Summary
Qui, presentiamo un protocollo per lo screening della biodiversità del suolo per cercare ceppi fungini coinvolti nella degradazione di materiali recalcitranti. In primo luogo, i ceppi fungini in grado di crescere su acidi umici o lignocellulosa sono isolati. La loro attività viene poi testata sia in saggi enzimatici che su inquinanti come idrocarburi e plastiche.
Abstract
L'inquinamento ambientale è un problema crescente e l'identificazione dei funghi coinvolti nel processo di biorisanamento è un compito essenziale. Il suolo ospita un'incredibile diversità di vita microbica e può essere una buona fonte di questi funghi biorisanativi. Questo lavoro mira a cercare funghi del suolo con potenziale di biorisanamento utilizzando diversi test di screening. I terreni di coltura minerale integrati con sostanze recalcitranti come unica fonte di carbonio sono stati utilizzati come test di crescita. In primo luogo, le diluizioni del suolo sono state placcate su piastre di Petri con mezzo minerale modificato con acidi umici o lignocellulosa. Le colonie fungine in crescita sono state isolate e testate su diversi substrati, come miscele complesse di idrocarburi (petrolato e olio motore usato) e polveri di diversi polimeri plastici (PET, PP, PS, PUR, PVC). Test enzimatici qualitativi sono stati associati ai test di crescita per studiare la produzione di esterasi, laccasi, perossidasi e proteasi. Questi enzimi sono coinvolti nei principali processi di degradazione del materiale recalcitrante e la loro secrezione costitutiva da parte dei ceppi fungini esaminati potrebbe avere il potenziale per essere sfruttata per il biorisanamento. Più di 100 ceppi sono stati isolati e testati e sono stati trovati diversi isolati con un buon potenziale di biorisanamento. In conclusione, i test di screening descritti sono un metodo semplice e a basso costo per identificare ceppi fungini con potenziale di biorisanamento dal suolo. Inoltre, è possibile personalizzare i test di screening per diversi inquinanti, in base alle esigenze, aggiungendo altre sostanze recalcitranti a terreni di coltura minimi.
Introduction
Il suolo è una componente fondamentale della vita sulla Terra ed è alla base di molti ecosistemi. I minerali, la materia organica e i microrganismi nel suolo possono essere considerati come un unico sistema, con strette associazioni e interazioni che si verificano tra di loro. Le interazioni di questi composti hanno un impatto importante sui processi terrestri, sulla qualità ambientale e sulla salute dell'ecosistema1. L'inquinamento del suolo pone seri problemi ambientali in tutto il mondo. L'applicazione indiscriminata, a lungo termine ed eccessiva di sostanze recalcitranti e tossiche, come pesticidi, prodotti petroliferi, plastica e altre sostanze chimiche, ha gravi effetti sull'ecologia del suolo e, di conseguenza, può alterare il microbiota del suolo. Le comunità microbiche nei suoli sono composte da una vasta gamma di organismi in diversi stati fisiologici, la maggior parte dei quali sono batteri e funghi. Molti dei contaminanti nei suoli hanno stabilità a medio-lungo termine e la loro persistenza può portare allo sviluppo di meccanismi adattivi che consentono ai microrganismi di utilizzare sostanze recalcitranti come nutrienti 2,3. Questi microrganismi possono, quindi, essere considerati per le tecniche di biorisanamento.
Il biorisanamento cerca di mitigare gli effetti dell'inquinamento utilizzando microrganismi e i loro enzimi per la degradazione o la trasformazione dei rifiuti in composti meno tossici o non tossici. Varie specie di archaea, batteri, alghe e funghi possiedono questa capacità di biorisanamento4. Come risultato delle loro particolari azioni biodegradative, i funghi sono organismi particolarmente promettenti per il biorisanamento. Possono attaccare diversi substrati usando la loro rete ifale, consentendo loro di penetrare nella matrice del suolo in modo più efficiente rispetto ad altri microrganismi. Inoltre, possono raggiungere interstizi inaccessibili in cui i contaminanti sono difficili da rimuovere5 e possono anche sopravvivere a bassi livelli di umidità6. Inoltre, i funghi sintetizzano diverse cassette di enzimi non specifici, di solito per degradare sostanze recalcitranti naturali come cellulosa, lignina e acidi umici. Quelli che mancano del substrato bersaglio possono essere coinvolti nella degradazione di una vasta gamma di inquinanti recalcitranti, come idrocarburi, plastica e pesticidi 7,8,9,10. Pertanto, sebbene molte specie fungine siano già state segnalate come agenti di biorisanamento, vi è un crescente interesse nell'esplorazione di specie che non sono ancora state studiate per selezionare candidati per il biorisanamento di sostanze contaminanti recalcitranti. Le specie già note per avere proprietà di biorisanamento appartengono ai phyla Ascomycota 11,12,13, Basidiomycota14,15 e Mucoromycota. Ad esempio, i generi Penicillium e Aspergillus sono ben noti per essere coinvolti nella degradazione degli idrocarburi alifatici13, diversi polimeri plastici 16,17,18, metalli pesanti 19 e coloranti20. Allo stesso modo, studi condotti su funghi basidiomiceti, come Phanerochaete chrysosporium e Trametes versicolor, hanno rivelato il loro coinvolgimento nell'ossidazione di materiali recalcitranti come gli idrocarburi aromatici13 e le plastiche21. Un altro esempio di funghi coinvolti nei processi di biodegradazione sono gli zigomiceti Rhizopus spp., Mucor spp. e Cunninghamella spp.22,23. In particolare, Cunninghamella è in grado di ossidare idrocarburi aromatici ed è considerata un organismo modello per lo studio della disintossicazione di prodotti da una vasta gamma di xenobiotici13.
