Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Изоляция и скрининг из биоразнообразия почв на грибы, участвующие в деградации непокорных материалов

Published: May 16, 2022 doi: 10.3791/63445
Automatic Translation
1, 1, 1
1Laboratory of Mycology, Department of Earth and Environmental Sciences, University of Pavia

Summary

Здесь мы представляем протокол скрининга биоразнообразия почв для поиска грибковых штаммов, участвующих в деградации непокорных материалов. Сначала выделяют грибковые штаммы, способные расти на гуминовых кислотах или лигноцеллюлозе. Затем их активность проверяется как в ферментативных анализах, так и на загрязняющих веществах, таких как углеводороды и пластмассы.

Abstract

Загрязнение окружающей среды является растущей проблемой, и выявление грибов, участвующих в процессе биоремедиации, является важной задачей. Почва содержит невероятное разнообразие микробной жизни и может быть хорошим источником этих биоремедиативных грибов. Эта работа направлена на поиск почвенных грибов с потенциалом биоремедиации с использованием различных скрининговых тестов. Минеральные питательные среды, дополненные непокорными веществами в качестве единственного источника углерода, использовались в качестве тестов на рост. Сначала разбавления почвы покрывали на чашках Петри минеральной средой, дополненной гуминовыми кислотами или лигноцеллюлозой. Растущие колонии грибов были выделены и испытаны на различных субстратах, таких как сложные смеси углеводородов (вазелин и отработанное моторное масло) и порошки различных пластиковых полимеров (ПЭТ, ПП, ПС, ПУР, ПВХ). Качественные ферментативные тесты были связаны с тестами роста для исследования производства эстераз, лакказ, пероксидаз и протеаз. Эти ферменты участвуют в основных процессах деградации непокорного материала, и их конститутивная секреция исследуемыми грибковыми штаммами может иметь потенциал для использования для биоремедиации. Было выделено и протестировано более 100 штаммов, обнаружено несколько изолятов с хорошим потенциалом биоремедиации. В заключение, описанные скрининговые тесты являются простым и недорогим методом выявления грибковых штаммов с потенциалом биоремедиации из почвы. Кроме того, можно адаптировать скрининговые тесты для различных загрязняющих веществ в соответствии с требованиями, добавляя другие непокорные вещества в минимальные питательные среды.

Introduction

Почва является фундаментальным компонентом жизни на Земле и является основой многих экосистем. Минералы, органические вещества и микроорганизмы в почве можно рассматривать как одну систему, между которой происходят тесные ассоциации и взаимодействия. Взаимодействие этих соединений оказывает важное влияние на наземные процессы, качество окружающей среды и здоровье экосистем1. Загрязнение почв создает серьезные экологические проблемы во всем мире. Неизбирательное, долгосрочное и чрезмерное применение непокорных и токсичных веществ, таких как пестициды, нефтепродукты, пластмассы и другие химические вещества, оказывает серьезное воздействие на экологию почвы и, как следствие, может изменить микробиоту почвы. Микробные сообщества в почвах состоят из широкого спектра организмов в различных физиологических состояниях, большинство из которых являются бактериями и грибами. Многие из загрязняющих веществ в почвах имеют средне- и долгосрочную стабильность, и их стойкость может привести к развитию адаптивных механизмов, позволяющих микроорганизмам использовать непокорные вещества в качестве питательных веществ 2,3. Поэтому эти микроорганизмы могут рассматриваться для методов биоремедиации.

Биоремедиация пытается смягчить последствия загрязнения путем использования микроорганизмов и их ферментов для деградации или превращения отходов в менее токсичные или нетоксичные соединения. Различные виды архей, бактерий, водорослей и грибов обладают этой способностью биоремедиации4. В результате своего особого биодеградативного действия грибы являются особенно перспективными организмами для биоремедиации. Они могут атаковать различные субстраты, используя свою гифальную сеть, что позволяет им проникать в почвенную матрицу более эффективно, чем другие микроорганизмы. Кроме того, они могут достигать недоступных промежутков, где загрязняющие вещества трудно удалить5, и они также могут выдерживать низкий уровень влажности6. Кроме того, грибы синтезируют различные кассеты неспецифических ферментов, как правило, для разложения природных непокорных веществ, таких как целлюлоза, лигнин и гуминовые кислоты. Те, у кого отсутствует целевой субстрат, могут быть вовлечены в деградацию широкого спектра непокорных загрязнителей, таких как углеводороды, пластмассы и пестициды 7,8,9,10. Поэтому, хотя многие виды грибов уже были зарегистрированы в качестве агентов биоремедиации, растет интерес к изучению видов, которые еще не были изучены, для отбора кандидатов на биоремедиацию непокорных загрязняющих веществ. Уже известные виды, обладающие биоремедиационными свойствами, принадлежат к типу Ascomycota 11,12,13, Basidiomycota 14,15 и Mucoromycota. Например, хорошо известно, что роды Penicillium и Aspergillus участвуют в деградации алифатических углеводородов13, различных пластиковых полимеров 16,17,18, тяжелых металлов 19 и красителей20. Аналогичным образом, исследования, проведенные на грибах базидиомицетов, таких как Phanerochaete chrysosporium и Trametes versicolor, выявили их участие в окислении непокорных материалов, таких как ароматические углеводороды13 и пластмассы21. Другим примером грибов, участвующих в процессах биодеградации, являются зигомицеты Rhizopus spp., Mucor spp. и Cunninghamella spp.22,23. В частности, Cunninghamella способна окислять ароматические углеводороды и считается модельным организмом для изучения детоксикации продуктов из широкого спектра ксенобиотиков13.

Существует несколько грибковых ферментов, участвующих в основных деградативных процессах непокорных материалов24,25, таких как эстераза, лакказа, пероксидаза и протеаза. Лакказы представляют собой медьсодержащие оксидазы, вырабатываемые в клетке и впоследствии секретируемые, которые позволяют окислять различные фенольные и ароматические соединения. Они могут разлагать орто- и парадифенолы, аминогруппсодержащие фенолы, лигнин и арильную группу, содержащие диамины26. Пероксидазы используют перекись водорода в качестве медиатора для разложения лигнина и других ароматических соединений. Существует много различных пероксидаз, но те, которые обладают наибольшим потенциалом для разложения токсичных веществ, - это лигнинпероксидаза и пероксидаза марганца27.

Эстеразы и протеазы относятся к группе экстра- или эктоклеточных ферментов, которые действуют вне клеток своего происхождения, но все еще связаны с ними. Эти ферменты могут катализировать гидролиз больших непокорных молекул в более мелкие. Благодаря низкой субстратной специфичности эти ферменты могут играть ключевую роль в биоремедиации различных загрязняющих веществ, таких как текстильные красители, стоки, выделяемые из целлюлозно-бумажной промышленности и кожевенного дубления, нефтепродукты, пластмассы и пестициды 28,29,30.

Уже опубликован ряд методов скрининга для отбора биоремедиативных грибковых штаммов. Например, агаровая среда на основе соломы использовалась для скрининга грибов белой гнили с высоким потенциалом деградации полициклических ароматических углеводородов (ПАУ)31; и небольшие кусочки гниющей древесины были помещены на агар экстракта солода (MEA) для изоляции гниющих грибов32. Однако большинство методов, которые уже были предложены, отбирают очень специфические грибы для их интересующей деятельности. Это исследование предлагает более широкий подход к выбору почвенных грибов с более широким спектром действия. Метод основан на первоначальном нанесении серийных разбавлений образцов почвы на среду, дополненную гуминовыми кислотами или лигноцеллюлозой, смешанной с антибиотиками, для отбора грибов, обладающих способностью разлагать эти природные непокорные вещества. Гуминовые кислоты и лигноцеллюлоза, по сути, являются веществами, которые чрезвычайно устойчивы к биодеградации, так как имеют очень сложные молекулярные структуры, и это позволяет им быть отличными показателями деградативной способности испытуемых грибов33,34. Впоследствии грибы, отобранные в первых тестах, проверяются для выявления грибов, способных разлагать конкретные загрязняющие вещества, такие как вазелин, отработанное моторное масло и пластмассы. Наконец, проводятся качественные ферментативные тесты для выявления грибковых штаммов, способных продуцировать ферменты, участвующие в процессах биодеградации непокорных веществ. С этой целью проводятся протеазные и эстеразные тесты, при этом галловая кислота и гваякол используются в качестве индикаторов выработки лакказы и других лигнинолитических ферментов35,36. Эти субстраты используются, потому что была обнаружена сильная корреляция между способностью грибов окислять их до их коричневой формы и обладанием лигнинолитической способностью 37,38,39.

С помощью этих протоколов можно выделять грибковые штаммы с высоким деградативным потенциалом и широким спектром действия непосредственно из образцов почвы. Выделение этих грибковых штаммов может помочь найти новых кандидатов для целей биоремедиации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подбор грибковых штаммов, способных разлагать непокорные материалы из почвы

  1. Приготовление раствора антибиотика.
    1. Поместите пенициллин (50 мг/л), стрептомицин (40 мг/л), хлортетрациклин (40 мг/л), неомицин (100 мг/л) и хлорамфеникол (100 мг/л) в 250 мл деионизированной стерильной воды.
    2. Перед добавлением хлорамфеникола в раствор антибиотика растворите его в 3 мл ≥99% этанола.
    3. Поместите раствор антибиотика на магнитную мешалку (без нагревания) с магнитным перемешивающим стержнем внутри раствора на 10 мин. Храните при температуре 4 °C.
  2. Подготовка питательных сред.
    1. Положить 1 г товарной гуминовой кислоты, 3,26 г бульона Бушнелла-Хааса (BH) и 15 г агара в 1 л деионизированной воды и автоклавировать его в течение 20 мин при 121 °C (гуминовый кислотный агар).
    2. Поместите гуминовый кислотный агар в чашку Петри под ламинарным проточным шкафом.
    3. Поместите 4 г лигноцеллюлозы, 3,26 г BH и 15 г агара в 1 л деионизированной воды и автоклавируйте его в течение 20 мин при 121 °C (лигноцеллюлозный агар).
    4. Разложите лигноцеллюлозный агар в чашки Петри под ламинарным проточным шкафом.
    5. Под ламинарным проточным шкафом после того, как среда затвердеет в чашках Петри, переложите 1 мл раствора антибиотика на подготовленные пластины с помощью стерильного шприца с фильтром 0,2 мкм для его стерилизации.
    6. Равномерно распределите раствор антибиотика по поверхностям пластин с помощью стерильного одноразового L-образного клеточного распределителя и дайте ему высохнуть на воздухе под ламинарным проточным шкафом.
    7. Положить 20 г солодового экстракта бульона и 15 г агара в 1 л деионизированной воды и автоклавировать его в течение 20 мин при 121 °С (солодовый экстракт агар - MEA).
    8. Разложите MEA в чашки Петри под ламинарным шкафом.
  3. Отбор проб почвы и разбавление почвы.
    1. Возьмите пробу интересующей почвы на глубине 10 см, удалив из верхнего слоя любые растения, траву и мертвые листья, и поместите ее в стерильные полиэтиленовые мешки.
    2. Дойдя до лаборатории, просейте почву с помощью сетки 2 мм, удалив любые корни и растительный мусор.
    3. Если нет возможности сразу приступить к анализу ниже по течению, сохраните просеянные образцы почвы при температуре 4 °C.
    4. Работая под ламинарным проточным шкафом, поместите 1 г просеянного грунта в стерильную трубку объемом 15 мл с 10 мл стерильной деионизированной воды (1 х 10-1 разбавление). Встряхните трубку горизонтально в течение 30 мин.
    5. Под ламинарным проточным шкафом, прежде чем суспензия осядет, взять 1 мл 1 х 10-1 разведения стерильной пипеткой и переложить его в 9 мл деионизированной водной заготовки (1 х 10-2 разведения). Вихрь его основательно.
    6. Прежде чем суспензия осядет, возьмите 1 мл из 1 х 10-2 разведения стерильной пипеткой и переложите его в 9 мл деионизированной водной заготовки (1 х 10-3 разведения). Вихрь его основательно.
  4. Разбавление почвы селективными средами.
    1. Работая под ламинарным проточным шкафом, соберите 100 мкл разведения 1 х 10-3 с помощью микропипетки со стерильной точкой и переложите ее на гуминовый агар Петри чашку. Делайте это не менее чем на 4 или 5 чашках Петри.
    2. Равномерно распределите разбавление по поверхности чашки Петри с помощью стерильного одноразового распределителя клеток L-образной формы.
    3. Дайте ему высохнуть на воздухе в течение 10-15 минут под ламинарным проточным шкафом.
    4. Повторите шаги 1.4.1.-1.4.3. с использованием лигноцеллюлозной чашки Петри.
    5. Инкубировать при 25 °C в темноте в течение максимум 15 дней.
  5. Выделение колоний грибов, выращенных из селективных сред в питательные среды.
    1. Начиная с 3 дней после приготовления, ежедневно проверяйте приготовленные селективные среды чашки Петри на наличие роста любой грибковой колонии в течение максимум 15 дней.
    2. Проверьте все присутствующие грибковые колонии на наличие сходства. При необходимости подготовьте слайд для наблюдения под световым микроскопом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Цель состоит в том, чтобы изолировать наибольшее количество колоний грибов, но необходимо избегать всегдаго выделения одного и того же грибкового штамма из разных пластин, поэтому эта проверка очень важна. Ищите колонии с различной макро- и микроморфологией.
    3. Под ламинарным проточным шкафом или на горелке Бунзена изолируйте каждый выбранный грибковый штамм, осторожно удалив небольшую часть мицелия из колонии стерильной иглой для прививки и переместив ее в новую чашку Петри.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе очень важно быть деликатным и точным, потому что существует высокий риск загрязнения от других грибковых колоний, присутствующих в оригинальной чашке Петри. Если на инокулированной пластине MEA растет более одного грибкового штамма, повторите шаг 1.5.3.
    4. Инкубировать при 25 °C в темноте в течение 7 дней. Это грибковые штаммы, которые должны быть дополнительно протестированы на конкретных непокорных веществах.

