Summary
Här presenterar vi ett protokoll för screening av markens biologiska mångfald för att leta efter svampstammar som är involverade i nedbrytningen av motsträviga material. Först isoleras svampstammar som kan växa på humana syror eller lignocellulosa. Deras aktivitet testas sedan både i enzymatiska analyser och på föroreningar som kolväten och plast.
Abstract
Miljöföroreningar är ett ökande problem, och att identifiera svampar som är involverade i bioremedieringsprocessen är en viktig uppgift. Jord är värd för en otrolig mångfald av mikrobiellt liv och kan vara en bra källa till dessa bioremedierande svampar. Detta arbete syftar till att söka efter marksvampar med bioremedieringspotential genom att använda olika screeningtester. Mineralodlingsmedier kompletterade med motsträviga ämnen som enda kolkälla användes som tillväxttester. Först pläterades jordutspädningar på petriskålar med mineralmedium ändrat med humana syror eller lignocellulosa. De växande svampkolonierna isolerades och testades på olika substrat, såsom komplexa blandningar av kolväten (petrolatum och begagnad motorolja) och pulver av olika plastpolymerer (PET, PP, PS, PUR, PVC). Kvalitativa enzymatiska tester associerades med tillväxttesterna för att undersöka produktionen av esteraser, laccases, peroxidaser och proteaser. Dessa enzymer är involverade i de huvudsakliga nedbrytningsprocesserna av motsträvigt material, och deras konstitutiva utsöndring av de undersökta svampstammarna kan ha potential att utnyttjas för bioremediering. Mer än 100 stammar isolerades och testades, och flera isolat med god bioremedieringspotential hittades. Sammanfattningsvis är de beskrivna screeningtesterna en enkel och billig metod för att identifiera svampstammar med bioremedieringspotential från jorden. Dessutom är det möjligt att skräddarsy screeningtesterna för olika föroreningar, enligt kraven, genom att lägga till andra motsträviga ämnen till minimala odlingsmedier.
Introduction
Jord är en grundläggande del av livet på jorden och är grunden för många ekosystem. Mineralerna, organiskt material och mikroorganismer i jorden kan betraktas som ett system, med nära föreningar och interaktioner som uppstår mellan dem. Samspelet mellan dessa föreningar har en viktig inverkan på terrestra processer, miljökvalitet och ekosystemhälsa1. Markföroreningar utgör allvarliga miljöproblem över hela världen. Den urskillningslösa, långsiktiga och överdrivna tillämpningen av motsträviga och giftiga ämnen, såsom bekämpningsmedel, petroleumprodukter, plast och andra kemikalier, har allvarliga effekter på markens ekologi och kan som ett resultat förändra markens mikrobiota. Mikrobiella samhällen i jordar består av ett brett spektrum av organismer i olika fysiologiska tillstånd, där majoriteten är bakterier och svampar. Många av föroreningarna i jord har stabilitet på medellång till lång sikt, och deras uthållighet kan leda till utveckling av adaptiva mekanismer som gör det möjligt för mikroorganismerna att använda motsträviga ämnen som näringsämnen 2,3. Dessa mikroorganismer kan därför övervägas för bioremedieringstekniker.
Bioremediering försöker mildra effekterna av föroreningar genom att använda mikroorganismer och deras enzymer för nedbrytning eller omvandling av avfall till mindre giftiga eller giftfria föreningar. Olika arter av arkéer, bakterier, alger och svampar har denna bioremedieringsförmåga4. Som ett resultat av deras speciella biologiska verkan är svampar särskilt lovande organismer för bioremediering. De kan attackera olika substrat med hjälp av deras hyphalnätverk, vilket gör det möjligt för dem att tränga in i jordmatrisen mer effektivt än andra mikroorganismer. Dessutom kan de nå otillgängliga mellanrum där föroreningar är svåra att ta bort5, och de kan också överleva låga fuktnivåer6. Dessutom syntetiserar svampar olika kassetter av ospecifika enzymer, vanligtvis för att bryta ner naturliga motsträviga ämnen såsom cellulosa, lignin och humana syror. De som saknar målsubstratet kan vara involverade i nedbrytningen av ett brett spektrum av motsträviga föroreningar, såsom kolväten, plast och bekämpningsmedel 7,8,9,10. Därför, även om många svamparter redan har rapporterats som bioremedieringsmedel, finns det ett ökande intresse för att utforska arter som ännu inte har studerats för att välja kandidater för bioremediering av motsträviga förorenande ämnen. De arter som redan är kända för att ha bioremedieringsegenskaper tillhör phyla Ascomycota 11,12,13, Basidiomycota 14,15 och Mucoromycota. Till exempel är släktena Penicillium och Aspergillus välkända för att vara involverade i nedbrytningen av alifatiska kolväten13, olika plastpolymerer 16,17,18, tungmetaller 19 och färgämnen20. På liknande sätt har studier utförda på basidiomycetessvampar, såsom Phanerochaete chrysosporium och Trametes versicolor, avslöjat deras engagemang i oxidationen av motsträviga material såsom aromatiska kolväten13 och plast21. Ett annat exempel på svampar som är involverade i de biologiska nedbrytningsprocesserna är zygomycetes Rhizopus spp., Mucor spp., och Cunninghamella spp.22,23. I synnerhet kan Cunninghamella oxidera aromatiska kolväten och anses vara en modellorganisme för att studera avgiftning av produkter från ett brett spektrum av xenobiotika13.
Det finns flera svampenzymer involverade i de stora nedbrytande processerna av motsträviga material 24,25, såsom esteras, laccase, peroxidas och proteas. Laccases är kopparinnehållande oxidaser som produceras i cellen och därefter utsöndras, som möjliggör oxidation av en mängd olika fenoliska och aromatiska föreningar. De kan bryta ner orto- och paradifenoler, aminogruppinnehållande fenoler, lignin och arylgruppinnehållande diaminer26. Peroxidaser använder väteperoxid som medlare för att bryta ner lignin och andra aromatiska föreningar. Det finns många olika peroxidaser, men de som har störst potential att bryta ner giftiga ämnen är ligninperoxidas och manganperoxidas27.