Ci sono diversi enzimi fungini coinvolti nei principali processi degradativi dei materiali recalcitranti 24,25, come esterasi, laccasi, perossidasi e proteasi. Le laccasi sono ossidasi contenenti rame prodotte nella cellula e successivamente secrete, che permettono l'ossidazione di una varietà di composti fenolici e aromatici. Possono degradare orto e parafenoli, i fenoli contenenti gruppi amminici, la lignina e le diammine contenenti il gruppo arilico26. Le perossidasi utilizzano il perossido di idrogeno come mediatore per degradare la lignina e altri composti aromatici. Ci sono molte perossidasi diverse, ma quelle con il maggior potenziale di degradare le sostanze tossiche sono la lignina perossidasi e la perossidasi di manganese27.
Le esterasi e le proteasi appartengono al gruppo degli enzimi extra- o ecto-cellulari, che agiscono al di fuori delle loro cellule di origine ma sono ancora legati ad esse. Questi enzimi possono catalizzare l'idrolisi di grandi molecole recalcitranti in quelle più piccole. A causa della loro bassa specificità del substrato, questi enzimi possono svolgere un ruolo chiave nel biorisanamento di vari inquinanti, come coloranti tessili, effluenti rilasciati dalle industrie della cellulosa e della carta e concia della pelle, prodotti petroliferi, materie plastiche e pesticidi 28,29,30.
Sono già stati pubblicati numerosi metodi di screening per selezionare ceppi fungini biorisanativi. Ad esempio, il mezzo di agar a base di paglia è stato utilizzato per lo screening di funghi di marciume bianco ad alto potenziale nella degradazione degli idrocarburi policiclici aromatici (IPA)31; e piccoli pezzi di legno in decomposizione sono stati posti su agar estratto di malto (MEA) per isolare i funghi in decomposizionedel legno 32. Tuttavia, la maggior parte dei metodi che sono già stati proposti selezionano funghi molto specifici per la loro attività di interesse. Questa ricerca propone un approccio più ampio per la selezione dei funghi del suolo con un più ampio raggio d'azione. Il metodo si basa sulla placcatura iniziale di diluizioni seriali di campioni di terreno su un mezzo modificato con acidi umici o lignocellulosa mescolati con antibiotici per selezionare funghi con la capacità di degradare queste sostanze recalcitranti naturali. Gli acidi umici e la lignocellulosa, infatti, sono sostanze estremamente resistenti alla biodegradazione poiché hanno strutture molecolari molto complesse, e questo permette loro di essere ottimi indicatori della capacità degradativa dei funghi testati33,34. Successivamente, i funghi selezionati nei primi test vengono sottoposti a screening per identificare quelli con il potenziale di degradare inquinanti specifici come petrolato, olio motore usato e plastica. Infine, vengono eseguiti test enzimatici qualitativi per rilevare ceppi fungini in grado di produrre enzimi coinvolti nei processi di biodegradazione di sostanze recalcitranti. A tale scopo vengono condotti test di proteasi e esterasi, mentre l'acido gallico e il guaiacolo sono utilizzati come indicatori della produzione di laccasi e di altri enzimi ligninolitici35,36. Questi substrati sono utilizzati perché è stata trovata una forte correlazione tra la capacità dei funghi di ossidarli alla loro forma di colore marrone e il possesso di capacità ligninolitica 37,38,39.
Attraverso questi protocolli, è possibile isolare ceppi fungini ad alto potenziale degradativo e un ampio spettro di azione direttamente da campioni di suolo. L'isolamento di questi ceppi fungini potrebbe aiutare a trovare nuovi candidati per scopi di biorisanamento.
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Protocol
1. Selezione di ceppi fungini in grado di degradare materiali recalcitranti dal suolo
- Preparazione della soluzione antibiotica.
- Mettere penicillina (50 mg / L), streptomicina (40 mg / L), clorttraciclina (40 mg / L), neomicina (100 mg / L) e cloramfenicolo (100 mg / L) in 250 ml di acqua sterile deionizzata.
- Prima di aggiungere cloramfenicolo alla soluzione antibiotica, scioglierlo in 3 ml di etanolo ≥99%.
- Posizionare la soluzione antibiotica su un agitatore magnetico (senza calore) con una barra di agitazione magnetica all'interno della soluzione per 10 minuti. Conservare a 4 °C.
- Preparazione dei mezzi di crescita.
- Mettere 1 g di acido umico commerciale, 3,26 g di brodo Bushnell-Haas (BH) e 15 g di agar in 1 L di acqua deionizzata e autoclave per 20 minuti a 121 °C (agar acido umico).
- Placcare l'acido umico agar in piastre di Petri sotto un armadio a flusso laminare.