2. Ростовые тесты на непокорные вещества

  1. Тест на рост на вазелине.
    1. Переложить 20 мл жидкости BH (3,26 г/л BH) во флаконы по 50 мл и стерилизовать их автоклавированием при 121 °C в течение 20 мин.
    2. Переложите 7 мл деионизированной воды в стеклянные флаконы по 15 мл и добавьте несколько кусочков разбитых стеклянных крышек в каждый флакон.
    3. Стерилизуйте их автоклавированием при 121 °C в течение 20 мин.
    4. Под ламинарным проточным шкафом добавьте 1 мл вазелина в каждый флакон 50 мл BH с помощью стерильной пипетки. Держите несколько флаконов только с BH в качестве отрицательного контроля.
    5. Под ламинарным проточным шкафом удалите мицелий на поверхности среды из пластин MEA с выбранными грибковыми штаммами (приготовленными на этапе 1.5.3.) с помощью стерильной иглы и переложите его на стеклянные флаконы объемом 15 мл с разбитыми крышками.
    6. Перемешайте каждый флакон на вихревом миксере в течение 2 мин, позволив сломанным покровам разрезать куб грибковой колонии, сделав грибковую суспензию.
    7. Инокулируйте каждый флакон вазелина 200 мкл грибковой суспензии. Сделайте две реплики для каждого грибкового штамма.
    8. Для отрицательного контроля поместите 200 мкл грибковой суспензии во флаконы только с жидким BH. Кроме того, держите пару флаконов с вазелином без какой-либо грибковой прививки, чтобы проверить загрязнение в среде.
    9. Инкубируйте флаконы при 25 °C в темноте и проверяйте их через 15 дней и 30 дней из инокулята.
  2. Тест на рост отработанного моторного масла.
    1. Поместите 3,26 г BH и 15 г агара в 1 л деионизированной воды и автоклавируйте его в течение 20 мин при 121 °C (BHA).
    2. Разложите BHA в чашки Петри под ламинарным шкафом.
    3. Когда он затвердеет, переложите 500 мкл отработанного моторного масла на чашки BHA Petri и равномерно распределите его по поверхностям пластин с помощью стерильного одноразового распределителя L-образных ячеек.
    4. Инокулируйте каждую использованную пластину BHA моторного масла с каждым грибковым штаммом, собирая мицелий из пластин, подготовленных на этапе 1.5.3. Работайте на горелке Бунзена или под ламинарной вытяжкой, чтобы избежать загрязнения. Сделайте две реплики для каждого грибкового штамма.
    5. Для отрицательного контроля прививайте чашки Петри только BHA. Кроме того, держите пару отработанных чашек моторного масла BHA Petri без какой-либо грибковой прививки, чтобы проверить загрязнение в среде.
    6. Высиживайте чашки Петри при 25 °C в темноте и проверяйте их через 15 дней и 30 дней из инокулята.
  3. Тест на рост пластмасс.
    1. Переложите 200 мкл грибковой суспензии (этапы 2.1.5.-2.1.6.) в 96-микролуночную пластину. Сделайте три реплики грибкового штамма-пластической комбинации.
    2. К каждой лунке с грибковой суспензией добавляют по 10 мг различного вида пластикового порошка (полиэтилентерефталат – ПЭТ, поливинилхлорид – ПВХ, полиэтилен высокой плотности – ПНД, полистирол – ПС, полиуретан – ПУР).
    3. Для отрицательного контроля вместо добавления пластикового порошка добавляют 200 мкл стерилизованного раствора BH в лунку с грибковой суспензией. Кроме того, для каждого типа пластикового порошка заполните лунку 200 мкл стерилизованного раствора BH и 10 мг каждой пластиковой пыли, чтобы проверить загрязнение среды.
    4. Инкубируйте пластины микролунки при 25 °C в темноте и проверяйте их через 15 дней и 30 дней из инокулята.

