Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Isolering og screening fra jordens biodiversitet for svampe involveret i nedbrydning af genstridige materialer

Published: May 16, 2022 doi: 10.3791/63445
Automatic Translation
1, 1, 1
1Laboratory of Mycology, Department of Earth and Environmental Sciences, University of Pavia

Summary

Her præsenterer vi en protokol til screening af jordens biodiversitet for at lede efter svampestammer, der er involveret i nedbrydning af genstridige materialer. For det første isoleres svampestammer, der er i stand til at vokse på huminsyrer eller lignocellulose. Deres aktivitet testes derefter både i enzymatiske assays og på forurenende stoffer som kulbrinter og plast.

Abstract

Miljøforurening er et stigende problem, og det er en væsentlig opgave at identificere svampe, der er involveret i bioremedieringsprocessen. Jord er vært for en utrolig mangfoldighed af mikrobielt liv og kan være en god kilde til disse bioremedierende svampe. Dette arbejde har til formål at søge efter jordsvampe med bioremedieringspotentiale ved hjælp af forskellige screeningstests. Mineralske dyrkningsmedier suppleret med genstridige stoffer som den eneste kulstofkilde blev anvendt som væksttest. For det første blev jordfortyndinger belagt på petriskåle med mineralsk medium ændret med humic syrer eller lignocellulose. De voksende svampekolonier blev isoleret og testet på forskellige substrater, såsom komplekse blandinger af carbonhydrider (petrolatum og brugt motorolie) og pulvere af forskellige plastpolymerer (PET, PP, PS, PUR, PVC). Kvalitative enzymatiske tests var forbundet med væksttestene for at undersøge produktionen af esteraser, laccases, peroxidaser og proteaser. Disse enzymer er involveret i de vigtigste nedbrydningsprocesser af genstridigt materiale, og deres konstitutive sekretion af de undersøgte svampestammer kan have potentiale til at blive udnyttet til bioremediering. Mere end 100 stammer blev isoleret og testet, og der blev fundet flere isolater med et godt bioremedieringspotentiale. Afslutningsvis er de beskrevne screeningstests en nem og billig metode til at identificere svampestammer med bioremedieringspotentiale fra jorden. Derudover er det muligt at skræddersy screeningstestene for forskellige forurenende stoffer i henhold til kravene ved at tilføje andre genstridige stoffer til minimale kulturmedier.

Introduction

Jord er en grundlæggende bestanddel af livet på Jorden og er grundlaget for mange økosystemer. Mineraler, organisk materiale og mikroorganismer i jorden kan betragtes som et system, med tætte foreninger og interaktioner mellem dem. Samspillet mellem disse forbindelser har en vigtig indvirkning på terrestriske processer, miljøkvalitet og økosystemets sundhed1. Jordforurening udgør alvorlige miljøproblemer på verdensplan. Den vilkårlige, langsigtede og overdrevne anvendelse af genstridige og giftige stoffer, såsom pesticider, olieprodukter, plast og andre kemikalier, har alvorlige virkninger på jordens økologi og kan som følge heraf ændre jordens mikrobiota. Mikrobielle samfund i jordbunden består af en bred vifte af organismer i forskellige fysiologiske tilstande, hvor størstedelen er bakterier og svampe. Mange af de forurenende stoffer i jordbunden har stabilitet på mellemlang til lang sigt, og deres vedholdenhed kan føre til udvikling af adaptive mekanismer, der gør det muligt for mikroorganismerne at udnytte genstridige stoffer som næringsstoffer 2,3. Disse mikroorganismer kan derfor overvejes til bioremedieringsteknikker.

Bioremediering forsøger at afbøde virkningerne af forurening ved at anvende mikroorganismer og deres enzymer til nedbrydning eller omdannelse af affald til mindre giftige eller ikke-toksiske forbindelser. Forskellige arter af arkæer, bakterier, alger og svampe besidder denne bioremedieringsevne4. Som et resultat af deres særlige bionedbrydelige virkninger er svampe særligt lovende organismer til bioremediering. De kan angribe forskellige substrater ved hjælp af deres bindestregsnetværk, så de kan trænge ind i jordmatrixen mere effektivt end andre mikroorganismer. Derudover kan de nå utilgængelige mellemrum, hvor forurenende stoffer er vanskelige at fjerne5, og de kan også overleve lave fugtighedsniveauer6. Desuden syntetiserer svampe forskellige kassetter af uspecifikke enzymer, normalt for at nedbryde naturlige genstridige stoffer som cellulose, lignin og huminsyrer. De, der mangler målsubstratet, kan være involveret i nedbrydningen af en lang række genstridige forurenende stoffer, såsom kulbrinter, plast og pesticider 7,8,9,10. Selv om mange svampearter allerede er blevet rapporteret som bioremedieringsmidler, er der derfor stigende interesse for at udforske arter, der endnu ikke er blevet undersøgt for at udvælge kandidater til bioremediering af genstridige forurenende stoffer. De arter, der allerede vides at have bioremedieringsegenskaber, tilhører phyla Ascomycota 11,12,13, Basidiomycota 14,15 og Mucoromycota. For eksempel er slægterne Penicillium og Aspergillus velkendte for at være involveret i nedbrydningen af alifatiske carbonhydrider13, forskellige plastpolymerer 16,17,18, tungmetaller 19 og farvestoffer20. Tilsvarende har undersøgelser udført på basidiomycetes svampe, såsom Phanerochaete chrysosporium og Trametes versicolor, afsløret deres involvering i oxidationen af genstridige materialer såsom aromatiske carbonhydrider13 og plast21. Et andet eksempel på svampe involveret i bionedbrydningsprocesserne er zygomycetes Rhizopus spp., Mucor spp., og Cunninghamella spp.22,23. Cunninghamella er især i stand til at oxidere aromatiske kulbrinter og betragtes som en modelorganisme til undersøgelse af afgiftning af produkter fra en bred vifte af xenobiotika13.

Der er flere svampeenzymer involveret i de store nedbrydende processer af genstridige materialer24,25, såsom esterase, laccase, peroxidase og protease. Laccases er kobberholdige oxidaser produceret i cellen og efterfølgende udskilt, der tillader oxidation af en række phenoliske og aromatiske forbindelser. De kan nedbryde ortho- og paradiphenoler, de aminogruppeholdige phenoler, lignin og de arylgruppeholdige diaminer26. Peroxidaser bruger hydrogenperoxid som mediator til at nedbryde lignin og andre aromatiske forbindelser. Der er mange forskellige peroxidaser, men dem med det største potentiale til at nedbryde giftige stoffer er ligninperoxidase og manganperoxidase27.

Esteraser og proteaser tilhører gruppen af ekstra- eller ektocellulære enzymer, som virker uden for deres oprindelsesceller, men stadig er bundet til dem. Disse enzymer kan katalysere hydrolysen af store genstridige molekyler i mindre. På grund af deres lave substratspecicitet kan disse enzymer spille en nøglerolle i bioremediering af forskellige forurenende stoffer, såsom tekstilfarvestoffer, spildevand frigivet fra papirmasse- og papirindustrien og lædergarvning, olieprodukter, plast og pesticider 28,29,30.

En række screeningsmetoder til udvælgelse for bioremedierende svampestammer er allerede blevet offentliggjort. For eksempel er halmbaseret agarmedium blevet brugt til at screene for hvidrotsvampe med stort potentiale i nedbrydningen af de polycykliske aromatiske kulbrinter (PAH)31; og små stykker rådnende træ er blevet anbragt på maltekstraktagar (MEA) for at isolere trærådnende svampe32. Imidlertid vælger de fleste af de metoder, der allerede er blevet foreslået, meget specifikke svampe til deres aktivitet af interesse. Denne forskning foreslår en bredere tilgang til udvælgelse af jordsvampe med en bredere vifte af handlinger. Metoden er afhængig af den indledende plettering af serielle fortyndinger af jordprøver på et medium ændret med huminsyrer eller lignocellulose blandet med antibiotika for at udvælge svampe med evnen til at nedbryde disse naturlige genstridige stoffer. Huminsyrer og lignocellulose er faktisk stoffer, der er ekstremt resistente over for bionedbrydning, da de har meget komplekse molekylære strukturer, og dette gør det muligt for dem at være fremragende indikatorer for de testede svampes nedbrydende evne33,34. Derefter screenes de svampe, der blev udvalgt i de første tests, for at identificere dem, der har potentiale til at nedbryde specifikke forurenende stoffer såsom petrolatum, brugt motorolie og plast. Endelig udføres kvalitative enzymatiske tests for at detektere svampestammer, der er i stand til at producere enzymer involveret i bionedbrydningsprocesserne af genstridige stoffer. Til dette formål udføres protease- og esterasetest, mens gallinsyre og guaiacol anvendes som indikatorer for laccase og anden ligninolytisk enzymproduktion35,36. Disse substrater anvendes, fordi der er fundet en stærk sammenhæng mellem svampenes evne til at oxidere dem til deres brunfarvede form og besiddelsen af ligninolytisk evne 37,38,39.

Gennem disse protokoller er det muligt at isolere svampestammer med højt nedbrydende potentiale og et bredt spektrum af handlinger direkte fra jordprøver. Isoleringen af disse svampestammer kan hjælpe med at finde nye kandidater til bioremedieringsformål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Udvælgelse af svampestammer, der er i stand til at nedbryde genstridige materialer fra jorden

  1. Fremstilling af antibiotikaopløsning.
    1. Penicillin (50 mg/l), streptomycin (40 mg/l), chlortetracyclin (40 mg/l), neomycin (100 mg/l) og chloramphenicol (100 mg/l) sættes i 250 ml deioniseret sterilt vand.
    2. Før du tilsætter chloramphenicol til antibiotikaopløsningen, opløses den i 3 ml ≥99% ethanol.
    3. Anbring antibiotikaopløsningen på en magnetisk omrører (ingen varme) med en magnetisk omrøringsstang inde i opløsningen i 10 minutter. Opbevar den ved 4 °C.
  2. Forberedelse af vækstmedier.
    1. 1 g kommerciel huminsyre, 3,26 g Bushnell-Haas-bouillon (BH) og 15 g agar kom i 1 liter deioniseret vand og autoklave det i 20 minutter ved 121 °C (huminsyre agar).
    2. Tallerken huminsyre agar i petriskåle under et laminært flowskab.
    3. 4 g lignocellulose, 3,26 g BH og 15 g agar kom i 1 liter deioniseret vand og autoklave det i 20 minutter ved 121 °C (lignocellulose agar).
    4. Plade lignocellulose agar i petriskåle under et laminært flowskab.
    5. Under et laminært strømningsskab, efter at mediet er størknet i petriskålene, overføres 1 ml af antibiotikaopløsningen til de tilberedte plader ved hjælp af en steril sprøjte med et 0,2 μm filter for at sterilisere det.
    6. Fordel antibiotikaopløsningen jævnt på pladeoverfladerne ved hjælp af en steril engangs L-formet cellespreder og lad den lufttørre under det laminære strømningsskab.
    7. 20 g maltekstrakt bouillon og 15 g agar kom i 1 liter deioniseret vand og autoklave det i 20 minutter ved 121 °C (maltekstrakt agar - MEA).
    8. Tallerken MEA i petriskåle under et laminært flowskab.
  3. Jordprøveudtagning og jordfortyndelser.
    1. Prøve jorden af interesse på en dybde på 10 cm, fjern planter, græs og døde blade fra det øverste lag, og læg det i sterile polyethylenposer.
    2. Efter at have nået laboratoriet, sigt jorden ved hjælp af et 2 mm net, fjern eventuelle rødder og planteaffald.
    3. Hvis det ikke er muligt at gå videre med downstream-analysen med det samme, opbevares de sigtede jordprøver ved 4 °C.
    4. Arbejder under et laminært strømningsskab, sæt 1 g af den sigtede jord i et sterilt 15 ml rør med 10 ml sterilt deioniseret vand (1 x 10-1 fortynding). Ryst røret vandret i 30 min.
    5. Under et laminært strømningsskab, før suspensionen sætter sig, skal du tage 1 ml af 1 x 10-1 fortyndingen med en steril pipette og overføre den til et 9 ml deioniseret vandemne (1 x 10-2 fortynding). Vortex det grundigt.
    6. Før suspensionen sætter sig, skal du tage 1 ml af 1 x 10-2 fortyndingen med en steril pipette og overføre den til et 9 ml deioniseret vandemne (1 x 10-3 fortynding). Vortex det grundigt.
  4. Plettering af jordfortyndelser på selektive medier.
    1. Arbejder under et laminært flowskab, opsaml 100 μL af 1 x 10-3 fortyndingen ved hjælp af en mikropipette med et sterilt punkt og overfør det til en humic agar Petri skål. Gør dette for mindst 4 eller 5 petriskåle.
    2. Fordel fortyndingen jævnt på petriskålens overflade ved hjælp af en steril engangs L-formet cellespreder.
    3. Lad det lufttørre i 10-15 minutter under det laminære strømningsskab.
    4. Gentag trin 1.4.1.-1.4.3. ved hjælp af lignocellulose petriskåle.
    5. Inkuber ved 25 °C i mørke i højst 15 dage.
  5. Isolering af svampekolonier dyrket fra selektive medier til vækstmedier.
    1. Fra 3 dage efter tilberedning skal du kontrollere de tilberedte selektive medier Petriskåle dagligt for enhver svampekolonivækst i højst 15 dage.
    2. Kontroller alle de svampekolonier, der er til stede for ligheder. Forbered om nødvendigt et dias, der skal observeres under et lysmikroskop.
      BEMÆRK: Målet er at isolere det højeste antal svampekolonier, men det er nødvendigt at undgå altid at isolere den samme svampestamme fra forskellige plader, så denne kontrol er meget vigtig. Kig efter kolonier med forskellig makro- og mikromorfologi.
    3. Under et laminært flowskab eller ved en Bunsen-brænder isoleres hver valgt svampestamme ved forsigtigt at fjerne en lille del af myceliet fra kolonien med en steril podningsnål og overføre den til en ny MEA-petriskål.
      BEMÆRK: I denne fase er det meget vigtigt at være delikat og præcis, fordi der er stor risiko for forurening fra de andre svampekolonier, der findes i den originale petriskål. Hvis der vokser mere end én svampestamme på den podede MEA-plade, gentages trin 1.5.3.
    4. Inkuber ved 25 °C i mørke i 7 dage. Det er de svampestammer, der skal testes yderligere på specifikke genstridige stoffer.

2. Vækstforsøg med genstridige stoffer

  1. Væksttest på petrolatum.
    1. Overfør 20 ml flydende BH (3,26 g/l BH) til 50 ml hætteglas og steriliser dem ved autoklavering ved 121 °C i 20 minutter.
    2. Overfør 7 ml deioniseret vand til 15 ml glashætteglas, og tilsæt nogle stykker knuste glasdæksler i hvert hætteglas.
    3. Steriliser dem ved autoklavering ved 121 °C i 20 min.
    4. Under det laminære flowskab tilsættes 1 ml petrolatum til hvert 50 ml BH-hætteglas ved hjælp af en steril pipette. Opbevar nogle hætteglas med kun BH som den negative kontrol.
    5. Under det laminære strømningsskab skal du fjerne myceliet på overfladen af mediet fra MEA-pladerne med de valgte svampestammer (fremstillet ved trin 1.5.3.) ved hjælp af en steril nål og overføre det til 15 ml glashætteglas med de ødelagte dæksler.
    6. Omrør hvert hætteglas på en hvirvelblander i 2 minutter, så de ødelagte dæksedler kan skære terningen af svampekolonien og lave en svampesuspension.
    7. Inokuler hvert hætteglas med petrolatum med 200 μL svampesuspension. Lav to replikater for hver svampestamme.
    8. Til den negative kontrol sættes 200 μL svampesuspension i hætteglas med kun flydende BH. Desuden skal du holde et par hætteglas med petrolatum uden svampepodning for at kontrollere, om der er forurening i mediet.
    9. Inkubere hætteglassene ved 25 °C i mørke og kontrollere dem efter 15 dage og 30 dage fra inokulumet.
  2. Væksttest på brugt motorolie.
    1. 3,26 g BH og 15 g agar kom i 1 liter deioniseret vand og autoklaver det i 20 minutter ved 121 °C (BHA).
    2. Tallerken BHA i petriskåle under et laminært flowskab.
    3. Når den er størknet, overføres 500 μL brugt motorolie til BHA-petriskålene og fordeles jævnt på pladeoverfladerne ved hjælp af en steril engangs L-formet cellespreder.
    4. Inokuler hver brugt motorolie BHA-plade med hver svampestamme, og opsaml myceliet fra pladerne fremstillet på trin 1.5.3. Arbejd ved en Bunsen-brænder eller under en laminær flowhætte for at undgå forurening. Lav to replikater for hver svampestamme.
    5. For den negative kontrol skal du kun inokulere petriskålene med BHA. Opbevar desuden et par brugte BHA petriskåle med motorolie uden svampepodning for at kontrollere, om der er forurening i mediet.
    6. Inkuber petriskålene ved 25 °C i mørke og kontroller dem efter 15 dage og 30 dage fra inokulumet.
  3. Væksttest på plast.
    1. Overfør 200 μL svampesuspension (trin 2.1.5.-2.1.6.) til en 96-mikrobrøndplade. Lav tre replikater af svampestamme-plastkombinationen.
    2. Til hver brønd med svampesuspensionen tilsættes 10 mg af en anden slags plastpulver (polyethylenterephthalat - PET, polyvinylchlorid - PVC, polyethylen med høj densitet - HDPE, polystyren - PS, polyurethan - PUR).
    3. Til den negative kontrol tilsættes 200 μL steriliseret BH-opløsning i stedet for at tilsætte plastpulveret til brønden med svampesuspensionen. For hver type plastpulver fyldes en brønd desuden med 200 μL steriliseret BH-opløsning og 10 mg af hvert plaststøv for at kontrollere, om mediet er kontamineret.
    4. Inkuber mikrobrøndpladerne ved 25 °C i mørke og kontroller dem efter 15 dage og 30 dage fra inokulumet.

3. Kvalitative enzymatiske test

  1. Kvalitativ ligninolytiske enzymer kolorimetrisk test.
    1. Kom 27 g kartoffeldextrose bouillon (PD) og 15 g agar i 1 liter deioniseret vand og autoklave det i 20 minutter ved 121 °C (PDA).
    2. Når mediet er kølet lidt af, men stadig er flydende, tilsættes gallinsyre (5 g/l) under en laminær flowhætte og tallerkens mediet i petriskåle.
    3. Inokuler PDA + gallinsyrepladerne med hver svampestamme, opsaml myceliet fra pladerne fremstillet på trin 1.5.3. Arbejd ved en Bunsen-brænder eller under en laminær flowhætte for at undgå forurening.
    4. Som negative kontroller skal du forberede petriskåle med kun PDA (ingen gallinsyre) og inokulere dem med svampestammerne (en for hver svampestamme) samt en petriskål med PDA + gallinsyre og ingen svampepodning.
    5. Inkuber petriskålene ved 25 °C i mørke og kontroller dem efter 7 dage fra inokulumet.
  2. Kvalitative laccases kolorimetrisk test.
    1. 27 g PD og 15 g agar sættes i 1 liter deioniseret vand og autoklaverer det i 20 minutter ved 121 °C (PDA).
    2. Når mediet er kølet lidt af, men stadig er flydende, tilsættes guaiacol (400 μL/L) under en laminær flowhætte og tallerken det i petriskåle.
    3. Inokuler PDA + guaiacol-pladerne med hver svampestamme, og opsaml myceliet fra pladerne fremstillet på trin 1.5.3. Arbejd ved en Bunsen-brænder eller under en laminær flowhætte for at undgå forurening.
    4. Som negative kontroller skal du forberede petriskåle med kun PDA (ingen guaiacol) Og inokulere dem med svampestammerne (en for hver svampestamme) samt en petriskål med PDA + guaiacol og ingen svampepodning.
    5. Inkuber petriskålene ved 25 °C i mørke og kontroller dem efter 7 dage fra inokulumet.
  3. Kvalitative proteaser test.
    1. JA-mediet forberedes ved at tilsætteK2HPO4 (1 g/L), KH2PO4 (0,5 g/L), MgSO4·7H20(0,5 g/L), MnCl2·4H20(0,001 g/L), CuCl2·2H20(1,4 x 10-5 g/L), ZnCl2 (1,1 x 10-5 g/L), CoCl2·6H20(2 x 10-5 g/L), Na2MoO4·2H20(1,3 x 10-5 g/L), FeCl3·6H20(7,5 x 10-5 g/L) og gelatine/peptone (0,02 g/l) til deioniseret vand.
    2. Anbring JA-mediet på en magnetisk omrører (ingen varme) med en magnetisk omrøringsstang inde i mediet i 10 minutter.
    3. Når alle salte er opløst i mediet, overføres 5 ml af opløsningen til 20 ml sterile glashætteglas og autoklaverer dem i 20 minutter ved 121 °C.
    4. Til den negative kontrol skal ca. 20 ml sterile glashætteglas fremstilles med 5 ml BH-opløsning og autoklaveres i 20 minutter ved 121 °C.
    5. Under et laminært flowskab overføres 200 μL svampesuspension (trin 2.1.5.-2.1.6.) for hver stamme til JA-mediumsteriliserede hætteglas (lav mindst 2 replikater pr. Svampestamme). For hver svampestamme tilsættes 200 μL af den samme svampesuspension til BH-steriliserede hætteglas for at få en negativ kontrol.
    6. Inkubere hætteglassene ved 25 °C i mørke i 21 dage og kontrollere dem hver 7. dag.
  4. Kvalitative esteraser test.
    1. Forbered Tween 80-mediet ved at tilsætte peptone (10 g/l), NaCl (5 g/l),CaCl2 (0,1 g/l) og 10 ml Tween 80 til 1 liter deioniseret vand.
    2. Anbring Tween 80-mediet på en magnetisk omrører (ingen varme) med en magnetisk omrøringsstang inde i mediet i 10 minutter.
    3. Når alt er smeltet inde i mediet, overføres 5 ml af opløsningen til 20 ml sterile glashætteglas og autoklaverer dem i 20 minutter ved 121 °C.
    4. Til den negative kontrol skal ca. 20 ml sterile glashætteglas fremstilles med 5 ml BH-opløsning og autoklaveres i 20 minutter ved 121 °C.
    5. Under et laminært flowskab overføres 200 μL svampesuspension (trin 2.1.5.-2.1.6.) for hver stamme til Tween 80 medium steriliserede hætteglas (lav mindst 2 replikater pr. Svampestamme). For hver svampestamme tilsættes 200 μL af den samme svampesuspension til BH-steriliserede hætteglas for negativ kontrol.
    6. Inkubere hætteglassene ved 25 °C i mørke i 21 dage og kontrollere dem hver 7. dag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De selektive mediemetoder (afsnit 1 i protokollen) gjorde det muligt at screene jordens rige biodiversitet og udvælge svampe med stort bioremedieringspotentiale. Med huminsyre- og lignocellulosemediet blev mere end 100 svampestammer isoleret. Disse svampe producerede enzymer involveret i bionedbrydning af naturlige genstridige materialer, som har en kemisk struktur, der ligner mange forurenende stoffer. Svampestammerne isoleret med de selektive medier havde imidlertid brug for yderligere screening. Specifikt isolerede de selektive tests de stammer, der var i stand til at nedbryde huminsyrer og lignocellulose, væksttestene screenede de isolerede svampe for dem, der var i stand til at anvende et specifikt forurenende stof som deres eneste kulstofkilde, og de kvalitative enzymatiske tests beskrev deres metaboliske aktiviteter.

Væksttestene var fokuseret på svampens evne til at nedbryde kulbrinter (petrolatum og brugt motorolie) og plast (PET, PVC, HDPE, PS, PUR). Hvert af disse stoffer blev anvendt i en test som den eneste kulstofkilde for de udvalgte svampestammer. Svampens evne til at udnytte disse stoffer blev vurderet som forskellen i kolonivækst mellem prøverne med det tilsatte stof og kontrolprøverne med kun minimalt medium (BH eller BHA, afhængigt af testen). En kvalitativ skala blev brugt til at beskrive resultaterne (figur 1), der spænder fra fraværet af vækstforskel med kontrollen (0) til lave (+), mellemstore (++) og høje (+++) niveauer af forskel i vækst.

Figure 1
Figur 1: Vækstsucces for svampestammer i væksttestene. Procentdelen af svampestammer, der kan vokse på petrolatum, brugt motorolie og plastpulvere (polyethylenterephthalat, PET; polyvinylchlorid, PVC; polyethylen med høj densitet, HDPE; polystyren, PS; polyurethan, PUR) som deres eneste kulstofkilde med forskellige grader af succes (ingen vækst, 0; lav vækst, +; medium vækst, ++; høj vækst, +++). Klik her for at se en større version af denne figur.

Petrolatum og brugte motorolietest evaluerede kulbrintebionedbrydningspotentialet for de udvalgte svampestammer. Petrolatum, en blanding af langkædede alkaner (>C25), blev anvendt som den eneste kulstofkilde. Svampens evne til at udnytte dette stof blev vurderet som forskellen i kolonivækst mellem hætteglas med BH + petrolatum og kontrolhætteglas med kun BH (figur 2). Næsten 75% af de testede svampestammer var i stand til at bruge petrolatum som deres eneste kulstofkilde, og 21% af stammerne udviste maksimal vækst (+++, figur 1).

Figure 2
Figur 2: Billeder af den kvalitative vækstskala på petrolatum som eneste kulstofkilde. Den kvalitative skala er baseret på vækstforskellen mellem de behandlede prøver og BH-kontrollen. Det spænder fra fraværet af vækstforskel (0) til lave (+), mellemstore (++) og høje (+++) niveauer af vækstforskel. Klik her for at se en større version af denne figur.

Brugt motorolie er en kompleks blanding af carbonhydrider, motoradditiver og metaller. Det blev brugt i væksttestene til at evaluere svampens evne til at udnytte en kompleks og giftig carbonhydridblanding som kulstofkilde. Ligesom de andre væksttests blev væksten evalueret ved at sammenligne svampevæksten i plader med motorolien med vækst i kontrolpladerne, der kun indeholdt BHA (figur 3). Vækstresultaterne bekræftede effektiviteten af de selektive medier (afsnit 1 i protokollen). Faktisk var næsten 90% af de isolerede svampestammer i stand til at vokse på brugt motorolie, hvor 39% viste maksimal vækst (+++, figur 1).

Figure 3
Figur 3: Billeder af den kvalitative vækstskala på brugt motorolie som eneste kulstofkilde. Den kvalitative skala er baseret på vækstforskellen mellem de behandlede prøver og BHA-kontrollen. Det spænder fra fravær af vækstforskel (0) til lave (+), mellemstore (++) og høje (+++) niveauer af vækstforskel. Klik her for at se en større version af denne figur.

Væksttest på plastpulvere blev brugt til at vælge svampestammer, der kunne bruge specifikke plastpolymerer som deres primære kulstofkilde; Derfor har disse stammer et stort potentiale for plastisk bioremediering. Væksten i flerbrøndsplader blev observeret ved stereomikroskop og evalueret ved hjælp af en kvalitativ skala, der spænder fra fravær af vækst (0) til høj produktion af hyfer (+++). PUR var det plastpulver, der havde den højeste procentdel af svampestammer, der viste vækst (92%), hvor 31% af stammerne viste maksimal vækst (+++). Ca. 70 % af de stammer, der var isoleret fra huminsyre og lignocellulosemedier, voksede på PS-pulver, mens næsten 60-65 % af dem var i stand til at anvende HDPE, PVC og PET som deres eneste kulstofkilde. Derfor var en stor procentdel af svampe i stand til at vokse på de forskellige plastpulvere i multiwell plader, men et meget lavt antal af dem viste høj kolonisering af plast. Faktisk var kun 10% af stammerne i stand til at trives på PET og HDPE, og 13% var i stand til at trives med PS. Den eneste plast, hvor der regelmæssigt blev observeret høj svampevækst, var PUR, hvor ca. 30% af svampestammerne formåede at vokse meget rigeligt.

Kvalitative enzymatiske tests blev udført for at detektere svampestammer, der kan producere enzymer involveret i bionedbrydningsprocesserne af genstridige stoffer. Peroxidaser og laccases er ligninolytiske enzymer, hvis produktion er indikeret med en brunlig halo på undersiden af mediet i gallinsyre- og guaiacol-test (trin 3.1. og trin 3.2. i protokollen). I begge tests indikerede stigningen i farvens intensitet en højere produktion af disse enzymer (figur 4).

Figure 4
Figur 4: Billeder af den kvalitative skala af kvalitative ligninolytiske enzymer. Den kvalitative skala er baseret på produktionen af en rød/brunlig glorie omkring kolonien. 0 = ingen aktivitet, + = en vis aktivitet, ++ = høj aktivitet, +++ meget høj aktivitet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Ca. 60% af de testede svampe var i stand til at producere ligninolytiske enzymer, hvilket indikerer succesen med de selektive medier. Desuden producerede 12% af de isolerede svampestammer en intens mørk glorie omkring kolonien (+++) i gallinsyremedium, hvor 17% gjorde det i guaiacol medium (laccases), hvilket indikerer høj svampesekretion af disse enzymer (figur 5).

Figure 5
Figur 5: Hastighed af enzymaktivitet af svampestammer under kvalitative enzymatiske tests. Procentdelen af svampestammer, der er i stand til at producere ligninolytiske enzymer, laccases, proteaser og esteraser med forskellige succesniveauer (0 = ingen aktivitet, + = aktivitet, ++ = høj aktivitet, +++ meget høj aktivitet) under deres tilsvarende kvalitative enzymatiske tests. Klik her for at se en større version af denne figur.

En anden screeningstest, der blev brugt til at analysere svampeaktivitet, var proteasetesten, som var baseret på forskellen i svampevækst mellem JA mellemstore hætteglas og kontrolhætteglas med BH. Imidlertid viste ca. 70% af svampestammerne i JA-mediet samme vækst som kontroller eller endda nedsat vækst. Ingen svampestamme nåede det maksimale niveau af forskel (+++). Disse resultater tyder på, at denne test kan være uegnet til screening for proteaseaktivitet.

Endelig blev esteraseaktiviteten evalueret ved dannelsen af et hvidt bundfald i Tween 80-medium (figur 5). Næsten 60% af de udvalgte svampestammer viste esteraseaktivitet, og 13% viste en høj dannelse af bundfaldet (+++), hvilket tyder på, at stammerne i de 13% skulle vælges for at undersøge deres bionedbrydningspotentiale (figur 5).

Med hensyn til alle vækst- og enzymatiske tests var de mest succesrige stammer (dvs. dem, der opnåede +++ i mindst en test) de mest interessante. Disse svampestammer var i stand til effektivt at anvende genstridige stoffer som deres eneste kulstofkilde, eller de producerede et højt niveau af enzymer involveret i bionedbrydning af genstridige stoffer. Faktisk var 39 af de 115 svampestammer, der blev testet, i stand til at trives (+++) på kulbrintekilder (petrolatum eller brugt motorolie), og 58 havde høj vækst på mindst en plastpolymer. Kun 32 viste meget høj enzymatisk aktivitet (+++) i mindst en af de udførte enzymatiske tests. Disse resultater viser den høje effektivitet af alle de rapporterede screeningstest, bortset fra proteasetesten, som ikke udvalgte nogen højtydende stammer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Jordens rige biodiversitet er en rigelig kilde til svampe, der besidder mange metaboliske evner, hvoraf nogle kan være potentielle kandidater til bioremediering. Selektive medietest (afsnit 1 i protokollen) er nemme at udføre og effektive metoder til isolering af svampe, der er i stand til at vokse på naturlige komplekse polymerer som deres eneste kulstofkilde. Svampe kan producere ekstracellulære, ikke-specifikke hydrolaser og oxidoreduktaser30 , såsom de ligninolytiske enzymer laccases og peroxidaser31. Disse enzymer kan nedbryde lignocellulose og huminsyrer, men også mange forskellige xenobiotika, herunder carbonhydrider, aromatiske forbindelser og chlorerede organiske forbindelser32.

De beskrevne metoder giver resultater, der er lette at fortolke og er billige at udføre. Disse egenskaber gør det muligt for dem at blive brugt af ikke-eksperter. Visse aspekter, såsom sterilitet og morfologisk identifikation, kræver dog særlig opmærksomhed. For eksempel er 30 minutters omrøring af jordsuspensionen (trin 1.3.4.) nødvendig, så svampesporerne og propagulerne frigøres fra jordens mikrostruktur og kan suspenderes i opløsningen. På denne måde er det muligt at isolere det maksimale antal svampestammer ved at plettere fortyndinger af denne jordsuspension. Makro- og mikroskopisk morfologisk identifikation af svampestammer er vigtig for at skelne mellem stammer og undgå at isolere den samme svampestamme flere gange. Desuden er sterilitet og undgåelse af mikrobielle kontaminering afgørende, fordi tilstedeværelsen af andre aktive svampestammer kan give et misvisende billede af aktiviteten af de undersøgte kolonier.

Efter de selektive tests blev der udført en række væksttest på forskellige genstridige stoffer, såsom petrolatum, brugt motorolie og forskellige plastpolymerer. Denne fase kan tilpasses i henhold til de genstridige stoffer af interesse. Det vigtige skridt er at tilføje det valgte stof til BH eller BHA som den eneste kulstofkilde og kontrollere svampevæksten mod en kontrol uden det tilsatte genstridige stof.

Formålet med vækstforsøgene på plast og kulbrinter var at vurdere, om svampen kunne anvende disse stoffer som sin eneste kulstofkilde ved kvalitativt at observere dens vækst på materialet. På grund af den ekstreme genstridighed af disse materialer er det desværre meget vanskeligt at kvantificere det faktiske fald i substratets vægt og stigningen i svampebiomassens vægt, især efter relativt kort tid. Hvis en svampestamme klarer sig meget godt i disse screeningsvæksttest, bør der foretages yderligere undersøgelser for at kvantificere nedbrydningen af det genstridige stof.

De anvendte enzymatiske tests (afsnit 3 i protokollen) blev valgt, fordi de viste sig at være effektive og hurtige at udføre, men de giver kun kvalitative resultater. De fremhæver nedbrydningspotentialet for en svampestamme, men de kan ikke præcist kvantificere det. Hvis en stamme af særlig interesse isoleres, kan yderligere tests, såsom spektrofotometriske kvantitative enzymessays, udføres for at beskrive den metaboliske aktivitet mere præcist. Den eneste enzymatiske test, der viste suboptimal effekt, var den kvalitative proteasetest med et lavt antal stammer, der kunne vokse på JA-mediet. Faktisk antyder den høje procentdel af stammer, der er i stand til at vokse på PUR, at svampene producerede proteaser, der var involveret i at bryde amid- og urethanbindingerne, med esterase rettet mod esterbindingerne40. Det næsten fuldstændige fravær af proteaseproducerende svampe tyder på, at der kan have været et problem i den anvendte metode. Andre tests kan vedtages for proteaseaktivitet, såsom kasein41, skummetmælk42 eller mælkepulver43 agarpladetest. Gallinsyretesten viste sig at være meget nyttig til påvisning af produktionen af ligninolytiske enzymer, men desværre var den ikke særlig specifik og kunne ikke skelne mellem typen af ligninolytisk enzym, der blev produceret (enten peroxidaser eller laccases).

Resultaterne af dette arbejde tyder på, at brugen af lignocellulose eller huminsyrer som selektive medier gør det muligt at isolere svampestammer med bioremedieringspotentiale fra den rige jordbiodiversitet. Faktisk var mere end 70% af svampestammerne isoleret ved de selektive metoder i stand til at vokse på petrolatum eller brugt motorolie, og 60% var i stand til at vokse på forskellige plastpolymerer som den eneste kulstofkilde. Desuden beskrev de kvalitative enzymatiske tests den metaboliske aktivitet af disse svampe forbundet med bionedbrydningsprocesser. Udvælgelsen af svampestammer, der viser +++ aktivitet i en eller flere tests, anbefales, fordi det øger chancerne for at finde en svampestamme, der er meget aktiv i bioremediering. Test med gasmassekromatografi (GC-MS) på de genstridige stoffer efter langvarig kontakt med de svampestammer, der er udvalgt med vores screeningstest, har vist faktisk bionedbrydning af materialerne 9,44. Anvendelsen af disse enkle screeningstest i forskellige økosystemer vil gøre det muligt at undersøge svampenes biodiversitet i forskellige jordarter. Søgning efter svampe, der kan nedbryde genstridige materialer, vil øge antallet af identificerede stammer, der har potentiale til bioremediering og hjælpe med at tackle det voksende problem med miljøforurening.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi anerkender Scuola di Alta Formazione Dottorale (SAFD) fra University of Pavia og professor Solveig Tosi for at give mulighed for dette arbejde.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 microwell plate Greiner bio-one 650185
Agar VWR 84609.05
Bushnell-Haas Broth Fluka B5051
CaCl2 Sigma-Aldrich C5670
Chloroamphenicol Eurobio GABCRL006Z
Chlortetracycline Sigma-Aldrich Y0001451
CoCl2·6H2O Sigma-Aldrich C8661
CuCl2·2H2O Sigma-Aldrich C3279
Ethanol VWR Chemicals 20821.296
FeCl3·6H2O Sigma-Aldrich 236489
Filter 0.2 µm Whatman 10462200
gallic acid Sigma-Aldrich G7384
Glass cover slips Biosigma VBS634
Glass vials 15 mL SciLabware P35467
guaiacol Sigma-Aldrich G5502
High-density polyethylene (HDPE) Sigma-Aldrich 434272
Humic acids Aldrich Chemistry 53680
K2HPO4 Sigma-Aldrich P8281
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5655
Lignocellulose / / Sterilized bioethanol production waste
L-shaped cell spreader Laboindustria S.p.a 21133
magnetic stirrer A.C.E.F 8235
Malt Extract Broth Sigma-Aldrich 70146
MgSO4·7H2O Sigma-Aldrich M2643
Micropipette 1000 μL Gilson FA10006M
Micropipette 200  μL Gilson FA10005M
MnCl2·4H2O Sigma-Aldrich M5005
Na2MoO4·2H2O Sigma-Aldrich M1651
NaCl Sigma-Aldrich S5886
Neomycin Sigma-Aldrich N0401000
Penicillin Sigma-Aldrich 1504489
peptone Sigma-Aldrich 83059
Polyethylene terephthalate (PET) Goodfellow ES306031
Petri dishes Laboindustria S.p.a 21050
Petrolatum (Paraffin liquid) A.C.E.F 009661
Potato Dextrose Broth Sigma-Aldrich P6685
Polystyrene (PS) Sigma-Aldrich 331651
Polyurethane (PUR) Sigma-Aldrich GF20677923
Polyvinyl chloride (PVC) Sigma-Aldrich 81388
Sterile falcon tube Greiner bio-one 227 261
Sterile glass vials 20 mL Sigma-Aldrich SU860051
Sterile point 1000  μL Gilson F172511
Sterile point 200  μL Gilson F172311
Sterile polyethylene bags WHIRL-PAK B01018
sterile syringe Rays 5523CM25
Streptomycin Sigma-Aldrich S-6501
Tween 80 Sigma-Aldrich P1754
Used engine oil / / complex mixture of hydrocarbons, engine additives, and metals, provided by an Italian private company
Vials 50 mL Sigma-Aldrich 33108-U
ZnCl2 Sigma-Aldrich Z0152

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mohammadi, K., Heidari, G., Khalesro, S., Sohrabi, Y. Soil management, microorganisms and organic matter interactions: A review. African Journal of Biotechnology. 10 (86), 19840-19849 (2011).
  2. Daccò, C., Girometta, C., Asemoloye, M. D., Carpani, G., Picco, A. M., Tosi, S. Key fungal degradation patterns, enzymes and their applications for the removal of aliphatic hydrocarbons in polluted soils: A review. International Biodeterioration and Biodegradation. 147, (2020).
  3. Asemoloye, M. D., Ahmad, R., Jonathan, S. G. Synergistic action of rhizospheric fungi with Megathyrsus maximus root speeds up hydrocarbon degradation kinetics in oil polluted soil. Chemosphere. 187, 1-10 (2017).
  4. Abatenh, E., Gizaw, B., Tsegaye, Z., Wassie, M. The role of microorganisms in bioremediation - A review. Open Journal of Environmental Biology. 2, 038-046 (2017).
  5. Dix, N. J., Webster, J. Fungal Ecology. , Chapman & Hall. Cambridge, UK. (1995).
  6. Magan, N. Fungi in extreme environment. Environmental and Microbial Relationships. The Mycota. Esser, K., Lemke, P. A. 4, Springer. Berlin, Heidelberg. 99-114 (2007).
  7. Aranda, E. Promising approaches towards biotransformation of polycyclic aromatic hydrocarbons with Ascomycota fungi. Current Opinion in Biotechnology. 38, 1-8 (2016).
  8. Hasan, I. F., AI-Jawhari, Role of Filamentous Fungi to Remove Petroleum Hydrocarbons from the Environment. Microbial Action on Hydrocarbons. Kumar, V., Kumar, M., Prasad, R. , Springer. Singapore. (2018).
  9. Daccò, C., et al. Trichoderma: evaluation of its degrading abilities for the bioremediation of hydrocarbon complex mixtures. Applied Sciences. 10 (9), 3152 (2020).
  10. Alarcón, A., Davies, F. T., Autenrieth, R. L., Zuberer, D. A. Arbuscular mycorrhiza and petroleum-degrading microorganisms enhance phytoremediation of petroleum-contaminated soil. International Journal of Phytoremediation. 10, 251-263 (2008).
  11. Mancera-López, M. E., et al. Bioremediation of an aged hydro-carbon-contaminated soil by a combined system of biostimulation-bioaugmentation with filamentous fungi. International Biodeterioration and Biodegradation. 61, (2008).
  12. Hatami, E., Abbaspour, A., Dorostkar, V. Phytoremediation of a petroleum-polluted soil by native plant species in Lorestan Province, Iran. Environmental Science and Pollution Research. 26, 24323-24330 (2019).
  13. Prenafeta-Boldú, F. X., De Hoog, G. S., Summerbell, R. C. Fungal communities in hydrocarbon degradation. Microbial Communities Utilizing Hydrocarbons and Lipids: Members, Metagenomics and Ecophysiology. Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology. , Springer. Cham. 1-36 (2018).
  14. Gu, J., Ford, T., Mitton, D., Mitchell, R. Microbiological degradation of polymeric materials. Uhlig's Corrosion Handbook. , John Wiley and Sons. 421-438 (2011).
  15. Tuomela, M., Hatakka, A. Oxidative fungal enzymes for bioremediation. Comprehensive Biotechnology: Environmental and Related Biotechnologies. 6, Elsevier. 224-239 (2019).
  16. DSouza, G. C., et al. Fungal biodegradation of low-density polyethylene using consortium of Aspergillus species under controlled conditions. Heliyon. 7 (5), 07008 (2021).
  17. El-Sayed, M. T., Rabie, G. H., Hamed, E. A. Biodegradation of low-density polyethylene (LDPE) using the mixed culture of Aspergillus carbonarius and A. fumigates. Environment, Development, and Sustainability. 23 (10), 14556-14584 (2021).
  18. Sepperumal, U., Markandan, M., Palraja, I. Micromorphological and chemical changes during biodegradation of polyethylene terephthalate (PET) by Penicillium sp. Journal of Microbiology and Biotechnology Research. 3 (4), 47-53 (2013).
  19. Leitão, A. L. Potential of Penicillium species in the bioremediation field. International Journal of Environmental Research and Public Health. 6 (4), 1393-1417 (2009).
  20. Chen, S. H., Ting, A. S. Y. Biosorption and biodegradation potential of triphenylmethane dyes by newly discovered Penicillium simplicissimum isolated from indoor wastewater sample. International Biodeterioration & Biodegradation. 103, 1-7 (2015).
  21. Orhan, Y., Buyukgungor, H. Enhancement of biodegradability of disposable polyethylene in controlled biological soil. International Biodeterioration and Biodegradation. 45, 49-55 (2000).
  22. Deshmukh, R., Khardenavis, A. A., Purohit, H. J. Diverse metabolic capacities of fungi for bioremediation. Indian journal of microbiology. 56 (3), 247-264 (2016).
  23. Viswanath, B., Rajesh, B., Janardhan, A., Kumar, A. P., Narasimha, G. Fungal laccases and their applications in bioremediation. Enzyme research. 2014, 163242 (2014).
  24. Ali, M., Husain, Q., Ishqi, H. M. Fungal peroxidases mediated bioremediation of industrial pollutants. Fungal Bioremediation. , CRC Press. Boca Raton. (2019).
  25. Nousiainen, P., Kontro, J., Manner, H., Hatakka, A., Sipilä, J. Phenolic mediators enhance the manganese peroxidase catalyzed oxidation of recalcitrant lignin model compounds and synthetic lignin. Fungal Genetics and Biology. 72, 137-149 (2014).
  26. Srivastava, S., Kumar, M. Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs): A sustainable approach. Sustainable Green Technologies for Environmental Management. , Springer. Singapore. (2019).
  27. Wei, R., Zimmermann, W. Microbial enzymes for the recycling of recalcitrant petroleum-based plastics: how far are we. Microbial Biotechnology. 10 (6), 1308-1322 (2017).
  28. Matsubara, M., Lynch, J. M., De Leij, F. A. A. M. A simple screening procedure for selecting fungi with potential for use in the bioremediation of contaminated land. Enzyme and Microbial Technology. 39 (7), 1365-1372 (2006).
  29. Mann, J., et al. Screening and selection of fungi for bioremediation of olive mill wastewater. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 26 (3), 567-571 (2010).
  30. Andlar, M., Rezić, T., Marđetko, N., Kracher, D., Ludwig, R., Šantek, B. Lignocellulose degradation: an overview of fungi and fungal enzymes involved in lignocellulose degradation. Engineering in Life Sciences. 18, 768-778 (2018).
  31. Goméz-Toribio, V., García-Martín, A. B., Martínez, M. J., Martínez, A. T., Guillén, F. Induction of extracellular hydroxyl radical production by white-rot fungi through quinone redox cycling. Applied and Environmental Microbiology. 75, 3944-3953 (2009).
  32. Belcarz, A., Ginalska, G., Kornillowicz-Kowalska, T. Extracellular enzyme activities of Bjerkandera adusta R59 soil strain, capable of daunomycin and humic acids degradation. Applied Microbiology and Biotechnology. 68 (5), 686-694 (2005).
  33. Stevenson, F. J. Humus Chemistry: Genesis, Composition, Reactions. 2nd ed. , Wiley. New York. (1995).
  34. Andlar, M., et al. Lignocellulose degradation: An overview of fungi and fungal enzymes involved in lignocellulose degradation. Engineering in Life Sciences. 18 (11), 768-778 (2018).
  35. Lee, H., et al. Biotechnological procedures to select white rot fungi for the degradation of PAHs. Journal of Microbiological Methods. 97 (1), 56-62 (2014).
  36. Batista-García, R. A., et al. Simple screening protocol for identification of potential mycoremediation tools for the elimination of polycyclic aromatic hydrocarbons and phenols from hyperalkalophile industrial effluents. Journal of Environmental Management. 198, 1-11 (2017).
  37. Shleev, S. V., et al. Comparison of physico-chemical characteristics of four laccases from different basidiomycetes. Biochimie. 86 (9-10), (2004).
  38. Kiiskinen, L. L., Rättö, M., Kruus, K. Screening for novel laccase-producing microbes. Journal of Applied Microbiology. 97, (2004).
  39. Kumar, V. V., Rapheal, V. S. Induction and purification by three-phase partitioning of aryl alcohol oxidase (AAO) from Pleurotus ostreatus. Applied Biochemistry and Biotechnology. , 163 (2011).
  40. Loredo-Treviño, A., Gutiérrez-Sánchez, G., Rodríguez-Herrera, R., Aguilar, C. N. Microbial enzymes involved in polyurethane biodegradation: a review. Journal of Polymers and the Environment. 20 (1), 258-265 (2012).
  41. Garriga, M., et al. Technological and sensorial evaluation of Lactobacillus strains as starter cultures in fermented sausages. International Journal of Food Microbiology. 32 (1-2), 173-183 (1996).
  42. Zerdani, I., Faid, M., Malki, A. Feather wastes digestion by new isolated strains Bacillus sp. In microcco. African Journal of Biotechnology. 3 (1), 67-70 (2004).
  43. Nygren, C. M., Edqvist, J., Elfstrand, M., Heller, G., Taylor, A. F. Detection of extracellular protease activity in different species and genera of ectomycorrhizal fungi. Mycorrhiza. 17 (3), 241-248 (2007).
  44. Asemoloye, M. D., et al. Hydrocarbon degradation and enzyme activities of Aspergillus oryzae and Mucor irregularis isolated from Nigerian crude oil-polluted sites. Microorganisms. 8 (12), 1912 (2020).

Tags

Biologi nummer 183 Svampe jord biodiversitet bioremediering screeningstest kulbrinter plast enzymatisk aktivitet
Isolering og screening fra jordens biodiversitet for svampe involveret i nedbrydning af genstridige materialer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Temporiti, M. E. E., Daccò, C., … More

Temporiti, M. E. E., Daccò, C., Nicola, L. Isolation and Screening from Soil Biodiversity for Fungi Involved in the Degradation of Recalcitrant Materials. J. Vis. Exp. (183), e63445, doi:10.3791/63445 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter