Summary
Hier stellen wir ein Protokoll für das Screening der Bodenbiodiversität vor, um nach Pilzstämmen zu suchen, die am Abbau von widerspenstigen Materialien beteiligt sind. Zuerst werden Pilzstämme, die auf Huminsäuren oder Lignocellulose wachsen können, isoliert. Ihre Aktivität wird dann sowohl in enzymatischen Assays als auch an Schadstoffen wie Kohlenwasserstoffen und Kunststoffen getestet.
Abstract
Umweltverschmutzung ist ein zunehmendes Problem, und die Identifizierung von Pilzen, die am Bioremediationsprozess beteiligt sind, ist eine wesentliche Aufgabe. Der Boden beherbergt eine unglaubliche Vielfalt an mikrobiellem Leben und kann eine gute Quelle für diese bioremediativen Pilze sein. Diese Arbeit zielt darauf ab, nach Bodenpilzen mit Bioremediationspotenzial zu suchen, indem verschiedene Screening-Tests verwendet werden. Als Wachstumstests wurden mineralische Kulturmedien verwendet, die mit widerspenstigen Substanzen als einzige Kohlenstoffquelle ergänzt wurden. Zunächst wurden Bodenverdünnungen auf Petrischalen mit mineralischem Medium plattiert, das mit Huminsäuren oder Lignocellulose versetzt war. Die wachsenden Pilzkolonien wurden isoliert und auf verschiedenen Substraten getestet, wie komplexen Mischungen von Kohlenwasserstoffen (Petrolatum und gebrauchtes Motorenöl) und Pulvern verschiedener Kunststoffpolymere (PET, PP, PS, PUR, PVC). Qualitative enzymatische Tests wurden mit den Wachstumstests verbunden, um die Produktion von Esterasen, Laccases, Peroxidasen und Proteasen zu untersuchen. Diese Enzyme sind an den Hauptabbauprozessen von widerspenstigem Material beteiligt, und ihre konstitutive Sekretion durch die untersuchten Pilzstämme könnte das Potenzial haben, für die Bioremediation genutzt zu werden. Mehr als 100 Stämme wurden isoliert und getestet, und es wurden mehrere Isolate mit gutem Bioremediationspotenzial gefunden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die beschriebenen Screening-Tests eine einfache und kostengünstige Methode sind, um Pilzstämme mit Bioremediationspotenzial aus dem Boden zu identifizieren. Darüber hinaus ist es möglich, die Screening-Tests für verschiedene Schadstoffe je nach Bedarf anzupassen, indem anderen widerspenstigen Substanzen Minimalkulturmedien zugesetzt werden.
Introduction
Der Boden ist ein grundlegender Bestandteil des Lebens auf der Erde und die Grundlage vieler Ökosysteme. Die Mineralien, organischen Stoffe und Mikroorganismen im Boden können als ein System betrachtet werden, wobei enge Assoziationen und Wechselwirkungen zwischen ihnen auftreten. Die Wechselwirkungen dieser Verbindungen haben einen wichtigen Einfluss auf terrestrische Prozesse, die Umweltqualität und die Gesundheit des Ökosystems1. Die Bodenverschmutzung stellt weltweit ernste Umweltprobleme dar. Die wahllose, langfristige und übermäßige Anwendung von widerspenstigen und toxischen Substanzen wie Pestiziden, Erdölprodukten, Kunststoffen und anderen Chemikalien hat schwerwiegende Auswirkungen auf die Bodenökologie und kann infolgedessen die Mikrobiota des Bodens verändern. Mikrobielle Gemeinschaften in Böden bestehen aus einer Vielzahl von Organismen in verschiedenen physiologischen Zuständen, wobei die Mehrheit Bakterien und Pilze sind. Viele der Schadstoffe in Böden haben eine mittel- bis langfristige Stabilität, und ihre Persistenz kann zur Entwicklung adaptiver Mechanismen führen, die es den Mikroorganismen ermöglichen, widerspenstige Substanzen als Nährstoffe zu verwenden 2,3. Diese Mikroorganismen können daher für Bioremediationstechniken in Betracht gezogen werden.
Bioremediation versucht, die Auswirkungen der Umweltverschmutzung zu mildern, indem Mikroorganismen und ihre Enzyme für den Abbau oder die Umwandlung von Abfällen in weniger toxische oder ungiftige Verbindungen verwendet werden. Verschiedene Arten von Archaeen, Bakterien, Algen und Pilzen besitzen diese Bioremediationsfähigkeit4. Aufgrund ihrer besonderen biologisch abbaubaren Wirkung sind Pilze besonders vielversprechende Organismen für die Bioremediation. Sie können verschiedene Substrate mit ihrem Hyphennetzwerk angreifen, wodurch sie effizienter in die Bodenmatrix eindringen können als andere Mikroorganismen. Darüber hinaus können sie unzugängliche Zwischenräume erreichen, an denen Verunreinigungen schwer zu entfernen sind5, und sie können auch niedrige Feuchtigkeitswerteüberleben 6. Darüber hinaus synthetisieren Pilze verschiedene Kassetten unspezifischer Enzyme, in der Regel, um natürliche widerspenstige Substanzen wie Cellulose, Lignin und Huminsäuren abzubauen. Diejenigen, denen das Zielsubstrat fehlt, können am Abbau einer Vielzahl von widerspenstigen Schadstoffen wie Kohlenwasserstoffen, Kunststoffen und Pestiziden beteiligt sein 7,8,9,10. Obwohl bereits viele Pilzarten als Bioremediationsmittel gemeldet wurden, steigt das Interesse an der Erforschung von Arten, die noch nicht untersucht wurden, um Kandidaten für die Bioremediation von widerspenstigen kontaminierenden Substanzen auszuwählen. Die Arten, von denen bereits bekannt ist, dass sie Bioremediationseigenschaften haben, gehören zu den Stämmen Ascomycota 11,12,13, Basidiomycota 14,15 und Mucoromycota. Zum Beispiel sind die Gattungen Penicillium und Aspergillus bekanntermaßen am Abbau von aliphatischen Kohlenwasserstoffen 13, verschiedenen Kunststoffpolymeren16,17,18, Schwermetallen 19 und Farbstoffen20 beteiligt. In ähnlicher Weise haben Studien, die an Basidiomycetes-Pilzen wie Phanerochaete Chrysosporium und Trametes versicolor durchgeführt wurden, ihre Beteiligung an der Oxidation von widerspenstigen Materialien wie aromatischen Kohlenwasserstoffen13 und Kunststoffen21 gezeigt. Ein weiteres Beispiel für Pilze, die an den biologischen Abbauprozessen beteiligt sind, sind die Zygomyceten Rhizopus spp., Mucor spp. und Cunninghamella spp.22,23. Insbesondere Cunninghamella ist in der Lage, aromatische Kohlenwasserstoffe zu oxidieren und gilt als Modellorganismus für die Untersuchung der Entgiftung von Produkten aus einer breiten Palette von Xenobiotika13.
Es gibt mehrere Pilzenzyme, die an den wichtigsten Abbauprozessen von widerspenstigen Materialienbeteiligt sind 24,25, wie Esterase, Laccase, Peroxidase und Protease. Laccasen sind kupferhaltige Oxidasen, die in der Zelle produziert und anschließend sezerniert werden, die die Oxidation einer Vielzahl von phenolischen und aromatischen Verbindungen ermöglichen. Sie können Ortho- und Paradiphenole, die aminogruppenhaltigen Phenole, Lignin und die Arylgruppen-haltigen Diamine26 abbauen. Peroxidasen verwenden Wasserstoffperoxid als Mediator, um Lignin und andere aromatische Verbindungen abzubauen. Es gibt viele verschiedene Peroxidasen, aber diejenigen mit dem größten Potenzial, toxische Substanzen abzubauen, sind Ligninperoxidase und Manganperoxidase27.
Esterasen und Proteasen gehören zur Gruppe der extra- oder ektozellulären Enzyme, die außerhalb ihrer Ursprungszellen wirken, aber dennoch an sie gebunden sind. Diese Enzyme können die Hydrolyse großer widerspenstiger Moleküle in kleinere katalysieren. Aufgrund ihrer geringen Substratspezifität können diese Enzyme eine Schlüsselrolle bei der Bioremediation verschiedener Schadstoffe wie Textilfarbstoffe, Abwässer aus der Zellstoff- und Papierindustrie und Ledergerbung, Erdölprodukte, Kunststoffe und Pestizidespielen 28,29,30.
Eine Reihe von Screening-Methoden zur Auswahl für bioremediative Pilzstämme wurde bereits veröffentlicht. Zum Beispiel wurde Agarmedium auf Strohbasis verwendet, um nach Weißfäulepilzen mit hohem Potenzial im Abbau polyzyklischer aromatischer Kohlenwasserstoffe (PAK) zu suchen31; und kleine Stücke von verrottendem Holz wurden auf Malzextraktagar (MEA) gelegt, um holzverrottende Pilze32 zu isolieren. Die meisten der bereits vorgeschlagenen Methoden wählen jedoch sehr spezifische Pilze für ihre interessierende Aktivität aus. Diese Forschung schlägt einen breiteren Ansatz für die Auswahl von Bodenpilzen mit einem breiteren Wirkungsspektrum vor. Die Methode beruht auf der anfänglichen Beschichtung von seriellen Verdünnungen von Bodenproben auf ein Medium, das mit Huminsäuren oder Lignocellulose, gemischt mit Antibiotika, modifiziert ist, um Pilze auszuwählen, die diese natürlichen widerspenstigen Substanzen abbauen können. Huminsäuren und Lignocellulose sind in der Tat Substanzen, die extrem resistent gegen biologischen Abbau sind, da sie sehr komplexe molekulare Strukturen haben, und dies ermöglicht es ihnen, ausgezeichnete Indikatoren für die Abbaufähigkeit der getesteten Pilzezu sein 33,34. Anschließend werden die in den ersten Tests ausgewählten Pilze untersucht, um diejenigen zu identifizieren, die das Potenzial haben, bestimmte Schadstoffe wie Petrolatum, gebrauchtes Motoröl und Kunststoffe abzubauen. Schließlich werden qualitative enzymatische Tests durchgeführt, um Pilzstämme nachzuweisen, die in der Lage sind, Enzyme zu produzieren, die an den biologischen Abbauprozessen widerspenstiger Substanzen beteiligt sind. Zu diesem Zweck werden Protease- und Esterasetests durchgeführt, während Gallussäure und Guajakol als Indikatoren für die Produktion von Laccase- und anderen ligninolytischen Enzymenverwendet werden 35,36. Diese Substrate werden verwendet, weil eine starke Korrelation zwischen der Fähigkeit von Pilzen, sie zu ihrer braunen Form zu oxidieren, und dem Besitz der ligninolytischen Fähigkeit37,38,39 gefunden wurde.
Durch diese Protokolle ist es möglich, Pilzstämme mit hohem Abbaupotenzial und einem breiten Wirkungsspektrum direkt aus Bodenproben zu isolieren. Die Isolierung dieser Pilzstämme könnte dazu beitragen, neue Kandidaten für die Bioremediation zu finden.
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Protocol
1. Auswahl von Pilzstämmen, die in der Lage sind, widerspenstige Materialien aus dem Boden abzubauen
- Herstellung von antibiotischer Lösung.
- Penicillin (50 mg / L), Streptomycin (40 mg / L), Chlortetracyclin (40 mg / L), Neomycin (100 mg / L) und Chloramphenicol (100 mg / L) in 250 ml deionisiertes steriles Wasser.
- Bevor Sie Chloramphenicol in die antibiotische Lösung geben, lösen Sie es in 3 ml ≥99% Ethanol auf.
- Legen Sie die antibiotische Lösung für 10 min auf einen Magnetrührer (keine Hitze) mit einem magnetischen Rührstab in die Lösung. Lagern Sie es bei 4 ° C.
- Aufbereitung von Wachstumsmedien.
- Geben Sie 1 g handelsübliche Huminsäure, 3,26 g Bushnell-Haas-Brühe (BH) und 15 g Agar in 1 l entionisiertes Wasser und autoklavieren Sie es für 20 min bei 121 ° C (Huminsäureagar).
- Den Huminsäure-Agar unter einem Laminar-Flow-Gehäuse in Petrischalen auffüllen.
- Geben Sie 4 g Lignocellulose, 3,26 g BH und 15 g Agar in 1 L deionisiertes Wasser und autoklavieren Sie es für 20 min bei 121 ° C (Lignocellulose-Agar).
- Den Lignocellulose-Agar unter einem Laminar-Flow-Schrank in Petrischalen auffüllen.
- Nachdem die Medien in den Petrischalen erstarrt sind, geben Sie unter einem Laminar-Flow-Schrank 1 ml der antibiotischen Lösung mit einer sterilen Spritze mit einem 0,2-μm-Filter auf die vorbereiteten Platten, um sie zu sterilisieren.
- Verteilen Sie die antibiotische Lösung mit einem sterilen Einweg-L-förmigen Zellstreuer gleichmäßig auf den Plattenoberflächen und lassen Sie sie unter dem Laminar-Flow-Gehäuse an der Luft trocknen.
- 20 g Malzextraktbrühe und 15 g Agar in 1 L entionisiertes Wasser geben und 20 min bei 121 °C (Malzextraktagar - MEA) autoklavieren.
- Die MEA unter einem Laminar-Flow-Schrank in Petrischalen auffüllen.
- Bodenproben und Bodenverdünnungen.
- Probieren Sie den interessierenden Boden in einer Tiefe von 10 cm, entfernen Sie Pflanzen, Gras und abgestorbene Blätter aus der obersten Schicht und legen Sie ihn in sterile Polyethylenbeutel.
- Nachdem Sie das Labor erreicht haben, sieben Sie den Boden mit einem 2-mm-Netz und entfernen Sie alle Wurzeln und Pflanzenreste.
- Wenn es nicht möglich ist, sofort mit der nachgelagerten Analyse fortzufahren, lagern Sie die gesiebten Bodenproben bei 4 °C.
- Arbeiten Sie unter einem Laminar-Flow-Schrank und geben Sie 1 g des gesiebten Bodens in ein steriles 15-ml-Rohr mit 10 ml sterilem deionisiertem Wasser (1 x 10-1 Verdünnung). Schütteln Sie das Rohr horizontal für 30 min.
- Nehmen Sie unter einem Laminar-Flow-Schrank, bevor sich die Suspension setzt, 1 ml der 1 x 10-1-Verdünnung mit einer sterilen Pipette und geben Sie sie in einen 9 ml deionisierten Wasserrohling (1 x 10-2-Verdünnung). Wirbeln Sie es gründlich ein.
- Bevor sich die Suspension absetzt, nehmen Sie 1 ml der 1 x 10-2 Verdünnung mit einer sterilen Pipette und geben Sie sie in einen 9 ml deionisierten Wasserrohling (1 x 10-3 Verdünnung). Wirbeln Sie es gründlich ein.
- Beschichtung von Bodenverdünnungen auf selektiven Medien.
- In einem Laminar-Flow-Schrank werden 100 μL der 1 x 10-3-Verdünnung mit einer Mikropipette mit steriler Stelle gesammelt und auf eine Humus-Agar-Petrischale übertragen. Tun Sie dies für mindestens 4 oder 5 Petrischale.
- Verteilen Sie die Verdünnung gleichmäßig auf der Petrischalenoberfläche mit einem sterilen Einweg-L-förmigen Zellstreuer.
- Lassen Sie es 10-15 min unter dem Laminar-Flow-Schrank an der Luft trocknen.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.4.1.-1.4.3. Verwendung von Lignocellulose-Petrischale.
- Bei 25 °C im Dunkeln maximal 15 Tage inkubieren.
- Isolierung von Pilzkolonien, die von selektiven Medien zu Wachstumsmedien gezüchtet werden.
- Ab 3 Tagen nach der Zubereitung überprüfen Sie die vorbereiteten selektiven Medien-Petrischalen täglich für maximal 15 Tage auf das Wachstum von Pilzkolonien.
- Überprüfen Sie alle vorhandenen Pilzkolonien auf Ähnlichkeiten. Bereiten Sie bei Bedarf einen Objektträger vor, der unter einem Lichtmikroskop beobachtet werden soll.
HINWEIS: Das Ziel ist es, die höchste Anzahl von Pilzkolonien zu isolieren, aber es ist notwendig, zu vermeiden, dass immer derselbe Pilzstamm von verschiedenen Platten isoliert wird, daher ist diese Überprüfung sehr wichtig. Suchen Sie nach Kolonien mit unterschiedlicher Makro- und Mikromorphologie. - Isolieren Sie unter einem Laminar-Flow-Schrank oder an einem Bunsenbrenner jeden ausgewählten Pilzstamm, indem Sie vorsichtig einen kleinen Teil des Myzels mit einer sterilen Impfnadel aus der Kolonie entfernen und in eine neue MEA-Petrischale überführen.
HINWEIS: In dieser Phase ist es sehr wichtig, empfindlich und präzise zu sein, da ein hohes Risiko einer Kontamination durch die anderen Pilzkolonien besteht, die in der ursprünglichen Petrischale vorhanden sind. Wenn mehr als ein Pilzstamm auf der geimpften MEA-Platte wächst, wiederholen Sie Schritt 1.5.3. - 7 Tage bei 25 °C im Dunkeln inkubieren. Dies sind die Pilzstämme, die weiter auf bestimmte widerspenstige Substanzen getestet werden sollen.
2. Wachstumstests an widerspenstigen Stoffen
- Wachstumstest auf Petrolatum.
- 20 ml flüssiges BH (3,26 g/L BH) in 50 ml Fläschchen geben und durch Autoklavieren bei 121 °C für 20 min sterilisieren.
- Geben Sie 7 ml deionisiertes Wasser in 15 ml Glasfläschchen und fügen Sie einige Stücke zerbrochener Glasabdeckungen in jede Durchstechflasche hinzu.
- Sterilisieren Sie sie durch Autoklavieren bei 121 °C für 20 min.
- Unter dem Laminar-Flow-Kabinett 1 ml Vaseline mit einer sterilen Pipette in jede 50 ml BH-Durchstechflasche geben. Bewahren Sie einige Fläschchen mit nur BH als Negativkontrolle auf.
- Unter dem Laminar-Flow-Gehäuse wird das Myzel auf der Oberfläche des Mediums mit den ausgewählten Pilzstämmen (vorbereitet in Schritt 1.5.3.) mit einer sterilen Nadel von den MEA-Platten entfernt und mit den zerbrochenen Deckgläsern auf 15 ml Glasfläschchen übertragen.
- Agitieren Sie jedes Fläschchen auf einem Wirbelmischer für 2 min, so dass die gebrochenen Deckgläser den Würfel der Pilzkolonie schneiden können, wodurch eine Pilzsuspension entsteht.
- Beimpfen Sie jede Petrolatum-Durchstechflasche mit 200 μL Pilzspension. Machen Sie zwei Replikate für jeden Pilzstamm.
- Für die Negativkontrolle geben Sie 200 μL Pilzsuspension in Durchstechflaschen mit nur flüssigem BH. Bewahren Sie außerdem ein paar Fläschchen mit Petrolatum ohne Pilzimpfung auf, um nach einer Kontamination im Medium zu suchen.
- Inkubieren Sie die Fläschchen bei 25 °C im Dunkeln und überprüfen Sie sie nach 15 Tagen und 30 Tagen nach dem Impfstoff.
- Wachstumstest an gebrauchtem Motoröl.
- Geben Sie 3,26 g BH und 15 g Agar in 1 L deionisiertes Wasser und autoklavieren Sie es für 20 min bei 121 °C (BHA).
- Die BHA unter einem Laminar-Flow-Schrank in Petrischalen auffüllen.
- Wenn es erstarrt ist, übertragen Sie 500 μL gebrauchtes Motoröl auf die BHA Petrischalen und verteilen Sie es gleichmäßig auf den Plattenoberflächen mit einem sterilen Einweg-L-förmigen Zellstreuer.
- Jede verbrauchte Maschinenöl-BHA-Platte wird mit jedem Pilzstamm beimpft und das Myzel aus den in Schritt 1.5.3 hergestellten Platten gesammelt. Arbeiten Sie an einem Bunsenbrenner oder unter einer Laminar-Flow-Haube, um eine Kontamination zu vermeiden. Machen Sie zwei Replikate für jeden Pilzstamm.
- Für die Negativkontrolle impfen Sie die Petrischalen nur mit BHA. Bewahren Sie außerdem ein paar gebrauchte Motoröl-BHA-Petrischalen ohne Pilzimpfung auf, um nach Verunreinigungen im Medium zu suchen.
- Die Petrischalen bei 25 °C im Dunkeln ausbrüten und nach 15 Tagen und 30 Tagen ab dem Impfstoff überprüfen.
- Wachstumstest an Kunststoffen.
- 200 μL Pilzsuspension (Schritte 2.1.5.-2.1.6.) in eine 96-Mikrowellenplatte übertragen. Machen Sie drei Repliken der Pilzstamm-Kunststoff-Kombination.
- Zu jeder Vertiefung mit der Pilzsuspension fügen Sie 10 mg einer anderen Art von Kunststoffpulver hinzu (Polyethylenterephthalat - PET, Polyvinylchlorid - PVC, Polyethylen hoher Dichte - HDPE, Polystyrol - PS, Polyurethan - PUR).
- Für die Negativkontrolle, anstatt das Kunststoffpulver hinzuzufügen, fügen Sie 200 μL sterilisierte BH-Lösung in die Vertiefung mit der Pilzsuspension hinzu. Darüber hinaus füllen Sie für jede Art von Kunststoffpulver eine Vertiefung mit 200 μL sterilisierter BH-Lösung und 10 mg jedes Kunststoffstaubs, um auf Verunreinigungen des Mediums zu prüfen.
- Die Mikrotiterplatten bei 25 °C im Dunkeln inkubieren und nach 15 Tagen und 30 Tagen ab dem Inokulum überprüfen.
3. Qualitative enzymatische Tests
- Qualitativer ligninolytischer Enzym kolorimetrischer Test.
- 27 g Kartoffeldextrosebrühe (PD) und 15 g Agar in 1 L entionisiertes Wasser geben und 20 min bei 121 °C (PDA) autoklavieren.
- Wenn das Medium etwas abgekühlt ist, aber immer noch flüssig ist, fügen Sie Gallussäure (5 g / L) unter einer laminaren Flow-Haube hinzu und füllen Sie das Medium in Petrischalen auf.
- Die PDA + Gallussäureplatten werden mit jedem Pilzstamm beimpft und das Myzel aus den in Schritt 1.5.3 hergestellten Platten gesammelt. Arbeiten Sie an einem Bunsenbrenner oder unter einer Laminar-Flow-Haube, um eine Kontamination zu vermeiden.
- Als Negativkontrollen Petrischalen nur mit PDA (keine Gallussäure) zubereiten und mit den Pilzstämmen (eine für jeden Pilzstamm) sowie einer Petrischale mit PDA + Gallussäure und ohne Pilzimpfung impfen.
- Brüten Sie die Petrischalen bei 25 °C im Dunkeln aus und überprüfen Sie sie nach 7 Tagen ab dem Impfstoff.
- Qualitativer kolorimetrischer Laccase-Test.
- Geben Sie 27 g PD und 15 g Agar in 1 L entionisiertes Wasser und autoklavieren Sie es für 20 min bei 121 °C (PDA).
- Wenn das Medium etwas abgekühlt ist, aber immer noch flüssig ist, Guaiacol (400 μL/L) unter eine laminare Haube geben und in Petrischalen geben.
- Die PDA + Guaiacolplatten werden mit jedem Pilzstamm beimpft und das Myzel aus den in Schritt 1.5.3 hergestellten Platten gesammelt. Arbeiten Sie an einem Bunsenbrenner oder unter einer Laminar-Flow-Haube, um Verunreinigungen zu vermeiden.
- Als Negativkontrollen Petrischalen nur mit PDA (kein Guaiacol) zubereiten und mit den Pilzstämmen (einer für jeden Pilzstamm) sowie einer Petrischale mit PDA + Guaiacol und ohne Pilzimpfung impfen.
- Brüten Sie die Petrischalen bei 25 °C im Dunkeln aus und überprüfen Sie sie nach 7 Tagen ab dem Impfstoff.
- Qualitativer Proteasentest.
- Das YES-Medium wird durch Zugabe von K2 HPO 4 (1 g/L),KH2PO4 (0,5 g/L), MgSO 4·7H2O(0,5 g/L), MnCl 2·4H 2 O (0,001 g/L), CuCl 2·2H2 O(1,4 x 10-5 g/L), ZnCl 2 (1,1 x 10-5 g/L), CoCl 2·6H2O (2 x 10-5 g/L), Na2MoO4·2H2O (1,3 x 10-5 g/L), FeCl3·6H2O (7,5 x 10-5 g/L) und Gelatine/Pepton (0,02 g/L) zu entionisiertem Wasser.
- Legen Sie das JA-Medium für 10 min auf einen Magnetrührer (keine Hitze) mit einem magnetischen Rührstab im Medium.
- Wenn sich alle Salze in das Medium aufgelöst haben, geben Sie 5 ml der Lösung in 20 ml sterile Glasdurchstechflaschen und autoklavieren Sie sie für 20 min bei 121 ° C.
- Für die Negativkontrolle bereiten Sie etwa 20 ml sterile Glasfläschchen mit 5 ml BH-Lösung vor und autoklavieren Sie sie für 20 min bei 121 °C.
- Übertragen Sie in einem Laminar-Flow-Kabinett 200 μL Pilzsuspension (Schritte 2.1.5.-2.1.6.) für jeden Stamm auf die YES medium sterilisierten Durchstechflaschen (mindestens 2 Replikate pro Pilzstamm). Fügen Sie für jeden Pilzstamm 200 μL derselben Pilzsuspension zu BH-sterilisierten Fläschchen hinzu, um eine Negativkontrolle zu erhalten.
- Die Fläschchen 21 Tage lang bei 25 °C im Dunkeln bebrüten und alle 7 Tage kontrollieren.
- Qualitativer Esterase-Test.
- Bereiten Sie das Tween 80-Medium vor, indem Sie Pepton (10 g / L), NaCl (5 g / L), CaCl2 (0,1 g / L) und 10 ml Tween 80 bis 1 L deionisiertes Wasser hinzufügen.
- Legen Sie das Tween 80 Medium für 10 min auf einen Magnetrührer (keine Hitze) mit einem Magnetrührstab im Medium.
- Wenn alles im Medium geschmolzen ist, übertragen Sie 5 ml der Lösung in 20 ml sterile Glasfläschchen und autoklavieren Sie sie für 20 min bei 121 ° C.
- Für die Negativkontrolle bereiten Sie etwa 20 ml sterile Glasfläschchen mit 5 ml BH-Lösung vor und autoklavieren Sie sie für 20 min bei 121 °C.
- Übertragen Sie in einem Laminar-Flow-Schrank 200 μL Pilzsuspension (Schritte 2.1.5.-2.1.6.) für jeden Stamm auf die Tween 80 mittelsterilisierten Durchstechflaschen (mindestens 2 Wiederholungen pro Pilzstamm). Fügen Sie für jeden Pilzstamm 200 μL derselben Pilzsuspension zu BH-sterilisierten Durchstechflaschen zur Negativkontrolle hinzu.
- Die Fläschchen 21 Tage lang bei 25 °C im Dunkeln bebrüten und alle 7 Tage kontrollieren.
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Representative Results
Die selektiven Medienmethoden (Abschnitt 1 des Protokolls) ermöglichten es, die reiche Biodiversität des Bodens zu untersuchen und die Pilze mit hohem Bioremediationspotenzial auszuwählen. Mit den Huminsäure- und Lignocellulosemedien wurden mehr als 100 Pilzstämme isoliert. Diese Pilze produzierten Enzyme, die am biologischen Abbau von natürlichen widerspenstigen Materialien beteiligt sind, die eine chemische Struktur haben, die vielen Schadstoffen ähnelt. Die mit den selektiven Medien isolierten Pilzstämme mussten jedoch weiter untersucht werden. Insbesondere isolierten die selektiven Tests die Stämme, die Huminsäuren und Lignocellulose abbauen konnten, die Wachstumstests untersuchten die isolierten Pilze auf diejenigen, die in der Lage waren, einen bestimmten Schadstoff als einzige Kohlenstoffquelle zu verwenden, und die qualitativen enzymatischen Tests beschrieben ihre metabolischen Aktivitäten.
Die Wachstumstests konzentrierten sich auf die Fähigkeit der Pilze, Kohlenwasserstoffe (Petrolatum und gebrauchtes Motoröl) und Kunststoffe (PET, PVC, HDPE, PS, PUR) abzubauen. Jede dieser Substanzen wurde in einem Test als einzige Kohlenstoffquelle für die ausgewählten Pilzstämme verwendet. Die Fähigkeit der Pilze, diese Substanzen auszubeuten, wurde als Unterschied im Koloniewachstum zwischen den Proben mit der zugesetzten Substanz und den Kontrollproben mit nur minimalem Medium (BH oder BHA, je nach Test) bewertet. Zur Beschreibung der Ergebnisse (Abbildung 1) wurde eine qualitative Skala verwendet, die von der fehlenden Wachstumsdifferenz mit der Kontrolle (0) bis hin zu niedrigen (+), mittleren (++) und hohen (+++) Wachstumsraten reichte.
Abbildung 1: Wachstumsrate von Pilzstämmen in den Wachstumstests. Der Prozentsatz der Pilzstämme, die auf Petrolatum, gebrauchtem Motoröl und Kunststoffpulvern (Polyethylenterephthalat, PET; Polyvinylchlorid, PVC; Polyethylen hoher Dichte, HDPE; Polystyrol, PS; Polyurethan, PUR) als einzige Kohlenstoffquelle mit unterschiedlichem Erfolg (kein Wachstum, 0; geringes Wachstum, +; mittleres Wachstum, ++; hohes Wachstum, +++) wachsen können. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Die Petrolatum- und Gebrauchtmotoröltests bewerteten das biologische Abbaupotenzial der ausgewählten Pilzstämme. Petrolatum, eine Mischung aus langkettigen Alkanen (>C25), wurde als einzige Kohlenstoffquelle verwendet. Die Fähigkeit des Pilzes, diese Substanz zu nutzen, wurde als Unterschied im Koloniewachstum zwischen Fläschchen mit BH + Petrolatum und Kontrollfläschchen mit nur BH bewertet (Abbildung 2). Fast 75% der getesteten Pilzstämme waren in der Lage, Petrolatum als einzige Kohlenstoffquelle zu verwenden, und 21% der Stämme zeigten ein maximales Wachstum (+++, Abbildung 1).
Abbildung 2: Bilder der qualitativen Wachstumsskala auf Petrolatum als einziger Kohlenstoffquelle. Die qualitative Skala basiert auf dem Wachstumsunterschied zwischen den behandelten Proben und der BH-Kontrolle. Sie reicht von der fehlenden Wachstumsdifferenz (0) bis hin zu niedrigen (+), mittleren (++) und hohen (+++) Wachstumsdifferenzen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Gebrauchtes Motorenöl ist eine komplexe Mischung aus Kohlenwasserstoffen, Motoradditiven und Metallen. Es wurde in den Wachstumstests verwendet, um die Fähigkeit des Pilzes zu bewerten, eine komplexe und toxische Kohlenwasserstoffmischung als Kohlenstoffquelle zu verwenden. Wie bei den anderen Wachstumstests wurde das Wachstum bewertet, indem das Pilzwachstum in Platten mit dem Motoröl mit dem Wachstum in den Steuerplatten, die nur BHA enthielten, verglichen wurde (Abbildung 3). Die Wachstumsergebnisse bestätigten die Wirksamkeit der selektiven Medien (Abschnitt 1 des Protokolls). Tatsächlich konnten fast 90% der isolierten Pilzstämme mit gebrauchtem Motoröl wachsen, wobei 39% ein maximales Wachstum zeigten (+++, Abbildung 1).
Abbildung 3: Bilder der qualitativen Wachstumsskala von gebrauchtem Motoröl als einziger Kohlenstoffquelle. Die qualitative Skala basiert auf dem Wachstumsunterschied zwischen den behandelten Proben und der BHA-Kontrolle. Sie reicht von der fehlenden Wachstumsdifferenz (0) bis hin zu niedrigen (+), mittleren (++) und hohen (+++) Wachstumsdifferenzen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Wachstumstests an Kunststoffpulvern wurden verwendet, um die Pilzstämme auszuwählen, die spezifische Kunststoffpolymere als primäre Kohlenstoffquelle verwenden könnten; Daher haben diese Stämme ein hohes Potenzial für die biologische Sanierung von Kunststoffen. Das Wachstum der Multiwell-Platten wurde mit dem Stereomikroskop beobachtet und anhand einer qualitativen Skala bewertet, die von der Abwesenheit des Wachstums (0) bis zur hohen Produktion von Hyphen (+++) reichte. PUR war das Kunststoffpulver, das den höchsten Prozentsatz an Pilzstämmen aufwies, die Wachstum zeigten (92%), wobei 31% der Stämme ein maximales Wachstum aufwiesen (+++). Ungefähr 70% der aus Huminsäure und Lignocellulosemedien isolierten Stämme wuchsen auf PS-Pulver, während fast 60% -65% von ihnen HDPE, PVC und PET als einzige Kohlenstoffquelle verwenden konnten. Daher konnte ein großer Prozentsatz der Pilze auf den verschiedenen Kunststoffpulvern in Multiwell-Platten wachsen, aber eine sehr geringe Anzahl von ihnen zeigte eine hohe Besiedlung von Kunststoffen. Tatsächlich konnten nur 10% der Sorten auf PET und HDPE gedeihen, und 13% konnten auf PS gedeihen. Der einzige Kunststoff, bei dem regelmäßig ein hohes Pilzwachstum beobachtet wurde, war PUR, auf dem etwa 30% der Pilzstämme sehr reichlich wachsen konnten.
Qualitative enzymatische Tests wurden durchgeführt, um Pilzstämme nachzuweisen, die Enzyme produzieren können, die an den biologischen Abbauprozessen von widerspenstigen Substanzen beteiligt sind. Peroxidasen und Laccasen sind ligninolytische Enzyme, deren Produktion durch einen bräunlichen Halo auf der Unterseite des Mediums in Gallussäure- und Guaiacol-Tests angezeigt wird (Schritt 3.1. und Schritt 3.2. des Protokolls). In beiden Tests deutete die Zunahme der Farbintensität auf eine höhere Produktion dieser Enzyme hin (Abbildung 4).
Abbildung 4: Bilder der qualitativen Skala qualitativer ligninolytischer Enzyme. Die qualitative Skala basiert auf der Produktion eines rot/bräunlichen Heiligenscheins um die Kolonie herum. 0 = keine Aktivität, + = eine gewisse Aktivität, ++ = hohe Aktivität, +++ sehr hohe Aktivität. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Etwa 60% der getesteten Pilze waren in der Lage, ligninolytische Enzyme zu produzieren, was auf den Erfolg der selektiven Medien hinweist. Darüber hinaus produzierten 12% der isolierten Pilzstämme einen intensiven dunklen Halo um die Kolonie (+++) in Gallussäuremedium, wobei 17% dies in Guaiacol-Medium (Laccases) taten, was auf eine hohe Pilzsekretion dieser Enzyme hinweist (Abbildung 5).
Abbildung 5: Rate der Enzymaktivität durch Pilzstämme während qualitativer enzymatischer Tests. Der Prozentsatz der Pilzstämme, die in der Lage sind, ligninolytische Enzyme, Laccase, Proteasen und Esterasen mit unterschiedlichem Erfolg (0 = keine Aktivität, + = Aktivität, ++ = hohe Aktivität, +++ sehr hohe Aktivität) während ihrer entsprechenden qualitativen enzymatischen Tests zu produzieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ein weiterer Screening-Test, der zur Analyse der Pilzaktivität verwendet wurde, war der Proteasentest, der auf dem Unterschied im Pilzwachstum zwischen YES mittleren Fläschchen und Kontrollfläschchen mit BH basierte. Etwa 70% der Pilzstämme im YES-Medium zeigten jedoch ein ähnliches Wachstum wie Kontrollen oder sogar ein verringertes Wachstum. Kein Pilzstamm erreichte die maximale Differenz (+++). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass dieser Test für das Screening auf Proteaseaktivität ungeeignet sein kann.
Schließlich wurde die Esteraseaktivität durch die Bildung eines weißen Niederschlags in Tween 80 Medium bewertet (Abbildung 5). Fast 60% der ausgewählten Pilzstämme zeigten eine Esteraseaktivität und 13% zeigten eine hohe Formation des Niederschlags (+++), was darauf hindeutet, dass die Stämme in den 13% ausgewählt werden sollten, um ihr biologisches Abbaupotenzial zu untersuchen (Abbildung 5).
Bei allen Wachstums- und enzymatischen Tests waren die erfolgreichsten Stämme (d.h. diejenigen, die in mindestens einem Test +++ erhielten) die interessantesten. Diese Pilzstämme waren in der Lage, widerspenstige Substanzen effizient als einzige Kohlenstoffquelle zu nutzen, oder sie produzierten einen hohen Gehalt an Enzymen, die am biologischen Abbau widerspenstiger Substanzen beteiligt sind. Tatsächlich konnten 39 der 115 getesteten Pilzstämme (+++) auf Kohlenwasserstoffquellen (Petrolatum oder gebrauchtes Motoröl) gedeihen, und 58 hatten ein hohes Wachstum auf mindestens einem Kunststoffpolymer. Nur 32 zeigten in mindestens einem der durchgeführten enzymatischen Tests eine sehr hohe enzymatische Aktivität (+++). Diese Ergebnisse zeigen die hohe Wirksamkeit aller berichteten Screening-Tests, mit Ausnahme des Proteasen-Tests, bei dem keine Hochleistungsstämme ausgewählt wurden.
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Discussion
Die reiche Artenvielfalt des Bodens ist eine reichhaltige Quelle von Pilzen, die zahlreiche metabolische Fähigkeiten besitzen, von denen einige potenzielle Kandidaten für die Bioremediation sein könnten. Selektive Medientests (Abschnitt 1 des Protokolls) sind einfach durchzuführende und wirksame Methoden zur Isolierung von Pilzen, die auf natürlichen komplexen Polymeren als einzige Kohlenstoffquelle wachsen können. Pilze können extrazelluläre, unspezifische Hydrolasen und Oxidoreduktasen30 wie die ligninolytischen Enzyme Laccasen und Peroxidasen31 produzieren. Diese Enzyme können Lignocellulose und Huminsäuren abbauen, aber auch viele verschiedene Xenobiotika, einschließlich Kohlenwasserstoffe, aromatische Verbindungen und chlorierte organische Verbindungen32.
Die beschriebenen Methoden führen zu Ergebnissen, die leicht zu interpretieren und kostengünstig durchzuführen sind. Diese Eigenschaften ermöglichen es, dass sie von Nicht-Experten verwendet werden können. Bestimmte Aspekte, wie Sterilität und morphologische Identifikation, erfordern jedoch besondere Aufmerksamkeit. Beispielsweise ist die 30-minütige Bewegung der Bodensuspension (Schritt 1.3.4.) notwendig, damit die Pilzsporen und -vermehrungen von der Bodenmikrostruktur befreit werden und in der Lösung suspendiert werden können. Auf diese Weise ist es durch die Beschichtung von Verdünnungen dieser Bodensuspension möglich, die maximale Anzahl von Pilzstämmen zu isolieren. Die makro- und mikroskopische morphologische Identifizierung von Pilzstämmen ist wichtig, um zwischen Stämmen zu unterscheiden und eine mehrfache Isolierung desselben Pilzstamms zu vermeiden. Darüber hinaus sind Sterilität und Vermeidung mikrobieller Kontaminationen von entscheidender Bedeutung, da das Vorhandensein anderer aktiver Pilzstämme die Aktivität der untersuchten Kolonien falsch darstellen könnte.
Nach den selektiven Tests wurde eine Reihe von Wachstumstests an verschiedenen widerspenstigen Substanzen wie Petrolatum, gebrauchtem Motoröl und verschiedenen Kunststoffpolymeren durchgeführt. Diese Stufe kann entsprechend den widerspenstigen Substanzen von Interesse angepasst werden. Der wichtige Schritt besteht darin, die ausgewählte Substanz BH oder BHA als einzige Kohlenstoffquelle zuzusetzen und das Pilzwachstum gegen eine Kontrolle ohne die zugesetzte widerspenstige Substanz zu überprüfen.
Ziel der Wachstumstests an Kunststoffen und Kohlenwasserstoffen war es, zu beurteilen, ob der Pilz diese Substanzen als einzige Kohlenstoffquelle nutzen kann, indem er sein Wachstum auf dem Material qualitativ beobachtet. Leider ist es aufgrund der extremen Widerspenstigkeit dieser Materialien sehr schwierig, die tatsächliche Gewichtsabnahme des Substrats und die Zunahme des Gewichts der Pilzbiomasse zu quantifizieren, insbesondere nach relativ kurzer Zeit. Wenn ein Pilzstamm in diesen Screening-Wachstumstests sehr gut abschneidet, sollten weitere Studien durchgeführt werden, um den Abbau der widerspenstigen Substanz zu quantifizieren.
Die verwendeten enzymatischen Tests (Abschnitt 3 des Protokolls) wurden ausgewählt, weil sie sich als effizient und schnell erwiesen haben, aber nur qualitative Ergebnisse liefern. Sie heben das Abbaupotenzial eines PilzStammes hervor, können es aber nicht genau quantifizieren. Wird ein besonders interessanter Stamm isoliert, könnten weitere Tests, wie z.B. spektralphotometrische quantitative Enzymaufsätze, durchgeführt werden, um die Stoffwechselaktivität genauer zu beschreiben. Der einzige enzymatische Test, der eine suboptimale Wirksamkeit zeigte, war der qualitative Proteasentest, mit einer geringen Anzahl von Stämmen, die auf dem YES-Medium wachsen konnten. Tatsächlich deutet der hohe Prozentsatz der Stämme, die auf PUR wachsen können, darauf hin, dass die Pilze Proteasen produzierten, die am Aufbrechen der Amid- und Urethanbindungen beteiligt waren, wobei Esterase auf die Esterbindungenabzielte 40. Das fast vollständige Fehlen von Protease-produzierenden Pilzen deutet darauf hin, dass es bei der verwendeten Methode ein Problem gegeben haben könnte. Andere Tests könnten für Protease-Aktivitäten verwendet werden, wie Casein41, Magermilch42 oder Milchpulver43 Agarplattentests. Der Gallussäuretest erwies sich als sehr nützlich für den Nachweis der Produktion von ligninolytischen Enzymen, aber leider war er nicht sehr spezifisch und konnte nicht die Art des produzierten ligninolytischen Enzyms (entweder Peroxidasen oder Laccases) unterscheiden.
Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, dass die Verwendung von Lignocellulose oder Huminsäuren als selektive Medien es ermöglicht, Pilzstämme mit Bioremediationspotenzial aus der reichen Bodenbiodiversität zu isolieren. Tatsächlich konnten mehr als 70% der durch die selektiven Methoden isolierten Pilzstämme auf Petrolatum oder gebrauchtem Motoröl wachsen, und 60% konnten auf verschiedenen Kunststoffpolymeren als einzige Kohlenstoffquelle wachsen. Darüber hinaus beschrieben die qualitativen enzymatischen Tests die metabolische Aktivität dieser Pilze im Zusammenhang mit biologischen Abbauprozessen. Die Auswahl von Pilzstämmen, die in einem oder mehreren Tests eine Aktivität von +++ aufweisen, wird empfohlen, da sie die Chancen erhöht, einen Pilzstamm zu finden, der bei der Bioremediation sehr aktiv ist. Tests mittels Gasmassenchromatographie (GC-MS) an den widerspenstigen Substanzen nach längerem Kontakt mit den mit unseren Screening-Tests ausgewählten Pilzstämmen haben einen tatsächlichen biologischen Abbau der Materialiengezeigt 9,44. Der Einsatz dieser einfachen Screening-Tests in verschiedenen Ökosystemen wird die Untersuchung der Pilzbiodiversität in verschiedenen Böden ermöglichen. Die Suche nach Pilzen, die widerspenstige Materialien abbauen können, wird die Anzahl der identifizierten Stämme erhöhen, die das Potenzial für eine biologische Sanierung haben und dazu beitragen, das wachsende Problem der Umweltverschmutzung anzugehen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Wir danken der Scuola di Alta Formazione Dottorale (SAFD) der Universität Pavia und Professor Solveig Tosi für die Bereitstellung dieser Arbeit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 microwell plate | Greiner bio-one | 650185 | |
| Agar | VWR | 84609.05 | |
| Bushnell-Haas Broth | Fluka | B5051 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Chloroamphenicol | Eurobio | GABCRL006Z | |
| Chlortetracycline | Sigma-Aldrich | Y0001451 | |
| CoCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| CuCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3279 | |
| Ethanol | VWR Chemicals | 20821.296 | |
| FeCl3·6H2O | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| Filter 0.2 µm | Whatman | 10462200 | |
| gallic acid | Sigma-Aldrich | G7384 | |
| Glass cover slips | Biosigma | VBS634 | |
| Glass vials 15 mL | SciLabware | P35467 | |
| guaiacol | Sigma-Aldrich | G5502 | |
| High-density polyethylene (HDPE) | Sigma-Aldrich | 434272 | |
| Humic acids | Aldrich Chemistry | 53680 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P8281 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Lignocellulose | / | / | Sterilized bioethanol production waste |
| L-shaped cell spreader | Laboindustria S.p.a | 21133 | |
| magnetic stirrer | A.C.E.F | 8235 | |
| Malt Extract Broth | Sigma-Aldrich | 70146 | |
| MgSO4·7H2O | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| Micropipette 1000 μL | Gilson | FA10006M | |
| Micropipette 200 μL | Gilson | FA10005M | |
| MnCl2·4H2O | Sigma-Aldrich | M5005 | |
| Na2MoO4·2H2O | Sigma-Aldrich | M1651 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Neomycin | Sigma-Aldrich | N0401000 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | 1504489 | |
| peptone | Sigma-Aldrich | 83059 | |
| Polyethylene terephthalate (PET) | Goodfellow | ES306031 | |
| Petri dishes | Laboindustria S.p.a | 21050 | |
| Petrolatum (Paraffin liquid) | A.C.E.F | 009661 | |
| Potato Dextrose Broth | Sigma-Aldrich | P6685 | |
| Polystyrene (PS) | Sigma-Aldrich | 331651 | |
| Polyurethane (PUR) | Sigma-Aldrich | GF20677923 | |
| Polyvinyl chloride (PVC) | Sigma-Aldrich | 81388 | |
| Sterile falcon tube | Greiner bio-one | 227 261 | |
| Sterile glass vials 20 mL | Sigma-Aldrich | SU860051 | |
| Sterile point 1000 μL | Gilson | F172511 | |
| Sterile point 200 μL | Gilson | F172311 | |
| Sterile polyethylene bags | WHIRL-PAK | B01018 | |
| sterile syringe | Rays | 5523CM25 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S-6501 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | |
| Used engine oil | / | / | complex mixture of hydrocarbons, engine additives, and metals, provided by an Italian private company |
| Vials 50 mL | Sigma-Aldrich | 33108-U | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | Z0152 |
References
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