Esteraser och proteaser tillhör gruppen extra- eller ektocellulära enzymer, som verkar utanför sina ursprungsceller men fortfarande är bundna till dem. Dessa enzymer kan katalysera hydrolysen av stora motsträviga molekyler till mindre. På grund av deras låga substratspecificitet kan dessa enzymer spela en nyckelroll i bioremediering av olika föroreningar, såsom textilfärger, avloppsvatten som släpps ut från massa- och pappersindustrin och lädergarvning, petroleumprodukter, plast och bekämpningsmedel 28,29,30.
Ett antal screeningmetoder att välja för bioremedierande svampstammar har redan publicerats. Till exempel har halmbaserat agarmedium använts för att screena för vitrötsvampar med hög potential i nedbrytningen av polycykliska aromatiska kolväten (PAH)31; och små bitar av ruttnande trä har placerats på maltextraktagar (MEA) för att isolera trärötande svampar32. De flesta av de metoder som redan har föreslagits väljer emellertid mycket specifika svampar för deras aktivitet av intresse. Denna forskning föreslår ett bredare tillvägagångssätt för att välja marksvampar med ett bredare spektrum av åtgärder. Metoden bygger på initial plätering av seriella utspädningar av jordprover på ett medium som ändrats med humana syror eller lignocellulosa blandat med antibiotika för att välja svampar med förmågan att bryta ner dessa naturliga motsträviga ämnen. Humic syror och lignocellulosa är i själva verket ämnen som är extremt resistenta mot biologisk nedbrytning eftersom de har mycket komplexa molekylära strukturer, vilket gör att de kan vara utmärkta indikatorer på den nedbrytbara förmågan hos de testade svamparna33,34. Därefter screenas de svampar som valts ut i de första testerna för att identifiera de som har potential att bryta ned specifika föroreningar som petrolatum, begagnad motorolja och plast. Slutligen utförs kvalitativa enzymatiska tester för att detektera svampstammar som kan producera enzymer som är involverade i de biologiska nedbrytningsprocesserna av motsträviga ämnen. För detta ändamål utförs proteas- och esterastester, medan gallinsyra och guaiakol används som indikatorer på lakonfall och annan ligninolytisk enzymproduktion35,36. Dessa substrat används eftersom en stark korrelation har hittats mellan svamparnas förmåga att oxidera dem till sin brunfärgade form och innehavet av ligninolytisk förmåga 37,38,39.
Genom dessa protokoll är det möjligt att isolera svampstammar med hög nedbrytande potential och ett brett spektrum av verkan direkt från jordprover. Isoleringen av dessa svampstammar kan hjälpa till att hitta nya kandidater för bioremedieringsändamål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Val av svampstammar som kan bryta ner motsträviga material från jord
- Framställning av antibiotikalösning.
- Sätt penicillin (50 mg / L), streptomycin (40 mg / L), klortetracyklin (40 mg / L), neomycin (100 mg / L) och kloramfenikol (100 mg / L) i 250 ml avjoniserat sterilt vatten.
- Innan du tillsätter kloramfenikol till antibiotikalösningen, lös upp den i 3 ml ≥99% etanol.
- Placera antibiotikalösningen på en magnetomrörare (ingen värme) med en magnetisk omrörningsstång inuti lösningen i 10 minuter. Förvaras vid 4 °C.
- Förberedelse av tillväxtmedier.
- Lägg 1 g kommersiell huminsyra, 3,26 g Bushnell-Haas-buljong (BH) och 15 g agar i 1 liter avjoniserat vatten och autoklavera det i 20 minuter vid 121 °C (huminsyraagar).
- Platta den huminsyraagaren i petriskålar under ett laminärt flödesskåp.
- Lägg 4 g lignocellulosa, 3,26 g BH och 15 g agar i 1 liter avjoniserat vatten och autoklavera det i 20 minuter vid 121 °C (lignocellulosaagar).
- Platta lignocellulosaagaren i petriskålar under ett laminärt flödesskåp.
- Under ett laminärt flödesskåp, efter att mediet har stelnat i petriskålarna, överför 1 ml antibiotikalösning till de beredda plattorna med en steril spruta med ett 0,2 μm filter för att sterilisera det.
- Fördela antibiotikalösningen jämnt på plattytorna med en steril L-formad cellspridare för engångsbruk och låt den lufttorka under det laminära flödesskåpet.
- Lägg 20 g maltextraktbuljong och 15 g agar i 1 liter avjoniserat vatten och autoklavera det i 20 minuter vid 121 °C (maltextraktagar - MEA).
- Platta MEA i petriskålar under ett laminärt flödesskåp.
- Jordprovtagning och jordutspädningar.
- Prova jorden av intresse på ett djup av 10 cm, ta bort alla växter, gräs och döda löv från toppskiktet och lägg det i sterila polyetenpåsar.
- Efter att ha nått laboratoriet, sikta jorden med ett 2 mm nät, ta bort eventuella rötter och växtskräp.
- Om det inte är möjligt att fortsätta med nedströmsanalysen omedelbart, förvara de siktade jordproverna vid 4 °C.
- Arbeta under ett laminärt flödesskåp, lägg 1 g av den siktade jorden i ett sterilt 15 ml rör med 10 ml sterilt avjoniserat vatten (1 x 10-1 utspädning). Skaka röret horisontellt i 30 minuter.
- Under ett laminärt flödesskåp, innan suspensionen sätter sig, ta 1 ml av utspädningen 1 x 10-1 med en steril pipett och överför den till en 9 ml avjoniserat vattenämne (1 x 10-2 utspädning). Vortex det ordentligt.
- Innan suspensionen sätter sig, ta 1 ml av utspädningen 1 x 10-2 med en steril pipett och överför den till ett ämne på 9 ml avjoniserat vatten (1 x 10-3 utspädning). Vortex det ordentligt.
- Plätering av jordutspädningar på selektiva medier.
- Arbeta under ett laminärt flödesskåp, samla 100 μL av utspädningen 1 x 10-3 med en mikropipett med en steril punkt och överför den till en humisk agar Petriskål. Gör detta för minst 4 eller 5 petriskålar.
- Fördela utspädningen jämnt på petriskålens yta med en steril L-formad cellspridare för engångsbruk.
- Låt det lufttorka i 10-15 min under det laminära flödesskåpet.
- Upprepa steg 1.4.1.-1.4.3. med lignocellulosa petriskålar.
- Inkubera vid 25 °C i mörker i högst 15 dagar.
- Isolering av svampkolonier odlade från selektiva medier till tillväxtmedier.
- Från och med 3 dagar efter beredningen, kontrollera de beredda selektiva medierna Petri-rätter dagligen för eventuell svampkolonitillväxt i högst 15 dagar.
- Kontrollera alla svampkolonier som finns för likheter. Förbered vid behov en bild som ska observeras under ett ljusmikroskop.
OBS: Målet är att isolera det högsta antalet svampkolonier, men det är nödvändigt att undvika att alltid isolera samma svampstam från olika plattor, så denna kontroll är mycket viktig. Leta efter kolonier med olika makro- och mikromorfologi. - Under ett laminärt flödesskåp eller vid en Bunsen-brännare, isolera varje vald svampstam genom att försiktigt ta bort en liten del av myceliet från kolonin med en steril ympningsnål och överföra den till en ny MEA Petri-skål.
OBS: I denna fas är det mycket viktigt att vara känslig och exakt eftersom det finns en hög risk för kontaminering från de andra svampkolonierna som finns i den ursprungliga petriskålen. Om mer än en svampstam växer på den inokulerade MEA-plattan, upprepa steg 1.5.3. - Inkubera vid 25 °C i mörker i 7 dagar. Dessa är de svampstammar som ska testas ytterligare på specifika motsträviga ämnen.
2. Tillväxttester på motsträviga ämnen
- Tillväxttest på petrolatum.
- Överför 20 ml flytande BH (3,26 g/l BH) till 50 ml injektionsflaskor och sterilisera dem genom autoklavering vid 121 °C i 20 minuter.
- Överför 7 ml avjoniserat vatten till 15 ml glasflaskor och tillsätt några bitar av trasiga glasöverdrag i varje injektionsflaska.
- Sterilisera dem genom autoklavering vid 121 °C i 20 minuter.
- Under det laminära flödesskåpet, tillsätt 1 ml petrolatum till varje 50 ml BH-injektionsflaska med en steril pipett. Förvara några injektionsflaskor med endast BH som negativ kontroll.
- Under det laminära flödesskåpet, ta bort myceliet på ytan av mediet från MEA-plattorna med de valda svampstammarna (framställda i steg 1.5.3.) med en steril nål och överför det till 15 ml glasflaskor med de trasiga täckglasen.
- Agitera varje injektionsflaska på en virvelblandare i 2 minuter, så att de trasiga täckglasen kan skära kuben i svampkolonin och göra en svampsuspension.
- Inokulera varje injektionsflaska med petrolatum med 200 μl svampsuspension. Gör två replikat för varje svampstam.
- För den negativa kontrollen, sätt 200 μL svampsuspension i injektionsflaskor med endast flytande BH. Förvara dessutom ett par injektionsflaskor med petrolatum utan svampinokulering för att kontrollera om det finns kontaminering i mediet.
- Inkubera injektionsflaskorna vid 25 °C i mörker och kontrollera dem efter 15 dagar och 30 dagar från inokulatet.
- Tillväxttest på begagnad motorolja.
- Sätt 3,26 g BH och 15 g agar i 1 liter avjoniserat vatten och autoklavera det i 20 minuter vid 121 °C (BHA).
- Platta BHA i petriskålar under ett laminärt flödesskåp.
- När den har stelnat överför du 500 μl använd motorolja till BHA Petri-diskarna och fördelar den jämnt på plattytorna med hjälp av en steril L-formad cellspridare för engångsbruk.
- Inokulera varje använd BHA-platta med motorolja med varje svampstam och samla myceliet från plattorna som framställts i steg 1.5.3. Arbeta vid en Bunsen-brännare eller under en laminär flödeshuv för att undvika kontaminering. Gör två replikat för varje svampstam.
- För den negativa kontrollen, inokulera petriskålarna endast med BHA. Förvara dessutom ett par begagnade BHA Petri-rätter utan svampinokulering för att kontrollera om det finns föroreningar i mediet.
- Inkubera petriskålarna vid 25 °C i mörkret och kontrollera dem efter 15 dagar och 30 dagar från inokulatet.
- Tillväxttest på plast.
- Överför 200 μl svampsuspension (steg 2.1.5.-2.1.6)) till en 96-mikrowellplatta. Gör tre replikat av kombinationen svampstam-plast.
- Till varje brunn med svampsuspensionen, tillsätt 10 mg av en annan typ av plastpulver (polyetentereftalat - PET, polyvinylklorid - PVC, högdensitetspolyeten - HDPE, polystyren - PS, polyuretan - PUR).
- För den negativa kontrollen, istället för att tillsätta plastpulvret, tillsätt 200 μL steriliserad BH-lösning till brunnen med svampsuspensionen. För varje typ av plastpulver fyller du dessutom en brunn med 200 μl steriliserad BH-lösning och 10 mg av varje plastdamm för att kontrollera om mediet förorenas.
- Inkubera mikrowellplattorna vid 25 °C i mörker och kontrollera dem efter 15 dagar och 30 dagar från inokulatet.
3. Kvalitativa enzymatiska tester
- Kvalitativt ligninolytiska enzymer kolorimetriskt test.
- Lägg 27 g potatisdextrosbuljong (PD) och 15 g agar i 1 liter avjoniserat vatten och autoklavera det i 20 minuter vid 121 °C (PDA).
- När mediet har svalnat lite men fortfarande är flytande, tillsätt gallinsyra (5 g / L) under en laminär flödeshuv och platta mediet i petriskålar.
- Inokulera PDA + gallinsyraplattorna med varje svampstam och samla myceliet från plattorna som framställts i steg 1.5.3. Arbeta vid en Bunsen-brännare eller under en laminär flödeshuv för att undvika kontaminering.
- Som negativa kontroller, förbered petriskålar med endast PDA (ingen gallinsyra) och inokulera dem med svampstammarna (en för varje svampstam), samt en petriskål med PDA + gallinsyra och ingen svampinokulering.
- Inkubera petriskålarna vid 25 °C i mörkret och kontrollera dem efter 7 dagar från inokulatet.
- Kvalitativt laccases kolorimetriskt test.
- Lägg 27 g PD och 15 g agar i 1 liter avjoniserat vatten och autoklavera det i 20 minuter vid 121 °C (PDA).
- När mediet har svalnat lite men fortfarande är flytande, tillsätt guaiacol (400 μL/L) under en laminär flödeshuv och platta det i petriskålar.
- Inokulera PDA + guaiacolplattorna med varje svampstam och samla myceliet från plattorna som framställts i steg 1.5.3. Arbeta vid en Bunsen-brännare eller under en laminär flödeshuv för att undvika kontaminering.
- Som negativa kontroller, förbered petriskålar med endast PDA (ingen guaiacol) Och inokulera dem med svampstammarna (en för varje svampstam), samt en petriskål med PDA + guaiacol och ingen svampinokulering.
- Inkubera petriskålarna vid 25 °C i mörkret och kontrollera dem efter 7 dagar från inokulatet.
- Kvalitativt proteastest.
- Förbered YES-mediet genom tillsats avK2HPO4 (1 g/L),KH2PO4 (0,5 g/L), MgSO4·7H2O(0,5 g/L), MnCl2·4H2O(0,001 g/L), CuCl2·2H2O(1,4 x 10–5 g/l), ZnCl2 (1,1 x 10–5 g/L), CoCl2·6H2O(2 x 10–5 g/L). Na2MoO4·2H2O(1,3 x 10-5 g/L), FeCl3·6H2O(7,5 x 10-5 g/L) och gelatin/pepton (0,02 g/L) till avjoniserat vatten.
- Placera YES-mediet på en magnetomrörare (ingen värme) med en magnetisk omrörningsstång inuti mediet i 10 minuter.
- När alla salter har lösts upp i mediet överför du 5 ml av lösningen till 20 ml sterila glasflaskor och autoklaverar dem i 20 minuter vid 121 °C.
- För negativ kontroll, bered cirka 20 ml sterila glasflaskor med 5 ml BH-lösning och autoklavera dem i 20 minuter vid 121 °C.
- Överför 200 μl svampsuspension (steg 2.1.5.-2.1.6) under ett laminärt flödesskåp till de YES-mediumsteriliserade injektionsflaskorna (gör minst 2 replikat per svampstam). För varje svampstam, tillsätt 200 μL av samma svampsuspension till BH-steriliserade injektionsflaskor för att få en negativ kontroll.
- Inkubera injektionsflaskorna vid 25 °C i mörker i 21 dagar och kontrollera dem var 7:e dag.
- Kvalitativ esteras test.
- Förbered Tween 80-mediet genom att tillsätta pepton (10 g/L), NaCl (5 g/L),CaCl2 (0,1 g/L) och 10 ml Tween 80 till 1 liter avjoniserat vatten.
- Placera Tween 80-mediet på en magnetomrörare (ingen värme) med en magnetisk omrörningsstång inuti mediet i 10 minuter.
- När allt är smält inuti mediet överför du 5 ml av lösningen till 20 ml sterila glasflaskor och autoklaverar dem i 20 minuter vid 121 °C.
- För negativ kontroll, bered cirka 20 ml sterila glasflaskor med 5 ml BH-lösning och autoklavera dem i 20 minuter vid 121 °C.
- Överför 200 μl svampsuspension (steg 2.1.5.-2.1.6) under ett laminärt flödesskåp till Tween 80 mediumsteriliserade injektionsflaskor (gör minst 2 replikat per svampstam). För varje svampstam, tillsätt 200 μL av samma svampsuspension till BH-steriliserade injektionsflaskor för negativ kontroll.
- Inkubera injektionsflaskorna vid 25 °C i mörker i 21 dagar och kontrollera dem var 7:e dag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De selektiva mediemetoderna (avsnitt 1 i protokollet) gjorde det möjligt att screena markens rika biologiska mångfald och välja svampar med hög bioremedieringspotential. Med huminsyra- och lignocellulosamedierna isolerades mer än 100 svampstammar. Dessa svampar producerade enzymer som är involverade i biologisk nedbrytning av naturliga motsträviga material, som har en kemisk struktur som liknar många föroreningar. De svampstammar som isolerades med det selektiva mediet behövde dock ytterligare screening. Specifikt isolerade de selektiva testerna de stammar som kunde bryta ner humana syror och lignocellulosa, tillväxttesterna screenade de isolerade svamparna för dem som kunde använda en specifik förorening som sin enda kolkälla och de kvalitativa enzymatiska testerna beskrev deras metaboliska aktiviteter.
Tillväxttesterna fokuserade på svampförmågan att bryta ner kolväten (petrolatum och begagnad motorolja) och plast (PET, PVC, HDPE, PS, PUR). Vart och ett av dessa ämnen användes i ett test som enda kolkälla för de utvalda svampstammarna. Svampförmågan att utnyttja dessa ämnen utvärderades som skillnaden i kolonitillväxt mellan proverna med det tillsatta ämnet och kontrollproverna med endast minimalt medium (BH eller BHA, beroende på testet). En kvalitativ skala användes för att beskriva resultaten (figur 1), allt från frånvaron av tillväxtskillnad med kontrollen (0) till låga (+), medelstora (++) och höga (+++) nivåer av skillnad i tillväxt.
Figur 1: Tillväxttakt för svampstammar i tillväxttesterna. Andelen svampstammar som kan växa på petrolatum, begagnad motorolja och plastpulver (polyetentereftalat, PET; polyvinylklorid, PVC; högdensitetspolyeten, HDPE; polystyren, PS; polyuretan, PUR) som deras enda kolkälla med olika grad av framgång (ingen tillväxt, 0; låg tillväxt, +; medeltillväxt, ++; hög tillväxt, +++). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Petrolatum- och begagnade motoroljetester utvärderade potentialen för biologisk nedbrytning av kolväten hos de utvalda svampstammarna. Petrolatum, en blandning av långkedjiga alkaner (>C25), användes som enda kolkälla. Svampförmågan att utnyttja detta ämne utvärderades som skillnaden i kolonitillväxt mellan injektionsflaskor med BH + petrolatum och kontrollflaskor med endast BH (figur 2). Nästan 75% av de testade svampstammarna kunde använda petrolatum som sin enda kolkälla, och 21% av stammarna uppvisade maximal tillväxt (+++, Figur 1).
Figur 2: Bilder av den kvalitativa tillväxtskalan på petrolatum som enda kolkälla. Den kvalitativa skalan baseras på tillväxtskillnaden mellan de behandlade proverna och BH-kontrollen. Det sträcker sig från frånvaron av tillväxtskillnad (0), till låga (+), medelstora (++) och höga (+++) tillväxtskillnader. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Använd motorolja är en komplex blandning av kolväten, motortillsatser och metaller. Det användes i tillväxttesterna för att utvärdera svampförmågan att använda en komplex och giftig kolväteblandning som kolkälla. Liksom de andra tillväxttesterna utvärderades tillväxten genom att jämföra svamptillväxten i plattor med motoroljan med tillväxt i kontrollplattorna som bara innehöll BHA (figur 3). Tillväxtresultaten bekräftade effekten av det selektiva mediet (avsnitt 1 i protokollet). Faktum är att nästan 90% av de isolerade svampstammarna kunde växa på begagnad motorolja, med 39% som visade maximal tillväxt (+++, figur 1).
Figur 3: Bilder av den kvalitativa tillväxtskalan för använd motorolja som enda kolkälla. Den kvalitativa skalan baseras på tillväxtskillnaden mellan de behandlade proverna och BHA-kontrollen. Det sträcker sig från frånvaro av tillväxtskillnad (0), till låga (+), medelstora (++) och höga (+++) nivåer av tillväxtskillnad. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tillväxttester på plastpulver användes för att välja de svampstammar som kunde använda specifika plastpolymerer som sin primära kolkälla; därför har dessa stammar en hög potential för plastbioremediering. Tillväxten i multiwellplattor observerades med stereomikroskop och utvärderades med hjälp av en kvalitativ skala, allt från frånvaro av tillväxt (0) till hög produktion av hyfer (+++). PUR var det plastpulver som hade den högsta andelen svampstammar som visade tillväxt (92%), med 31% av stammarna som visade maximal tillväxt (+++). Cirka 70% av stammarna isolerade från huminsyra och lignocellulosamedia växte på PS-pulver, medan nästan 60%-65% av dem kunde använda HDPE, PVC och PET som sin enda kolkälla. Därför kunde en stor andel svampar växa på de olika plastpulverna i flerbrunnsplattor, men ett mycket lågt antal av dem visade hög kolonisering av plast. Faktum är att endast 10% av stammarna kunde trivas på PET och HDPE, och 13% kunde trivas på PS. Den enda plast där hög svamptillväxt regelbundet observerades var PUR, på vilken cirka 30% av svampstammarna lyckades växa mycket rikligt.
Kvalitativa enzymatiska tester utfördes för att detektera svampstammar som kan producera enzymer som är involverade i de biologiska nedbrytningsprocesserna av motsträviga ämnen. Peroxidaser och lakonfall är ligninolytiska enzymer vars produktion indikeras av en brunaktig halo på undersidan av mediet i gallinsyra- och guaiakoltester (steg 3.1 och steg 3.2 i protokollet). I båda testerna indikerade ökningen av färgens intensitet en högre produktion av dessa enzymer (Figur 4).
Figur 4: Bilder av den kvalitativa skalan av kvalitativa ligninolytiska enzymer. Den kvalitativa skalan bygger på produktion av en röd/brunaktig gloria runt kolonin. 0 = ingen aktivitet, + = viss aktivitet, ++ = hög aktivitet, +++ mycket hög aktivitet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Cirka 60% av de testade svamparna kunde producera ligninolytiska enzymer, vilket indikerar framgången för det selektiva mediet. Dessutom producerade 12% av de isolerade svampstammarna en intensiv mörk halo runt kolonin (+++) i gallinsyramedium, med 17% som gjorde det i guaiacolmedium (laccases), vilket indikerar hög svampsekretion av dessa enzymer (Figur 5).
Figur 5: Enzymaktivitetshastighet av svampstammar under kvalitativa enzymatiska tester. Andelen svampstammar som kan producera ligninolytiska enzymer, lakhöljen, proteaser och esteraser med olika framgångsnivåer (0 = ingen aktivitet, + = aktivitet, ++ = hög aktivitet, +++ mycket hög aktivitet) under deras motsvarande kvalitativa enzymatiska tester. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Ett annat screeningtest som användes för att analysera svampaktivitet var proteastestet, som baserades på skillnaden i svamptillväxt mellan YES-mediumflaskor och kontrollflaskor med BH. Men cirka 70% av svampstammarna i YES-mediet visade liknande tillväxt som kontroller, eller till och med minskad tillväxt. Ingen svampstam nådde den maximala skillnaden (+++). Dessa resultat tyder på att detta test kan vara olämpligt för screening för proteasaktivitet.
Slutligen utvärderades esterasaktiviteten genom bildandet av en vit fällning i Tween 80-medium (figur 5). Nästan 60% av de utvalda svampstammarna visade esterasaktivitet och 13% visade en hög bildning av fällningen (+++), vilket tyder på att stammarna i 13% bör väljas för att granska deras biologiska nedbrytningspotential (Figur 5).
När det gäller alla tillväxt- och enzymatiska tester var de mest framgångsrika stammarna (dvs de som erhöll +++ i minst ett test) de mest intressanta. Dessa svampstammar kunde effektivt använda motsträviga ämnen som sin enda kolkälla, eller så producerade de en hög nivå av enzymer som är involverade i biologisk nedbrytning av motsträviga ämnen. Faktum är att 39 av de 115 testade svampstammarna kunde trivas (+++) på kolvätekällor (petrolatum eller begagnad motorolja), och 58 hade hög tillväxt på minst en plastpolymer. Endast 32 visade mycket hög enzymatisk aktivitet (+++) i minst ett av de enzymatiska tester som utfördes. Dessa resultat visar den höga effekten av alla rapporterade screeningtester, förutom proteastestet, som inte valde några högpresterande stammar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Jordens rika biologiska mångfald är en riklig källa till svampar som har många metaboliska förmågor, varav några kan vara potentiella kandidater för bioremediering. Selektiva medietester (avsnitt 1 i protokollet) är enkla att utföra och effektiva metoder för att isolera svampar som kan växa på naturliga komplexa polymerer som sin enda kolkälla. Svampar kan producera extracellulära, ospecifika hydrolaser och oxidoreduktaser30 såsom de ligninolytiska enzymerna laccases och peroxidaser31. Dessa enzymer kan bryta ner lignocellulosa och humana syror, men också många olika xenobiotika, inklusive kolväten, aromatiska föreningar och klorerade organiska föreningar32.
De beskrivna metoderna ger resultat som är lätta att tolka och är billiga att genomföra. Dessa egenskaper gör att de kan användas av icke-experter. Vissa aspekter, såsom sterilitet och morfologisk identifiering, kräver emellertid särskild uppmärksamhet. Till exempel är 30 minuters omrörning av jordsuspensionen (steg 1.3.4)nödvändig så att svampsporerna och propagulerna frigörs från jordens mikrostruktur och kan suspenderas i lösningen. På detta sätt, genom plätering av utspädningar av denna jordsuspension, är det möjligt att isolera det maximala antalet svampstammar. Makro- och mikroskopisk morfologisk identifiering av svampstammar är viktiga för att skilja mellan stammar och undvika att isolera samma svampstam flera gånger. Dessutom är sterilitet och undvikande av mikrobiella föroreningar avgörande eftersom närvaron av andra aktiva svampstammar kan ge en felaktig bild av aktiviteten hos de studerade kolonierna.
Efter de selektiva testerna utfördes en rad tillväxttester på olika motsträviga ämnen, såsom petrolatum, använd motorolja och olika plastpolymerer. Detta steg kan anpassas enligt de motsträviga ämnena av intresse. Det viktiga steget är att tillsätta det valda ämnet till BH eller BHA som enda kolkälla och att kontrollera svamptillväxten mot en kontroll utan det tillsatta motsträviga ämnet.
Syftet med tillväxttesterna på plast och kolväten var att bedöma om svampen kunde använda dessa ämnen som sin enda kolkälla genom att kvalitativt observera dess tillväxt på materialet. Tyvärr, på grund av den extrema motsträvigheten hos dessa material, är det mycket svårt att kvantifiera den faktiska minskningen av substratets vikt och ökningen av svampbiomassans vikt, särskilt efter en relativt kort tid. Om en svampstam presterar mycket bra i dessa screeningtillväxttester bör ytterligare studier göras för att kvantifiera nedbrytningen av det motsträviga ämnet.
De använda enzymatiska testerna (avsnitt 3 i protokollet) valdes eftersom de visade sig vara effektiva och snabba att utföra, men de ger endast kvalitativa resultat. De belyser nedbrytningspotentialen hos en svampstam, men de kan inte exakt kvantifiera den. Om en stam av särskilt intresse isoleras kan ytterligare tester, såsom spektrofotometriska kvantitativa enzymuppsatser, utföras för att beskriva den metaboliska aktiviteten mer exakt. Det enda enzymatiska testet som visade suboptimal effekt var det kvalitativa proteastestet, med ett lågt antal stammar som kunde växa på YES-mediet. Faktum är att den höga andelen stammar som kan växa på PUR tyder på att svamparna producerade proteaser som är involverade i att bryta amid- och uretanbindningarna, med esteras riktad mot esterbindningarna40. Den nästan fullständiga frånvaron av proteasproducerande svampar tyder på att det kan ha varit ett problem i den använda metoden. Andra tester kan antas för proteasaktivitet, såsom kasein41, skummjölk42 eller mjölkpulver43 agarplåtstester. Gallinsyratestet visade sig vara mycket användbart för att detektera produktionen av ligninolytiska enzymer, men tyvärr var det inte särskilt specifikt och kunde inte skilja vilken typ av lignolytiskt enzym som producerades (antingen peroxidaser eller lakonfall).
Resultaten av detta arbete tyder på att användningen av lignocellulosa eller humana syror som selektiva medier gör att svampstammar med bioremedieringspotential kan isoleras från den rika biologiska mångfalden i jorden. Faktum är att mer än 70% av de svampstammar som isolerades med de selektiva metoderna kunde växa på petrolatum eller begagnad motorolja, och 60% kunde växa på olika plastpolymerer som den enda kolkällan. Dessutom beskrev de kvalitativa enzymatiska testerna den metaboliska aktiviteten hos dessa svampar kopplade till biologiska nedbrytningsprocesser. Valet av svampstammar som visar +++ aktivitet i ett eller flera tester rekommenderas eftersom det ökar chansen att hitta en svampstam som är mycket aktiv i bioremediering. Tester med gasmasskromatografi (GC-MS) på de motsträviga ämnena efter långvarig kontakt med de svampstammar som valts ut med våra screeningtester har visat faktisk biologisk nedbrytning av materialen 9,44. Användningen av dessa enkla screeningtester i olika ekosystem kommer att göra det möjligt att undersöka svampbiologisk mångfald i olika jordar. Att söka efter svampar som kan bryta ner motsträviga material kommer att öka antalet identifierade stammar som har potential för bioremediering och hjälpa till att hantera det växande problemet med miljöföroreningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi erkänner Scuola di Alta Formazione Dottorale (SAFD) vid Universitetet i Pavia och professor Solveig Tosi för att ha gett möjlighet till detta arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 microwell plate | Greiner bio-one | 650185 | |
| Agar | VWR | 84609.05 | |
| Bushnell-Haas Broth | Fluka | B5051 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Chloroamphenicol | Eurobio | GABCRL006Z | |
| Chlortetracycline | Sigma-Aldrich | Y0001451 | |
| CoCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| CuCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3279 | |
| Ethanol | VWR Chemicals | 20821.296 | |
| FeCl3·6H2O | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| Filter 0.2 µm | Whatman | 10462200 | |
| gallic acid | Sigma-Aldrich | G7384 | |
| Glass cover slips | Biosigma | VBS634 | |
| Glass vials 15 mL | SciLabware | P35467 | |
| guaiacol | Sigma-Aldrich | G5502 | |
| High-density polyethylene (HDPE) | Sigma-Aldrich | 434272 | |
| Humic acids | Aldrich Chemistry | 53680 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P8281 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Lignocellulose | / | / | Sterilized bioethanol production waste |
| L-shaped cell spreader | Laboindustria S.p.a | 21133 | |
| magnetic stirrer | A.C.E.F | 8235 | |
| Malt Extract Broth | Sigma-Aldrich | 70146 | |
| MgSO4·7H2O | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| Micropipette 1000 μL | Gilson | FA10006M | |
| Micropipette 200 μL | Gilson | FA10005M | |
| MnCl2·4H2O | Sigma-Aldrich | M5005 | |
| Na2MoO4·2H2O | Sigma-Aldrich | M1651 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Neomycin | Sigma-Aldrich | N0401000 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | 1504489 | |
| peptone | Sigma-Aldrich | 83059 | |
| Polyethylene terephthalate (PET) | Goodfellow | ES306031 | |
| Petri dishes | Laboindustria S.p.a | 21050 | |
| Petrolatum (Paraffin liquid) | A.C.E.F | 009661 | |
| Potato Dextrose Broth | Sigma-Aldrich | P6685 | |
| Polystyrene (PS) | Sigma-Aldrich | 331651 | |
| Polyurethane (PUR) | Sigma-Aldrich | GF20677923 | |
| Polyvinyl chloride (PVC) | Sigma-Aldrich | 81388 | |
| Sterile falcon tube | Greiner bio-one | 227 261 | |
| Sterile glass vials 20 mL | Sigma-Aldrich | SU860051 | |
| Sterile point 1000 μL | Gilson | F172511 | |
| Sterile point 200 μL | Gilson | F172311 | |
| Sterile polyethylene bags | WHIRL-PAK | B01018 | |
| sterile syringe | Rays | 5523CM25 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S-6501 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | |
| Used engine oil | / | / | complex mixture of hydrocarbons, engine additives, and metals, provided by an Italian private company |
| Vials 50 mL | Sigma-Aldrich | 33108-U | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | Z0152 |
References
- Mohammadi, K., Heidari, G., Khalesro, S., Sohrabi, Y. Soil management, microorganisms and organic matter interactions: A review. African Journal of Biotechnology. 10 (86), 19840-19849 (2011).
- Daccò, C., Girometta, C., Asemoloye, M. D., Carpani, G., Picco, A. M., Tosi, S. Key fungal degradation patterns, enzymes and their applications for the removal of aliphatic hydrocarbons in polluted soils: A review. International Biodeterioration and Biodegradation. 147, (2020).
- Asemoloye, M. D., Ahmad, R., Jonathan, S. G. Synergistic action of rhizospheric fungi with Megathyrsus maximus root speeds up hydrocarbon degradation kinetics in oil polluted soil. Chemosphere. 187, 1-10 (2017).
- Abatenh, E., Gizaw, B., Tsegaye, Z., Wassie, M. The role of microorganisms in bioremediation - A review. Open Journal of Environmental Biology. 2, 038-046 (2017).
- Dix, N. J., Webster, J. Fungal Ecology. , Chapman & Hall. Cambridge, UK. (1995).
- Magan, N. Fungi in extreme environment. Environmental and Microbial Relationships. The Mycota. Esser, K., Lemke, P. A. 4, Springer. Berlin, Heidelberg. 99-114 (2007).
- Aranda, E. Promising approaches towards biotransformation of polycyclic aromatic hydrocarbons with Ascomycota fungi. Current Opinion in Biotechnology. 38, 1-8 (2016).
- Hasan, I. F., AI-Jawhari, Role of Filamentous Fungi to Remove Petroleum Hydrocarbons from the Environment. Microbial Action on Hydrocarbons. Kumar, V., Kumar, M., Prasad, R. , Springer. Singapore. (2018).
- Daccò, C., et al. Trichoderma: evaluation of its degrading abilities for the bioremediation of hydrocarbon complex mixtures. Applied Sciences. 10 (9), 3152 (2020).
- Alarcón, A., Davies, F. T., Autenrieth, R. L., Zuberer, D. A. Arbuscular mycorrhiza and petroleum-degrading microorganisms enhance phytoremediation of petroleum-contaminated soil. International Journal of Phytoremediation. 10, 251-263 (2008).
- Mancera-López, M. E., et al. Bioremediation of an aged hydro-carbon-contaminated soil by a combined system of biostimulation-bioaugmentation with filamentous fungi. International Biodeterioration and Biodegradation. 61, (2008).
- Hatami, E., Abbaspour, A., Dorostkar, V. Phytoremediation of a petroleum-polluted soil by native plant species in Lorestan Province, Iran. Environmental Science and Pollution Research. 26, 24323-24330 (2019).
- Prenafeta-Boldú, F. X., De Hoog, G. S., Summerbell, R. C. Fungal communities in hydrocarbon degradation. Microbial Communities Utilizing Hydrocarbons and Lipids: Members, Metagenomics and Ecophysiology. Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology. , Springer. Cham. 1-36 (2018).
- Gu, J., Ford, T., Mitton, D., Mitchell, R. Microbiological degradation of polymeric materials. Uhlig's Corrosion Handbook. , John Wiley and Sons. 421-438 (2011).
- Tuomela, M., Hatakka, A. Oxidative fungal enzymes for bioremediation. Comprehensive Biotechnology: Environmental and Related Biotechnologies. 6, Elsevier. 224-239 (2019).
- DSouza, G. C., et al. Fungal biodegradation of low-density polyethylene using consortium of Aspergillus species under controlled conditions. Heliyon. 7 (5), 07008 (2021).
- El-Sayed, M. T., Rabie, G. H., Hamed, E. A. Biodegradation of low-density polyethylene (LDPE) using the mixed culture of Aspergillus carbonarius and A. fumigates. Environment, Development, and Sustainability. 23 (10), 14556-14584 (2021).
- Sepperumal, U., Markandan, M., Palraja, I. Micromorphological and chemical changes during biodegradation of polyethylene terephthalate (PET) by Penicillium sp. Journal of Microbiology and Biotechnology Research. 3 (4), 47-53 (2013).
- Leitão, A. L. Potential of Penicillium species in the bioremediation field. International Journal of Environmental Research and Public Health. 6 (4), 1393-1417 (2009).
- Chen, S. H., Ting, A. S. Y. Biosorption and biodegradation potential of triphenylmethane dyes by newly discovered Penicillium simplicissimum isolated from indoor wastewater sample. International Biodeterioration & Biodegradation. 103, 1-7 (2015).
- Orhan, Y., Buyukgungor, H. Enhancement of biodegradability of disposable polyethylene in controlled biological soil. International Biodeterioration and Biodegradation. 45, 49-55 (2000).
- Deshmukh, R., Khardenavis, A. A., Purohit, H. J. Diverse metabolic capacities of fungi for bioremediation. Indian journal of microbiology. 56 (3), 247-264 (2016).
- Viswanath, B., Rajesh, B., Janardhan, A., Kumar, A. P., Narasimha, G. Fungal laccases and their applications in bioremediation. Enzyme research. 2014, 163242 (2014).
- Ali, M., Husain, Q., Ishqi, H. M. Fungal peroxidases mediated bioremediation of industrial pollutants. Fungal Bioremediation. , CRC Press. Boca Raton. (2019).
- Nousiainen, P., Kontro, J., Manner, H., Hatakka, A., Sipilä, J. Phenolic mediators enhance the manganese peroxidase catalyzed oxidation of recalcitrant lignin model compounds and synthetic lignin. Fungal Genetics and Biology. 72, 137-149 (2014).
- Srivastava, S., Kumar, M. Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs): A sustainable approach. Sustainable Green Technologies for Environmental Management. , Springer. Singapore. (2019).
- Wei, R., Zimmermann, W. Microbial enzymes for the recycling of recalcitrant petroleum-based plastics: how far are we. Microbial Biotechnology. 10 (6), 1308-1322 (2017).
- Matsubara, M., Lynch, J. M., De Leij, F. A. A. M. A simple screening procedure for selecting fungi with potential for use in the bioremediation of contaminated land. Enzyme and Microbial Technology. 39 (7), 1365-1372 (2006).
- Mann, J., et al. Screening and selection of fungi for bioremediation of olive mill wastewater. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 26 (3), 567-571 (2010).
- Andlar, M., Rezić, T., Marđetko, N., Kracher, D., Ludwig, R., Šantek, B. Lignocellulose degradation: an overview of fungi and fungal enzymes involved in lignocellulose degradation. Engineering in Life Sciences. 18, 768-778 (2018).
- Goméz-Toribio, V., García-Martín, A. B., Martínez, M. J., Martínez, A. T., Guillén, F. Induction of extracellular hydroxyl radical production by white-rot fungi through quinone redox cycling. Applied and Environmental Microbiology. 75, 3944-3953 (2009).
- Belcarz, A., Ginalska, G., Kornillowicz-Kowalska, T. Extracellular enzyme activities of Bjerkandera adusta R59 soil strain, capable of daunomycin and humic acids degradation. Applied Microbiology and Biotechnology. 68 (5), 686-694 (2005).
- Stevenson, F. J. Humus Chemistry: Genesis, Composition, Reactions. 2nd ed. , Wiley. New York. (1995).
- Andlar, M., et al. Lignocellulose degradation: An overview of fungi and fungal enzymes involved in lignocellulose degradation. Engineering in Life Sciences. 18 (11), 768-778 (2018).
- Lee, H., et al. Biotechnological procedures to select white rot fungi for the degradation of PAHs. Journal of Microbiological Methods. 97 (1), 56-62 (2014).
- Batista-García, R. A., et al. Simple screening protocol for identification of potential mycoremediation tools for the elimination of polycyclic aromatic hydrocarbons and phenols from hyperalkalophile industrial effluents. Journal of Environmental Management. 198, 1-11 (2017).
- Shleev, S. V., et al. Comparison of physico-chemical characteristics of four laccases from different basidiomycetes. Biochimie. 86 (9-10), (2004).
- Kiiskinen, L. L., Rättö, M., Kruus, K. Screening for novel laccase-producing microbes. Journal of Applied Microbiology. 97, (2004).
- Kumar, V. V., Rapheal, V. S. Induction and purification by three-phase partitioning of aryl alcohol oxidase (AAO) from Pleurotus ostreatus. Applied Biochemistry and Biotechnology. , 163 (2011).
- Loredo-Treviño, A., Gutiérrez-Sánchez, G., Rodríguez-Herrera, R., Aguilar, C. N. Microbial enzymes involved in polyurethane biodegradation: a review. Journal of Polymers and the Environment. 20 (1), 258-265 (2012).
- Garriga, M., et al. Technological and sensorial evaluation of Lactobacillus strains as starter cultures in fermented sausages. International Journal of Food Microbiology. 32 (1-2), 173-183 (1996).
- Zerdani, I., Faid, M., Malki, A. Feather wastes digestion by new isolated strains Bacillus sp. In microcco. African Journal of Biotechnology. 3 (1), 67-70 (2004).
- Nygren, C. M., Edqvist, J., Elfstrand, M., Heller, G., Taylor, A. F. Detection of extracellular protease activity in different species and genera of ectomycorrhizal fungi. Mycorrhiza. 17 (3), 241-248 (2007).
- Asemoloye, M. D., et al. Hydrocarbon degradation and enzyme activities of Aspergillus oryzae and Mucor irregularis isolated from Nigerian crude oil-polluted sites. Microorganisms. 8 (12), 1912 (2020).