3. Качественные ферментативные тесты

  1. Качественный лигнинолитический колориметрический тест ферментов.
    1. Положить 27 г картофельного дюстрозного бульона (PD) и 15 г агара в 1 л деионизированной воды и автоклавировать его в течение 20 мин при 121 °C (PDA).
    2. Когда среда немного остынет, но все еще будет жидкой, добавьте галловую кислоту (5 г / л) под ламинарную вытяжку и накройте среду в чашки Петри.
    3. Инокулируйте пластины PDA + галловой кислоты с каждым грибковым штаммом, собирая мицелий из пластин, приготовленных на этапе 1.5.3. Работайте на горелке Бунзена или под ламинарной вытяжкой, чтобы избежать загрязнения.
    4. В качестве отрицательного контроля приготовьте чашки Петри только с КПК (без галловой кислоты) и привите их грибковыми штаммами (по одной на каждый грибковый штамм), а также одну чашку Петри с КПК + галловой кислотой и без грибковой прививки.
    5. Высиживайте чашки Петри при 25 °C в темноте и проверяйте их через 7 дней из инокулята.
  2. Качественный колориметрический тест лакказов.
    1. Поместите 27 г PD и 15 г агара в 1 л деионизированной воды и автоклавируйте его в течение 20 мин при 121 °C (PDA).
    2. Когда среда немного остынет, но все еще будет жидкой, добавьте гуайакол (400 мкл / л) под ламинарную вытяжку и разложите ее в чашку Петри.
    3. Инокулируют пластины PDA + guaiacol с каждым грибковым штаммом, собирая мицелий из пластин, приготовленных на этапе 1.5.3. Работайте на горелке Бунзена или под ламинарной вытяжкой, чтобы избежать загрязнения.
    4. В качестве отрицательного контроля приготовьте чашки Петри только с КПК (без гуайаколя) и привите их грибковыми штаммами (по одному на каждый грибной штамм), а также одну чашку Петри с КПК + гуайаколем и без грибковой инокуляции.
    5. Высиживайте чашки Петри при 25 °C в темноте и проверяйте их через 7 дней из инокулята.
  3. Качественный тест на протеазы.
    1. Подготовьте среду YES, добавив K2HPO4 (1 г/л), KH2PO4 (0,5 г/л), MgSO4·7H2O (0,5 г/л), MnCl2·4H2O (0,001 г/л), CuCl2·2H2O (1,4 x 10-5 г/л), ZnCl2 (1,1 x 10-5 г/л), CoCl2·6H2O(2 x 10-5 г/л), Na2MoO4·2H2O (1,3 x 10-5 г/л), FeCl3·6H2O (7,5 x 10-5 г/л) и желатин/пептон (0,02 г/л) в деионизированную воду.
    2. Поместите среду YES на магнитную мешалку (без нагрева) с магнитным перемешивающим стержнем внутри среды на 10 мин.
    3. Когда все соли растворятся в среде, переложите 5 мл раствора в 20 мл стерильных стеклянных флаконов и автоклавируйте их в течение 20 мин при 121 °C.
    4. Для отрицательного контроля приготовьте около 20 мл стерильных стеклянных флаконов с 5 мл раствора BH и автоклавируйте их в течение 20 мин при 121 °C.
    5. Под ламинарным проточным шкафом переложить 200 мкл грибковой суспензии (этапы 2.1.5.-2.1.6.) для каждого штамма в стерилизованные флаконы со средой YES (сделать по меньшей мере 2 реплики на грибковый штамм). Для каждого грибкового штамма добавьте 200 мкл той же грибковой суспензии в стерилизованные флаконы BH, чтобы иметь отрицательный контроль.
    6. Инкубируйте флаконы при 25 °C в темноте в течение 21 дня и проверяйте их каждые 7 дней.
  4. Качественный тест на эстеразы.
    1. Приготовьте среду Tween 80, добавив пептон (10 г/л), NaCl (5 г/л), CaCl2 (0,1 г/л) и 10 мл Tween от 80 до 1 л деионизированной воды.
    2. Поместите среду Tween 80 на магнитную мешалку (без нагрева) с магнитным перемешивающим стержнем внутри среды на 10 мин.
    3. Когда все расплавится внутри среды, переложите 5 мл раствора в 20 мл стерильных стеклянных флаконов и автоклавируйте их в течение 20 мин при 121 °C.
    4. Для отрицательного контроля приготовьте около 20 мл стерильных стеклянных флаконов с 5 мл раствора BH и автоклавируйте их в течение 20 мин при 121 °C.
    5. Под ламинарным проточным шкафом переложите 200 мкл грибковой суспензии (этапы 2.1.5.-2.1.6.) для каждого штамма в средние стерилизованные флаконы Tween 80 (сделайте не менее 2 реплик на грибной штамм). Для каждого грибкового штамма добавьте 200 мкл той же грибковой суспензии в стерилизованные флаконы BH для отрицательного контроля.
    6. Инкубируйте флаконы при 25 °C в темноте в течение 21 дня и проверяйте их каждые 7 дней.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Методы селективных сред (раздел 1 протокола) позволили провести скрининг богатого биоразнообразия почвы и отобрать грибы с высоким потенциалом биоремедиации. С гуминовой кислотой и лигноцеллюлозной средой было выделено более 100 грибковых штаммов. Эти грибы продуцируют ферменты, участвующие в биодеградации природных непокорных материалов, которые имеют химическую структуру, напоминающую многие загрязняющие вещества. Однако грибковые штаммы, выделенные с помощью селективных сред, нуждались в дальнейшем скрининге. В частности, селективные тесты изолировали штаммы, способные разлагать гуминовые кислоты и лигноцеллюлозу, тесты на рост проверяли изолированные грибы для тех, кто способен использовать конкретный загрязнитель в качестве единственного источника углерода, а качественные ферментативные тесты описывали их метаболическую активность.

Тесты роста были сосредоточены на грибковой способности разлагать углеводороды (вазелин и отработанное моторное масло) и пластмассы (ПЭТ, ПВХ, ПНД, ПС, ПУР). Каждое из этих веществ использовалось в тесте в качестве единственного источника углерода для выбранных грибковых штаммов. Способность грибков использовать эти вещества оценивалась как разница в росте колонии между образцами с добавленным веществом и контрольными образцами с минимальной средой (BH или BHA, в зависимости от теста). Для описания результатов использовалась качественная шкала (рисунок 1), варьирующаяся от отсутствия разницы в росте с контрольным (0) до низкого (+), среднего (++) и высокого (+++) уровней разницы в росте.

Figure 1
Рисунок 1: Скорость успеха роста грибковых штаммов в тестах роста. Процент грибковых штаммов, способных расти на вазелине, отработанном моторном масле и пластиковых порошках (полиэтилентерефталат, ПЭТ; поливинилхлорид, ПВХ; полиэтилен высокой плотности, ПНД; полистирол, PS; полиуретан, PUR) в качестве единственного источника углерода с разной степенью успеха (без роста, 0; низкий рост, +; средний рост, ++; высокий рост, +++). высокий рост, +++). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

В тестах на вазелин и отработанное моторное масло оценивали потенциал биодеградации углеводородов выбранных штаммов грибов. Вазелин, смесь длинноцепочечных алканов (>C25), использовался в качестве единственного источника углерода. Грибковая способность эксплуатировать это вещество оценивалась как разница в росте колонии между флаконами с BH + вазелином и контрольными флаконами только с BH (рисунок 2). Почти 75% протестированных грибковых штаммов смогли использовать вазелин в качестве единственного источника углерода, а 21% штаммов продемонстрировали максимальный рост (+++, рисунок 1).

Figure 2
Рисунок 2: Изображения качественного масштаба роста на вазелине как единственном источнике углерода. Качественная шкала основана на разнице роста между обработанными образцами и контролем BH. Он варьируется от отсутствия разницы роста (0) до низких (+), средних (++) и высоких (+++) уровней разницы роста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Отработанное моторное масло представляет собой сложную смесь углеводородов, присадок к двигателю и металлов. Он был использован в тестах роста для оценки грибковой способности использовать сложную и токсичную углеводородную смесь в качестве источника углерода. Как и в других тестах роста, рост оценивали путем сравнения грибкового роста в пластинах с моторным маслом с ростом в контрольных пластинах, содержащих только BHA (рисунок 3). Результаты роста подтвердили эффективность селективных сред (раздел 1 протокола). Действительно, почти 90% изолированных грибковых штаммов смогли вырасти на отработанном моторном масле, причем 39% показали максимальный рост (+++, рисунок 1).

Figure 3
Рисунок 3: Фотографии качественного масштаба роста на отработанном моторном масле как единственном источнике углерода. Качественная шкала основана на разнице роста между обработанными образцами и контролем BHA. Он варьируется от отсутствия разницы в росте (0) до низкого (+), среднего (++) и высокого (+++) уровней разницы роста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Тесты роста на пластиковых порошках использовались для выбора грибковых штаммов, которые могли бы использовать конкретные пластиковые полимеры в качестве основного источника углерода; следовательно, эти штаммы имеют высокий потенциал для биоремедиации пластика. Рост в многолуночных пластинах наблюдали с помощью стереомикроскопа и оценивали с помощью качественной шкалы, начиная от отсутствия роста (0) до высокой продукции гиф (+++). PUR был пластиковым порошком, который имел самый высокий процент грибковых штаммов, показывающих рост (92%), причем 31% штаммов показали максимальный рост (+++). Примерно 70% штаммов, выделенных из гуминовой кислоты и лигноцеллюлозных сред, выросли на порошке PS, в то время как почти 60-65% из них смогли использовать HDPE, PVC и PET в качестве единственного источника углерода. Поэтому большой процент грибов смог вырасти на различных пластиковых порошках в многолуночных пластинах, но очень низкое их количество показало высокую колонизацию пластмасс. Действительно, только 10% штаммов смогли процветать на ПЭТ и ПНД, а 13% смогли процветать на PS. Единственным пластиком, где регулярно наблюдался высокий рост грибков, был PUR, на котором примерно 30% грибковых штаммов умудрялись расти очень обильно.

Были проведены качественные ферментативные тесты для выявления грибковых штаммов, которые могут продуцировать ферменты, участвующие в процессах биодеградации непокорных веществ. Пероксидазы и лакказы представляют собой лигнинолитические ферменты, о продукции которых свидетельствует коричневатый ореол на нижней стороне среды в тестах галловой кислоты и гуайаколя (Этап 3.1. и Этап 3.2. протокола). В обоих тестах увеличение интенсивности цвета указывало на более высокую выработку этих ферментов (рисунок 4).

Figure 4
Рисунок 4: Изображения качественной шкалы качественных лигнинолитических ферментов. Качественная шкала основана на производстве красного/коричневатого ореола вокруг колонии. 0 = отсутствие активности, + = некоторая активность, ++ = высокая активность, +++ очень высокая активность. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Примерно 60% протестированных грибов смогли продуцировать лигнинолитические ферменты, что указывает на успех селективных сред. Более того, 12% выделенных грибковых штаммов произвели интенсивный темный ореол вокруг колонии (+++) в среде галловой кислоты, а 17% сделали это в среде гуаяколя (лакказы), что указывает на высокую грибковую секрецию этих ферментов (рисунок 5).

Figure 5
Рисунок 5: Скорость активности ферментов грибковыми штаммами при проведении качественных ферментативных тестов. Процент грибковых штаммов, способных продуцировать лигнинолитические ферменты, лакказы, протеазы и эстеразы с различными уровнями успеха (0 = отсутствие активности, + = активность, ++ = высокая активность, +++ очень высокая активность) при проведении соответствующих им качественных ферментативных тестов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Другим скрининговым тестом, используемым для анализа грибковой активности, был тест на протеазы, который был основан на разнице в росте грибков между средними флаконами YES и контрольными флаконами с BH. Тем не менее, примерно 70% грибковых штаммов в среде YES показали аналогичный рост с контрольной группой или даже снижение роста. Ни один грибковый штамм не достиг максимального уровня разницы (+++). Эти результаты свидетельствуют о том, что этот тест может быть непригоден для скрининга активности протеазы.

Наконец, активность эстераз оценивали по образованию белого осадка в среде Tween 80 (рисунок 5). Почти 60% отобранных грибковых штаммов показали активность эстеразы, а 13% показали высокое образование осадка (+++), что говорит о том, что штаммы в 13% должны быть выбраны для тщательного изучения их потенциала биодеградации (рисунок 5).

