | Confocal epifluorescence microscope |
| Maxiflox | Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda | MS-1.0298.0489 | Ciprofloxacin 3.5 mg/g |
| MEB-9400K | Nihon Kohden Corporation | - | System for electroretinogram recording |
| monoclonal IgG1 mouse anti-Brn3a | MilliporeSigma | MAB-1585 | Brn3a primary antibody solution |
| Neuropack Manager v08.33 | Nihon Kohden Corporation | - | Software for electroretinogram signal processing |
| Optomotry | CerebralMechanics | - | System for optomotor response analysis |
| Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19100 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Potassium ferrocyanide | Electron Microscopy Sciences | 20150 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Reference and ground electrodes for electroretinography | Chalgren Enterprises | 110-63 | Stainless steel needles 0.4 mm × 37 mm |
| Sodium cacodylate buffer | Electron Microscopy Sciences | 12300 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Ster MD | União Química Farmacêutica Nacional S/A | MS-1.0497.1287 | Prednisolone acetate 0.12% |
| Terolac | Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda | MS-1.0497.1286 | Ketorolac trometamol 0.5% |
| Terramicina | Laboratórios Pfizer Ltda | MS-1.0216.0024 | Oxytetracycline hydrochloride 30 mg/g + polymyxin B 10,000 U/g |
| Tono-Pen XL | Reichert Technologies | 230635 | Digital applanation handheld tonometer |
| TO-PRO-3 | Thermo Fisher Scientific | T3605 | Far red-fluorescent nuclear counterstain; emission at 661 nm |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 | Non-ionic surfactant |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Xilazin | Syntec do Brasil Ltda | 7899 | Xylazine hydrochloride 2% |
| Carl Zeiss | - | Stereo microscope for surgery and retinal dissection |
References
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