- Mettere 4 g di lignocellulosa, 3,26 g di BH e 15 g di agar in 1 L di acqua deionizzata e metterlo in autoclave per 20 minuti a 121 °C (lignocellulosa agar).
- Impiattare l'agar lignocellulosa in piastre di Petri sotto un armadio a flusso laminare.
- Sotto un armadio a flusso laminare, dopo che i fluidi si sono solidificati nelle piastre di Petri, trasferire 1 mL della soluzione antibiotica sulle piastre preparate utilizzando una siringa sterile con un filtro da 0,2 μm per sterilizzarla.
- Distribuire uniformemente la soluzione antibiotica sulle superfici della piastra utilizzando uno spandicellulare sterile monouso a forma di L e lasciarla asciugare all'aria sotto l'armadio a flusso laminare.
- Mettere 20 g di brodo di estratto di malto e 15 g di agar in 1 L di acqua deionizzata e autoclave per 20 minuti a 121 °C (estratto di malto agar - MEA).
- Placcare il MEA in piastre di Petri sotto un armadio a flusso laminare.
- Campionamento del suolo e diluizioni del suolo.
- Campionare il terreno di interesse a una profondità di 10 cm, rimuovendo eventuali piante, erba e foglie morte dallo strato superiore e metterlo in sacchetti di polietilene sterili.
- Dopo aver raggiunto il laboratorio, setacciare il terreno utilizzando una rete di 2 mm, rimuovendo eventuali radici e detriti vegetali.
- Se non è possibile procedere immediatamente con l'analisi a valle, conservare i campioni di terreno setacciati a 4 °C.
- Lavorando sotto un armadio a flusso laminare, mettere 1 g di terreno setacciato in un tubo sterile da 15 ml con 10 ml di acqua deionizzata sterile (1 x 10-1 diluizione). Agitare il tubo orizzontalmente per 30 minuti.
- Sotto un armadio a flusso laminare, prima che la sospensione si depositi, prendere 1 mL della diluizione 1 x 10-1 con una pipetta sterile e trasferirla in un bianco di acqua deionizzata da 9 ml (1 x 10-2 diluizione). Vortice a fondo.
- Prima che la sospensione si depositi, prendere 1 mL della diluizione 1 x 10-2 con una pipetta sterile e trasferirla in un bianco di 9 mL di acqua deionizzata (1 x 10-3 diluizione). Vortice a fondo.
- Diluizioni del terreno di placcatura su mezzi selettivi.
- Lavorando sotto un armadio a flusso laminare, raccogliere 100 μL della diluizione 1 x 10-3 usando una micropipetta con un punto sterile e trasferirla su una capsula di Petri di agar umico. Fallo per almeno 4 o 5 piastre di Petri.
- Distribuire uniformemente la diluizione sulla superficie della capsula di Petri utilizzando uno spandicellulare sterile monouso a forma di L.
- Lasciare asciugare all'aria per 10-15 minuti sotto l'armadio a flusso laminare.
- Ripetere i passaggi 1.4.1.-1.4.3. utilizzando piastre di Petri di lignocellulosa.
- Incubare a 25 °C al buio per un massimo di 15 giorni.
- Isolamento di colonie fungine cresciute da mezzi selettivi a mezzi di crescita.
- A partire da 3 giorni dopo la preparazione, controllare quotidianamente le piastre di Petri selettive preparate per qualsiasi crescita di colonie fungine per un massimo di 15 giorni.
- Controlla tutte le colonie fungine presenti per somiglianze. Se necessario, preparare un vetrino da osservare al microscopio ottico.
NOTA: L'obiettivo è quello di isolare il maggior numero di colonie fungine, ma è necessario evitare di isolare sempre lo stesso ceppo fungino da piastre diverse, quindi questo controllo è molto importante. Cerca colonie con diverse macro e micromorfologiche. - Sotto un armadio a flusso laminare o in un bruciatore Bunsen, isolare ogni ceppo fungino scelto rimuovendo delicatamente una piccola parte del micelio dalla colonia con un ago di inoculazione sterile e trasferendolo in una nuova capsula di Petri MEA.
NOTA: In questa fase, è molto importante essere delicati e precisi perché c'è un alto rischio di contaminazione dalle altre colonie fungine presenti nella capsula di Petri originale. Se sulla piastra MEA inoculata cresce più di un ceppo fungino, ripetere il passaggio 1.5.3. - Incubare a 25 °C al buio per 7 giorni. Questi sono i ceppi fungini da testare ulteriormente su specifiche sostanze recalcitranti.
2. Test di crescita su sostanze recalcitranti
- Test di crescita sul petrolato.
- Trasferire 20 mL di BH liquido (3,26 g/L di BH) in flaconcini da 50 mL e sterilizzarli in autoclave a 121 °C per 20 min.
- Trasferire 7 mL di acqua deionizzata in flaconcini di vetro da 15 mL e aggiungere alcuni pezzi di coperchi di vetro rotti in ogni flaconcino.
- Sterilizzarli in autoclave a 121 °C per 20 min.
- Sotto l'armadio a flusso laminare, aggiungere 1 mL di petrolato a ogni flaconcino da 50 mL bh utilizzando una pipetta sterile. Conservare alcuni flaconcini con solo BH come controllo negativo.
- Sotto l'armadio a flusso laminare, rimuovere il micelio sulla superficie del mezzo dalle piastre MEA con i ceppi fungini scelti (preparati al punto 1.5.3.) utilizzando un ago sterile e trasferirlo in flaconcini di vetro da 15 ml con le coperture rotte.
- Agitare ogni fiala su un miscelatore a vortice per 2 minuti, consentendo alle coperture rotte di tagliare il cubo della colonia fungina, creando una sospensione fungina.
- Inoculare ogni flaconcino di petrolato con 200 μL di sospensione fungina. Fai due repliche per ogni ceppo fungino.
- Per il controllo negativo, mettere 200 μL di sospensione fungina in flaconcini con solo BH liquido. Inoltre, tenere un paio di flaconcini con petrolato senza alcuna inoculazione fungina per verificare la contaminazione nel mezzo.
- Incubare i flaconcini a 25 °C al buio e controllarli dopo 15 giorni e 30 giorni dall'inoculo.
- Test di crescita su olio motore usato.
- Mettere 3,26 g di BH e 15 g di agar in 1 L di acqua deionizzata e autoclave per 20 minuti a 121 °C (BHA).
- Placcare il BHA in piastre di Petri sotto un armadio a flusso laminare.
- Una volta solidificato, trasferire 500 μL di olio motore usato sulle piastre di Bha Petri e distribuirlo uniformemente sulle superfici delle piastre utilizzando uno spandicellulare sterile monouso a forma di L.
- Inoculare ogni piastra BHA dell'olio motore usata con ogni ceppo fungino, raccogliendo il micelio dalle piastre preparate al punto 1.5.3. Lavora su un bruciatore Bunsen o sotto una cappa a flusso laminare per evitare contaminazioni. Fai due repliche per ogni ceppo fungino.
- Per il controllo negativo, inoculare le piastre di Petri solo con BHA. Inoltre, tenere un paio di piastre BHA Petri di olio motore usate senza alcuna inoculazione fungina per verificare la contaminazione nel mezzo.
- Incubare le piastre di Petri a 25 °C al buio e controllarle dopo 15 giorni e 30 giorni dall'inoculo.
- Test di crescita su materie plastiche.
- Trasferire 200 μL di sospensione fungina (fasi 2.1.5.-2.1.6.) in una piastra a 96 micro pozzetti. Fai tre repliche della combinazione ceppo-plastica fungina.
- A ciascun pozzetto con la sospensione fungina, aggiungere 10 mg di un diverso tipo di polvere plastica (polietilene tereftalato - PET, cloruro di polivinile - PVC, polietilene ad alta densità - HDPE, polistirene - PS, poliuretano - PUR).
- Per il controllo negativo, invece di aggiungere la polvere di plastica, aggiungere 200 μL di soluzione di BH sterilizzata al pozzo con la sospensione fungina. Inoltre, per ogni tipo di polvere plastica, riempire un pozzetto con 200 μL di soluzione di BH sterilizzata e 10 mg di ogni polvere di plastica per verificare la contaminazione del mezzo.
- Incubare le piastre del microwell a 25 °C al buio e controllarle dopo 15 giorni e 30 giorni dall'inoculo.
3. Test enzimatici qualitativi
- Test colorimetrico qualitativo degli enzimi ligninolitici.
- Mettere 27 g di brodo di destrosio di patate (PD) e 15 g di agar in 1 L di acqua deionizzata e autoclavelo per 20 minuti a 121 °C (PDA).
- Quando il mezzo si è raffreddato un po' ma è ancora liquido, aggiungere acido gallico (5 g/L) sotto una cappa a flusso laminare e placcare il mezzo in piastre di Petri.
- Inoculare le piastre di acido gallico PDA + con ogni ceppo fungino, raccogliendo il micelio dalle piastre preparate al punto 1.5.3. Lavora su un bruciatore Bunsen o sotto una cappa a flusso laminare per evitare contaminazioni.
- Come controlli negativi, preparare le piastre di Petri con solo PDA (senza acido gallico) e inocularle con i ceppi fungini (uno per ogni ceppo fungino), così come una capsula di Petri con PDA + acido gallico e nessuna inoculazione fungina.
- Incubare le piastre di Petri a 25 °C al buio e controllarle dopo 7 giorni dall'inoculo.
- Test colorimetrico qualitativo delle laccasi.
- Mettere 27 g di PD e 15 g di agar in 1 L di acqua deionizzata e autoclave per 20 minuti a 121 °C (PDA).
- Quando il mezzo si è raffreddato un po'ma è ancora liquido, aggiungere guaiacolo (400 μL/L) sotto una cappa a flusso laminare e inserirlo in piastre di Petri.
- Inoculare le piastre PDA + guaiacolo con ogni ceppo fungino, raccogliendo il micelio dalle piastre preparate al punto 1.5.3. Lavora in un bruciatore Bunsen o sotto una cappa a flusso laminare per evitare qualsiasi contaminazione.
- Come controlli negativi, preparare le piastre di Petri con solo PDA (senza guaiacolo) E inocularle con i ceppi fungini (uno per ogni ceppo fungino), così come una capsula di Petri con PDA + guaiacolo e nessuna inoculazione fungina.
- Incubare le piastre di Petri a 25 °C al buio e controllarle dopo 7 giorni dall'inoculo.
- Test qualitativo delle proteasi.
- Preparare il mezzo YES aggiungendo K2HPO4 (1 g/L) , KH2PO4 (0,5 g/L), MgSO4·7H2O (0,5 g/L), MnCl2·4H2O (0,001 g/L), CuCl2·2H2O (1,4 x 10-5 g/L), ZnCl2 (1,1 x 10-5 g/L), CoCl2·6H2O (2 x 10-5 g/L), Na2MoO4·2H2O (1,3 x 10-5 g/L), FeCl3·6H2O (7,5 x 10-5 g/L) e gelatina/peptone (0,02 g/L) in acqua deionizzata.
- Posizionare il mezzo YES su un agitatore magnetico (senza calore) con una barra di agitazione magnetica all'interno del mezzo per 10 minuti.
- Quando tutti i sali si sono sciolti nel mezzo, trasferire 5 mL della soluzione in flaconcini di vetro sterili da 20 mL e metterli in autoclave per 20 minuti a 121 °C.
- Per il controllo negativo, preparare circa 20 mL di flaconcini di vetro sterile con 5 mL di soluzione di BH e metterli in autoclave per 20 minuti a 121 °C.
- Sotto un armadio a flusso laminare, trasferire 200 μL di sospensione fungina (Fasi 2.1.5.-2.1.6.) per ciascun ceppo ai flaconcini sterilizzati del mezzo YES (effettuare almeno 2 repliche per ceppo fungino). Per ogni ceppo fungino, aggiungere 200 μL della stessa sospensione fungina ai flaconcini sterilizzati BH per avere un controllo negativo.
- Incubare i flaconcini a 25 °C al buio per 21 giorni e controllarli ogni 7 giorni.
- Test qualitativo delle esterasi.
- Preparare il mezzo Tween 80 aggiungendo peptone (10 g/L), NaCl (5 g/L), CaCl2 (0,1 g/L) e 10 ml di Tween 80 a 1 L di acqua deionizzata.
- Posizionare il mezzo Tween 80 su un agitatore magnetico (senza calore) con una barra di agitazione magnetica all'interno del mezzo per 10 minuti.
- Quando tutto è fuso all'interno del mezzo, trasferire 5 mL della soluzione in flaconcini di vetro sterili da 20 mL e metterli in autoclave per 20 minuti a 121 °C.
- Per il controllo negativo, preparare circa 20 mL di flaconcini di vetro sterile con 5 mL di soluzione di BH e metterli in autoclave per 20 minuti a 121 °C.
- Sotto un armadio a flusso laminare, trasferire 200 μL di sospensione fungina (Fasi 2.1.5.-2.1.6.) per ogni ceppo ai flaconcini sterilizzati medi Tween 80 (effettuare almeno 2 repliche per ceppo fungino). Per ogni ceppo fungino, aggiungere 200 μL della stessa sospensione fungina ai flaconcini sterilizzati BH per il controllo negativo.
- Incubare i flaconcini a 25 °C al buio per 21 giorni e controllarli ogni 7 giorni.
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Representative Results
I metodi di media selettivi (Sezione 1 del protocollo) hanno permesso di vagliare la ricca biodiversità del suolo e di selezionare i funghi con un elevato potenziale di biorisanamento. Con l'acido umico e la lignocellulosa, sono stati isolati più di 100 ceppi fungini. Questi funghi hanno prodotto enzimi coinvolti nella biodegradazione di materiali recalcitranti naturali, che hanno una struttura chimica simile a molti inquinanti. Tuttavia, i ceppi fungini isolati con i mezzi selettivi necessitavano di un ulteriore screening. Nello specifico, i test selettivi hanno isolato i ceppi in grado di degradare gli acidi umici e la lignocellulosa, i test di crescita hanno vagliato i funghi isolati per quelli in grado di utilizzare uno specifico inquinante come unica fonte di carbonio, e i test enzimatici qualitativi hanno descritto le loro attività metaboliche.
I test di crescita si sono concentrati sulla capacità fungina di degradare idrocarburi (petrolato e olio motore usato) e materie plastiche (PET, PVC, HDPE, PS, PUR). Ognuna di queste sostanze è stata utilizzata in un test come unica fonte di carbonio per i ceppi fungini selezionati. La capacità fungina di sfruttare queste sostanze è stata valutata come la differenza nella crescita della colonia tra i campioni con la sostanza aggiunta e i campioni di controllo con solo un mezzo minimo (BH o BHA, a seconda del test). Una scala qualitativa è stata utilizzata per descrivere i risultati (Figura 1), che vanno dall'assenza di differenza di crescita con il controllo (0) a livelli bassi (+), medi (++) e alti (+++) di differenza di crescita.
Figura 1: Tasso di successo della crescita dei ceppi fungini nei test di crescita. La percentuale di ceppi fungini in grado di crescere su petrolato, olio motore usato e polveri plastiche (polietilene tereftalato, PET; cloruro di polivinile, PVC; polietilene ad alta densità, HDPE; polistirene, PS; poliuretano, PUR) come unica fonte di carbonio con diversi gradi di successo (nessuna crescita, 0; bassa crescita, +; crescita media, ++; alta crescita, +++). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
I test del petrolato e dell'olio motore usato hanno valutato il potenziale di biodegradazione degli idrocarburi dei ceppi fungini selezionati. Il petrolato, una miscela di alcani a catena lunga (>C25), è stato utilizzato come unica fonte di carbonio. La capacità fungina di sfruttare questa sostanza è stata valutata come la differenza nella crescita della colonia tra fiale con BH + petrolato e fiale di controllo con solo BH (Figura 2). Quasi il 75% dei ceppi fungini testati è stato in grado di utilizzare il petrolato come unica fonte di carbonio e il 21% dei ceppi ha mostrato la massima crescita (+++, Figura 1).
Figura 2: Immagini della scala qualitativa di crescita del petrolato come unica fonte di carbonio. La scala qualitativa si basa sulla differenza di crescita tra i campioni trattati e il controllo BH. Si va dall'assenza di differenza di crescita (0), ai livelli bassi (+), medi (++) e alti (+++) di differenza di crescita. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
L'olio motore usato è una miscela complessa di idrocarburi, additivi per motori e metalli. È stato utilizzato nei test di crescita per valutare la capacità fungina di utilizzare una miscela di idrocarburi complessi e tossici come fonte di carbonio. Come gli altri test di crescita, la crescita è stata valutata confrontando la crescita fungina nelle piastre con l'olio motore con la crescita nelle piastre di controllo contenenti solo BHA (Figura 3). I risultati della crescita hanno confermato l'efficacia dei mezzi selettivi (Sezione 1 del protocollo). In effetti, quasi il 90% dei ceppi fungini isolati è stato in grado di crescere con olio motore usato, con il 39% che ha mostrato la massima crescita (+++, Figura 1).
Figura 3: Immagini della scala qualitativa di crescita dell'olio motore usato come unica fonte di carbonio. La scala qualitativa si basa sulla differenza di crescita tra i campioni trattati e il controllo BHA. Varia dall'assenza di differenza di crescita (0), a livelli bassi (+), medi (++) e alti (+++) di differenza di crescita. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
I test di crescita sulle polveri di plastica sono stati utilizzati per selezionare i ceppi fungini che potrebbero utilizzare specifici polimeri plastici come fonte primaria di carbonio; quindi, questi ceppi hanno un alto potenziale per il biorisanamento della plastica. La crescita delle placche multiwell è stata osservata mediante stereomicroscopio e valutata utilizzando una scala qualitativa, che va dall'assenza di crescita (0) all'elevata produzione di ife (+++). PUR è stata la polvere di plastica che ha avuto la più alta percentuale di ceppi fungini che hanno mostrato una crescita (92%), con il 31% dei ceppi che hanno mostrato la massima crescita (+++). Circa il 70% dei ceppi isolati dall'acido umico e dalla lignocellulosa è cresciuto con polvere di PS, mentre quasi il 60%-65% di essi è stato in grado di utilizzare HDPE, PVC e PET come unica fonte di carbonio. Pertanto, una grande percentuale di funghi è stata in grado di crescere sulle diverse polveri di plastica in piastre multiwell, ma un numero molto basso di essi ha mostrato un'elevata colonizzazione della plastica. In effetti, solo il 10% dei ceppi è stato in grado di prosperare su PET e HDPE e il 13% è stato in grado di prosperare su PS. L'unica plastica in cui è stata osservata regolarmente un'elevata crescita fungina è stata il PUR, su cui circa il 30% dei ceppi fungini è riuscito a crescere molto abbondantemente.
Sono stati eseguiti test enzimatici qualitativi per rilevare ceppi fungini in grado di produrre enzimi coinvolti nei processi di biodegradazione di sostanze recalcitranti. Le perossidasi e le laccasi sono enzimi ligninolitici la cui produzione è indicata da un alone brunastro sul lato inferiore del mezzo nei test dell'acido gallico e del guaiacolo (Fase 3.1. e Fase 3.2. del protocollo). In entrambi i test, l'aumento dell'intensità del colore ha indicato una maggiore produzione di questi enzimi (Figura 4).
Figura 4: Immagini della scala qualitativa degli enzimi ligninolitici qualitativi. La scala qualitativa si basa sulla produzione di un alone rosso/brunastro attorno alla colonia. 0 = nessuna attività, + = qualche attività, ++ = alta attività, +++ attività molto alta. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Circa il 60% dei funghi testati è stato in grado di produrre enzimi ligninolitici, indicando il successo del mezzo selettivo. Inoltre, il 12% dei ceppi fungini isolati ha prodotto un intenso alone scuro intorno alla colonia (+++) in mezzo acido gallico, con il 17% che lo ha fatto in mezzo guaiacolo (laccasi), indicando un'elevata secrezione fungina di questi enzimi (Figura 5).
Figura 5: Tasso di attività enzimatica da parte di ceppi fungini durante test enzimatici qualitativi. La percentuale di ceppi fungini in grado di produrre enzimi ligninolitici, laccasi, proteasi ed esterasi con diversi livelli di successo (0 = nessuna attività, + = attività, ++ = alta attività, +++ attività molto elevata) durante i corrispondenti test enzimatici qualitativi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Un altro test di screening utilizzato per analizzare l'attività fungina è stato il test delle proteasi, che si basava sulla differenza nella crescita fungina tra fiale medie YES e fiale di controllo con BH. Tuttavia, circa il 70% dei ceppi fungini nel mezzo YES ha mostrato una crescita simile ai controlli, o addirittura una diminuzione della crescita. Nessun ceppo fungino ha raggiunto il livello massimo di differenza (+++). Questi risultati suggeriscono che questo test potrebbe non essere adatto per lo screening per l'attività della proteasi.
Infine, l'attività delle esterasi è stata valutata mediante la formazione di un precipitato bianco nel mezzo Tween 80 (Figura 5). Quasi il 60% dei ceppi fungini selezionati ha mostrato attività esterasi e il 13% ha mostrato un'elevata formazione del precipitato (+++), suggerendo che i ceppi nel 13% dovrebbero essere selezionati per esaminare il loro potenziale di biodegradazione (Figura 5).
Per quanto riguarda tutti i test di crescita ed enzimatici, i ceppi di maggior successo (cioè quelli che hanno ottenuto +++ in almeno un test) sono stati i più interessanti. Questi ceppi fungini sono stati in grado di utilizzare in modo efficiente sostanze recalcitranti come unica fonte di carbonio, oppure hanno prodotto un alto livello di enzimi coinvolti nella biodegradazione di sostanze recalcitranti. In effetti, 39 dei 115 ceppi fungini testati erano in grado di prosperare (+++) su fonti di idrocarburi (petrolato o olio motore usato) e 58 avevano una crescita elevata su almeno un polimero plastico. Solo 32 hanno mostrato un'attività enzimatica molto elevata (+++) in almeno uno dei test enzimatici eseguiti. Questi risultati mostrano l'elevata efficacia di tutti i test di screening riportati, ad eccezione del test delle proteasi, che non ha selezionato ceppi ad alte prestazioni.
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Discussion
La ricca biodiversità del suolo è una fonte abbondante di funghi che possiedono numerose capacità metaboliche, alcune delle quali potrebbero essere potenziali candidati per il biorisanamento. I test selettivi sui fluidi (Sezione 1 del protocollo) sono metodi facili da eseguire ed efficaci per isolare funghi in grado di crescere su polimeri complessi naturali come unica fonte di carbonio. I funghi possono produrre idrolasi extracellulari, non specifiche e ossidoreduttasi30 come gli enzimi ligninolitici laccasi e perossidasi31. Questi enzimi possono degradare la lignocellulosa e gli acidi umici, ma anche molti xenobiotici diversi, tra cui idrocarburi, composti aromatici e composti organici clorurati32.
I metodi descritti producono risultati facili da interpretare e a basso costo da eseguire. Queste caratteristiche consentono loro di essere utilizzati da non esperti. Tuttavia, alcuni aspetti, come la sterilità e l'identificazione morfologica, richiedono un'attenzione particolare. Ad esempio, l'agitazione di 30 minuti della sospensione del suolo (fase 1.3.4.) è necessaria in modo che le spore e i propaguli fungini siano liberati dalla microstruttura del suolo e possano essere sospesi nella soluzione. In questo modo, placcando le diluizioni di questa sospensione del suolo, è possibile isolare il numero massimo di ceppi fungini. L'identificazione morfologica macro e microscopica dei ceppi fungini è importante per distinguere tra i ceppi ed evitare di isolare lo stesso ceppo fungino più volte. Inoltre, la sterilità e l'evitamento delle contaminazioni microbiche sono cruciali perché la presenza di altri ceppi fungini attivi potrebbe travisare l'attività delle colonie studiate.
Dopo i test selettivi, sono stati eseguiti una serie di test di crescita su diverse sostanze recalcitranti, come petrolato, olio motore usato e diversi polimeri plastici. Questa fase può essere personalizzata in base alle sostanze recalcitranti di interesse. Il passo importante è aggiungere la sostanza selezionata a BH o BHA come unica fonte di carbonio e controllare la crescita fungina contro un controllo senza l'aggiunta di sostanza recalcitrante.
Lo scopo dei test di crescita su materie plastiche e idrocarburi era quello di valutare se il fungo potesse utilizzare queste sostanze come unica fonte di carbonio osservando qualitativamente la sua crescita sul materiale. Purtroppo, a causa dell'estrema recalcitranza di questi materiali, è molto difficile quantificare l'effettiva diminuzione del peso del substrato e l'aumento del peso della biomassa fungina, soprattutto dopo un lasso di tempo relativamente breve. Se un ceppo fungino si comporta molto bene in questi test di crescita di screening, devono essere intrapresi ulteriori studi per quantificare la degradazione della sostanza recalcitrante.
I test enzimatici utilizzati (Sezione 3 del protocollo) sono stati scelti perché si sono dimostrati efficienti e veloci da eseguire, ma producono solo risultati qualitativi. Evidenziano il potenziale di degradazione di un ceppo fungino, ma non possono quantificarlo con precisione. Se un ceppo di particolare interesse viene isolato, ulteriori test, come saggi enzimatici quantitativi spettrofotometrici, potrebbero essere effettuati per descrivere l'attività metabolica in modo più preciso. L'unico test enzimatico che ha mostrato un'efficacia non ottimale è stato il test qualitativo delle proteasi, con un basso numero di ceppi in grado di crescere sul mezzo YES. In effetti, l'alta percentuale di ceppi in grado di crescere su PUR suggerisce che i funghi hanno prodotto proteasi coinvolte nella rottura dei legami ammidica e uretanica, con esterasi che colpisce i legami estere40. La quasi completa assenza di funghi che producono proteasi suggerisce che potrebbe esserci stato un problema nel metodo utilizzato. Altri test potrebbero essere adottati per l'attività della proteasi, come la caseina41, il latte scremato42 o i test su piastra di agarin polvere 43 . Il test dell'acido gallico si è rivelato molto utile per rilevare la produzione di enzimi ligninolitici, ma, sfortunatamente, non era molto specifico e non riusciva a distinguere il tipo di enzima ligninolitico prodotto (perossidasi o laccasi).
I risultati di questo lavoro suggeriscono che l'uso della lignocellulosa o degli acidi umici come mezzo selettivo consente di isolare i ceppi fungini con potenziale di biorisanamento dalla ricca biodiversità del suolo. Infatti, oltre il 70% dei ceppi fungini isolati dai metodi selettivi sono stati in grado di crescere su petrolato o olio motore usato, e il 60% è stato in grado di crescere su diversi polimeri plastici come unica fonte di carbonio. Inoltre, i test enzimatici qualitativi hanno descritto l'attività metabolica di questi funghi legata ai processi di biodegradazione. La selezione di ceppi fungini che mostrano attività +++ in uno o più test è raccomandata perché aumenta le possibilità di trovare un ceppo fungino molto attivo nel biorisanamento. Test mediante gascromatografia di massa (GC-MS) sulle sostanze recalcitranti dopo contatto prolungato con i ceppi fungini selezionati con i nostri test di screening hanno mostrato un'effettiva biodegradazione dei materiali 9,44. L'uso di questi semplici test di screening in diversi ecosistemi consentirà lo studio della biodiversità fungina in diversi suoli. La ricerca di funghi in grado di degradare i materiali recalcitranti aumenterà il numero di ceppi identificati che hanno il potenziale per il biorisanamento e contribuirà ad affrontare il crescente problema dell'inquinamento ambientale.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Riconosciamo la Scuola di Alta Formazione Dottorale (SAFD) dell'Università di Pavia e il professor Solveig Tosi per aver fornito l'opportunità di questo lavoro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 microwell plate | Greiner bio-one | 650185 | |
| Agar | VWR | 84609.05 | |
| Bushnell-Haas Broth | Fluka | B5051 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Chloroamphenicol | Eurobio | GABCRL006Z | |
| Chlortetracycline | Sigma-Aldrich | Y0001451 | |
| CoCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| CuCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3279 | |
| Ethanol | VWR Chemicals | 20821.296 | |
| FeCl3·6H2O | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| Filter 0.2 µm | Whatman | 10462200 | |
| gallic acid | Sigma-Aldrich | G7384 | |
| Glass cover slips | Biosigma | VBS634 | |
| Glass vials 15 mL | SciLabware | P35467 | |
| guaiacol | Sigma-Aldrich | G5502 | |
| High-density polyethylene (HDPE) | Sigma-Aldrich | 434272 | |
| Humic acids | Aldrich Chemistry | 53680 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P8281 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Lignocellulose | / | / | Sterilized bioethanol production waste |
| L-shaped cell spreader | Laboindustria S.p.a | 21133 | |
| magnetic stirrer | A.C.E.F | 8235 | |
| Malt Extract Broth | Sigma-Aldrich | 70146 | |
| MgSO4·7H2O | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| Micropipette 1000 μL | Gilson | FA10006M | |
| Micropipette 200 μL | Gilson | FA10005M | |
| MnCl2·4H2O | Sigma-Aldrich | M5005 | |
| Na2MoO4·2H2O | Sigma-Aldrich | M1651 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Neomycin | Sigma-Aldrich | N0401000 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | 1504489 | |
| peptone | Sigma-Aldrich | 83059 | |
| Polyethylene terephthalate (PET) | Goodfellow | ES306031 | |
| Petri dishes | Laboindustria S.p.a | 21050 | |
| Petrolatum (Paraffin liquid) | A.C.E.F | 009661 | |
| Potato Dextrose Broth | Sigma-Aldrich | P6685 | |
| Polystyrene (PS) | Sigma-Aldrich | 331651 | |
| Polyurethane (PUR) | Sigma-Aldrich | GF20677923 | |
| Polyvinyl chloride (PVC) | Sigma-Aldrich | 81388 | |
| Sterile falcon tube | Greiner bio-one | 227 261 | |
| Sterile glass vials 20 mL | Sigma-Aldrich | SU860051 | |
| Sterile point 1000 μL | Gilson | F172511 | |
| Sterile point 200 μL | Gilson | F172311 | |
| Sterile polyethylene bags | WHIRL-PAK | B01018 | |
| sterile syringe | Rays | 5523CM25 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S-6501 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | |
| Used engine oil | / | / | complex mixture of hydrocarbons, engine additives, and metals, provided by an Italian private company |
| Vials 50 mL | Sigma-Aldrich | 33108-U | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | Z0152 |
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