Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

عزل الفطريات المشاركة في تدهور المواد المتمردة وفحصها من التنوع البيولوجي للتربة

Published: May 16, 2022 doi: 10.3791/63445
Automatic Translation
1, 1, 1
1Laboratory of Mycology, Department of Earth and Environmental Sciences, University of Pavia

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا لفحص التنوع البيولوجي للتربة للبحث عن السلالات الفطرية المشاركة في تدهور المواد المتمردة. أولا ، يتم عزل السلالات الفطرية القادرة على النمو على الأحماض الدبالية أو الليجنوسليلوز. ثم يتم اختبار نشاطها في كل من الفحوصات الأنزيمية وعلى الملوثات مثل الهيدروكربونات والبلاستيك.

Abstract

التلوث البيئي هو مشكلة متزايدة، وتحديد الفطريات المشاركة في عملية المعالجة الحيوية هو مهمة أساسية. تستضيف التربة تنوعا لا يصدق من الحياة الميكروبية ويمكن أن تكون مصدرا جيدا لهذه الفطريات المعالجة بيولوجيا. يهدف هذا العمل إلى البحث عن فطريات التربة ذات إمكانات المعالجة الحيوية باستخدام اختبارات فحص مختلفة. تم استخدام وسائط الاستزراع المعدني المكملة بمواد متمردة كمصدر وحيد للكربون كاختبارات نمو. أولا ، تم طلاء تخفيفات التربة على أطباق بتري مع تعديل الوسط المعدني بالأحماض الدبالية أو الليجنوسليلوز. تم عزل المستعمرات الفطرية المتنامية واختبارها على ركائز مختلفة ، مثل الخلائط المعقدة من الهيدروكربونات (الفازلين وزيت المحركات المستخدم) ومساحيق البوليمرات البلاستيكية المختلفة (PET ، PP ، PS ، PUR ، PVC). ارتبطت الاختبارات الأنزيمية النوعية باختبارات النمو للتحقيق في إنتاج الإستراز واللاكات والبيروكسيديا والبروتياز. وتشارك هذه الإنزيمات في عمليات التحلل الرئيسية للمواد المتمردة، ويمكن أن يكون لإفرازها التأسيسي بواسطة السلالات الفطرية التي تم فحصها القدرة على استغلالها في المعالجة البيولوجية. وتم عزل واختبار أكثر من 100 سلالة، وتم العثور على العديد من العزلات ذات الإمكانات الجيدة للمعالجة البيولوجية. في الختام ، تعد اختبارات الفحص الموصوفة طريقة سهلة ومنخفضة التكلفة لتحديد السلالات الفطرية ذات إمكانات المعالجة الحيوية من التربة. بالإضافة إلى ذلك ، من الممكن تخصيص اختبارات الفحص للملوثات المختلفة ، وفقا للمتطلبات ، عن طريق إضافة مواد متمردة أخرى إلى الحد الأدنى من وسائط الاستزراع.

Introduction

التربة هي عنصر أساسي للحياة على الأرض وهي أساس العديد من النظم الإيكولوجية. يمكن اعتبار المعادن والمواد العضوية والكائنات الحية الدقيقة في التربة نظاما واحدا ، مع وجود ارتباطات وتفاعلات وثيقة تحدث بينها. تفاعلات هذه المركبات لها تأثير مهم على العمليات الأرضية والجودة البيئية وصحة النظام الإيكولوجي1. يشكل تلوث التربة مشاكل بيئية خطيرة في جميع أنحاء العالم. إن التطبيق العشوائي والطويل الأجل والمفرط للمواد المتمردة والسامة ، مثل المبيدات الحشرية والمنتجات البترولية والبلاستيك والمواد الكيميائية الأخرى ، له آثار خطيرة على بيئة التربة ، ونتيجة لذلك ، يمكن أن يغير ميكروبات التربة. تتكون المجتمعات الميكروبية في التربة من مجموعة واسعة من الكائنات الحية في حالات فسيولوجية مختلفة ، معظمها من البكتيريا والفطريات. العديد من الملوثات في التربة لديها استقرار متوسط إلى طويل الأجل ، ويمكن أن يؤدي استمرارها إلى تطوير آليات تكيفية تسمح للكائنات الحية الدقيقة باستخدام المواد المتمردة كمغذيات 2,3. وبالتالي ، يمكن النظر في هذه الكائنات الحية الدقيقة لتقنيات المعالجة الحيوية.

تحاول المعالجة البيولوجية التخفيف من آثار التلوث باستخدام الكائنات الحية الدقيقة وإنزيماتها لتدهور النفايات أو تحويلها إلى مركبات أقل سمية أو غير سامة. تمتلك أنواع مختلفة من العتائق والبكتيريا والطحالب والفطريات هذه القدرة على المعالجة الحيوية4. نتيجة لإجراءاتها الخاصة بالتحلل البيولوجي ، تعد الفطريات كائنات حية واعدة بشكل خاص للمعالجة الحيوية. يمكنهم مهاجمة ركائز مختلفة باستخدام شبكة hyphal الخاصة بهم ، مما يمكنهم من اختراق مصفوفة التربة بشكل أكثر كفاءة من الكائنات الحية الدقيقة الأخرى. بالإضافة إلى ذلك ، يمكنهم الوصول إلى interstics التي يتعذر الوصول إليها حيث يصعب إزالة الملوثات5 ، ويمكنهم أيضا البقاء على قيد الحياة في مستويات الرطوبة المنخفضة6. علاوة على ذلك ، تقوم الفطريات بتوليف أشرطة مختلفة من الإنزيمات غير المحددة ، عادة لتحلل المواد المتمردة الطبيعية مثل السليلوز واللجنين والأحماض الدبالية. يمكن أن تشارك تلك التي تفتقر إلى الركيزة المستهدفة في تدهور مجموعة واسعة من الملوثات المتمردة ، مثل الهيدروكربونات والبلاستيك والمبيدات الحشرية7،8،9،10. لذلك ، على الرغم من أن العديد من الأنواع الفطرية قد تم الإبلاغ عنها بالفعل كعوامل معالجة بيولوجية ، إلا أن هناك اهتماما متزايدا باستكشاف الأنواع التي لم تتم دراستها بعد لاختيار المرشحين للمعالجة البيولوجية للمواد الملوثة المتمردة. الأنواع المعروفة بالفعل أن لها خصائص المعالجة الحيوية تنتمي إلى الفصيلة Ascomycota 11,12,13 ، Basidiomycota 14,15 ، و Mucoromycota. على سبيل المثال ، من المعروف جيدا أن أجناس البنسليوم والرشاشيات تشارك في تدهور الهيدروكربونات الأليفاتية13 ، والبوليمرات البلاستيكية المختلفة 16،17،18 ، والمعادن الثقيلة19 ، والأصباغ20. وبالمثل ، كشفت الدراسات التي أجريت على الفطريات القاعدية ، مثل Phanerochaete chrysosporium و Trametes المبرقشة ، عن تورطها في أكسدة المواد المتمردة مثل الهيدروكربونات العطرية13 والبلاستيك21. مثال آخر على الفطريات المشاركة في عمليات التحلل البيولوجي هي zygomycetes Rhizopus spp. و Mucor spp. و Cunninghamella spp.22,23. على وجه الخصوص ، Cunninghamella قادر على أوكسيديز الهيدروكربونات العطرية ويعتبر كائنا نموذجيا لدراسة إزالة السموم من المنتجات من مجموعة واسعة من xenobiotics13.

هناك العديد من الإنزيمات الفطرية المشاركة في العمليات التحلل الرئيسية للمواد المتمردة24,25 ، مثل الإستراز ، اللاكاس ، البيروكسيديز ، والبروتياز. Laccases هي أوكسيديات تحتوي على النحاس تنتج في الخلية وتفرز لاحقا ، والتي تسمح بأكسدة مجموعة متنوعة من المركبات الفينولية والعطرية. يمكن أن تتحلل الفينول الأورثو وبارا ديفينول ، والفينولات المحتوية على المجموعة الأمينية ، واللجنين ، والديامينات المحتوية على مجموعة الأريل26. تستخدم البيروكسيديات بيروكسيد الهيدروجين كوسيط لتحلل اللجنين والمركبات العطرية الأخرى. هناك العديد من البيروكسيديا المختلفة ، ولكن تلك التي لديها أكبر قدرة على تحلل المواد السامة هي بيروكسيديز اللجنين وبيروكسيديز المنغنيز27.

تنتمي الإستراز والبروتياز إلى مجموعة الإنزيمات خارج الخلية أو الخارجية ، والتي تعمل خارج خلاياها الأصلية ولكنها لا تزال مرتبطة بها. يمكن لهذه الإنزيمات تحفيز التحلل المائي للجزيئات المتمردة الكبيرة إلى جزيئات أصغر. نظرا لخصوصية الركيزة المنخفضة ، يمكن لهذه الإنزيمات أن تلعب دورا رئيسيا في المعالجة الحيوية لمختلف الملوثات ، مثل أصباغ المنسوجات والنفايات السائلة المنبعثة من صناعات اللب والورق ودباغة الجلود والمنتجات البترولية والبلاستيك والمبيدات الحشرية28،29،30.

وقد تم بالفعل نشر عدد من طرق الفحص لاختيار السلالات الفطرية المعالجة بيولوجيا. فعلى سبيل المثال، استخدم وسط الأجار القائم على القش للكشف عن الفطريات البيضاء المتعفنة ذات الإمكانات العالية في تحلل الهيدروكربونات العطرية المتعددة الحلقات31؛ وتم وضع قطع صغيرة من الخشب المتعفن على مستخلص الشعير أجار (MEA) لعزل الفطريات المتعفنة بالخشب32. ومع ذلك ، فإن معظم الطرق التي تم اقتراحها بالفعل تختار فطريات محددة للغاية لنشاطها المثير للاهتمام. يقترح هذا البحث نهجا أوسع لاختيار فطريات التربة مع مجموعة أوسع من الإجراءات. تعتمد الطريقة على الطلاء الأولي للتخفيفات التسلسلية لعينات التربة على وسط معدل بالأحماض الدبالية أو الليجنوسليلوز الممزوج بالمضادات الحيوية لاختيار الفطريات مع القدرة على تحلل هذه المواد المتمردة الطبيعية. الأحماض الدبالية و lignocellulose ، في الواقع ، هي مواد مقاومة للغاية للتحلل البيولوجي لأنها تحتوي على هياكل جزيئية معقدة للغاية ، وهذا يسمح لها بأن تكون مؤشرات ممتازة على القدرة على التحلل للفطريات المختبرة33,34. بعد ذلك ، يتم فحص الفطريات المختارة في الاختبارات الأولى لتحديد تلك التي لديها القدرة على تحلل ملوثات معينة مثل الفازلين وزيت المحرك المستخدم والبلاستيك. وأخيرا ، يتم إجراء اختبارات إنزيمية نوعية للكشف عن السلالات الفطرية القادرة على إنتاج إنزيمات تشارك في عمليات التحلل البيولوجي للمواد المتمردة. لهذا الغرض ، يتم إجراء اختبارات البروتياز والإستراز ، في حين يتم استخدام حمض الغال و guaiacol كمؤشرات على إنتاج اللاك وإنزيم لجنينوليتيك الآخر35,36. يتم استخدام هذه الركائز لأنه تم العثور على علاقة قوية بين قدرة الفطريات على أكسدتها إلى شكلها البني اللون وامتلاك القدرة على تحلل الليجنينوليك37،38،39.

من خلال هذه البروتوكولات ، من الممكن عزل السلالات الفطرية ذات الإمكانات التحلل العالية ومجموعة واسعة من الإجراءات مباشرة من عينات التربة. يمكن أن يساعد عزل هذه السلالات الفطرية في العثور على مرشحين جدد لأغراض المعالجة البيولوجية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. اختيار السلالات الفطرية القادرة على تحلل المواد المتمردة من التربة

  1. إعداد محلول المضادات الحيوية.
    1. ضع البنسلين (50 مجم / لتر) والستربتومايسين (40 مجم / لتر) والكلورتتراسيكلين (40 مجم / لتر) والنيومايسين (100 مجم / لتر) والكلورامفينيكول (100 مجم / لتر) في 250 مل من الماء المعقم منزوع الأيونات.
    2. قبل إضافة الكلورامفينيكول إلى محلول المضادات الحيوية ، قم بإذابته في 3 مل من الإيثانول ≥99٪.
    3. ضع محلول المضاد الحيوي على مقلب مغناطيسي (بدون حرارة) مع شريط تحريك مغناطيسي داخل المحلول لمدة 10 دقائق. تخزينها في 4 درجة مئوية.
  2. إعداد وسائط النمو.
    1. ضع 1 غرام من حمض الدبالية التجاري ، و 3.26 غرام من مرق بوشنيل هاس (BH) ، و 15 غرام من الأجار في 1 لتر من الماء منزوع الأيونات وأوتوكلافه لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة مئوية (أجار حمض الدبالية).
    2. ضعي أجار حمض الدبالية في أطباق بتري تحت خزانة تدفق صفائحية.
    3. ضع 4 غرام من الليجنوسليلوز ، و 3.26 غرام من BH ، و 15 غرام من الأجار في 1 لتر من الماء منزوع الأيونات وأوتوكلافه لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة مئوية (lignocellulose agar).
    4. ضعي أجار الليجنوسليلوز في أطباق بتري تحت خزانة تدفق صفائحية.
    5. تحت خزانة تدفق صفائحية ، بعد أن تتصلب الوسائط في أطباق بتري ، قم بنقل 1 مل من محلول المضادات الحيوية إلى الأطباق المحضرة باستخدام حقنة معقمة مع مرشح 0.2 ميكرومتر لتعقيمها.
    6. قم بتوزيع محلول المضاد الحيوي بالتساوي على أسطح الألواح باستخدام موزع خلايا معقم على شكل حرف L يمكن التخلص منه واتركه يجف في الهواء تحت خزانة التدفق الرقائقي.
    7. ضع 20 جم من مرق مستخلص الشعير و 15 جم من الأجار في 1 لتر من الماء منزوع الأيونات وأوتوكلافه لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة مئوية (مستخلص الشعير أجار - MEA).
    8. ضعي ال MEA في أطباق بتري تحت خزانة تدفق صفائحية.
  3. أخذ عينات التربة وتخفيفها.
    1. قم بأخذ عينة من التربة ذات الأهمية على عمق 10 سم ، وإزالة أي نباتات وعشب وأوراق ميتة من الطبقة العليا ، ووضعها في أكياس البولي إيثيلين المعقمة.
    2. بعد الوصول إلى المختبر ، قم بغربلة التربة باستخدام شبكة 2 مم ، وإزالة أي جذور وحطام نباتي.
    3. إذا لم يكن من الممكن المضي قدما في تحليل المصب على الفور ، فقم بتخزين عينات التربة المنخلة عند 4 درجات مئوية.
    4. من خلال العمل تحت خزانة تدفق صفحية ، ضع 1 غرام من التربة المنخلة في أنبوب معقم سعة 15 مل مع 10 مل من الماء المعقم منزوع الأيونات (1 × 10-1 تخفيف). رج الأنبوب أفقيا لمدة 30 دقيقة.
    5. تحت خزانة تدفق صفحية ، قبل أن يستقر التعليق ، خذ 1 مل من التخفيف 1 × 10-1 باستخدام ماصة معقمة وانقلها إلى 9 مل من الماء منزوع الأيونات فارغ (1 × 10-2 تخفيف). دوامة ذلك بدقة.
    6. قبل أن يستقر التعليق ، خذ 1 مل من التخفيف 1 × 10-2 باستخدام ماصة معقمة وانقلها إلى 9 مل من الماء منزوع الأيونات فارغ (تخفيف 1 × 10-3). دوامة ذلك بدقة.
  4. طلاء تخفيفات التربة على وسائط انتقائية.
    1. من خلال العمل تحت خزانة تدفق صفائحية ، اجمع 100 ميكرولتر من التخفيف 1 × 10-3 باستخدام ماصة دقيقة مع نقطة معقمة ونقلها إلى طبق بتري أجار دبال. افعل ذلك لمدة 4 أو 5 أطباق بتري على الأقل.
    2. وزع التخفيف بالتساوي على سطح طبق بتري باستخدام موزع خلايا معقم على شكل حرف L يمكن التخلص منه.
    3. اتركيه يجف في الهواء لمدة 10-15 دقيقة تحت خزانة التدفق الرقائقي.
    4. كرر الخطوات 1.4.1.-1.4.3. باستخدام أطباق الليجنوسليلوز بيتري.
    5. احتضان في 25 درجة مئوية في الظلام لمدة أقصاها 15 يوما.
  5. عزل المستعمرات الفطرية نمت من وسائل الإعلام الانتقائية إلى وسائط النمو.
    1. بدءا من 3 أيام بعد التحضير ، تحقق من أطباق بتري الانتقائية المعدة يوميا لأي نمو مستعمرة فطرية لمدة أقصاها 15 يوما.
    2. تحقق من جميع المستعمرات الفطرية الموجودة بحثا عن أوجه التشابه. إذا لزم الأمر ، قم بإعداد شريحة ليتم ملاحظتها تحت المجهر الضوئي.
      ملاحظة: الهدف هو عزل أكبر عدد من المستعمرات الفطرية ، ولكن من الضروري تجنب عزل نفس السلالة الفطرية دائما من لوحات مختلفة ، لذلك هذا الفحص مهم جدا. ابحث عن مستعمرات ذات أشكال ماكرو وميكرومورفولوجية مختلفة.
    3. تحت خزانة التدفق الرقائقي أو في موقد بنسن ، اعزل كل سلالة فطرية مختارة عن طريق إزالة جزء صغير من الميسيليوم بلطف من المستعمرة باستخدام إبرة تلقيح معقمة ونقلها إلى طبق بتري جديد من MEA.
      ملاحظة: في هذه المرحلة ، من المهم جدا أن تكون دقيقا ودقيقا لأن هناك خطرا كبيرا من التلوث من المستعمرات الفطرية الأخرى الموجودة في طبق بتري الأصلي. إذا نمت أكثر من سلالة فطرية واحدة على صفيحة MEA الملقحة، كرر الخطوة 1.5.3.
    4. تحضن عند 25 درجة مئوية في الظلام لمدة 7 أيام. هذه هي السلالات الفطرية التي سيتم اختبارها بشكل أكبر على مواد متمردة محددة.

2. اختبارات النمو على المواد المتمردة

  1. اختبار النمو على الفازلين.
    1. انقل 20 مل من BH السائل (3.26 جم / لتر من BH) إلى قوارير 50 مل وقم بتعقيمها عن طريق التعقيم عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    2. انقل 7 مل من الماء منزوع الأيونات إلى قوارير زجاجية سعة 15 مل وأضف بعض القطع من أغطية الزجاج المكسور إلى كل قارورة.
    3. قم بتعقيمها عن طريق التعقيم عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    4. تحت خزانة التدفق الرقائقي ، أضف 1 مل من الفازلين إلى كل قارورة BH سعة 50 مل باستخدام ماصة معقمة. احتفظ ببعض القوارير مع BH فقط كعنصر تحكم سلبي.
    5. تحت خزانة التدفق الرقائقي، قم بإزالة الميسيليوم على سطح الوسط من ألواح MEA مع السلالات الفطرية المختارة (المحضرة في الخطوة 1.5.3) باستخدام إبرة معقمة وانقلها إلى قوارير زجاجية سعة 15 مل مع الأغطية المكسورة.
    6. حرك كل قارورة على خلاط دوامة لمدة 2 دقيقة ، مما يسمح للأغطية المكسورة بقطع مكعب المستعمرة الفطرية ، مما يجعل التعليق الفطري.
    7. تطعيم كل قارورة بترولاتوم مع 200 ميكرولتر من التعليق الفطري. جعل اثنين من النسخ المتماثلة لكل سلالة فطرية.
    8. للتحكم السلبي ، ضع 200 ميكرولتر من التعليق الفطري في قوارير مع BH السائل فقط. علاوة على ذلك ، احتفظ بقريورتين مع الفازلين دون أي تلقيح فطري للتحقق من وجود تلوث في الوسط.
    9. احتضان القوارير عند 25 درجة مئوية في الظلام والتحقق منها بعد 15 يوما و 30 يوما من اللقاح.
  2. اختبار النمو على زيت المحرك المستخدم.
    1. ضع 3.26 جم من BH و 15 جم من الأجار في 1 لتر من الماء منزوع الأيونات وأوتوكلافه لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة مئوية (BHA).
    2. ضعي BHA في أطباق بتري تحت خزانة تدفق صفائحية.
    3. عندما يصبح صلبا، انقل 500 ميكرولتر من زيت المحرك المستخدم إلى أطباق BHA Petri وقم بتوزيعه بالتساوي على أسطح الألواح باستخدام موزع خلايا معقم على شكل حرف L يمكن التخلص منه.
    4. قم بتلقيح كل لوحة BHA مستعملة لزيت المحرك مع كل سلالة فطرية ، وجمع الميسيليوم من الألواح المحضرة في الخطوة 1.5.3. اعمل في موقد بنسن أو تحت غطاء التدفق الرقائقي لتجنب التلوث. جعل اثنين من النسخ المتماثلة لكل سلالة فطرية.
    5. للسيطرة السلبية ، قم بتلقيح أطباق بتري مع BHA فقط. علاوة على ذلك ، احتفظ باثنين من أطباق زيت المحرك المستخدمة BHA Petri دون أي تلقيح فطري للتحقق من وجود تلوث في الوسط.
    6. احتضن أطباق بتري عند 25 درجة مئوية في الظلام وتحقق منها بعد 15 يوما و 30 يوما من اللقاح.
  3. اختبار النمو على البلاستيك.
    1. نقل 200 ميكرولتر من التعليق الفطري (الخطوات 2.1.5.-2.1.6) إلى صفيحة 96 ميكروويل. اصنع ثلاثة نسخ طبق الأصل من مزيج السلالة الفطرية والبلاستيك.
    2. إلى كل بئر مع التعليق الفطري ، أضف 10 ملغ من نوع مختلف من مسحوق البلاستيك (البولي إيثيلين تيريفثاليت - PET ، كلوريد البولي فينيل - PVC ، البولي إيثيلين عالي الكثافة - HDPE ، البوليسترين - PS ، البولي يوريثين - PUR).
    3. للتحكم السلبي ، بدلا من إضافة مسحوق البلاستيك ، أضف 200 ميكرولتر من محلول BH المعقم إلى البئر مع التعليق الفطري. علاوة على ذلك ، لكل نوع من أنواع مسحوق البلاستيك ، املأ بئرا ب 200 ميكرولتر من محلول BH المعقم و 10 ملغ من كل غبار بلاستيكي للتحقق من تلوث الوسط.
    4. احتضان لوحات microwell عند 25 درجة مئوية في الظلام والتحقق منها بعد 15 يوما و 30 يوما من اللقاح.

3. الاختبارات الأنزيمية النوعية

  1. اختبار الإنزيمات المحللة للجينينولتيك النوعية.
    1. ضع 27 جم من مرق سكر العنب البطاطس (PD) و 15 جم من الأجار في 1 لتر من الماء منزوع الأيونات وأوتوكلافه لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة مئوية (PDA).
    2. عندما يبرد الوسط قليلا ولكنه لا يزال سائلا ، أضف حمض الغاليك (5 جم / لتر) تحت غطاء تدفق صفائحي وقم بطحن الوسط في أطباق بتري.
    3. قم بتلقيح PDA + ألواح حمض الغال مع كل سلالة فطرية ، وجمع الميسيليوم من الألواح المحضرة في الخطوة 1.5.3. اعمل في موقد بنسن أو تحت غطاء التدفق الرقائقي لتجنب التلوث.
    4. كضوابط سلبية ، قم بإعداد أطباق بتري مع PDA فقط (بدون حمض غاليك) وتلقيحها بالسلالات الفطرية (واحدة لكل سلالة فطرية) ، بالإضافة إلى طبق بتري واحد مع PDA + حمض الغال وبدون تلقيح فطري.
    5. احتضن أطباق بتري على حرارة 25 درجة مئوية في الظلام وتحقق منها بعد 7 أيام من التطعيم.
  2. اختبار اللاكات النوعية اللونية.
    1. ضع 27 جم من PD و 15 جم من الأجار في 1 لتر من الماء منزوع الأيونات وأوتوكلافه لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة مئوية (PDA).
    2. عندما يبرد الوسط قليلا ولكنه لا يزال سائلا ، أضف guaiacol (400 ميكرولتر / لتر) تحت غطاء تدفق صفحي وقم بوضعه في أطباق Petri.
    3. قم بتلقيح ألواح PDA + guaiacol مع كل سلالة فطرية ، وجمع الميسيليوم من الألواح المحضرة في الخطوة 1.5.3. اعمل في موقد بنسن أو تحت غطاء التدفق الرقائقي لتجنب أي تلوث.
    4. كضوابط سلبية ، قم بإعداد أطباق بتري مع PDA فقط (بدون guaiacol) وتلقيحها بالسلالات الفطرية (واحدة لكل سلالة فطرية) ، بالإضافة إلى طبق بتري واحد مع PDA + guaiacol ولا يوجد تلقيح فطري.
    5. احتضن أطباق بتري على حرارة 25 درجة مئوية في الظلام وتحقق منها بعد 7 أيام من التطعيم.
  3. اختبار البروتياز النوعي.
    1. تحضير وسط نعم بإضافة K 2 HPO4 (1 جم / لتر) ، KH 2 PO 4 (0.5 جم / لتر) ، MgSO 4 · 7H 2 O (0.5 جم / لتر) ، MnCl 2 · 4H 2 O (0.001 جم / لتر) ، CuCl 2 · 2H 2 O (1.4 × 10-5 جم / لتر) ، ZnCl 2 (1.1 × 10-5 جم / لتر) ، CoCl 2 ·6H 2 O (2× 10-5 جم / لتر) ، Na2MoO4·2H 2 O (1.3 × 10-5 جم / لتر) ، FeCl3 ·6H2O (7.5 × 10-5 جم / لتر) ، والجيلاتين / الببتون (0.02 جم / لتر) إلى الماء منزوع الأيونات.
    2. ضع وسط نعم على مقلب مغناطيسي (بدون حرارة) مع قضيب تحريك مغناطيسي داخل الوسط لمدة 10 دقائق.
    3. عندما تذوب جميع الأملاح في الوسط ، انقل 5 مل من المحلول إلى قوارير زجاجية معقمة سعة 20 مل وأوتوكلافها لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة مئوية.
    4. للتحكم السلبي ، قم بإعداد حوالي 20 مل من قوارير الزجاج المعقمة مع 5 مل من محلول BH وأوتوكلافها لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة مئوية.
    5. تحت خزانة التدفق الرقائقي ، انقل 200 ميكرولتر من التعليق الفطري (الخطوات 2.1.5.-2.1.6) لكل سلالة إلى قوارير YES المتوسطة المعقمة (قم بعمل نسختين متماثلتين على الأقل لكل سلالة فطرية). لكل سلالة فطرية ، أضف 200 ميكرولتر من نفس التعليق الفطري إلى قوارير BH المعقمة للحصول على تحكم سلبي.
    6. احتضن القوارير عند 25 درجة مئوية في الظلام لمدة 21 يوما وتحقق منها كل 7 أيام.
  4. اختبار الاسترازات النوعية.
    1. تحضير توين 80 متوسطة عن طريق إضافة الببتون (10 جم / لتر) ، كلوريد الصوديوم (5 جم / لتر) ، CaCl2 (0.1 جم / لتر) ، و 10 مل من Tween 80 إلى 1 L من الماء منزوع الأيونات.
    2. ضع وسط Tween 80 على مقلب مغناطيسي (بدون حرارة) مع شريط تحريك مغناطيسي داخل الوسط لمدة 10 دقائق.
    3. عندما يذوب كل شيء داخل الوسط ، انقل 5 مل من المحلول إلى قوارير زجاجية معقمة سعة 20 مل وأوتوكلافها لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة مئوية.
    4. للتحكم السلبي ، قم بإعداد حوالي 20 مل من قوارير الزجاج المعقمة مع 5 مل من محلول BH وأوتوكلافها لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة مئوية.
    5. تحت خزانة التدفق الرقائقي ، انقل 200 ميكرولتر من التعليق الفطري (الخطوات 2.1.5.-2.1.6) لكل سلالة إلى قوارير Tween 80 متوسطة التعقيم (قم بعمل نسختين متماثلتين على الأقل لكل سلالة فطرية). لكل سلالة فطرية ، أضف 200 ميكرولتر من نفس التعليق الفطري إلى قوارير BH المعقمة للسيطرة السلبية.
    6. احتضن القوارير عند 25 درجة مئوية في الظلام لمدة 21 يوما وتحقق منها كل 7 أيام.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وسمحت أساليب الوسائط الانتقائية (القسم 1 من البروتوكول) بفحص التنوع البيولوجي الغني للتربة واختيار الفطريات ذات القدرة العالية على المعالجة البيولوجية. مع حمض الدبالية ووسائط الليجنوسليلوز ، تم عزل أكثر من 100 سلالة فطرية. أنتجت هذه الفطريات إنزيمات تشارك في التحلل البيولوجي للمواد المتمردة الطبيعية ، والتي لها بنية كيميائية تشبه العديد من الملوثات. ومع ذلك ، فإن السلالات الفطرية المعزولة مع الوسائط الانتقائية تحتاج إلى مزيد من الفحص. على وجه التحديد ، عزلت الاختبارات الانتقائية السلالات القادرة على تحلل الأحماض الدبالية والليجنوسليلوز ، وفحصت اختبارات النمو الفطريات المعزولة لأولئك القادرين على استخدام ملوث معين كمصدر وحيد للكربون ، ووصفت الاختبارات الأنزيمية النوعية أنشطتهم الأيضية.

ركزت اختبارات النمو على القدرة الفطرية على تحلل الهيدروكربونات (الفازلين وزيت المحرك المستعمل) والبلاستيك (PET ، PVC ، HDPE ، PS ، PUR). تم استخدام كل من هذه المواد في اختبار كمصدر وحيد للكربون للسلالات الفطرية المختارة. تم تقييم القدرة الفطرية على استغلال هذه المواد على أنها الفرق في نمو المستعمرة بين العينات التي تحتوي على المادة المضافة وعينات التحكم ذات الحد الأدنى من الوسط فقط (BH أو BHA ، اعتمادا على الاختبار). تم استخدام مقياس نوعي لوصف النتائج (الشكل 1) ، بدءا من عدم وجود فرق نمو مع التحكم (0) إلى مستويات منخفضة (+) ، متوسطة (++) ، وعالية (+++) من الفرق في النمو.

Figure 1
الشكل 1: معدل نجاح نمو السلالات الفطرية في اختبارات النمو. النسبة المئوية للسلالات الفطرية القادرة على النمو على الفازلين وزيت المحرك المستخدم والمساحيق البلاستيكية (البولي إيثيلين تيريفثالات ، PET ؛ كلوريد البولي فينيل ، PVC ؛ البولي إيثيلين عالي الكثافة ، HDPE ؛ البوليسترين ، PS ؛ البولي يوريثين ، PUR) كمصدر الكربون الوحيد مع درجات مختلفة من النجاح (لا نمو ، 0 ؛ نمو منخفض ، + ؛ نمو متوسط ، ++ ؛ نمو مرتفع ، +++). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

قيمت اختبارات الفازلين وزيت المحرك المستخدم إمكانات التحلل البيولوجي الهيدروكربوني للسلالات الفطرية المختارة. تم استخدام بترولاتوم ، وهو مزيج من الألكانات طويلة السلسلة (>C25) ، كمصدر وحيد للكربون. تم تقييم القدرة الفطرية على استغلال هذه المادة على أنها الفرق في نمو المستعمرة بين القوارير التي تحتوي على BH + petrolatum وقوارير التحكم مع BH فقط (الشكل 2). تمكن ما يقرب من 75٪ من السلالات الفطرية التي تم اختبارها من استخدام الفازلين كمصدر وحيد للكربون ، وأظهرت 21٪ من السلالات أقصى نمو (+++ ، الشكل 1).

Figure 2
الشكل 2: صور للمقياس النوعي للنمو على الفازلين كمصدر وحيد للكربون. يعتمد المقياس النوعي على فرق النمو بين العينات المعالجة والتحكم في BH. وهو يتراوح من عدم وجود فرق نمو (0) ، إلى مستويات منخفضة (+) ، متوسطة (++) ، ومستويات عالية (+++) من فرق النمو. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

زيت المحرك المستخدم هو مزيج معقد من الهيدروكربونات والمواد المضافة للمحرك والمعادن. تم استخدامه في اختبارات النمو لتقييم القدرة الفطرية على استخدام مزيج هيدروكربوني معقد وسام كمصدر للكربون. مثل اختبارات النمو الأخرى ، تم تقييم النمو من خلال مقارنة النمو الفطري في الألواح مع زيت المحرك مع النمو في لوحات التحكم التي تحتوي على BHA فقط (الشكل 3). أكدت نتائج النمو فعالية الوسائط الانتقائية (القسم 1 من البروتوكول). في الواقع ، تمكن ما يقرب من 90٪ من السلالات الفطرية المعزولة من النمو على زيت المحرك المستخدم ، مع إظهار 39٪ أقصى نمو (+++ ، الشكل 1).

Figure 3
الشكل 3: صور للمقياس النوعي للنمو على زيت المحرك المستخدم كمصدر وحيد للكربون. يعتمد المقياس النوعي على فرق النمو بين العينات المعالجة والتحكم في BHA. وهو يتراوح من غياب فرق النمو (0) ، إلى مستويات منخفضة (+) ، متوسطة (++) ، ومستويات عالية (+++) من فرق النمو. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

واستخدمت اختبارات النمو على مساحيق البلاستيك لاختيار السلالات الفطرية التي يمكن أن تستخدم بوليمرات بلاستيكية محددة كمصدر أساسي للكربون؛ وبالتالي ، فإن هذه السلالات لديها إمكانات عالية للمعالجة الحيوية البلاستيكية. وقد لوحظ النمو في الصفائح متعددة الآبار بواسطة المجهر المجسم وتم تقييمه باستخدام مقياس نوعي ، يتراوح من غياب النمو (0) إلى الإنتاج العالي للهيفاي (+++). كان PUR هو مسحوق البلاستيك الذي يحتوي على أعلى نسبة من السلالات الفطرية التي تظهر نموا (92٪) ، مع 31٪ من السلالات التي تظهر أقصى نمو (+++). ما يقرب من 70 ٪ من السلالات المعزولة من حمض الدبالية ووسائط الليجنوسليلوز نمت على مسحوق PS ، في حين أن ما يقرب من 60 ٪ -65 ٪ منهم كانوا قادرين على استخدام HDPE و PVC و PET كمصدر وحيد للكربون. لذلك ، تمكنت نسبة كبيرة من الفطريات من النمو على مساحيق بلاستيكية مختلفة في ألواح متعددة الآبار ، لكن عددا منخفضا جدا منها أظهر استعمارا عاليا للبلاستيك. في الواقع ، كان 10٪ فقط من السلالات قادرة على الازدهار على PET و HDPE ، و 13٪ كانت قادرة على الازدهار على PS. البلاستيك الوحيد الذي لوحظ فيه نمو فطري مرتفع بانتظام هو PUR ، حيث تمكن ما يقرب من 30٪ من السلالات الفطرية من النمو بكثرة.

تم إجراء اختبارات إنزيمية نوعية للكشف عن السلالات الفطرية التي يمكن أن تنتج إنزيمات تشارك في عمليات التحلل البيولوجي للمواد المتمردة. البيروكسيديز واللاكات هي إنزيمات تحلل الليجنينو يشار إلى إنتاجها بواسطة هالة بنية اللون على الجانب السفلي من الوسط في اختبارات حمض الغال والغواياكول (الخطوة 3.1. والخطوة 3.2. من البروتوكول). في كلا الاختبارين ، أشارت الزيادة في شدة اللون إلى إنتاج أعلى لهذه الإنزيمات (الشكل 4).

Figure 4
الشكل 4: صور للمقياس النوعي للإنزيمات المحللة للجينينو النوعية. يعتمد المقياس النوعي على إنتاج هالة حمراء / بنية حول المستعمرة. 0 = لا يوجد نشاط ، + = بعض النشاط ، ++ = نشاط مرتفع ، +++ نشاط مرتفع جدا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ما يقرب من 60 ٪ من الفطريات التي تم اختبارها كانت قادرة على إنتاج إنزيمات تحلل الليجنينوليك ، مما يشير إلى نجاح الوسائط الانتقائية. علاوة على ذلك ، أنتجت 12٪ من السلالات الفطرية المعزولة هالة داكنة مكثفة حول المستعمرة (+++) في وسط حمض الغال ، مع قيام 17٪ بذلك في وسط guaiacol (laccase) ، مما يشير إلى إفراز فطري مرتفع لهذه الإنزيمات (الشكل 5).

Figure 5
الشكل 5: معدل نشاط الإنزيم بواسطة السلالات الفطرية أثناء الاختبارات الأنزيمية النوعية. النسبة المئوية للسلالات الفطرية القادرة على إنتاج إنزيمات تحلل الليجنينوليك ، واللاكات ، والبروتياز ، والإستراز بمستويات مختلفة من النجاح (0 = لا يوجد نشاط ، + = نشاط ، ++ = نشاط عالي ، +++ نشاط مرتفع جدا) خلال الاختبارات الأنزيمية النوعية المقابلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

اختبار فحص آخر يستخدم لتحليل النشاط الفطري هو اختبار البروتياز ، والذي استند إلى الفرق في نمو الفطريات بين قوارير YES المتوسطة وقوارير التحكم مع BH. ومع ذلك ، أظهر ما يقرب من 70 ٪ من السلالات الفطرية في وسط YES نموا مشابها للضوابط ، أو حتى انخفاض النمو. لم تصل أي سلالة فطرية إلى الحد الأقصى لمستوى الفرق (+++). تشير هذه النتائج إلى أن هذا الاختبار قد يكون غير مناسب لفحص نشاط الأنزيم البروتيني.

وأخيرا، تم تقييم نشاط الإستراز من خلال تكوين راسب أبيض في وسط توين 80 (الشكل 5). أظهر ما يقرب من 60٪ من السلالات الفطرية المختارة نشاط إستراز ، وأظهر 13٪ تكوينا عاليا للراسب (+++) ، مما يشير إلى أنه ينبغي اختيار السلالات في 13٪ للتدقيق في إمكانات التحلل البيولوجي (الشكل 5).

فيما يتعلق بجميع اختبارات النمو والاختبارات الأنزيمية ، كانت السلالات الأكثر نجاحا (أي تلك التي حصلت على +++ في اختبار واحد على الأقل) هي الأكثر إثارة للاهتمام. كانت هذه السلالات الفطرية قادرة على استخدام المواد المتمردة بكفاءة كمصدر وحيد للكربون ، أو أنتجت مستوى عاليا من الإنزيمات المشاركة في التحلل البيولوجي للمواد المتمردة. في الواقع ، تمكنت 39 سلالة فطرية من أصل 115 سلالة تم اختبارها من الازدهار (+++) على مصادر الهيدروكربونات (الفازلين أو زيت المحرك المستعمل) ، وكان لدى 58 سلالة نمو عالية على بوليمر بلاستيكي واحد على الأقل. أظهر 32 فقط نشاطا إنزيميا عاليا جدا (+++) في واحد على الأقل من الاختبارات الأنزيمية التي تم إجراؤها. تظهر هذه النتائج الفعالية العالية لجميع اختبارات الفحص المبلغ عنها ، باستثناء اختبار البروتياز ، الذي لم يحدد أي سلالات عالية الأداء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

التنوع البيولوجي الغني للتربة هو مصدر وفير للفطريات التي تمتلك العديد من القدرات الأيضية ، وبعضها يمكن أن يكون مرشحا محتملا للمعالجة البيولوجية. اختبارات الوسائط الانتقائية (القسم 1 من البروتوكول) هي طرق سهلة الأداء وفعالة لعزل الفطريات القادرة على النمو على البوليمرات المعقدة الطبيعية كمصدر وحيد للكربون. يمكن أن تنتج الفطريات هيدرولاز خارج الخلية وغير محددة وأكسيدوريدوكتازات30 مثل الإنزيمات المحللة للجينينو laccases و peroxidases31. يمكن لهذه الإنزيمات أن تحلل الليجنوسليلوز والأحماض الدبالية ، ولكن أيضا العديد من الزينوبيوتيك المختلفة ، بما في ذلك الهيدروكربونات والمركبات العطرية والمركبات العضوية المكلورة32.

تنتج الطرق الموصوفة نتائج سهلة التفسير ومنخفضة التكلفة لتنفيذها. هذه الخصائص تسمح باستخدامها من قبل غير الخبراء. ومع ذلك ، فإن بعض الجوانب ، مثل العقم وتحديد الهوية المورفولوجية ، تتطلب اهتماما خاصا. على سبيل المثال ، يعد التحريض لمدة 30 دقيقة لتعليق التربة (الخطوة 1.3.4) ضروريا حتى يتم تحرير الجراثيم الفطرية والبروباجولات من البنية المجهرية للتربة ويمكن تعليقها في المحلول. وبهذه الطريقة ، من خلال تخفيف الطلاء لتعليق التربة هذا ، من الممكن عزل أكبر عدد ممكن من السلالات الفطرية. يعد التحديد المورفولوجي الكلي والمجهري للسلالات الفطرية مهما من أجل التمييز بين السلالات وتجنب عزل نفس السلالة الفطرية عدة مرات. علاوة على ذلك ، فإن العقم وتجنب الملوثات الميكروبية أمران حاسمان لأن وجود سلالات فطرية نشطة أخرى يمكن أن يشوه نشاط المستعمرات المدروسة.

بعد الاختبارات الانتقائية ، تم إجراء مجموعة من اختبارات النمو على مواد متمردة مختلفة ، مثل الفازلين وزيت المحرك المستخدم والبوليمرات البلاستيكية المختلفة. يمكن تخصيص هذه المرحلة وفقا للمواد المتمردة ذات الاهتمام. الخطوة المهمة هي إضافة المادة المختارة إلى BH أو BHA كمصدر وحيد للكربون والتحقق من النمو الفطري مقابل التحكم بدون المادة المتمردة المضافة.

كان الهدف من اختبارات النمو على البلاستيك والهيدروكربونات هو تقييم ما إذا كان بإمكان الفطريات استخدام هذه المواد كمصدر وحيد للكربون من خلال مراقبة نموها نوعيا على المادة. لسوء الحظ ، بسبب العناد الشديد لهذه المواد ، من الصعب جدا تحديد الانخفاض الفعلي في وزن الركيزة وزيادة وزن الكتلة الحيوية الفطرية ، خاصة بعد فترة زمنية قصيرة نسبيا. إذا كان أداء السلالة الفطرية جيدا للغاية في اختبارات نمو الفحص هذه ، فيجب إجراء المزيد من الدراسات لتحديد تدهور المادة المتمردة.

تم اختيار الاختبارات الأنزيمية المستخدمة (القسم 3 من البروتوكول) لأنها أثبتت أنها فعالة وسريعة الأداء ، لكنها لا تنتج سوى نتائج نوعية. إنها تسلط الضوء على إمكانات التدهور لسلالة فطرية ، لكنها لا تستطيع تحديدها كميا بدقة. إذا تم عزل سلالة ذات أهمية خاصة ، فيمكن إجراء المزيد من الاختبارات ، مثل مقالات الإنزيم الكمي الطيفي الضوئي ، لوصف النشاط الأيضي بشكل أكثر دقة. كان الاختبار الأنزيمي الوحيد الذي أظهر فعالية دون المستوى الأمثل هو اختبار البروتياز النوعي ، مع عدد قليل من السلالات القادرة على النمو على وسط YES. في الواقع ، تشير النسبة المئوية العالية من السلالات القادرة على النمو على PUR إلى أن الفطريات أنتجت البروتياز المشاركة في كسر روابط الأميد واليوريثان ، مع استهداف الإستراز لروابط الإستر40. يشير الغياب شبه الكامل للفطريات المنتجة للبروتياز إلى احتمال وجود مشكلة في الطريقة المستخدمة. يمكن اعتماد اختبارات أخرى لنشاط الأنزيم البروتيني ، مثل الكازين41 أو الحليب منزوع الدسم 42 أو مسحوق الحليب43 اختبارات لوحة أجار. أثبت اختبار حمض الغال أنه مفيد جدا للكشف عن إنتاج الإنزيمات المحللة للجينينوليتيك ، ولكن لسوء الحظ ، لم يكن محددا للغاية ولم يستطع التمييز بين نوع الإنزيم المحلل للجينينو المنتج (إما البيروكسيديات أو اللاكسيدات).

وتشير نتائج هذا العمل إلى أن استخدام اللجنوسليلوز أو الأحماض الدبالية كوسائط انتقائية يسمح بعزل السلالات الفطرية ذات القدرة على المعالجة البيولوجية عن التنوع البيولوجي الغني بالتربة. في الواقع ، كان أكثر من 70٪ من السلالات الفطرية المعزولة بالطرق الانتقائية قادرة على النمو على الفازلين أو زيت المحرك المستخدم ، و 60٪ كانت قادرة على النمو على بوليمرات بلاستيكية مختلفة كمصدر وحيد للكربون. علاوة على ذلك ، وصفت الاختبارات الأنزيمية النوعية النشاط الأيضي لهذه الفطريات المرتبطة بعمليات التحلل البيولوجي. يوصى باختيار السلالات الفطرية التي تظهر نشاط +++ في اختبار واحد أو أكثر لأنه يزيد من فرص العثور على سلالة فطرية نشطة للغاية في المعالجة الحيوية. أظهرت الاختبارات التي تستخدم كروماتوغرافيا كتلة الغاز (GC-MS) على المواد المتمردة بعد ملامسة السلالات الفطرية المختارة مع اختبارات الفحص الخاصة بنا التحلل البيولوجي الفعلي للمواد 9,44. وسيسمح استخدام اختبارات الفحص البسيطة هذه في النظم الإيكولوجية المختلفة بالتحقيق في التنوع البيولوجي الفطري في التربة المختلفة. إن البحث عن الفطريات التي يمكن أن تتحلل المواد المتمردة سيزيد من عدد السلالات المحددة التي لديها القدرة على المعالجة البيولوجية ويساعد على معالجة المشكلة المتزايدة للتلوث البيئي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

نحن نقدر Scuola di Alta Formazione Dottorale (SAFD) من جامعة بافيا والبروفيسور سولفيغ توسي لإتاحة الفرصة لهذا العمل.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 microwell plate Greiner bio-one 650185
Agar VWR 84609.05
Bushnell-Haas Broth Fluka B5051
CaCl2 Sigma-Aldrich C5670
Chloroamphenicol Eurobio GABCRL006Z
Chlortetracycline Sigma-Aldrich Y0001451
CoCl2·6H2O Sigma-Aldrich C8661
CuCl2·2H2O Sigma-Aldrich C3279
Ethanol VWR Chemicals 20821.296
FeCl3·6H2O Sigma-Aldrich 236489
Filter 0.2 µm Whatman 10462200
gallic acid Sigma-Aldrich G7384
Glass cover slips Biosigma VBS634
Glass vials 15 mL SciLabware P35467
guaiacol Sigma-Aldrich G5502
High-density polyethylene (HDPE) Sigma-Aldrich 434272
Humic acids Aldrich Chemistry 53680
K2HPO4 Sigma-Aldrich P8281
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5655
Lignocellulose / / Sterilized bioethanol production waste
L-shaped cell spreader Laboindustria S.p.a 21133
magnetic stirrer A.C.E.F 8235
Malt Extract Broth Sigma-Aldrich 70146
MgSO4·7H2O Sigma-Aldrich M2643
Micropipette 1000 μL Gilson FA10006M
Micropipette 200  μL Gilson FA10005M
MnCl2·4H2O Sigma-Aldrich M5005
Na2MoO4·2H2O Sigma-Aldrich M1651
NaCl Sigma-Aldrich S5886
Neomycin Sigma-Aldrich N0401000
Penicillin Sigma-Aldrich 1504489
peptone Sigma-Aldrich 83059
Polyethylene terephthalate (PET) Goodfellow ES306031
Petri dishes Laboindustria S.p.a 21050
Petrolatum (Paraffin liquid) A.C.E.F 009661
Potato Dextrose Broth Sigma-Aldrich P6685
Polystyrene (PS) Sigma-Aldrich 331651
Polyurethane (PUR) Sigma-Aldrich GF20677923
Polyvinyl chloride (PVC) Sigma-Aldrich 81388
Sterile falcon tube Greiner bio-one 227 261
Sterile glass vials 20 mL Sigma-Aldrich SU860051
Sterile point 1000  μL Gilson F172511
Sterile point 200  μL Gilson F172311
Sterile polyethylene bags WHIRL-PAK B01018
sterile syringe Rays 5523CM25
Streptomycin Sigma-Aldrich S-6501
Tween 80 Sigma-Aldrich P1754
Used engine oil / / complex mixture of hydrocarbons, engine additives, and metals, provided by an Italian private company
Vials 50 mL Sigma-Aldrich 33108-U
ZnCl2 Sigma-Aldrich Z0152

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mohammadi, K., Heidari, G., Khalesro, S., Sohrabi, Y. Soil management, microorganisms and organic matter interactions: A review. African Journal of Biotechnology. 10 (86), 19840-19849 (2011).
  2. Daccò, C., Girometta, C., Asemoloye, M. D., Carpani, G., Picco, A. M., Tosi, S. Key fungal degradation patterns, enzymes and their applications for the removal of aliphatic hydrocarbons in polluted soils: A review. International Biodeterioration and Biodegradation. 147, (2020).
  3. Asemoloye, M. D., Ahmad, R., Jonathan, S. G. Synergistic action of rhizospheric fungi with Megathyrsus maximus root speeds up hydrocarbon degradation kinetics in oil polluted soil. Chemosphere. 187, 1-10 (2017).
  4. Abatenh, E., Gizaw, B., Tsegaye, Z., Wassie, M. The role of microorganisms in bioremediation - A review. Open Journal of Environmental Biology. 2, 038-046 (2017).
  5. Dix, N. J., Webster, J. Fungal Ecology. , Chapman & Hall. Cambridge, UK. (1995).
  6. Magan, N. Fungi in extreme environment. Environmental and Microbial Relationships. The Mycota. Esser, K., Lemke, P. A. 4, Springer. Berlin, Heidelberg. 99-114 (2007).
  7. Aranda, E. Promising approaches towards biotransformation of polycyclic aromatic hydrocarbons with Ascomycota fungi. Current Opinion in Biotechnology. 38, 1-8 (2016).
  8. Hasan, I. F., AI-Jawhari, Role of Filamentous Fungi to Remove Petroleum Hydrocarbons from the Environment. Microbial Action on Hydrocarbons. Kumar, V., Kumar, M., Prasad, R. , Springer. Singapore. (2018).
  9. Daccò, C., et al. Trichoderma: evaluation of its degrading abilities for the bioremediation of hydrocarbon complex mixtures. Applied Sciences. 10 (9), 3152 (2020).
  10. Alarcón, A., Davies, F. T., Autenrieth, R. L., Zuberer, D. A. Arbuscular mycorrhiza and petroleum-degrading microorganisms enhance phytoremediation of petroleum-contaminated soil. International Journal of Phytoremediation. 10, 251-263 (2008).
  11. Mancera-López, M. E., et al. Bioremediation of an aged hydro-carbon-contaminated soil by a combined system of biostimulation-bioaugmentation with filamentous fungi. International Biodeterioration and Biodegradation. 61, (2008).
  12. Hatami, E., Abbaspour, A., Dorostkar, V. Phytoremediation of a petroleum-polluted soil by native plant species in Lorestan Province, Iran. Environmental Science and Pollution Research. 26, 24323-24330 (2019).
  13. Prenafeta-Boldú, F. X., De Hoog, G. S., Summerbell, R. C. Fungal communities in hydrocarbon degradation. Microbial Communities Utilizing Hydrocarbons and Lipids: Members, Metagenomics and Ecophysiology. Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology. , Springer. Cham. 1-36 (2018).
  14. Gu, J., Ford, T., Mitton, D., Mitchell, R. Microbiological degradation of polymeric materials. Uhlig's Corrosion Handbook. , John Wiley and Sons. 421-438 (2011).
  15. Tuomela, M., Hatakka, A. Oxidative fungal enzymes for bioremediation. Comprehensive Biotechnology: Environmental and Related Biotechnologies. 6, Elsevier. 224-239 (2019).
  16. DSouza, G. C., et al. Fungal biodegradation of low-density polyethylene using consortium of Aspergillus species under controlled conditions. Heliyon. 7 (5), 07008 (2021).
  17. El-Sayed, M. T., Rabie, G. H., Hamed, E. A. Biodegradation of low-density polyethylene (LDPE) using the mixed culture of Aspergillus carbonarius and A. fumigates. Environment, Development, and Sustainability. 23 (10), 14556-14584 (2021).
  18. Sepperumal, U., Markandan, M., Palraja, I. Micromorphological and chemical changes during biodegradation of polyethylene terephthalate (PET) by Penicillium sp. Journal of Microbiology and Biotechnology Research. 3 (4), 47-53 (2013).
  19. Leitão, A. L. Potential of Penicillium species in the bioremediation field. International Journal of Environmental Research and Public Health. 6 (4), 1393-1417 (2009).
  20. Chen, S. H., Ting, A. S. Y. Biosorption and biodegradation potential of triphenylmethane dyes by newly discovered Penicillium simplicissimum isolated from indoor wastewater sample. International Biodeterioration & Biodegradation. 103, 1-7 (2015).
  21. Orhan, Y., Buyukgungor, H. Enhancement of biodegradability of disposable polyethylene in controlled biological soil. International Biodeterioration and Biodegradation. 45, 49-55 (2000).
  22. Deshmukh, R., Khardenavis, A. A., Purohit, H. J. Diverse metabolic capacities of fungi for bioremediation. Indian journal of microbiology. 56 (3), 247-264 (2016).
  23. Viswanath, B., Rajesh, B., Janardhan, A., Kumar, A. P., Narasimha, G. Fungal laccases and their applications in bioremediation. Enzyme research. 2014, 163242 (2014).
  24. Ali, M., Husain, Q., Ishqi, H. M. Fungal peroxidases mediated bioremediation of industrial pollutants. Fungal Bioremediation. , CRC Press. Boca Raton. (2019).
  25. Nousiainen, P., Kontro, J., Manner, H., Hatakka, A., Sipilä, J. Phenolic mediators enhance the manganese peroxidase catalyzed oxidation of recalcitrant lignin model compounds and synthetic lignin. Fungal Genetics and Biology. 72, 137-149 (2014).
  26. Srivastava, S., Kumar, M. Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs): A sustainable approach. Sustainable Green Technologies for Environmental Management. , Springer. Singapore. (2019).
  27. Wei, R., Zimmermann, W. Microbial enzymes for the recycling of recalcitrant petroleum-based plastics: how far are we. Microbial Biotechnology. 10 (6), 1308-1322 (2017).
  28. Matsubara, M., Lynch, J. M., De Leij, F. A. A. M. A simple screening procedure for selecting fungi with potential for use in the bioremediation of contaminated land. Enzyme and Microbial Technology. 39 (7), 1365-1372 (2006).
  29. Mann, J., et al. Screening and selection of fungi for bioremediation of olive mill wastewater. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 26 (3), 567-571 (2010).
  30. Andlar, M., Rezić, T., Marđetko, N., Kracher, D., Ludwig, R., Šantek, B. Lignocellulose degradation: an overview of fungi and fungal enzymes involved in lignocellulose degradation. Engineering in Life Sciences. 18, 768-778 (2018).
  31. Goméz-Toribio, V., García-Martín, A. B., Martínez, M. J., Martínez, A. T., Guillén, F. Induction of extracellular hydroxyl radical production by white-rot fungi through quinone redox cycling. Applied and Environmental Microbiology. 75, 3944-3953 (2009).
  32. Belcarz, A., Ginalska, G., Kornillowicz-Kowalska, T. Extracellular enzyme activities of Bjerkandera adusta R59 soil strain, capable of daunomycin and humic acids degradation. Applied Microbiology and Biotechnology. 68 (5), 686-694 (2005).
  33. Stevenson, F. J. Humus Chemistry: Genesis, Composition, Reactions. 2nd ed. , Wiley. New York. (1995).
  34. Andlar, M., et al. Lignocellulose degradation: An overview of fungi and fungal enzymes involved in lignocellulose degradation. Engineering in Life Sciences. 18 (11), 768-778 (2018).
  35. Lee, H., et al. Biotechnological procedures to select white rot fungi for the degradation of PAHs. Journal of Microbiological Methods. 97 (1), 56-62 (2014).
  36. Batista-García, R. A., et al. Simple screening protocol for identification of potential mycoremediation tools for the elimination of polycyclic aromatic hydrocarbons and phenols from hyperalkalophile industrial effluents. Journal of Environmental Management. 198, 1-11 (2017).
  37. Shleev, S. V., et al. Comparison of physico-chemical characteristics of four laccases from different basidiomycetes. Biochimie. 86 (9-10), (2004).
  38. Kiiskinen, L. L., Rättö, M., Kruus, K. Screening for novel laccase-producing microbes. Journal of Applied Microbiology. 97, (2004).
  39. Kumar, V. V., Rapheal, V. S. Induction and purification by three-phase partitioning of aryl alcohol oxidase (AAO) from Pleurotus ostreatus. Applied Biochemistry and Biotechnology. , 163 (2011).
  40. Loredo-Treviño, A., Gutiérrez-Sánchez, G., Rodríguez-Herrera, R., Aguilar, C. N. Microbial enzymes involved in polyurethane biodegradation: a review. Journal of Polymers and the Environment. 20 (1), 258-265 (2012).
  41. Garriga, M., et al. Technological and sensorial evaluation of Lactobacillus strains as starter cultures in fermented sausages. International Journal of Food Microbiology. 32 (1-2), 173-183 (1996).
  42. Zerdani, I., Faid, M., Malki, A. Feather wastes digestion by new isolated strains Bacillus sp. In microcco. African Journal of Biotechnology. 3 (1), 67-70 (2004).
  43. Nygren, C. M., Edqvist, J., Elfstrand, M., Heller, G., Taylor, A. F. Detection of extracellular protease activity in different species and genera of ectomycorrhizal fungi. Mycorrhiza. 17 (3), 241-248 (2007).
  44. Asemoloye, M. D., et al. Hydrocarbon degradation and enzyme activities of Aspergillus oryzae and Mucor irregularis isolated from Nigerian crude oil-polluted sites. Microorganisms. 8 (12), 1912 (2020).

Tags

علم الأحياء، العدد 183، الفطريات، التربة، التنوع البيولوجي، المعالجة البيولوجية، اختبار الفحص، الهيدروكربونات، البلاستيك، النشاط الأنزيمي
عزل الفطريات المشاركة في تدهور المواد المتمردة وفحصها من التنوع البيولوجي للتربة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Temporiti, M. E. E., Daccò, C., … More

Temporiti, M. E. E., Daccò, C., Nicola, L. Isolation and Screening from Soil Biodiversity for Fungi Involved in the Degradation of Recalcitrant Materials. J. Vis. Exp. (183), e63445, doi:10.3791/63445 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter