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Biology

अलगाव और कवक के लिए मिट्टी जैव विविधता से स्क्रीनिंग अड़ियल सामग्री के क्षरण में शामिल

Published: May 16, 2022 doi: 10.3791/63445
Automatic Translation
1, 1, 1
1Laboratory of Mycology, Department of Earth and Environmental Sciences, University of Pavia

Summary

यहां, हम मिट्टी की जैव विविधता की जांच के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ताकि अड़ियल सामग्री के क्षरण में शामिल कवक उपभेदों की तलाश की जा सके। सबसे पहले, ह्यूमिक एसिड या लिग्नोसेल्युलोज पर बढ़ने में सक्षम कवक उपभेदों को अलग किया जाता है। उनकी गतिविधि तब एंजाइमेटिक assays और हाइड्रोकार्बन और प्लास्टिक जैसे प्रदूषकों दोनों में परीक्षण किया जाता है।

Abstract

पर्यावरण प्रदूषण एक बढ़ती हुई समस्या है, और बायोरेमेडिएशन प्रक्रिया में शामिल कवक की पहचान करना एक आवश्यक कार्य है। मिट्टी माइक्रोबियल जीवन की एक अविश्वसनीय विविधता की मेजबानी करती है और इन बायोरेमेडिएटिव कवक का एक अच्छा स्रोत हो सकती है। इस काम का उद्देश्य विभिन्न स्क्रीनिंग परीक्षणों का उपयोग करके बायोरेमेडिएशन क्षमता के साथ मिट्टी कवक की खोज करना है। खनिज संस्कृति मीडिया एकमात्र कार्बन स्रोत के रूप में अड़ियल पदार्थों के साथ पूरक विकास परीक्षणों के रूप में इस्तेमाल किया गया था। सबसे पहले, मिट्टी के dilutions humic एसिड या lignocellulose के साथ संशोधित खनिज माध्यम के साथ पेट्री व्यंजनपर मढ़वाया गया था। बढ़ती कवक कॉलोनियों को अलग-थलग कर दिया गया था और विभिन्न सब्सट्रेट्स पर परीक्षण किया गया था, जैसे हाइड्रोकार्बन के जटिल मिश्रण (पेट्रोलेटम और इस्तेमाल किए गए मोटर तेल) और विभिन्न प्लास्टिक पॉलिमर (पीईटी, पीपी, पीएस, पीयूआर, पीवीसी) के पाउडर। गुणात्मक एंजाइमेटिक परीक्षणों को एस्टेरेस, लैक्केस, पेरोक्सीडेस और प्रोटीज के उत्पादन की जांच करने के लिए विकास परीक्षणों से जोड़ा गया था। ये एंजाइम अड़ियल सामग्री की मुख्य गिरावट प्रक्रियाओं में शामिल हैं, और जांच किए गए कवक उपभेदों द्वारा उनके संरचनात्मक स्राव में बायोरेमेडिएशन के लिए शोषण करने की क्षमता हो सकती है। 100 से अधिक उपभेदों को अलग किया गया और परीक्षण किया गया, और अच्छी बायोरेमेडिएशन क्षमता वाले कई आइसोलेट्स पाए गए। अंत में, वर्णित स्क्रीनिंग परीक्षण मिट्टी से बायोरेमेडिएशन क्षमता के साथ कवक उपभेदों की पहचान करने के लिए एक आसान और कम लागत वाली विधि है। इसके अलावा, आवश्यकताओं के अनुसार, न्यूनतम संस्कृति मीडिया में अन्य अड़ियल पदार्थों को जोड़कर, विभिन्न प्रदूषकों के लिए स्क्रीनिंग परीक्षणों को दर्जी करना संभव है।

Introduction

मिट्टी पृथ्वी पर जीवन का एक मौलिक घटक है और कई पारिस्थितिक तंत्रों का आधार है। मिट्टी में खनिजों, कार्बनिक पदार्थों और सूक्ष्मजीवों को एक प्रणाली के रूप में माना जा सकता है, उनके बीच होने वाले घनिष्ठ संबंधों और बातचीत के साथ। इन यौगिकों की बातचीत स्थलीय प्रक्रियाओं, पर्यावरण की गुणवत्ता और पारिस्थितिकी तंत्र के स्वास्थ्य पर एक महत्वपूर्ण प्रभावडालती है। मृदा प्रदूषण दुनिया भर में गंभीर पर्यावरणीय समस्याएं पैदा करता है। कीटनाशकों, पेट्रोलियम उत्पादों, प्लास्टिक और अन्य रसायनों जैसे अड़ियल और विषाक्त पदार्थों के अंधाधुंध, दीर्घकालिक और अत्यधिक अनुप्रयोग का मिट्टी की पारिस्थितिकी पर गंभीर प्रभाव पड़ता है और परिणामस्वरूप, मिट्टी माइक्रोबायोटा को बदल सकता है। मिट्टी में माइक्रोबियल समुदाय विभिन्न शारीरिक राज्यों में जीवों की एक विस्तृत श्रृंखला से बने होते हैं, जिनमें से अधिकांश बैक्टीरिया और कवक होते हैं। मिट्टी में कई संदूषकों में मध्यम से दीर्घकालिक स्थिरता होती है, और उनकी दृढ़ता अनुकूली तंत्र के विकास का कारण बन सकती है जो सूक्ष्मजीवों को पोषक तत्वों के रूप में अड़ियल पदार्थों का उपयोग करने की अनुमति देती है 2,3। इसलिए, इन सूक्ष्मजीवों को बायोरेमेडिएशन तकनीकों के लिए माना जा सकता है।

बायोरेमेडिएशन कम विषाक्त या गैर-विषैले यौगिकों में अपशिष्ट के क्षरण या परिवर्तन के लिए सूक्ष्मजीवों और उनके एंजाइमों का उपयोग करके प्रदूषण के प्रभावों को कम करने की कोशिश करता है। आर्किया, बैक्टीरिया, शैवाल और कवक की विभिन्न प्रजातियों में यह बायोरेमेडिएशन क्षमताहै। उनके विशेष बायोडिग्रेडेटिव कार्यों के परिणामस्वरूप, कवक विशेष रूप से बायोरेमेडिएशन के लिए होनहार जीव हैं। वे अपने हाइफ़ल नेटवर्क का उपयोग करके विभिन्न सब्सट्रेट्स पर हमला कर सकते हैं, जिससे उन्हें अन्य सूक्ष्मजीवों की तुलना में मिट्टी मैट्रिक्स को अधिक कुशलता से भेदने में सक्षम बनाया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, वे दुर्गम इंटरस्टिस तक पहुंच सकते हैं जहां संदूषकों को5 को हटाना मुश्किल है, और वे कम नमी के स्तर6 से भी बच सकते हैं। इसके अलावा, कवक अनिर्दिष्ट एंजाइमों के विभिन्न कैसेटों को संश्लेषित करते हैं, आमतौर पर सेल्यूलोज, लिग्निन और ह्यूमिक एसिड जैसे प्राकृतिक अड़ियल पदार्थों को नीचा दिखाने के लिए। जिन लोगों के पास लक्ष्य सब्सट्रेट की कमी है, वे हाइड्रोकार्बन, प्लास्टिक और कीटनाशकों 7,8,9,10 जैसे अड़ियल प्रदूषकों की एक विस्तृत श्रृंखला के क्षरण में शामिल हो सकते हैं। इसलिए, हालांकि कई कवक प्रजातियों को पहले से ही बायोरेमेडिएशन एजेंटों के रूप में रिपोर्ट किया गया है, लेकिन उन प्रजातियों की खोज में रुचि बढ़ रही है जो अभी तक अड़ियल दूषित पदार्थों के बायोरेमेडिएशन के लिए उम्मीदवारों का चयन करने के लिए अध्ययन नहीं किए गए हैं। जिन प्रजातियों को पहले से ही बायोरेमेडिएशन गुणों के लिए जाना जाता है, वे फाइला एस्कोमाइकोटा 11,12,13, बेसिडिओमाइकोटा 14,15 और म्यूकोरोमिकोटा से संबंधित हैं। उदाहरण के लिए, जेनेरा पेनिसिलियम और एस्परगिलस को एलिफैटिक हाइड्रोकार्बन 13, विभिन्न प्लास्टिक पॉलिमर16,17,18, भारी धातुओं 19, और रंजक20 के क्षरण में शामिल होने के लिए अच्छी तरह से जाना जाता है। इसी तरह, बेसिडियोमाइसेट्स कवक पर किए गए अध्ययन, जैसे कि फेनेरोकोटेटे क्रिसोस्पोरियम और ट्रैमेट्स वर्सीकोलर, ने सुगंधित हाइड्रोकार्बन13 और प्लास्टिक21 जैसे अड़ियल पदार्थों के ऑक्सीकरण में उनकी भागीदारी का खुलासा किया है। बायोडिग्रेडेशन प्रक्रियाओं में शामिल कवक का एक और उदाहरण zygomycetes Rhizopus spp., Mucor spp., और Cunninghamella spp.22,23 हैं। विशेष रूप से, कनिंघमेला सुगंधित हाइड्रोकार्बन को ऑक्सीडेज करने में सक्षम है और इसे ज़ेनोबायोटिक्स13 की एक विस्तृत श्रृंखला से उत्पादों के विषहरण का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल जीव माना जाता है।

वहाँ कई कवक एंजाइमों recalcitrant सामग्री24,25, जैसे esterase, laccase, पेरोक्सीडेज, और प्रोटीज के प्रमुख degradative प्रक्रियाओं में शामिल हैं। Laccases तांबे युक्त ऑक्सीडेज सेल में उत्पादित और बाद में स्रावित कर रहे हैं, कि phenolic और सुगंधित यौगिकों की एक किस्म के ऑक्सीकरण की अनुमति देते हैं. वे ऑर्थो और पैरा डाइफेनोल्स, अमीनो समूह-युक्त फिनोल, लिग्निन और ऐरिल समूह-युक्त डायमाइन्स26 को नीचा दिखा सकते हैं। पेरोक्सीडेस लिग्निन और अन्य सुगंधित यौगिकों को नीचा दिखाने के लिए मध्यस्थ के रूप में हाइड्रोजन पेरोक्साइड का उपयोग करते हैं। कई अलग-अलग पेरोक्सीडेस हैं, लेकिन विषाक्त पदार्थों को नीचा दिखाने की सबसे बड़ी क्षमता वाले लोग लिग्निन पेरोक्सीडेज और मैंगनीज पेरोक्सीडेज27 हैं।

एस्टेरेस और प्रोटीज अतिरिक्त या एक्टो-सेलुलर एंजाइमों के समूह से संबंधित हैं, जो अपने मूल कोशिकाओं के बाहर कार्य करते हैं लेकिन अभी भी उनके लिए बाध्य हैं। ये एंजाइम छोटे लोगों में बड़े अड़ियल अणुओं के हाइड्रोलिसिस को उत्प्रेरित कर सकते हैं। उनकी कम सब्सट्रेट विशिष्टता के कारण, ये एंजाइम विभिन्न प्रदूषकों के बायोरेमेडिएशन में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं, जैसे कि कपड़ा रंजक, लुगदी और कागज उद्योगों से जारी बहिस्त्राव और चमड़े की कमाना, पेट्रोलियम उत्पाद, प्लास्टिक और कीटनाशक 28,29,30।

बायोरेमेडिएटिव फंगल उपभेदों के लिए चयन करने के लिए कई स्क्रीनिंग विधियों को पहले ही प्रकाशित किया जा चुका है। उदाहरण के लिए, पुआल-आधारित अगर माध्यम का उपयोग पॉलीसाइक्लिक एरोमैटिक हाइड्रोकार्बन (पीएएच) गिरावट31 में उच्च क्षमता के साथ सफेद-सड़ांध कवक के लिए स्क्रीन करने के लिए किया गया है; और सड़ने वाली लकड़ी के छोटे टुकड़ों को माल्ट निकालने आगर (एमईए) पर रखा गया है ताकि लकड़ी-सड़ने वाले कवक32 को अलग किया जा सके। हालांकि, पहले से ही प्रस्तावित किए गए अधिकांश तरीके रुचि की अपनी गतिविधि के लिए बहुत विशिष्ट कवक का चयन करते हैं। यह शोध कार्रवाई की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ मिट्टी कवक का चयन करने के लिए एक व्यापक दृष्टिकोण का प्रस्ताव करता है। विधि ह्यूमिक एसिड या लिग्नोसेल्यूलोज के साथ संशोधित एक माध्यम पर मिट्टी के नमूनों के सीरियल dilutions के प्रारंभिक चढ़ाना पर निर्भर करता है जो एंटीबायोटिक दवाओं के साथ मिश्रित होता है ताकि इन प्राकृतिक अड़ियल पदार्थों को नीचा दिखाने की क्षमता के साथ कवक का चयन किया जा सके। ह्यूमिक एसिड और लिग्नोसेल्युलोज, वास्तव में, ऐसे पदार्थ हैं जो बायोडिग्रेडेशन के लिए बेहद प्रतिरोधी हैं क्योंकि उनके पास बहुत जटिल आणविक संरचनाएं हैं, और यह उन्हें परीक्षण किए गए कवक33,34 की डिग्रेडेटिव क्षमता के उत्कृष्ट संकेतक होने की अनुमति देता है। इसके बाद, पहले परीक्षणों में चुने गए कवक को उन लोगों की पहचान करने के लिए जांच की जाती है, जिनके पास पेट्रोलेटम, उपयोग किए गए इंजन तेल और प्लास्टिक जैसे विशिष्ट प्रदूषकों को नीचा दिखाने की क्षमता होती है। अंत में, गुणात्मक एंजाइमेटिक परीक्षण कवक उपभेदों का पता लगाने के लिए किए जाते हैं जो अड़ियल पदार्थों की बायोडिग्रेडेशन प्रक्रियाओं में शामिल एंजाइमों का उत्पादन करने में सक्षम होते हैं। इस उद्देश्य के लिए, प्रोटीज और एस्टेरेस परीक्षण आयोजित किए जाते हैं, जबकि गैलिक एसिड और गुआकोल का उपयोग लैक्केस और अन्य लिग्निनोलिटिक एंजाइम उत्पादन35,36 के संकेतकों के रूप में किया जाता है। इन सब्सट्रेट्स का उपयोग इसलिए किया जाता है क्योंकि कवक की क्षमता के बीच एक मजबूत सहसंबंध पाया गया है ताकि उन्हें अपने भूरे रंग के रूप में ऑक्सीकरण किया जा सके और लिग्निनोलिटिक क्षमता 37,38,39 के कब्जे के बीच।

इन प्रोटोकॉल के माध्यम से, उच्च अवक्रमक क्षमता और मिट्टी के नमूनों से सीधे कार्रवाई के एक व्यापक स्पेक्ट्रम के साथ कवक उपभेदों को अलग करना संभव है। इन कवक उपभेदों का अलगाव बायोरेमेडिएशन उद्देश्यों के लिए नए उम्मीदवारों को खोजने में मदद कर सकता है।

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Protocol

1. कवक उपभेदों का चयन मिट्टी से अड़ियल सामग्री को नीचा दिखाने में सक्षम

  1. एंटीबायोटिक समाधान की तैयारी।
    1. पेनिसिलिन (50 मिलीग्राम / एल), स्ट्रेप्टोमाइसिन (40 मिलीग्राम / एल), क्लोरटेट्रासाइक्लिन (40 मिलीग्राम / एल), नियोमाइसिन (100 मिलीग्राम / एल), और क्लोराम्फेनिकोल (100 मिलीग्राम / एल) को विआयनीकृत बाँझ पानी के 250 मिलीलीटर में डालें।
    2. एंटीबायोटिक समाधान में क्लोरैम्फेनिकोल जोड़ने से पहले, इसे ≥99% इथेनॉल के 3 मिलीलीटर में भंग कर दें।
    3. एंटीबायोटिक समाधान को 10 मिनट के लिए समाधान के अंदर एक चुंबकीय सरगर्मी बार के साथ एक चुंबकीय हलचल (कोई गर्मी नहीं) पर रखें। इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. विकास मीडिया की तैयारी।
    1. वाणिज्यिक ह्यूमिक एसिड के 1 ग्राम, बुशनेल-हास शोरबा (बीएच) के 3.26 ग्राम, और 15 ग्राम आगर को विआयनीकृत पानी के 1 एल में रखें और इसे 121 डिग्री सेल्सियस (ह्यूमिक एसिड आगर) पर 20 मिनट के लिए आटोक्लेव करें।
    2. प्लेट ह्यूमिक एसिड आगर एक लैमिनर प्रवाह कैबिनेट के तहत पेट्री व्यंजन में.
    3. लिग्नोसेल्यूलोज के 4 ग्राम, बीएच के 3.26 ग्राम, और 15 ग्राम आगर को विआयनीकृत पानी के 1 लीटर में डालें और इसे 121 डिग्री सेल्सियस (लिग्नोसेल्युलोज अगर) पर 20 मिनट के लिए आटोक्लेव करें।
    4. एक लैमिनर प्रवाह कैबिनेट के तहत पेट्री व्यंजनों में लिग्नोसेल्युलोज आगर प्लेट।
    5. एक लैमिनर प्रवाह कैबिनेट के तहत, पेट्री व्यंजनों में मीडिया के जमने के बाद, इसे निष्फल करने के लिए 0.2 μm फिल्टर के साथ एक बाँझ सिरिंज का उपयोग करके तैयार प्लेटों पर एंटीबायोटिक समाधान के 1 मिलीलीटर को स्थानांतरित करें।
    6. एक बाँझ डिस्पोजेबल एल-आकार के सेल स्प्रेडर का उपयोग करके प्लेट सतहों पर समान रूप से एंटीबायोटिक समाधान वितरित करें और इसे लैमिनर प्रवाह कैबिनेट के तहत हवा से सूखने दें।
    7. माल्ट निकालने शोरबा और आगर के 15 ग्राम के 20 ग्राम विआयनीकृत पानी के 1 एल में रखो और इसे 121 डिग्री सेल्सियस (माल्ट निकालने आगर - MEA) पर 20 मिनट के लिए आटोक्लेव करें।
    8. एक लैमिनर प्रवाह कैबिनेट के तहत पेट्री व्यंजन में एमईए प्लेट.
  3. मिट्टी के नमूने और मिट्टी dilutions.
    1. 10 सेमी की गहराई पर ब्याज की मिट्टी का नमूना लें, ऊपरी परत से किसी भी पौधे, घास और मृत पत्तियों को हटा दें, और इसे बाँझ पॉलीथीन बैग में डालें।
    2. प्रयोगशाला तक पहुंचने के बाद, 2 मिमी जाल का उपयोग करके मिट्टी को छलनी करें, किसी भी जड़ों और पौधे के मलबे को हटा दें।
    3. यदि डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के साथ तुरंत आगे बढ़ना संभव नहीं है, तो छलनी मिट्टी के नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें।
    4. एक लैमिनर फ्लो कैबिनेट के तहत काम करते हुए, छलनी मिट्टी के 1 ग्राम को एक बाँझ 15 मिलीलीटर ट्यूब में 10 मिलीलीटर बाँझ विआयनीकृत पानी (1 x 10-1 कमजोर पड़ने) के साथ रखा गया। ट्यूब को क्षैतिज रूप से 30 मिनट के लिए हिलाएं।
    5. एक लैमिनर फ्लो कैबिनेट के तहत, निलंबन बसने से पहले, एक बाँझ पिपेट के साथ 1 x 10-1 कमजोर पड़ने का 1 एमएल लें और इसे 9 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी खाली (1 x 10-2 कमजोर पड़ने) में स्थानांतरित करें। इसे अच्छी तरह से भंवर करें।
    6. निलंबन से पहले, एक बाँझ पिपेट के साथ 1 x 10-2 कमजोर पड़ने का 1 एमएल लें और इसे 9 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी के खाली (1 x 10-3 कमजोर पड़ने) में स्थानांतरित करें। इसे अच्छी तरह से भंवर करें।
  4. चयनात्मक मीडिया पर मिट्टी dilutions चढ़ाना.
    1. एक लैमिनर प्रवाह कैबिनेट के तहत काम करते हुए, एक बाँझ बिंदु के साथ एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करके 1 x 10-3 कमजोर पड़ने के 100 μL एकत्र करें और इसे ह्यूमिक आगर पेट्री डिश पर स्थानांतरित करें। कम से कम 4 या 5 पेट्री व्यंजनों के लिए ऐसा करें।
    2. एक बाँझ डिस्पोजेबल एल के आकार के सेल स्प्रेडर का उपयोग करके पेट्री डिश सतह पर समान रूप से कमजोर पड़ने को वितरित करें।
    3. इसे लैमिनर फ्लो कैबिनेट के तहत 10-15 मिनट के लिए हवा से सूखने दें।
    4. चरण 1.4.1.-1.4.3 दोहराएँ। लिग्नोसेल्युलोज पेट्री व्यंजनों का उपयोग करना।
    5. अधिकतम 15 दिनों के लिए अंधेरे में 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  5. चयनात्मक मीडिया से विकास मीडिया तक उगाए गए कवक उपनिवेशों का अलगाव।
    1. तैयारी के 3 दिनों के बाद से शुरू, अधिकतम 15 दिनों के लिए किसी भी फंगल कॉलोनी विकास के लिए दैनिक रूप से तैयार चयनात्मक मीडिया पेट्री व्यंजनों की जांच करें।
    2. समानता के लिए मौजूद सभी कवक कॉलोनियों की जांच करें। यदि आवश्यक हो, तो प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत देखी जाने वाली स्लाइड तैयार करें।
      नोट: उद्देश्य कवक उपनिवेशों की उच्चतम संख्या को अलग करना है, लेकिन विभिन्न प्लेटों से एक ही कवक तनाव को हमेशा अलग करने से बचना आवश्यक है, इसलिए यह जांच बहुत महत्वपूर्ण है। विभिन्न मैक्रो और माइक्रोमॉर्फोलॉजी के साथ उपनिवेशों की तलाश करें।
    3. एक लैमिनर फ्लो कैबिनेट के तहत या एक बुनसेन बर्नर पर, धीरे-धीरे कॉलोनी से माइसेलियम के एक छोटे से हिस्से को एक बाँझ इनोक्यूलेशन सुई के साथ हटाकर और इसे एक नए एमईए पेट्री डिश में स्थानांतरित करके प्रत्येक चुने हुए फंगल तनाव को अलग करें।
      नोट: इस चरण में, नाजुक और सटीक होना बहुत महत्वपूर्ण है क्योंकि मूल पेट्री डिश में मौजूद अन्य कवक उपनिवेशों से संदूषण का उच्च जोखिम है। यदि संक्रमित एमईए प्लेट पर एक से अधिक फंगल स्ट्रेन बढ़ता है, तो चरण 1.5.3 को दोहराएं।
    4. 7 दिनों के लिए अंधेरे में 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। ये कवक उपभेदों को विशिष्ट अड़ियल पदार्थों पर आगे परीक्षण किया जा करने के लिए कर रहे हैं।

2. अड़ियल पदार्थों पर विकास परीक्षण

  1. Petrolatum पर विकास परीक्षण.
    1. 50 एमएल शीशियों में 20 मिलीलीटर तरल बीएच (बीएच के 3.26 ग्राम / एल) को स्थानांतरित करें और 20 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर ऑटोक्लेविंग करके उन्हें निष्फल करें।
    2. 15 मिलीलीटर कांच की शीशियों में विआयनीकृत पानी के 7 मिलीलीटर स्थानांतरित करें और प्रत्येक शीशी में टूटे हुए ग्लास कवरलिप्स के कुछ टुकड़े जोड़ें।
    3. 20 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर ऑटोक्लेविंग करके उन्हें निष्फल करें।
    4. लैमिनर फ्लो कैबिनेट के तहत, एक बाँझ पिपेट का उपयोग करके प्रत्येक 50 एमएल बीएच शीशी में 1 एमएल पेट्रोलेटम जोड़ें। नकारात्मक नियंत्रण के रूप में केवल बीएच के साथ कुछ शीशियों को रखें।
    5. लैमिनर फ्लो कैबिनेट के तहत, चुने हुए फंगल उपभेदों (चरण 1.5.3 पर तैयार) के साथ एमईए प्लेटों से माध्यम की सतह पर माइसेलियम को हटा दें और एक बाँझ सुई का उपयोग करके और इसे टूटे हुए कवरलिप्स के साथ 15 मिलीलीटर ग्लास शीशियों में स्थानांतरित करें।
    6. 2 मिनट के लिए एक भंवर मिक्सर पर प्रत्येक शीशी को उत्तेजित करें, जिससे टूटे हुए कवरलिप्स को फंगल कॉलोनी के घन को काटने की अनुमति मिलती है, जिससे फंगल निलंबन होता है।
    7. फंगल निलंबन के 200 μL के साथ प्रत्येक petrolatum शीशी को टीका लगाएं। प्रत्येक कवक तनाव के लिए दो प्रतिकृति बनाएं।
    8. नकारात्मक नियंत्रण के लिए, केवल तरल बीएच के साथ शीशियों में फंगल निलंबन के 200 μL डाल दिया। इसके अलावा, माध्यम में संदूषण की जांच करने के लिए किसी भी कवक टीका के बिना पेट्रोलेटम के साथ कुछ शीशियों को रखें।
    9. शीशियों को अंधेरे में 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें और इनोकुलम से 15 दिनों और 30 दिनों के बाद उनकी जांच करें।
  2. इस्तेमाल किए गए इंजन तेल पर विकास परीक्षण।
    1. विआयनीकृत पानी के 1 लीटर में 3.26 ग्राम बीएच और 15 ग्राम आगर डालें और इसे 121 डिग्री सेल्सियस (बीएचए) पर 20 मिनट के लिए आटोक्लेव करें।
    2. एक लैमिनर प्रवाह कैबिनेट के तहत पेट्री व्यंजनों में भा प्लेट.
    3. जब यह ठोस हो जाता है, तो बीएचए पेट्री व्यंजनों पर उपयोग किए गए इंजन तेल के 500 μL को स्थानांतरित करें और इसे एक बाँझ डिस्पोजेबल एल-आकार के सेल स्प्रेडर का उपयोग करके प्लेट की सतहों पर समान रूप से वितरित करें।
    4. प्रत्येक कवक तनाव के साथ प्रत्येक इस्तेमाल इंजन तेल भा प्लेट को टीका लगाएं, चरण 1.5.3 पर तैयार प्लेटों से माइसेलियम एकत्र करें। संदूषण से बचने के लिए एक Bunsen बर्नर या एक लैमिनर प्रवाह हुड के नीचे काम करें। प्रत्येक कवक तनाव के लिए दो प्रतिकृति बनाएं।
    5. नकारात्मक नियंत्रण के लिए, केवल बीएचए के साथ पेट्री व्यंजनों को टीका लगाएं। इसके अलावा, माध्यम में संदूषण की जांच करने के लिए किसी भी कवक टीका के बिना इस्तेमाल किए गए इंजन तेल बीएचए पेट्री व्यंजनों की एक जोड़ी रखें।
    6. अंधेरे में 25 डिग्री सेल्सियस पर पेट्री व्यंजनों को इनक्यूबेट करें और इनोकुलम से 15 दिनों और 30 दिनों के बाद उनकी जांच करें।
  3. प्लास्टिक पर विकास परीक्षण।
    1. फंगल निलंबन के 200 μL (चरण 2.1.5.-2.1.6.) को 96-माइक्रोवेल प्लेट में स्थानांतरित करें। कवक तनाव-प्लास्टिक संयोजन के तीन प्रतिकृतियाँ बनाओ.
    2. फंगल निलंबन के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए, प्लास्टिक पाउडर के एक अलग प्रकार के 10 मिलीग्राम जोड़ें (polyethylene terephthalate - पीईटी, polyvinyl क्लोराइड - पीवीसी, उच्च घनत्व polyethylene - HDPE, polystyrene - पीएस, polyurethane - PUR)।
    3. नकारात्मक नियंत्रण के लिए, प्लास्टिक पाउडर जोड़ने के बजाय, फंगल निलंबन के साथ अच्छी तरह से स्टरलाइज्ड बीएच समाधान के 200 μL जोड़ें। इसके अलावा, प्रत्येक प्रकार के प्लास्टिक पाउडर के लिए, माध्यम के संदूषण की जांच करने के लिए 200 μL निष्फल बीएच समाधान और प्रत्येक प्लास्टिक की धूल के 10 मिलीग्राम के साथ एक अच्छी तरह से भरें।
    4. अंधेरे में 25 डिग्री सेल्सियस पर माइक्रोवेल प्लेटों को इनक्यूबेट करें और इनोकुलम से 15 दिनों और 30 दिनों के बाद उनकी जांच करें।

3. गुणात्मक एंजाइमेटिक परीक्षण

  1. गुणात्मक लिग्निनोलिटिक एंजाइम colorimetric परीक्षण।
    1. आलू डेक्सट्रोज शोरबा (पीडी) के 27 ग्राम और आगर के 15 ग्राम को विआयनीकृत पानी के 1 लीटर में डालें और इसे 121 डिग्री सेल्सियस (पीडीए) पर 20 मिनट के लिए आटोक्लेव करें।
    2. जब माध्यम थोड़ा ठंडा हो जाता है लेकिन अभी भी तरल है, तो एक लैमिनर प्रवाह हुड के नीचे गैलिक एसिड (5 ग्राम / एल) जोड़ें और माध्यम को पेट्री व्यंजनों में प्लेट करें।
    3. प्रत्येक फंगल तनाव के साथ पीडीए + गैलिक एसिड प्लेटों को टीका लगाएं, चरण 1.5.3 पर तैयार प्लेटों से माइसेलियम एकत्र करें। संदूषण से बचने के लिए एक Bunsen बर्नर या एक लैमिनर प्रवाह हुड के नीचे काम करें।
    4. नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, केवल पीडीए (कोई गैलिक एसिड नहीं) के साथ पेट्री व्यंजन तैयार करें और उन्हें फंगल उपभेदों (प्रत्येक कवक तनाव के लिए एक) के साथ-साथ पीडीए + गैलिक एसिड के साथ एक पेट्री डिश और कोई फंगल इनोक्यूलेशन के साथ टीका लगाएं।
    5. अंधेरे में 25 डिग्री सेल्सियस पर पेट्री व्यंजनों को इनक्यूबेट करें और इनोकुलम से 7 दिनों के बाद उनकी जांच करें।
  2. गुणात्मक laccases colorimetric परीक्षण.
    1. 27 ग्राम पीडी और 15 ग्राम आगर को 1 लीटर विआयनीकृत पानी में डालें और इसे 121 डिग्री सेल्सियस (पीडीए) पर 20 मिनट के लिए आटोक्लेव करें।
    2. जब माध्यम थोड़ा ठंडा हो जाता है लेकिन अभी भी तरल है, तो एक लैमिनर प्रवाह हुड के नीचे गुइयाकोल (400 μL / L) जोड़ें और इसे पेट्री व्यंजनों में प्लेट करें।
    3. प्रत्येक कवक तनाव के साथ पीडीए + guaiacol प्लेटों को संक्रमित करें, चरण 1.5.3 पर तैयार प्लेटों से माइसेलियम एकत्र करें। किसी भी संदूषण से बचने के लिए एक Bunsen बर्नर या एक लैमिनर प्रवाह हुड के तहत काम करें।
    4. नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, केवल पीडीए (कोई guaiacol) के साथ पेट्री व्यंजन तैयार करें और उन्हें फंगल उपभेदों (प्रत्येक कवक तनाव के लिए एक) के साथ-साथ पीडीए + गुइयाकोल के साथ एक पेट्री डिश और कोई फंगल इनोक्यूलेशन नहीं के साथ टीका लगाएं।
    5. अंधेरे में 25 डिग्री सेल्सियस पर पेट्री व्यंजनों को इनक्यूबेट करें और इनोकुलम से 7 दिनों के बाद उनकी जांच करें।
  3. गुणात्मक प्रोटीज परीक्षण।
    1. K2HPO4 (1 g/L) , KH2PO4 (0.5 g/L), MgSO4·7H2O (0.5 g/L), MnCl2·4H2O (0.001 g/L), CuCl2·2H 2 O (1.4 x 10-5 g/L), ZnCl2 (1.1 x 10-5 g/L), CoCl2·6H2O (2)2 Na2MoO4·2H2O (1.3 x 10-5 g/L), FeCl3·6H2O (7.5 x 10-5 g/L), और जिलेटिन/पेप्टोन (0.02 g/L) विआयनीकृत पानी के लिए।
    2. 10 मिनट के लिए माध्यम के अंदर एक चुंबकीय सरगर्मी पट्टी के साथ एक चुंबकीय हलचल (कोई गर्मी नहीं) पर हाँ माध्यम रखें।
    3. जब सभी लवण माध्यम में भंग हो जाते हैं, तो समाधान के 5 मिलीलीटर को 20 मिलीलीटर बाँझ कांच की शीशियों में स्थानांतरित करें और उन्हें 121 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए आटोक्लेव करें।
    4. नकारात्मक नियंत्रण के लिए, बीएच समाधान के 5 एमएल के साथ कुछ 20 मिलीलीटर बाँझ कांच की शीशियों को तैयार करें और उन्हें 121 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए आटोक्लेव करें।
    5. एक लैमिनर प्रवाह कैबिनेट के तहत, प्रत्येक तनाव के लिए फंगल निलंबन के 200 μL (चरण 2.1.5.-2.1.6.) को YES माध्यम निष्फल शीशियों में स्थानांतरित करें (प्रति फंगल तनाव कम से कम 2 प्रतिकृति बनाएं)। प्रत्येक कवक तनाव के लिए, एक नकारात्मक नियंत्रण रखने के लिए बीएच निष्फल शीशियों में एक ही फंगल निलंबन के 200 μL जोड़ें।
    6. शीशियों को 21 दिनों के लिए अंधेरे में 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें और हर 7 दिनों में उनकी जांच करें।
  4. गुणात्मक esterases परीक्षण.
    1. पेप्टोन (10 ग्राम / एल), NaCl (5 g / L), CaCl2 (0.1 g / L), और 10 मिलीलीटर Tween 80 से 1 L विआयनीकृत पानी को जोड़कर Tween 80 माध्यम तैयार करें।
    2. Tween 80 माध्यम को 10 मिनट के लिए माध्यम के अंदर एक चुंबकीय सरगर्मी पट्टी के साथ एक चुंबकीय हलचल (कोई गर्मी नहीं) पर रखें।
    3. जब माध्यम के अंदर सब कुछ पिघल जाता है, तो समाधान के 5 मिलीलीटर को 20 मिलीलीटर बाँझ कांच की शीशियों में स्थानांतरित करें और उन्हें 121 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए आटोक्लेव करें।
    4. नकारात्मक नियंत्रण के लिए, बीएच समाधान के 5 एमएल के साथ कुछ 20 मिलीलीटर बाँझ कांच की शीशियों को तैयार करें और उन्हें 121 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए आटोक्लेव करें।
    5. एक लैमिनर प्रवाह कैबिनेट के तहत, प्रत्येक तनाव के लिए फंगल निलंबन के 200 μL (चरण 2.1.5.-2.1.6.) को Tween 80 मध्यम निष्फल शीशियों के लिए स्थानांतरित करें (प्रति फंगल तनाव कम से कम 2 प्रतिकृति बनाएं)। प्रत्येक कवक तनाव के लिए, नकारात्मक नियंत्रण के लिए बीएच निष्फल शीशियों के लिए एक ही फंगल निलंबन के 200 μL जोड़ें।
    6. शीशियों को 21 दिनों के लिए अंधेरे में 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें और हर 7 दिनों में उनकी जांच करें।

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Representative Results

चयनात्मक मीडिया विधियों (प्रोटोकॉल की धारा 1) ने मिट्टी की समृद्ध जैव विविधता की जांच करने की अनुमति दी और उच्च बायोरेमेडिएशन क्षमता वाले कवक को चुना जा सकता है। ह्यूमिक एसिड और लिग्नोसेल्युलोज मीडिया के साथ, 100 से अधिक कवक उपभेदों को अलग किया गया था। इन कवक ने प्राकृतिक अड़ियल पदार्थों के बायोडिग्रेडेशन में शामिल एंजाइमों का उत्पादन किया, जिसमें कई प्रदूषकों के समान रासायनिक संरचना होती है। हालांकि, चयनात्मक मीडिया के साथ अलग किए गए कवक उपभेदों को आगे की स्क्रीनिंग की आवश्यकता थी। विशेष रूप से, चयनात्मक परीक्षणों ने ह्यूमिक एसिड और लिग्नोसेल्युलोज को नीचा दिखाने में सक्षम उपभेदों को अलग कर दिया, विकास परीक्षणों ने अपने एकमात्र कार्बन स्रोत के रूप में एक विशिष्ट प्रदूषक का उपयोग करने में सक्षम लोगों के लिए अलग-थलग कवक की जांच की, और गुणात्मक एंजाइमेटिक परीक्षणों ने उनकी चयापचय गतिविधियों का वर्णन किया।

विकास परीक्षण हाइड्रोकार्बन (पेट्रोलेटम और इस्तेमाल किए गए इंजन तेल) और प्लास्टिक (पीईटी, पीवीसी, एचडीपीई, पीएस, पीईआर) को नीचा दिखाने की कवक क्षमता पर केंद्रित थे। इन पदार्थों में से प्रत्येक का उपयोग चयनित कवक उपभेदों के लिए एकमात्र कार्बन स्रोत के रूप में एक परीक्षण में किया गया था। इन पदार्थों का शोषण करने की कवक क्षमता का मूल्यांकन अतिरिक्त पदार्थ के साथ नमूनों और केवल न्यूनतम माध्यम (बीएच या बीएचए, परीक्षण के आधार पर) के साथ नियंत्रण नमूनों के बीच कॉलोनी के विकास में अंतर के रूप में किया गया था। परिणामों (चित्रा 1) का वर्णन करने के लिए एक गुणात्मक पैमाने का उपयोग किया गया था, जो नियंत्रण (0) के साथ विकास अंतर की अनुपस्थिति से लेकर कम (+), मध्यम (++), और विकास में अंतर के उच्च (+++) स्तरों तक था।

Figure 1
चित्रा 1: विकास परीक्षणों में कवक उपभेदों की विकास सफलता की दर। पेट्रोलेटम पर बढ़ने में सक्षम कवक उपभेदों का प्रतिशत, इंजन तेल का उपयोग किया जाता है, और प्लास्टिक पाउडर (पॉलीइथिलीन टेरेफ्थालेट, पीईटी; पॉलीविनाइल क्लोराइड, पीवीसी; उच्च घनत्व वाले पॉलीइथिलीन, एचडीपीई; पॉलीस्टीरीन, पीएस; पॉलीयुरेथेन, पीयूआर) सफलता के विभिन्न डिग्री के साथ अपने एकमात्र कार्बन स्रोत के रूप में (कोई विकास, 0; कम विकास, +; मध्यम विकास, ++; उच्च विकास, +++)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पेट्रोलेटम और उपयोग किए गए इंजन तेल परीक्षणों ने चयनित कवक उपभेदों की हाइड्रोकार्बन बायोडिग्रेडेशन क्षमता का मूल्यांकन किया। पेट्रोलेटम, लंबी श्रृंखला के अल्केन्स (>C25) का मिश्रण, एकमात्र कार्बन स्रोत के रूप में उपयोग किया गया था। इस पदार्थ का शोषण करने की कवक क्षमता का मूल्यांकन बीएच + पेट्रोलेटम के साथ शीशियों के बीच कॉलोनी के विकास में अंतर के रूप में किया गया था और केवल बीएच (चित्रा 2) के साथ शीशियों को नियंत्रित किया गया था। परीक्षण किए गए कवक उपभेदों में से लगभग 75% अपने एकमात्र कार्बन स्रोत के रूप में पेट्रोलेटम का उपयोग करने में सक्षम थे, और 21% उपभेदों ने अधिकतम विकास (+++, चित्रा 1) का प्रदर्शन किया।

Figure 2
चित्रा 2: एकमात्र कार्बन स्रोत के रूप में पेट्रोलेटम पर विकास के गुणात्मक पैमाने के चित्र। गुणात्मक पैमाने उपचारित नमूनों और बीएच नियंत्रण के बीच विकास के अंतर पर आधारित है। यह विकास अंतर (0) की अनुपस्थिति से लेकर निम्न (+), मध्यम (++), और विकास अंतर के उच्च (+++) स्तरों तक होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

प्रयुक्त इंजन तेल हाइड्रोकार्बन, इंजन additives, और धातुओं का एक जटिल मिश्रण है। इसका उपयोग कार्बन स्रोत के रूप में एक जटिल और विषाक्त हाइड्रोकार्बन मिश्रण का उपयोग करने की कवक क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए विकास परीक्षणों में किया गया था। अन्य विकास परीक्षणों की तरह, केवल बीएचए (चित्रा 3) वाले नियंत्रण प्लेटों में वृद्धि के साथ इंजन तेल के साथ प्लेटों में कवक वृद्धि की तुलना करके विकास का मूल्यांकन किया गया था। विकास परिणामों ने चयनात्मक मीडिया (प्रोटोकॉल के अनुभाग 1) की प्रभावकारिता की पुष्टि की। वास्तव में, अलग-थलग कवक उपभेदों का लगभग 90% उपयोग किए गए इंजन तेल पर बढ़ने में सक्षम था, जिसमें 39% अधिकतम वृद्धि (+++, चित्रा 1) दिखा रहे थे।

Figure 3
चित्रा 3: एकमात्र कार्बन स्रोत के रूप में उपयोग किए जाने वाले इंजन तेल पर विकास के गुणात्मक पैमाने के चित्र। गुणात्मक पैमाने उपचारित नमूनों और बीएचए नियंत्रण के बीच विकास के अंतर पर आधारित है। यह विकास अंतर (0) की अनुपस्थिति से लेकर निम्न (+), मध्यम (++), और विकास अंतर के उच्च (+++) स्तरों तक होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

प्लास्टिक पाउडर पर विकास परीक्षणों का उपयोग कवक उपभेदों का चयन करने के लिए किया गया था जो विशिष्ट प्लास्टिक पॉलिमर को अपने प्राथमिक कार्बन स्रोत के रूप में उपयोग कर सकते थे; इसलिए, इन उपभेदों में प्लास्टिक बायोरेमेडिएशन के लिए एक उच्च क्षमता है। मल्टीवेल प्लेटों में वृद्धि स्टीरियोमाइक्रोस्कोप द्वारा देखी गई थी और एक गुणात्मक पैमाने का उपयोग करके मूल्यांकन किया गया था, जिसमें वृद्धि (0) की अनुपस्थिति से लेकर हाइफे (+++ ) के उच्च उत्पादन तक शामिल थे। PUR प्लास्टिक पाउडर था जिसमें कवक उपभेदों का उच्चतम प्रतिशत था जो विकास (92%) दिखा रहा था, जिसमें 31% उपभेदों ने अधिकतम वृद्धि (+++) दिखाई थी। ह्यूमिक एसिड और लिग्नोसेल्युलोज मीडिया से अलग किए गए उपभेदों का लगभग 70% पीएस पाउडर पर बढ़ गया, जबकि उनमें से लगभग 60% -65% अपने एकमात्र कार्बन स्रोत के रूप में एचडीपीई, पीवीसी और पीईटी का उपयोग करने में सक्षम थे। इसलिए, कवक का एक बड़ा प्रतिशत मल्टीवेल प्लेटों में विभिन्न प्लास्टिक पाउडर पर बढ़ने में सक्षम था, लेकिन उनमें से बहुत कम संख्या ने प्लास्टिक के उच्च उपनिवेशीकरण को दिखाया। दरअसल, केवल 10% उपभेद पीईटी और एचडीपीई पर पनपने में सक्षम थे, और 13% पीएस पर पनपने में सक्षम थे। एकमात्र प्लास्टिक जहां उच्च कवक विकास नियमित रूप से देखा गया था, वह पुर था, जिस पर लगभग 30% कवक उपभेद बहुतायत से बढ़ने में कामयाब रहे।

गुणात्मक एंजाइमेटिक परीक्षण कवक उपभेदों का पता लगाने के लिए किए गए थे जो अड़ियल पदार्थों की बायोडिग्रेडेशन प्रक्रियाओं में शामिल एंजाइमों का उत्पादन कर सकते हैं। पेरोक्सीडेस और लैककेस लिग्निनोलिटिक एंजाइम हैं जिनके उत्पादन को गैलिक एसिड और गुएयाकोल परीक्षणों में माध्यम के नीचे एक भूरे रंग के प्रभामंडल द्वारा इंगित किया जाता है (प्रोटोकॉल के चरण 3.1 और चरण 3.2)। दोनों परीक्षणों में, रंग की तीव्रता में वृद्धि ने इन एंजाइमों के उच्च उत्पादन का संकेत दिया (चित्रा 4)।

Figure 4
चित्रा 4: गुणात्मक लिग्निनोलिटिक एंजाइमों के गुणात्मक पैमाने के चित्र। गुणात्मक पैमाने कॉलोनी के चारों ओर एक लाल / भूरे रंग के प्रभामंडल के उत्पादन पर आधारित है। 0 = कोई गतिविधि नहीं, + = कुछ गतिविधि, ++ = उच्च गतिविधि, +++ बहुत उच्च गतिविधि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

परीक्षण किए गए कवक का लगभग 60% लिग्निनोलिटिक एंजाइमों का उत्पादन करने में सक्षम थे, जो चयनात्मक मीडिया की सफलता का संकेत देते हैं। इसके अलावा, अलग-थलग कवक उपभेदों के 12% ने गैलिक एसिड माध्यम में कॉलोनी (+++) के चारों ओर एक तीव्र अंधेरे प्रभामंडल का उत्पादन किया, जिसमें 17% ने गुइयाकोल माध्यम (लैककेस) में ऐसा किया, जो इन एंजाइमों के उच्च कवक स्राव को दर्शाता है (चित्रा 5)।

Figure 5
चित्रा 5: गुणात्मक एंजाइमेटिक परीक्षणों के दौरान कवक उपभेदों द्वारा एंजाइम गतिविधि की दर। कवक उपभेदों का प्रतिशत ligninolytic एंजाइमों, laccases, proteases, और esterases सफलता के विभिन्न स्तरों के साथ उत्पादन करने में सक्षम (0 = कोई गतिविधि, + = गतिविधि, ++ = उच्च गतिविधि, +++ बहुत उच्च गतिविधि) उनके इसी गुणात्मक एंजाइमेटिक परीक्षणों के दौरान। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

फंगल गतिविधि का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया जाने वाला एक और स्क्रीनिंग परीक्षण प्रोटीज परीक्षण था, जो यस मध्यम शीशियों और बीएच के साथ नियंत्रण शीशियों के बीच कवक विकास में अंतर पर आधारित था। हालांकि, हाँ माध्यम में कवक उपभेदों के लगभग 70% ने नियंत्रण के समान विकास दिखाया, या यहां तक कि विकास में भी कमी आई। कोई कवक तनाव अंतर के अधिकतम स्तर (+++) तक नहीं पहुंचा। इन परिणामों से पता चलता है कि यह परीक्षण प्रोटीज गतिविधि के लिए स्क्रीनिंग के लिए अनुपयुक्त हो सकता है।

अंत में, esterases गतिविधि Tween 80 माध्यम (चित्रा 5) में एक सफेद अवक्षेप के गठन द्वारा मूल्यांकन किया गया था। चयनित कवक उपभेदों के लगभग 60% ने एस्टेरेस गतिविधि दिखाई, और 13% ने अवक्षेप (+++ ) का एक उच्च गठन प्रदर्शित किया, यह सुझाव देते हुए कि 13% में उपभेदों को उनकी बायोडिग्रेडेशन क्षमता (चित्रा 5) की जांच करने के लिए चुना जाना चाहिए।

सभी विकास और एंजाइमेटिक परीक्षणों के बारे में, सबसे सफल उपभेद (यानी, जो कम से कम एक परीक्षण में +++ प्राप्त करते हैं) सबसे दिलचस्प थे। ये कवक उपभेद कुशलतापूर्वक अपने एकमात्र कार्बन स्रोत के रूप में अड़ियल पदार्थों का उपयोग करने में सक्षम थे, या उन्होंने अड़ियल पदार्थों के बायोडिग्रेडेशन में शामिल एंजाइमों के एक उच्च स्तर का उत्पादन किया। दरअसल, परीक्षण किए गए 115 कवक उपभेदों में से 39 हाइड्रोकार्बन स्रोतों (पेट्रोलेटम या उपयोग किए गए इंजन तेल) पर (+++) पनपने में सक्षम थे, और 58 में कम से कम एक प्लास्टिक बहुलक पर उच्च वृद्धि थी। केवल 32 ने कम से कम एक एंजाइमेटिक परीक्षण में बहुत उच्च एंजाइमेटिक गतिविधि (+++) दिखाई। ये परिणाम प्रोटीज परीक्षण के अलावा सभी रिपोर्ट किए गए स्क्रीनिंग परीक्षणों की उच्च प्रभावकारिता दिखाते हैं, जिसने किसी भी उच्च प्रदर्शन वाले उपभेदों का चयन नहीं किया था।

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Discussion

मिट्टी की समृद्ध जैव विविधता कवक का एक प्रचुर स्रोत है जिसमें कई चयापचय क्षमताएं हैं, जिनमें से कुछ बायोरेमेडिएशन के लिए संभावित उम्मीदवार हो सकते हैं। चयनात्मक मीडिया परीक्षण (प्रोटोकॉल की धारा 1) अपने एकमात्र कार्बन स्रोत के रूप में प्राकृतिक जटिल पॉलिमर पर बढ़ने में सक्षम कवक को अलग करने के लिए आसान-से-प्रदर्शन और प्रभावी तरीके हैं। कवक बाह्य कोशिकीय, गैर-विशिष्ट हाइड्रोलेस और ऑक्सीडोरेडक्टेस30 जैसे लिग्निनोलिटिक एंजाइमों के लैक्केस और पेरोक्सीडेस31 का उत्पादन कर सकता है। ये एंजाइम लिग्नोसेल्युलोज और ह्यूमिक एसिड को नीचा दिखा सकते हैं, लेकिन हाइड्रोकार्बन, सुगंधित यौगिकों और क्लोरीनयुक्त कार्बनिक यौगिकों सहित कई अलग-अलग ज़ेनोबायोटिक्स भी।

वर्णित विधियां ऐसे परिणाम उत्पन्न करती हैं जिनकी व्याख्या करना आसान है और उन्हें पूरा करने के लिए कम लागत है। ये विशेषताएं उन्हें गैर-विशेषज्ञों द्वारा उपयोग करने की अनुमति देती हैं। हालांकि, कुछ पहलुओं, जैसे कि बाँझपन और रूपात्मक पहचान, को विशेष ध्यान देने की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, मिट्टी के निलंबन (चरण 1.3.4.) का 30 मिनट का आंदोलन आवश्यक है ताकि कवक बीजाणुओं और प्रोपागुल्स को मिट्टी के माइक्रोस्ट्रक्चर से मुक्त किया जा सके और समाधान में निलंबित किया जा सके। इस तरह, इस मिट्टी के निलंबन के dilutions चढ़ाना द्वारा, कवक उपभेदों की अधिकतम संख्या को अलग करना संभव है। कवक उपभेदों की मैक्रो और माइक्रोस्कोपिक रूपात्मक पहचान उपभेदों के बीच अंतर करने और एक ही फंगल तनाव को कई बार अलग करने से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, माइक्रोबियल संदूषणों की बांझपन और परिहार महत्वपूर्ण हैं क्योंकि अन्य सक्रिय कवक उपभेदों की उपस्थिति अध्ययन किए गए उपनिवेशों की गतिविधि को गलत तरीके से पेश कर सकती है।

चयनात्मक परीक्षणों के बाद, विकास परीक्षणों की एक सरणी विभिन्न अड़ियल पदार्थों पर की गई थी, जैसे कि पेट्रोलैटम, उपयोग किए गए इंजन तेल और विभिन्न प्लास्टिक पॉलिमर। इस चरण को ब्याज के अड़ियल पदार्थों के अनुसार अनुकूलित किया जा सकता है। महत्वपूर्ण कदम बीएच या बीएचए में चयनित पदार्थ को एकमात्र कार्बन स्रोत के रूप में जोड़ना है और अतिरिक्त अड़ियल पदार्थ के बिना नियंत्रण के खिलाफ कवक विकास की जांच करना है।

प्लास्टिक और हाइड्रोकार्बन पर विकास परीक्षणों का उद्देश्य यह आकलन करना था कि क्या कवक सामग्री पर गुणात्मक रूप से अपने विकास को देखकर इन पदार्थों को अपने एकमात्र कार्बन स्रोत के रूप में उपयोग कर सकता है। दुर्भाग्य से, इन सामग्रियों के अत्यधिक पुनरावृत्ति के कारण, सब्सट्रेट के वजन में वास्तविक कमी और कवक बायोमास के वजन में वृद्धि को मापना बहुत मुश्किल है, खासकर अपेक्षाकृत कम समय के बाद। यदि एक कवक तनाव इन स्क्रीनिंग विकास परीक्षणों में बहुत अच्छी तरह से प्रदर्शन करता है, तो अड़ियल पदार्थ के क्षरण को मापने के लिए आगे के अध्ययन किए जाने चाहिए।

उपयोग किए गए एंजाइमेटिक परीक्षण (प्रोटोकॉल की धारा 3) को चुना गया था क्योंकि वे प्रदर्शन करने के लिए कुशल और तेज साबित हुए थे, लेकिन वे केवल गुणात्मक परिणाम उत्पन्न करते हैं। वे एक कवक तनाव की गिरावट क्षमता को उजागर करते हैं, लेकिन वे इसे ठीक से निर्धारित नहीं कर सकते हैं। यदि विशेष रुचि के एक तनाव को अलग किया जाता है, तो आगे के परीक्षण, जैसे कि स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक मात्रात्मक एंजाइम निबंध, चयापचय गतिविधि को अधिक सटीक रूप से वर्णन करने के लिए किए जा सकते हैं। एकमात्र एंजाइमेटिक परीक्षण जिसने सबऑप्टिमल प्रभावकारिता को दिखाया, वह गुणात्मक प्रोटीज परीक्षण था, जिसमें कम संख्या में उपभेद ों को हां माध्यम पर बढ़ने में सक्षम बनाया गया था। दरअसल, PUR पर बढ़ने में सक्षम उपभेदों के उच्च प्रतिशत से पता चलता है कि कवक ने एमाइड और यूरेथेन बॉन्ड को तोड़ने में शामिल प्रोटीज का उत्पादन किया, एस्टर बांड40 को लक्षित करने वाले एस्टेरेज़ के साथ। प्रोटीज-उत्पादक कवक की लगभग पूर्ण अनुपस्थिति से पता चलता है कि उपयोग की जाने वाली विधि में कोई समस्या हो सकती है। अन्य परीक्षणों को प्रोटीज गतिविधि के लिए अपनाया जा सकता है, जैसे कि केसिन41, स्किम्ड मिल्क42, या दूध पाउडर43 अगर प्लेट परीक्षण। गैलिक एसिड परीक्षण लिग्निनोलिटिक एंजाइमों के उत्पादन का पता लगाने के लिए बहुत उपयोगी साबित हुआ, लेकिन, दुर्भाग्य से, यह बहुत विशिष्ट नहीं था और उत्पादित लिग्निनोलिटिक एंजाइम के प्रकार को अलग नहीं कर सका (या तो पेरोक्सीडेस या लैक्केस)।

इस काम के परिणाम बताते हैं कि चयनात्मक मीडिया के रूप में लिग्नोसेल्युलोज या ह्यूमिक एसिड का उपयोग बायोरेमेडिएशन क्षमता वाले कवक उपभेदों को समृद्ध मिट्टी की जैव विविधता से अलग करने की अनुमति देता है। दरअसल, चयनात्मक तरीकों से अलग किए गए फंगल उपभेदों के 70% से अधिक पेट्रोलेटम या उपयोग किए गए इंजन तेल पर बढ़ने में सक्षम थे, और 60% एकमात्र कार्बन स्रोत के रूप में विभिन्न प्लास्टिक पॉलिमर पर बढ़ने में सक्षम थे। इसके अलावा, गुणात्मक एंजाइमेटिक परीक्षणों ने बायोडिग्रेडेशन प्रक्रियाओं से जुड़े इन कवक की चयापचय गतिविधि का वर्णन किया। एक या एक से अधिक परीक्षणों में +++ गतिविधि दिखाने वाले कवक उपभेदों के चयन की सिफारिश की जाती है क्योंकि यह एक कवक तनाव खोजने की संभावना को बढ़ाता है जो बायोरेमेडिएशन में बहुत सक्रिय है। हमारे स्क्रीनिंग परीक्षणों के साथ चयनित कवक उपभेदों के साथ लंबे समय तक संपर्क के बाद अड़ियल पदार्थों पर गैस मास-क्रोमैटोग्राफी (जीसी-एमएस) का उपयोग करने वाले परीक्षणों ने सामग्री के वास्तविक बायोडिग्रेडेशन को दिखायाहै 9,44। विभिन्न पारिस्थितिक तंत्रों में इन सरल स्क्रीनिंग परीक्षणों का उपयोग विभिन्न मिट्टी में कवक जैव विविधता की जांच की अनुमति देगा। कवक की खोज जो अड़ियल सामग्री को नीचा दिखा सकती है, पहचाने गए उपभेदों की संख्या में वृद्धि करेगी, जिनमें बायोरेमेडिएशन की क्षमता है और पर्यावरण प्रदूषण की बढ़ती समस्या से निपटने में मदद मिलेगी।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम इस काम के लिए अवसर प्रदान करने के लिए पाविया विश्वविद्यालय के Scuola di Alta Formazione Dottorale (SAFD) और प्रोफेसर Solveig Tosi को स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 microwell plate Greiner bio-one 650185
Agar VWR 84609.05
Bushnell-Haas Broth Fluka B5051
CaCl2 Sigma-Aldrich C5670
Chloroamphenicol Eurobio GABCRL006Z
Chlortetracycline Sigma-Aldrich Y0001451
CoCl2·6H2O Sigma-Aldrich C8661
CuCl2·2H2O Sigma-Aldrich C3279
Ethanol VWR Chemicals 20821.296
FeCl3·6H2O Sigma-Aldrich 236489
Filter 0.2 µm Whatman 10462200
gallic acid Sigma-Aldrich G7384
Glass cover slips Biosigma VBS634
Glass vials 15 mL SciLabware P35467
guaiacol Sigma-Aldrich G5502
High-density polyethylene (HDPE) Sigma-Aldrich 434272
Humic acids Aldrich Chemistry 53680
K2HPO4 Sigma-Aldrich P8281
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5655
Lignocellulose / / Sterilized bioethanol production waste
L-shaped cell spreader Laboindustria S.p.a 21133
magnetic stirrer A.C.E.F 8235
Malt Extract Broth Sigma-Aldrich 70146
MgSO4·7H2O Sigma-Aldrich M2643
Micropipette 1000 μL Gilson FA10006M
Micropipette 200  μL Gilson FA10005M
MnCl2·4H2O Sigma-Aldrich M5005
Na2MoO4·2H2O Sigma-Aldrich M1651
NaCl Sigma-Aldrich S5886
Neomycin Sigma-Aldrich N0401000
Penicillin Sigma-Aldrich 1504489
peptone Sigma-Aldrich 83059
Polyethylene terephthalate (PET) Goodfellow ES306031
Petri dishes Laboindustria S.p.a 21050
Petrolatum (Paraffin liquid) A.C.E.F 009661
Potato Dextrose Broth Sigma-Aldrich P6685
Polystyrene (PS) Sigma-Aldrich 331651
Polyurethane (PUR) Sigma-Aldrich GF20677923
Polyvinyl chloride (PVC) Sigma-Aldrich 81388
Sterile falcon tube Greiner bio-one 227 261
Sterile glass vials 20 mL Sigma-Aldrich SU860051
Sterile point 1000  μL Gilson F172511
Sterile point 200  μL Gilson F172311
Sterile polyethylene bags WHIRL-PAK B01018
sterile syringe Rays 5523CM25
Streptomycin Sigma-Aldrich S-6501
Tween 80 Sigma-Aldrich P1754
Used engine oil / / complex mixture of hydrocarbons, engine additives, and metals, provided by an Italian private company
Vials 50 mL Sigma-Aldrich 33108-U
ZnCl2 Sigma-Aldrich Z0152

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References

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जीव विज्ञान अंक 183 कवक मिट्टी जैव विविधता bioremediation स्क्रीनिंग परीक्षण हाइड्रोकार्बन प्लास्टिक एंजाइमेटिक गतिविधि
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Temporiti, M. E. E., Daccò, C., … More

Temporiti, M. E. E., Daccò, C., Nicola, L. Isolation and Screening from Soil Biodiversity for Fungi Involved in the Degradation of Recalcitrant Materials. J. Vis. Exp. (183), e63445, doi:10.3791/63445 (2022).

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