Что касается всех тестов роста и ферментативности, наиболее успешными были наиболее успешные штаммы (т.е. те, которые получили +++ хотя бы в одном тесте). Эти грибковые штаммы смогли эффективно использовать непокорные вещества в качестве единственного источника углерода, или они произвели высокий уровень ферментов, участвующих в биодеградации непокорных веществ. Действительно, 39 из 115 протестированных штаммов грибов смогли процветать (+++) на углеводородных источниках (вазелине или отработанном моторном масле), а 58 имели высокий рост по крайней мере на одном пластиковом полимере. Только 32 показали очень высокую ферментативную активность (+++) по крайней мере в одном из проведенных ферментативных тестов. Эти результаты показывают высокую эффективность всех зарегистрированных скрининговых тестов, за исключением теста на протеазы, который не отбирал каких-либо высокоэффективных штаммов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Богатое биоразнообразие почвы является обильным источником грибов, которые обладают многочисленными метаболическими способностями, некоторые из которых могут быть потенциальными кандидатами на биоремедиацию. Селективные испытания сред (раздел 1 протокола) являются простыми в выполнении и эффективными методами выделения грибов, способных расти на природных сложных полимерах в качестве единственного источника углерода. Грибы могут продуцировать внеклеточные, неспецифические гидролазы и оксидоредуктазы30 , такие как лигнинолитические ферменты лакказы и пероксидазы31. Эти ферменты могут разлагать лигноцеллюлозу и гуминовые кислоты, а также множество различных ксенобиотиков, включая углеводороды, ароматические соединения и хлорированные органические соединения32.

Описанные методы дают результаты, которые легко интерпретируются и являются недорогими для выполнения. Эти характеристики позволяют использовать их неспециалистам. Однако некоторые аспекты, такие как стерильность и морфологическая идентификация, требуют особого внимания. Например, 30-минутное перемешивание почвенной суспензии (этап 1.3.4.) необходимо для того, чтобы споры и пропагулы грибов освободились от микроструктуры почвы и могли быть взвешены в растворе. Таким образом, путем обшивки разбавлением этой почвенной суспензии, можно выделить максимальное количество грибковых штаммов. Макро- и микроскопическая морфологическая идентификация грибковых штаммов важна для того, чтобы дифференцировать штаммы и избежать многократного выделения одного и того же грибкового штамма. Кроме того, стерильность и предотвращение микробных загрязнений имеют решающее значение, поскольку присутствие других активных грибковых штаммов может исказить активность исследуемых колоний.

После селективных испытаний был проведен ряд тестов на рост на различных непокорных веществах, таких как вазелин, отработанное моторное масло и различные пластиковые полимеры. Этот этап может быть настроен в соответствии с непокорными веществами, представляющими интерес. Важным шагом является добавление выбранного вещества в BH или BHA в качестве единственного источника углерода и проверка роста грибка против контроля без добавления непокорного вещества.

Целью тестов роста на пластмассах и углеводородах было оценить, может ли гриб использовать эти вещества в качестве единственного источника углерода, качественно наблюдая за его ростом на материале. К сожалению, из-за крайней непокорности этих материалов очень трудно количественно оценить фактическое снижение веса субстрата и увеличение веса грибковой биомассы, особенно через относительно короткий промежуток времени. Если грибковый штамм очень хорошо работает в этих скрининговых тестах роста, следует провести дальнейшие исследования для количественной оценки деградации непокорного вещества.

Используемые ферментативные тесты (раздел 3 протокола) были выбраны потому, что они оказались эффективными и быстрыми в выполнении, но они дают только качественные результаты. Они подчеркивают потенциал деградации грибкового штамма, но не могут точно его количественно оценить. Если выделен штамм, представляющий особый интерес, могут быть проведены дополнительные тесты, такие как спектрофотометрические количественные эссе ферментов, чтобы более точно описать метаболическую активность. Единственным ферментативным тестом, который показал неоптимальную эффективность, был качественный тест на протеазы, с низким количеством штаммов, способных расти на среде YES. Действительно, высокий процент штаммов, способных расти на PUR, предполагает, что грибы продуцируют протеазы, участвующие в разрыве амидных и уретановых связей, причем эстераза нацелена на эфирные связи40. Почти полное отсутствие протеаз-продуцирующих грибов говорит о том, что, возможно, была проблема в используемом методе. Другие тесты могут быть приняты для активности протеазы, такие как казеин41, обезжиренное молоко42 или сухое молоко43 агаровые пластины. Тест галловой кислоты оказался очень полезным для обнаружения выработки лигнинолитических ферментов, но, к сожалению, он был не очень специфическим и не мог различить тип продуцируемого лигнинолитического фермента (либо пероксидазы, либо лакказы).

Результаты этой работы свидетельствуют о том, что использование лигноцеллюлозы или гуминовых кислот в качестве селективных сред позволяет выделить грибковые штаммы с потенциалом биоремедиации из богатого биоразнообразия почвы. Действительно, более 70% грибковых штаммов, выделенных селективными методами, смогли вырасти на вазелине или отработанном моторном масле, а 60% смогли вырасти на различных пластиковых полимерах в качестве единственного источника углерода. Кроме того, качественные ферментативные тесты описывали метаболическую активность этих грибов, связанную с процессами биодеградации. Выбор грибковых штаммов, показывающих активность +++ в одном или нескольких тестах, рекомендуется, потому что это увеличивает шансы найти грибковый штамм, который очень активен в биоремедиации. Испытания с использованием газовой масс-хроматографии (GC-MS) на непокорных веществах после длительного контакта с грибковыми штаммами, отобранными с помощью наших скрининговых тестов, показали фактическую биодеградацию материалов 9,44. Использование этих простых скрининговых тестов в различных экосистемах позволит исследовать грибковое биоразнообразие в разных почвах. Поиск грибов, которые могут разлагать непокорные материалы, увеличит количество идентифицированных штаммов, которые имеют потенциал для биоремедиации и поможет решить растущую проблему загрязнения окружающей среды.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы выражаем признательность Scuola di Alta Formazione Dottorale (SAFD) из Университета Павии и профессору Сольвейгу Тоси за предоставление возможности для этой работы.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 microwell plate Greiner bio-one 650185
Agar VWR 84609.05
Bushnell-Haas Broth Fluka B5051
CaCl2 Sigma-Aldrich C5670
Chloroamphenicol Eurobio GABCRL006Z
Chlortetracycline Sigma-Aldrich Y0001451
CoCl2·6H2O Sigma-Aldrich C8661
CuCl2·2H2O Sigma-Aldrich C3279
Ethanol VWR Chemicals 20821.296
FeCl3·6H2O Sigma-Aldrich 236489
Filter 0.2 µm Whatman 10462200
gallic acid Sigma-Aldrich G7384
Glass cover slips Biosigma VBS634
Glass vials 15 mL SciLabware P35467
guaiacol Sigma-Aldrich G5502
High-density polyethylene (HDPE) Sigma-Aldrich 434272
Humic acids Aldrich Chemistry 53680
K2HPO4 Sigma-Aldrich P8281
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5655
Lignocellulose / / Sterilized bioethanol production waste
L-shaped cell spreader Laboindustria S.p.a 21133
magnetic stirrer A.C.E.F 8235
Malt Extract Broth Sigma-Aldrich 70146
MgSO4·7H2O Sigma-Aldrich M2643
Micropipette 1000 μL Gilson FA10006M
Micropipette 200  μL Gilson FA10005M
MnCl2·4H2O Sigma-Aldrich M5005
Na2MoO4·2H2O Sigma-Aldrich M1651
NaCl Sigma-Aldrich S5886
Neomycin Sigma-Aldrich N0401000
Penicillin Sigma-Aldrich 1504489
peptone Sigma-Aldrich 83059
Polyethylene terephthalate (PET) Goodfellow ES306031
Petri dishes Laboindustria S.p.a 21050
Petrolatum (Paraffin liquid) A.C.E.F 009661
Potato Dextrose Broth Sigma-Aldrich P6685
Polystyrene (PS) Sigma-Aldrich 331651
Polyurethane (PUR) Sigma-Aldrich GF20677923
Polyvinyl chloride (PVC) Sigma-Aldrich 81388
Sterile falcon tube Greiner bio-one 227 261
Sterile glass vials 20 mL Sigma-Aldrich SU860051
Sterile point 1000  μL Gilson F172511
Sterile point 200  μL Gilson F172311
Sterile polyethylene bags WHIRL-PAK B01018
sterile syringe Rays 5523CM25
Streptomycin Sigma-Aldrich S-6501
Tween 80 Sigma-Aldrich P1754
Used engine oil / / complex mixture of hydrocarbons, engine additives, and metals, provided by an Italian private company
Vials 50 mL Sigma-Aldrich 33108-U
ZnCl2 Sigma-Aldrich Z0152

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mohammadi, K., Heidari, G., Khalesro, S., Sohrabi, Y. Soil management, microorganisms and organic matter interactions: A review. African Journal of Biotechnology. 10 (86), 19840-19849 (2011).
  2. Daccò, C., Girometta, C., Asemoloye, M. D., Carpani, G., Picco, A. M., Tosi, S. Key fungal degradation patterns, enzymes and their applications for the removal of aliphatic hydrocarbons in polluted soils: A review. International Biodeterioration and Biodegradation. 147, (2020).
  3. Asemoloye, M. D., Ahmad, R., Jonathan, S. G. Synergistic action of rhizospheric fungi with Megathyrsus maximus root speeds up hydrocarbon degradation kinetics in oil polluted soil. Chemosphere. 187, 1-10 (2017).
  4. Abatenh, E., Gizaw, B., Tsegaye, Z., Wassie, M. The role of microorganisms in bioremediation - A review. Open Journal of Environmental Biology. 2, 038-046 (2017).
  5. Dix, N. J., Webster, J. Fungal Ecology. , Chapman & Hall. Cambridge, UK. (1995).
  6. Magan, N. Fungi in extreme environment. Environmental and Microbial Relationships. The Mycota. Esser, K., Lemke, P. A. 4, Springer. Berlin, Heidelberg. 99-114 (2007).
  7. Aranda, E. Promising approaches towards biotransformation of polycyclic aromatic hydrocarbons with Ascomycota fungi. Current Opinion in Biotechnology. 38, 1-8 (2016).
  8. Hasan, I. F., AI-Jawhari, Role of Filamentous Fungi to Remove Petroleum Hydrocarbons from the Environment. Microbial Action on Hydrocarbons. Kumar, V., Kumar, M., Prasad, R. , Springer. Singapore. (2018).
  9. Daccò, C., et al. Trichoderma: evaluation of its degrading abilities for the bioremediation of hydrocarbon complex mixtures. Applied Sciences. 10 (9), 3152 (2020).
  10. Alarcón, A., Davies, F. T., Autenrieth, R. L., Zuberer, D. A. Arbuscular mycorrhiza and petroleum-degrading microorganisms enhance phytoremediation of petroleum-contaminated soil. International Journal of Phytoremediation. 10, 251-263 (2008).
  11. Mancera-López, M. E., et al. Bioremediation of an aged hydro-carbon-contaminated soil by a combined system of biostimulation-bioaugmentation with filamentous fungi. International Biodeterioration and Biodegradation. 61, (2008).
  12. Hatami, E., Abbaspour, A., Dorostkar, V. Phytoremediation of a petroleum-polluted soil by native plant species in Lorestan Province, Iran. Environmental Science and Pollution Research. 26, 24323-24330 (2019).
  13. Prenafeta-Boldú, F. X., De Hoog, G. S., Summerbell, R. C. Fungal communities in hydrocarbon degradation. Microbial Communities Utilizing Hydrocarbons and Lipids: Members, Metagenomics and Ecophysiology. Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology. , Springer. Cham. 1-36 (2018).
  14. Gu, J., Ford, T., Mitton, D., Mitchell, R. Microbiological degradation of polymeric materials. Uhlig's Corrosion Handbook. , John Wiley and Sons. 421-438 (2011).
  15. Tuomela, M., Hatakka, A. Oxidative fungal enzymes for bioremediation. Comprehensive Biotechnology: Environmental and Related Biotechnologies. 6, Elsevier. 224-239 (2019).
  16. DSouza, G. C., et al. Fungal biodegradation of low-density polyethylene using consortium of Aspergillus species under controlled conditions. Heliyon. 7 (5), 07008 (2021).
  17. El-Sayed, M. T., Rabie, G. H., Hamed, E. A. Biodegradation of low-density polyethylene (LDPE) using the mixed culture of Aspergillus carbonarius and A. fumigates. Environment, Development, and Sustainability. 23 (10), 14556-14584 (2021).
  18. Sepperumal, U., Markandan, M., Palraja, I. Micromorphological and chemical changes during biodegradation of polyethylene terephthalate (PET) by Penicillium sp. Journal of Microbiology and Biotechnology Research. 3 (4), 47-53 (2013).
  19. Leitão, A. L. Potential of Penicillium species in the bioremediation field. International Journal of Environmental Research and Public Health. 6 (4), 1393-1417 (2009).
  20. Chen, S. H., Ting, A. S. Y. Biosorption and biodegradation potential of triphenylmethane dyes by newly discovered Penicillium simplicissimum isolated from indoor wastewater sample. International Biodeterioration & Biodegradation. 103, 1-7 (2015).
  21. Orhan, Y., Buyukgungor, H. Enhancement of biodegradability of disposable polyethylene in controlled biological soil. International Biodeterioration and Biodegradation. 45, 49-55 (2000).
  22. Deshmukh, R., Khardenavis, A. A., Purohit, H. J. Diverse metabolic capacities of fungi for bioremediation. Indian journal of microbiology. 56 (3), 247-264 (2016).
  23. Viswanath, B., Rajesh, B., Janardhan, A., Kumar, A. P., Narasimha, G. Fungal laccases and their applications in bioremediation. Enzyme research. 2014, 163242 (2014).
  24. Ali, M., Husain, Q., Ishqi, H. M. Fungal peroxidases mediated bioremediation of industrial pollutants. Fungal Bioremediation. , CRC Press. Boca Raton. (2019).
  25. Nousiainen, P., Kontro, J., Manner, H., Hatakka, A., Sipilä, J. Phenolic mediators enhance the manganese peroxidase catalyzed oxidation of recalcitrant lignin model compounds and synthetic lignin. Fungal Genetics and Biology. 72, 137-149 (2014).
  26. Srivastava, S., Kumar, M. Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs): A sustainable approach. Sustainable Green Technologies for Environmental Management. , Springer. Singapore. (2019).
  27. Wei, R., Zimmermann, W. Microbial enzymes for the recycling of recalcitrant petroleum-based plastics: how far are we. Microbial Biotechnology. 10 (6), 1308-1322 (2017).
  28. Matsubara, M., Lynch, J. M., De Leij, F. A. A. M. A simple screening procedure for selecting fungi with potential for use in the bioremediation of contaminated land. Enzyme and Microbial Technology. 39 (7), 1365-1372 (2006).
  29. Mann, J., et al. Screening and selection of fungi for bioremediation of olive mill wastewater. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 26 (3), 567-571 (2010).
  30. Andlar, M., Rezić, T., Marđetko, N., Kracher, D., Ludwig, R., Šantek, B. Lignocellulose degradation: an overview of fungi and fungal enzymes involved in lignocellulose degradation. Engineering in Life Sciences. 18, 768-778 (2018).
  31. Goméz-Toribio, V., García-Martín, A. B., Martínez, M. J., Martínez, A. T., Guillén, F. Induction of extracellular hydroxyl radical production by white-rot fungi through quinone redox cycling. Applied and Environmental Microbiology. 75, 3944-3953 (2009).
  32. Belcarz, A., Ginalska, G., Kornillowicz-Kowalska, T. Extracellular enzyme activities of Bjerkandera adusta R59 soil strain, capable of daunomycin and humic acids degradation. Applied Microbiology and Biotechnology. 68 (5), 686-694 (2005).
  33. Stevenson, F. J. Humus Chemistry: Genesis, Composition, Reactions. 2nd ed. , Wiley. New York. (1995).
  34. Andlar, M., et al. Lignocellulose degradation: An overview of fungi and fungal enzymes involved in lignocellulose degradation. Engineering in Life Sciences. 18 (11), 768-778 (2018).
  35. Lee, H., et al. Biotechnological procedures to select white rot fungi for the degradation of PAHs. Journal of Microbiological Methods. 97 (1), 56-62 (2014).
  36. Batista-García, R. A., et al. Simple screening protocol for identification of potential mycoremediation tools for the elimination of polycyclic aromatic hydrocarbons and phenols from hyperalkalophile industrial effluents. Journal of Environmental Management. 198, 1-11 (2017).
  37. Shleev, S. V., et al. Comparison of physico-chemical characteristics of four laccases from different basidiomycetes. Biochimie. 86 (9-10), (2004).
  38. Kiiskinen, L. L., Rättö, M., Kruus, K. Screening for novel laccase-producing microbes. Journal of Applied Microbiology. 97, (2004).
  39. Kumar, V. V., Rapheal, V. S. Induction and purification by three-phase partitioning of aryl alcohol oxidase (AAO) from Pleurotus ostreatus. Applied Biochemistry and Biotechnology. , 163 (2011).
  40. Loredo-Treviño, A., Gutiérrez-Sánchez, G., Rodríguez-Herrera, R., Aguilar, C. N. Microbial enzymes involved in polyurethane biodegradation: a review. Journal of Polymers and the Environment. 20 (1), 258-265 (2012).
  41. Garriga, M., et al. Technological and sensorial evaluation of Lactobacillus strains as starter cultures in fermented sausages. International Journal of Food Microbiology. 32 (1-2), 173-183 (1996).
  42. Zerdani, I., Faid, M., Malki, A. Feather wastes digestion by new isolated strains Bacillus sp. In microcco. African Journal of Biotechnology. 3 (1), 67-70 (2004).
  43. Nygren, C. M., Edqvist, J., Elfstrand, M., Heller, G., Taylor, A. F. Detection of extracellular protease activity in different species and genera of ectomycorrhizal fungi. Mycorrhiza. 17 (3), 241-248 (2007).
  44. Asemoloye, M. D., et al. Hydrocarbon degradation and enzyme activities of Aspergillus oryzae and Mucor irregularis isolated from Nigerian crude oil-polluted sites. Microorganisms. 8 (12), 1912 (2020).

Tags

Биология Выпуск 183 Грибы почва биоразнообразие биоремедиация скрининг-тест углеводороды пластмассы ферментативная активность
Изоляция и скрининг из биоразнообразия почв на грибы, участвующие в деградации непокорных материалов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Temporiti, M. E. E., Daccò, C., … More

Temporiti, M. E. E., Daccò, C., Nicola, L. Isolation and Screening from Soil Biodiversity for Fungi Involved in the Degradation of Recalcitrant Materials. J. Vis. Exp. (183), e63445, doi:10.3791/63445 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter