Summary
Dieses Protokoll enthält eine detaillierte Zusammenfassung der Strategien zur Beimpfung von Pflanzenwurzeln mit bodenbürtigen Mikroben. Am Beispiel der Pilze Verticillium longisporum und Verticillium dahliae werden drei verschiedene Wurzelinfektionssysteme beschrieben. Mögliche Anwendungen und mögliche nachgelagerte Analysen werden aufgezeigt und Vor- oder Nachteile für jedes System diskutiert.
Abstract
Die Rhizosphäre beherbergt eine hochkomplexe mikrobielle Gemeinschaft, in der Pflanzenwurzeln ständig herausgefordert werden. Wurzeln stehen in engem Kontakt mit einer Vielzahl von Mikroorganismen, aber Studien über bodenbürtige Wechselwirkungen liegen immer noch hinter denen, die an oberirdischen Organen durchgeführt werden. Obwohl in der Literatur einige Impfstrategien zur Infektion von Modellpflanzen mit Modellwurzelpathogenen beschrieben werden, bleibt es schwierig, einen umfassenden methodischen Überblick zu erhalten. Um dieses Problem anzugehen, werden drei verschiedene Wurzelimpfsysteme genau beschrieben, die angewendet werden können, um Einblicke in die Biologie der Wurzel-Mikroben-Interaktionen zu gewinnen. Zur Veranschaulichung wurden Verticillium-Arten (nämlich V. longisporum und V. dahliae) als wurzeleindringende Modellpathogene verwendet. Die Methoden können jedoch leicht an andere wurzelbesiedelnde Mikroben angepasst werden - sowohl pathogene als auch nützliche. Durch die Besiedlung der Pflanze Xylem zeigen bodengetragene Gefäßpilze wie Verticillium spp. einen einzigartigen Lebensstil. Nach der Wurzelinvasion breiten sie sich über die Xylemgefäße akropetisch aus, erreichen den Spross und lösen Krankheitssymptome aus. Drei repräsentative Pflanzenarten wurden als Modellwirte ausgewählt: Arabidopsis thaliana, wirtschaftlich wichtiger Raps (Brassica napus) und Tomate (Solanum lycopersicum). Es werden Schritt-für-Schritt-Protokolle gegeben. Es werden repräsentative Ergebnisse von Pathogenitätsassays, transkriptionellen Analysen von Markergenen und unabhängigen Bestätigungen durch Reporterkonstrukte gezeigt. Darüber hinaus werden die Vor- und Nachteile jedes Impfsystems gründlich diskutiert. Diese bewährten Protokolle können dabei helfen, Ansätze für Forschungsfragen zu Wurzel-Mikroben-Interaktionen bereitzustellen. Zu wissen, wie Pflanzen mit Mikroben im Boden umgehen, ist entscheidend für die Entwicklung neuer Strategien zur Verbesserung der Landwirtschaft.
Introduction
Natürliche Böden werden von einer erstaunlichen Anzahl von Mikroben bewohnt, die neutral, schädlich oder vorteilhaft für Pflanzen sein können1. Viele Pflanzenpathogene werden durch den Boden übertragen, umgeben die Wurzeln und greifen das unterirdische Organ an. Diese Mikroorganismen gehören zu einer Vielzahl von Kladen: Pilze, Oomyceten, Bakterien, Nematoden, Insekten und einige Viren 1,2. Sobald die Umweltbedingungen eine Infektion begünstigen, werden anfällige Pflanzen krank und die Ernteerträge sinken. Die Auswirkungen des Klimawandels, wie die globale Erwärmung und Wetterextreme, werden den Anteil bodenbürtiger Pflanzenpathogeneerhöhen 3. Daher wird es immer wichtiger, diese zerstörerischen Mikroben und ihre Auswirkungen auf die Lebens- und Futtermittelproduktion, aber auch auf natürliche Ökosysteme zu untersuchen. Darüber hinaus gibt es mikrobielle Mutualisten im Boden, die eng mit den Wurzeln interagieren und das Wachstum, die Entwicklung und die Immunität der Pflanzen fördern. Wenn Pflanzen mit Krankheitserregern konfrontiert werden, können sie aktiv spezifische Gegner in der Rhizosphäre rekrutieren, die das Überleben des Wirts unterstützen können, indem sie Krankheitserreger unterdrücken 4,5,6,7. Mechanistische Details und Signalwege, die an vorteilhaften Wurzel-Mikroben-Interaktionen beteiligt sind, sind jedoch oft noch unbekannt6.
Es ist daher wichtig, das allgemeine Verständnis der Wurzel-Mikroben-Wechselwirkungen zu erweitern. Zuverlässige Methoden zur Beimpfung von Wurzeln mit bodenbürtigen Mikroorganismen sind notwendig, um Modellstudien durchzuführen und die Erkenntnisse in landwirtschaftliche Anwendungen zu überführen. Vorteilhafte Wechselwirkungen im Boden werden beispielsweise mit Serendipita indica (früher bekannt als Piriformospora indica), stickstoffbindendem Rhizobium spp. oder Mykorrhizapilzen untersucht, während bekannte bodenbürtige Pflanzenpathogene Ralstonia solanacearum, Phytophthora spp., Fusarium spp. und Verticillium spp.1 umfassen. Die beiden letzteren sind Pilzgattungen, die weltweit verbreitet sind und Gefäßerkrankungenverursachen 2. Verticillium spp. (Ascomycota) kann Hunderte von Pflanzenarten infizieren - hauptsächlich Dikotyledonen, einschließlich krautiger Einjähriger, holziger Stauden und vieler Kulturpflanzen 2,8. Hyphen von Verticillium treten in die Wurzel ein und wachsen sowohl interzellulär als auch intrazellulär in Richtung des zentralen Zylinders, um die Xylemgefäße zu besiedeln 2,9. In diesen Gefäßen bleibt der Pilz für den größten Teil seines Lebenszyklus. Da der Xylemsaft nährstoffarm ist und pflanzliche Abwehrstoffe trägt, muss sich der Pilz an diese einzigartige Umgebung anpassen. Dies wird durch die Sekretion von kolonisationsbezogenen Proteinen erreicht, die es dem Erreger ermöglichen, in seinem Wirt10,11 zu überleben. Nach Erreichen des Wurzelgefäßes kann sich der Pilz innerhalb der Xylemgefäße akropetal auf das Laub ausbreiten, was zu einer systemischen Besiedlung des Wirts 9,12 führt. Zu diesem Zeitpunkt ist die Pflanze im Wachstum 9,10,13 negativ beeinflusst. Zum Beispiel treten Wachstumsverzögerung und gelbe Blätter sowie vorzeitige Seneszenz13,14,15,16 auf.
Ein Mitglied dieser Gattung ist Verticillium longisporum, das stark an brassicaceous Wirte wie den agronomisch wichtigen Raps, Blumenkohl und die Modellpflanze Arabidopsis thaliana12 angepasst ist. Mehrere Studien kombinierten V. longisporum und A. thaliana, um umfangreiche Einblicke in bodenbürtige Gefäßerkrankungen und die daraus resultierenden Wurzelabwehrreaktionenzu gewinnen 13,15,16,17. Mit dem Modellsystem V. longisporum / A. thaliana können einfache Empfindlichkeitstests durchgeführt werden und für beide Organismen stehen gut etablierte genetische Ressourcen zur Verfügung. Eng verwandt mit V. longisporum ist der Erreger Verticillium dahliae. Obwohl beide Pilzarten einen ähnlichen vaskulären Lebensstil und Invasionsprozess durchführen, sind ihre Vermehrungseffizienz von den Wurzeln bis zu den Blättern und die hervorgerufenen Krankheitssymptome bei A. thaliana unterschiedlich: Während V. longisporum normalerweise eine frühe Seneszenz induziert, führt eine Infektion mit V. dahliae zu welken18. Kürzlich wurden in einer methodischen Zusammenfassung verschiedene Wurzelimpfstrategien zur Infektion von A. thaliana mit V. longisporum oder V. dahliae vorgestellt, die bei der Planung von Versuchsaufbauten helfen19. Auf dem Feld verursacht V. longisporum gelegentlich erhebliche Schäden in der Rapsproduktion12, während V. dahliae ein sehr breites Wirtsspektrum hat, das mehrere Kulturarten wie Weinrebe, Kartoffel und Tomate8 umfasst. Dies macht beide Krankheitserreger wirtschaftlich interessant zu untersuchende Modelle.
So verwenden die folgenden Protokolle sowohl V. longisporum als auch V. dahliae als Modell-Wurzelpathogene, um mögliche Ansätze für Wurzelimpfungen zu veranschaulichen. Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), Raps (Brassica napus) und Tomaten (Solanum lycopersicum) wurden als Musterwirte ausgewählt. Detaillierte Beschreibungen der Methoden finden Sie im folgenden Text und im dazugehörigen Video. Vor- und Nachteile für jedes Impfsystem werden diskutiert. Zusammengenommen kann diese Protokollsammlung helfen, eine geeignete Methode für spezifische Forschungsfragen im Kontext von Wurzel-Mikroben-Interaktionen zu identifizieren.
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Protocol
1. Medien für Pilzkulturen und Pflanzenimpfsysteme
- Flüssige Kartoffeldextrose-Brühe (PDB): 21 g/L PDB in Reinstwasser in einem hitzestabilen Kolben zubereiten.
- Flüssige Czapek Dextrose Brühe (CDB): Bereiten Sie 42 g/L CDB in Reinstwasser in einem hitzestabilen Kolben zu.
- Medium für das Petrischalen-Impfsystem: Bereiten Sie einen hitzestabilen Kolben mit 1,5 g/L Murashige und Skoog-Medium (MS) und 8 g/L Agar in Reinstwasser vor.
HINWEIS: Vermeiden Sie Zucker in diesem Medium, da dies nach der Impfung zu übermäßigem Pilzwachstum führt. - Medium für das auf Kunststoffbechern basierende Impfsystem: Bereiten Sie einen hitzestabilen Kolben mit 4,4 g/L MS, 0,2 g/L MgSO4, 1 g/L KNO3, 0,5 g/L 2-(N-morpholino)ethansulfonsäure (MES) und 6,0 g/L Agar in Reinstwasser vor und stellen Sie den pH-Wert mit 5 M KOH auf 5,7 ein.
HINWEIS: Vermeiden Sie Zucker in diesem Medium, da dies nach der Impfung zu übermäßigem Pilzwachstum führt. - 1/4 MS Medium: Bereiten Sie 1,2 g/L MS in Reinstwasser vor.
- Verwenden Sie den Autoklaven, um alle oben genannten Lösungen zu sterilisieren. Die Glaskolben in den Korb legen, den Deckel schließen und 15 min bei 121 °C und 98,9 kPa sterilisieren.
2. Sterilisieren der Oberfläche von Pflanzensamen
HINWEIS: Verwenden Sie das folgende Protokoll immer, um die Oberfläche von Samen aus Arabidopsis, Raps und Tomaten vor der Aussaat zu sterilisieren.
- Geben Sie die Samen in ein 2 ml Reaktionsrohr. Setzen Sie das Rohr in einen Exsikkator mit einem internen Fassungsvermögen von 5,8 l.
- Erzeugen Sie Chlorgas im Exsikkator durch Zugabe von 6 ml 33% Salzsäure (HCl) in 100 ml 12% wässriges Natriumhypochlorit (NaClO).
- Schließen Sie sofort den Deckel des Exsikkators und inkubieren Sie die Samen für 3 h im Gas.
3. Vorbereitung des Inokulums mit Verticillium-Sporen (asexuell abgeleitete Konidien)
HINWEIS: V. dahliae (Stamm JR2) wie V. longisporum (Stamm Vl43)17,18,19 kultivieren. Stellen Sie sicher, dass alle Geräte und Medien keimfrei sind und dass alle Schritte in einer laminaren Durchflusshaube ausgeführt werden, um das Inokulum axenisch zu halten.
- 150 ml flüssiges PDB (Schritt 1.1) werden in einen 500 ml Schikanenkolben gefüllt und das Medium mit 500 mg/L Cefotaxim ergänzt.
- Geben Sie Verticillium conida aus der Lagerung von Glycerinmaterial in das PDB-Medium. Schließen Sie den Kolben mit einem sterilen Schaumstoffstopfen.
- Inkubieren Sie die Kultur für 7-10 Tage in einer dunklen Box bei Raumtemperatur (RT) unter kontinuierlichem, horizontalem Schütteln (Rotary Shaker; 60 U / min). Dadurch entstehen kleine, weiße Myzelenkugeln.
- Entfernen und verwerfen Sie den PDB-Überstand sorgfältig. Die meisten Myzelien sollten im Kolben verbleiben.
- 100 ml flüssiges CDB (Schritt 1.2) auf die Myzelie im Schikanenkolben geben und das Medium mit 500 mg/L Cefotaxim ergänzen.
- Inkubieren Sie weitere 4-5 Tage in einer dunklen Box bei RT unter kontinuierlichem, horizontalem Schütteln (Rotary Shaker, 60 U / min), um eine Sporulation zu induzieren. Der Überstand wird gelblich-gräulich, wenn Konidien freigesetzt werden.
- Filtern Sie einen Teil (5-10 ml) der konidienhaltigen Flüssigkeit durch ein Filterpapier (Partikelrückhaltegrad von 8-12 μm) in ein steriles 50 mL Auffangröhrchen. Dies trennt Sporen von Myzelien.
- Bestimmen Sie die Sporenkonzentration mit einer Zellzählkammer und einem Mikroskop. Mit keimfreiem 1/4 MS-Medium in Reinstwasser verdünnen, bis die unten angegebenen Sporenkonzentrationen erhalten sind.
HINWEIS: Unter dem Mikroskop sind die Konidien von V. longisporum meist langgezogen und 7,1-8,8 μm groß, während V. dahliae-Konidien kürzer (3,5-5,5 μm) und eher kugelförmig20 sind. - Verwenden Sie diese frisch geernteten Konidien als Impfstoff. Stellen Sie sicher, dass die Experimente immer mit frisch geernteten Konidien und nicht mit gefrorenen Beständen durchgeführt werden, da das Einfrieren die Anzahl der lebensfähigen Sporen erheblich reduziert19.
- Zur Langzeitlagerung die Sporen als hochkonzentrierte Sporenlösung (ca. 1 x 108 Sporen/ml) in 25%igem Glycerin bei -80 °C (bis 1 Jahr lagerfähig) einfrieren. Für die nächsten Experimente verwenden Sie diese Glycerinvorräte, um das PDB-Medium in Schritt 3.2 zu impfen.
4. Ein steriles In-vitro-Impfsystem auf Basis von Petrischalen
HINWEIS: Stellen Sie beim Petrischalensystem17 sicher, dass alle Geräte und Medien keimfrei sind und dass alle Schritte in einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden.
- Nach dem Autoklavieren das Medium (siehe Schritt 1.3) in Petrischalen gießen.
- Nach dem Aushärten des Mediums die Petrischalen in einen sterilen Plastikbeutel umpacken und über Nacht kopfüber im Kühlschrank (4-10 °C) aufbewahren. Ein gekühltes Medium hilft, ein Abrutschen des Mediums in den nächsten Schritten zu verhindern.
- Schneiden und entfernen Sie einen Infektionskanal und das obere Drittel des erstarrten Mediums mit einem Skalpell (Abbildung 1A). Vermeiden Sie es, während des Schneidens Flüssigkeit oder Luft unter das Agarmedium zu bekommen. Andernfalls rutscht das Medium und schließt den Infektionskanal.
- Verteilen Sie 50-100 oberflächensterilisierte Arabidopsis-Samen mit einer sterilen Pipettenspitze auf der geschnittenen Oberseite. Legen Sie die Samen in den Winkel, in dem die geschnittene Agaroberfläche die Wand der Petrischale berührt, so dass Wurzeln zwischen dem Medium und der Petrischalenwand wachsen können. Dies wird die Impfung später erleichtern.
- Schließen Sie die Petrischalen und verschließen Sie sie mit luftdurchlässigem Klebeband, um einen Gasaustausch zu ermöglichen.
- Nach der Schichtung für 2 Tage in der Dunkelheit bei 4 °C die Platten senkrecht in ein geeignetes Rack legen und die Pflanzen bei 22 °C ± 1 °C unter Langzeitbedingungen (16 h Licht / 8 h Dunkelheit) in einer Wachstumskammer anbauen.
- Wenn der Großteil der Wurzeln den Infektionskanal erreicht (etwa 9-11 Tage alte Sämlinge), legen Sie die Platten horizontal ab, öffnen Sie sie und fügen Sie 500 μL frisch geerntete Verticillium-Konidien mit einer Konzentration von 4 x 105 Sporen / ml direkt in den Infektionskanal hinzu, wobei darauf zu achten ist, dass die Flüssigkeit gleichmäßig im Kanal verteilt wird.
- Bereiten Sie in ähnlicher Weise Kontrollplatten vor, indem Sie 500 μL einer Scheinlösung anstelle von Sporen (keimfreies 1/4 MS-Medium) hinzufügen.
- Inkubieren Sie die Platten horizontal für ein paar Minuten, bis die Flüssigkeit eingeweicht ist und nicht austreten kann, wenn die Platten wieder vertikal aufgestellt werden. Schließen Sie dann den Deckel und verschließen Sie die Platten mit luftdurchlässigem Klebeband.
- Inkubieren Sie die Platten vertikal in der Wachstumskammer. Optional können Sie die Wurzelteile mit schwarzen Papierkartons bedecken, um Wurzeln und bodenbürtige Pilze zu verdunkeln (siehe19).
- Führen Sie die Analysen je nach Forschungsfrage zu den bevorzugten Zeitpunkten nach der Inokulation durch (die hier verwendeten genauen Zeitpunkte finden Sie in den Abbildungslegenden). Im Folgenden finden Sie einige Vorschläge.
- Schneiden Sie die Blätter von den Wurzeln und ernten Sie beide separat. Nehmen Sie die Agarstreifen aus den Petrischalen heraus, um leicht an die Wurzeln zu gelangen, und ziehen Sie sie vorsichtig mit einer Pinzette aus dem Agar. Sämtliches Pflanzenmaterial sofort in flüssigem Stickstoff einfrieren.
- Mahlen Sie die Proben in flüssigem Stickstoff. Extrahieren Sie die Gesamt-DNA aus 100 mg Blattmaterial, um mittels einer quantitativen PCR (qPCR) die Menge an Pilz-DNA im Verhältnis zur Pflanzen-DNA zu bestimmen (siehe19).
- Mahlen Sie die Proben in flüssigem Stickstoff. Nehmen Sie 100 mg Pflanzenmaterial ein und extrahieren Sie die gesamte RNA. Durchführung einer quantitativen Reverse-Transkriptions-PCR (qRT-PCR), um die Expression von Pflanzengenen (oder Pilzgenen) während des Befalls zu bestimmen (siehe19).
- Entfernen Sie vorsichtig die Wurzeln aus dem Agar, vermeiden Sie Verletzungen und untersuchen Sie sie unter dem Fluoreszenzmikroskop.
- Bestimmen Sie die Induktion von Markergenen in Pflanzenreporterlinien (z. B. Luciferase, β-Glucuronidase oder fluoreszierende Reporter17,19,21).
- Visualisieren Sie die Pilzvermehrung an der Wurzel unter Verwendung von Pilzreporterlinien (z. B. V. longisporum, das konstitutiv ein verbessertes grün fluoreszierendes Protein, Vl-sGFP 9) exprimiert, oder durch Färbetechniken (z. B. durch 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-N-acetyl-beta-d-glucosaminid (X-beta-D-Glc-Nac)18).
- Schneiden Sie die Blätter von den Wurzeln und ernten Sie beide separat. Nehmen Sie die Agarstreifen aus den Petrischalen heraus, um leicht an die Wurzeln zu gelangen, und ziehen Sie sie vorsichtig mit einer Pinzette aus dem Agar. Sämtliches Pflanzenmaterial sofort in flüssigem Stickstoff einfrieren.
5. Ein steriles In-vitro-Impfsystem , das mit Plastikbechern organisiert ist
HINWEIS: Wie in der ersten Beschreibung dieser Technik19 erwähnt, stellen Sie sicher, dass alle Geräte und Medien keimfrei sind und dass alle Schritte in einer Laminar-Flow-Haube ausgeführt werden.
- Verwenden Sie transparente Plastikbecher mit einem Gesamtvolumen von 500 ml und sterilisieren Sie sie in einem 70% -75% -Ethanolbad für mindestens 20 min. Trocknen Sie die Becher in der Laminar-Flow-Haube.
- Gießen Sie das autoklavierte Medium (siehe Schritt 1.4) in die Plastikbecher. Optional Cefotaxim (Endkonzentration von 50 mg/L) in das autoklavierte Medium geben, um bakterielle Kontaminationen zu vermeiden. Verwenden Sie 150 ml Medium pro Tasse für Experimente mit Arabidopsis oder mehr Medium (250-300 ml pro Tasse) für Experimente mit größeren Pflanzenarten (Raps, Tomate).
- Legen Sie eine Kunststoffschicht (zuvor durch Inkubation in 70%-75% Ethanol für 20 min sterilisiert) auf das Medium, bevor es erstarrt (Abbildung 1B).
HINWEIS: Diese Kunststoffschicht enthält vier vorgefertigte Löcher an den Ecken zum Platzieren von oberflächensterilisiertem Saatgut. Dadurch können die Samen auf das Medium zugreifen. Später verhindert diese Trennschicht, dass die Blätter das pilzhaltige Medium berühren, so dass die Mikroben die Blätter nicht direkt angreifen können und den Wurzelweg nehmen müssen. Ein weiteres Loch befindet sich in der Mitte, wodurch der Infektionskanal durchtrennt werden kann. - Wenn das Medium erstarrt ist, schneiden Sie das Agar mit einem Skalpell durch das vorgefertigte Mittelloch bis zu einer Tiefe von etwa 1,5 cm. Entfernen Sie den geschnittenen Agar, um einen Infektionskanal zu schaffen, in den die Pilzsporen später hinzugefügt werden können.
- Kratzen Sie das Agarmedium leicht mit einer Pipettenspitze in den vier kleineren Löchern, um die erstarrte Haut zu unterbrechen (dies ermöglicht es den Samen, Wasser aus dem wässrigen Agarmedium aufzunehmen). Legen Sie die Samen mit einer Pipettenspitze in die kleineren Löcher.
- Schließen Sie den Plastikbecher mit einem zweiten, umgedrehten Plastikbecher und verschließen Sie ihn mit luftdurchlässigem Klebeband. Das Band muss den Gasaustausch ermöglichen.
- Nach 3 Tagen Schichtung bei Dunkelheit bei 4 °C die Bechersysteme unter 12 h Licht / 12 h Dunkelheit (Arabidopsis, Raps) oder 16 h Licht / 8 h Dunkelheit (Tomate) in Wachstumskammern bei konstanter Temperatur von 22 °C und 60% Luftfeuchtigkeit inkubieren.
- Befolgen Sie das empfohlene Alter der Pflanzen für die Impfung: 21 Tage für Arabidopsis; 5-7 Tage für Raps; 12 Tage für Tomaten.
- Beimpfen Sie Pflänzchen mit Verticillium , indem Sie 1 ml Konidienlösung (empfohlene Konzentration: 4 x 105 Sporen/ml) in den Infektionskanal geben. Um Kontrollproben vorzubereiten, geben Sie 1 ml Scheinlösung ohne Sporen (keimfreies 1/4 MS-Medium) in den Kanal.
- Führen Sie die Analysen je nach Forschungsfrage zu den bevorzugten Zeitpunkten nach der Inokulation durch (die hier verwendeten genauen Zeitpunkte finden Sie in den Abbildungslegenden). Im Folgenden finden Sie einige Vorschläge.
- Machen Sie Fotos von den Pflanzen mit einer Digitalkamera von oben, wobei der Abstand für jedes Foto gleich bleibt. Quantifizieren Sie die Blattfläche (z. B. mit ImageJ22 oder BlattFlaeche17,19; verwenden Sie die Länge der Tassen, um die Skala einzustellen) und vergleichen Sie infizierte und Kontrollgruppen. Kategorisieren Sie die Entwicklung von Krankheitssymptomen (z. B. kleinere, gelblichere oder nekrotische Blätter).
HINWEIS: Wenn es Stängel auf Arabidopsis gibt, entfernen Sie sie, um bessere Fotos von den Rosetten zu erhalten. - Entfernen Sie die Wurzeln und definieren Sie die Biomasse (Frischgewicht) von Trieben aus infizierten und kontrollieren Sie Proben durch Wiegen. Bestimmen Sie das relative Frischgewicht19.
- Sammeln Sie die Proben für molekulare Analysen wie folgt.
- Arabidopsis: Entfernen Sie Stängel, falls vorhanden. Schneiden Sie die Rosetten an der Basis von den Wurzeln ab. Achten Sie darauf, das gesamte Wurzelmaterial aus der Probe auszuschließen und ganze Rosetten zu ernten. Kombinieren Sie 4-5 Rosetten aus verschiedenen Pflanzen zu einer Probe und frieren Sie das Blattmaterial in flüssigem Stickstoff ein.
- Ziehen Sie die Wurzeln vorsichtig mit einer Pinzette aus dem Medium, drücken und tupfen Sie sie mit einem Papiertuch ab, um Agarreste zu entfernen, und kombinieren Sie 4-5 Wurzeln von verschiedenen Pflanzen zu einer Probe. Sofort in flüssigem Stickstoff einfrieren.
- Raps/Tomate: Schneiden Sie Stielsegmente aus dem Hypokotyl (z. B. 1 cm lang; immer die gleiche Stammregion nehmen). Kombinieren Sie Material von 4-5 Pflanzen in jede Probe und frieren Sie es in flüssigem Stickstoff ein.
- Mahlen Sie die Proben in flüssigem Stickstoff. Extrahieren Sie die Gesamt-DNA aus 100 mg des Blatt- oder Stammmaterials, um mittels qPCR die Menge an Pilz-DNA im Verhältnis zur Pflanzen-DNA zu bestimmen (siehe19).
- Mahlen Sie die Proben in flüssigem Stickstoff, nehmen Sie 100 mg Pflanzenmaterial und extrahieren Sie die gesamte RNA. Führen Sie die qRT-PCR durch, um die Expression von Pflanzengenen (oder Pilzgenen) bei Befall zu bestimmen (siehe19).
- Machen Sie Fotos von den Pflanzen mit einer Digitalkamera von oben, wobei der Abstand für jedes Foto gleich bleibt. Quantifizieren Sie die Blattfläche (z. B. mit ImageJ22 oder BlattFlaeche17,19; verwenden Sie die Länge der Tassen, um die Skala einzustellen) und vergleichen Sie infizierte und Kontrollgruppen. Kategorisieren Sie die Entwicklung von Krankheitssymptomen (z. B. kleinere, gelblichere oder nekrotische Blätter).
6. Ein bodenbasiertes Impfsystem in Töpfen
- Mischen Sie Erde und Sand gründlich in einem volumetrischen Verhältnis von 3: 1 (Erde: Sand), um das Waschen des Substrats von den Wurzeln zu erleichtern. Gießen Sie die Mischung in einen Autoklavenbeutel. Wenn die Mischung zu trocken ist, fügen Sie eine angemessene Menge Wasser hinzu und mischen Sie es in das Substrat. Dampf bei 80 °C für 20 min in einem Autoklaven, um mikrobielle Kontaminationen zu minimieren.
HINWEIS: Vermeiden Sie eine Erwärmung auf über 80 ° C, da dies die organischen Bodennährstoffe beeinträchtigen kann. - Füllen Sie Töpfe mit der Erde-Sand-Mischung und geben Sie sie in Schalen. Fügen Sie Wasser in die Schalen etwa 1/3 der Höhe eines Topfes hinzu, so dass das Erde-Sand-Gemisch gründlich mit Wasser getränkt wird. Besprühen Sie das Substrat zusätzlich mit einer Sprühflasche, um nasse Startbedingungen zu gewährleisten.
- Säen Sie 3-4 Samen in jedem Topf (Abbildung 1C) und stellen Sie sicher, dass die Samen genügend Abstand voneinander haben. Halten Sie sie für 3 Tage in der Dunkelheit bei 4 ° C für die Schichtung, um die Keimung zu synchronisieren.
HINWEIS: Einen Pflanzenüberschuss vorkultivieren, der eine Auswahl von Pflanzen ähnlicher Größe für die Impfexperimente ermöglicht und Abweichungen aufgrund individueller Unterschiede reduziert. - Lassen Sie die Sämlinge unter langen Tagesbedingungen (16 h Licht / 8 h Dunkelheit; konstante Temperatur von 22 °C; 60% Luftfeuchtigkeit) bei regelmäßiger Bewässerung wachsen.
- Befolgen Sie das empfohlene Alter der Pflanzen für die Impfung: 21 Tage für Arabidopsis, 7 Tage für Raps und 10 Tage für Tomaten. Pflücken Sie Pflanzen ähnlicher Größe, um die "Wurzeldip-Impfung" durchzuführen15,17,23,24. Nehmen Sie den Boden aus den Töpfen und graben Sie vorsichtig die Wurzeln aus.
- Waschen Sie vorsichtig nur die Wurzeln in einem Wasserbehälter und halten Sie die Rosetten aus dem Wasser. Die gewaschenen Wurzeln 60 min in einer Petrischale mit der Sporenlösung Verticillium (empfohlene Konzentration: 2 x 106 Sporen/ml) inkubieren. Für die nicht infizierte Kontrollgruppe die Wurzeln für 60 min in der Scheinlösung ohne Sporen (keimfreies 1/4 MS-Medium) inkubieren.
- Bereiten Sie neue Töpfe mit feuchter, dampfsterilisierter Erde (80 °C für 20 min) ohne Sand vor. Verwenden Sie eine Pipettenspitze, um in jedem Topf ein Loch in der Mitte des Bodens zu machen.
- Legen Sie die Wurzeln direkt in das Loch (Transfer nur eine Pflanze pro Topf). Nachdem Sie die Wurzeln eingefügt haben, stellen Sie sicher, dass Sie die Löcher vorsichtig mit Erde auffüllen. Vermeiden Sie es, den Boden zu drücken, da sonst das Umtopfen Stresssymptome wie violette Blätter verursachen kann.
- Kultivieren Sie infizierte und kontrollieren Sie Gruppen unter Langzeitbedingungen (16 h Licht / 8 h Dunkelheit; eine konstante Temperatur von 22 ° C; 60% Luftfeuchtigkeit) mit regelmäßiger Bewässerung.
- Führen Sie die Analysen je nach Forschungsfrage zu den bevorzugten Zeitpunkten nach der Inokulation durch (die hier verwendeten genauen Zeitpunkte finden Sie in den Abbildungslegenden). Im Folgenden finden Sie einige Vorschläge.
- Machen Sie Fotos von den Pflanzen mit einer Digitalkamera von oben und halten Sie den Abstand für jedes Foto gleich. Quantifizieren Sie die Blattfläche (z. B. mit ImageJ22 oder BlattFlaeche17,19; verwenden Sie den Durchmesser der Töpfe, um die Skala einzustellen) und vergleichen Sie infizierte und Kontrollgruppen. Kategorisieren Sie die Entwicklung von Krankheitssymptomen (z. B. kleinere, gelblichere oder nekrotische Blätter)13.
HINWEIS: Das Entfernen von Stängeln von Arabidopsis erleichtert das Fotografieren der Rosetten. - Entfernen Sie die Wurzeln und definieren Sie die Biomasse (Frischgewicht) von Trieben aus infizierten und kontrollieren Sie Proben durch Wiegen. Bestimmen Sie das relative Frischgewicht19.
- Alternativ können Sie die Pflanzenhöhe messen oder Pilzauswuchs aus Stammsegmenten kategorisieren, um die Schwere der Erkrankung zu bewerten13.
- Sammeln Sie Proben für molekulare Analysen wie folgt.
- Arabidopsis: Entfernen Sie die Stängel. Schneiden Sie die Rosetten an der Wurzelkrone ab. Kombinieren Sie 4-5 Rosetten aus verschiedenen Pflanzen zu einer Probe. Das Blattmaterial in flüssigem Stickstoff einfrieren.
HINWEIS: Bei Wurzeln ist es schwierig, sie ausreichend vom Boden zu reinigen, ohne die Genexpression durch Waschen neu zu programmieren. - Raps/Tomate: Schneiden Sie Stielsegmente aus dem Hypokotyl (z. B. 1 cm lang; immer die gleiche Stammregion nehmen). Kombinieren Sie Material aus 4-5 Pflanzen zu einer Probe und frieren Sie es in flüssigem Stickstoff ein.
- Mahlen Sie die Proben in flüssigem Stickstoff. Extrahieren Sie die Gesamt-DNA aus 100 mg Blatt- oder Stammmaterial, um mittels qPCR die Menge an Pilz-DNA im Verhältnis zur Pflanzen-DNA zu bestimmen (siehe19).
- Mahlen Sie die Proben in flüssigem Stickstoff, nehmen Sie 100 mg Pflanzenmaterial und extrahieren Sie die gesamte RNA. Führen Sie die qRT-PCR durch, um die Expression von Pflanzengenen (oder Pilzgenen) bei Befall zu bestimmen (siehe19).
- Machen Sie Fotos von den Pflanzen mit einer Digitalkamera von oben und halten Sie den Abstand für jedes Foto gleich. Quantifizieren Sie die Blattfläche (z. B. mit ImageJ22 oder BlattFlaeche17,19; verwenden Sie den Durchmesser der Töpfe, um die Skala einzustellen) und vergleichen Sie infizierte und Kontrollgruppen. Kategorisieren Sie die Entwicklung von Krankheitssymptomen (z. B. kleinere, gelblichere oder nekrotische Blätter)13.
7. Analyse der Daten
- Berechnen Sie den Durchschnitt und die Standardabweichung (± SD) basierend auf den biologischen Replikaten.
- Berechnen Sie die relativen Werte, indem Sie alle Ergebnisse der infizierten Gruppe durch das Ergebnis der Kontrolle dividieren. Zeigen Sie den Durchschnitt z. B. als "relativ zum Mock" oder "relativ zum Wildtyp" an.
- Bestimmen Sie die statistische Signifikanz zwischen Gruppen.
Abbildung 1: Zusammenstellung der drei Impfsysteme und einzelne Schritte in den Protokollen. Diese Abbildungen veranschaulichen die Systeme mit der Modellpflanze Arabidopsis thaliana. Bei anderen Pflanzenarten muss der Zeitpunkt angepasst werden. Orangefarbene Kästchen heben hervor, für welche Folgeanalysen mit dem jeweiligen System am meisten empfohlen werden. (A) Für das Impfsystem in Petrischalen17 das Medium gießen und verfestigen lassen. Bewahren Sie die Teller über Nacht im Kühlschrank auf. Schneiden und entfernen Sie dann das obere Drittel sowie den Infektionskanal (IC) mit einem Skalpell (weiße Bereiche in der Abbildung wurden vom Agar entfernt, während bläuliche Bereiche den Agar darstellen). Legen Sie die Samen auf die Schnittfläche und schließen Sie die Petrischale. Nach der Schichtung die Platten vertikal platzieren und die Pflanzen wachsen lassen. Sobald die meisten Wurzeln den Infektionskanal erreicht haben, fügen Sie die Sporenlösung mit einer Pipette direkt in den Kanal hinzu. Stellen Sie sicher, dass die Lösung gleichmäßig verteilt ist. Schließen Sie die Petrischalen und inkubieren Sie sie vertikal in einer Wachstumskammer. Ansätze, die folgen können, sind die Expressionsanalyse mit quantitativer Reverse-Transkriptions-PCR (qRT-PCR), Mikroskopie mit Reporterlinien und Quantifizierung mikrobieller DNA. (B) Für das Impfsystem in Plastikbechern19 gießen Sie das Medium und übertragen Sie die trennende Kunststoffschicht mit den vorgefertigten Löchern (vier kleine Löcher in den Ecken zum Platzieren der Samen und ein großes Loch in der Mitte für den Infektionskanal). Lassen Sie das Medium erstarren. Schneiden und entfernen Sie das Agarmedium im mittleren Loch mit einem Skalpell, um den Infektionskanal (IC) zu erhalten. Kratzen Sie das Medium in die kleineren Löcher und übertragen Sie die Samen. Schließen Sie den Becher mit einem umgekehrten Becher und verschließen Sie ihn mit luftdurchlässigem Klebeband (gelb symbolisiert). Lass die Pflanzen wachsen. Zur Impfung die Sporenlösung mit einer Pipette direkt in den Infektionskanal geben. Schließen Sie das System und setzen Sie die Kultivierung in der Wachstumskammer fort. Ansätze, die folgen können, sind die Expressionsanalyse mit qRT-PCR, die Quantifizierung mikrobieller DNA und die Bestimmung des Frischgewichts, der Blattfläche oder anderer Krankheitsmerkmale. (C) "Wurzeldip-Impfung"15,17,23,24: Für das bodenbasierte Impfsystem die Töpfe mit einem Erde-Sand-Gemisch füllen. Übertragen Sie die Samen und lassen Sie die Sämlinge wachsen. Graben Sie Pflanzen ähnlicher Größe aus und waschen Sie die Wurzeln in Wasser. Legen Sie die gewaschenen Wurzeln in eine Petrischale, die die Lösung mit den Sporen hält. Legen Sie nach der Inkubation einzelne Pflanzen in Töpfe mit Erde ein. Ansätze, die folgen können, sind die Expressionsanalyse in Blättern mit qRT-PCR, die Quantifizierung der mikrobiellen DNA und die Bestimmung des Frischgewichts, der Blattfläche oder anderer Krankheitsmerkmale. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Representative Results
Nach dem Protokoll wurden die Pflanzen kultiviert und mit V. longisporum (Stamm Vl4325) oder V. dahliae (Isolat JR218) beimpft. Verschiedene Szenarien wurden entwickelt, um die Wirksamkeit zu beweisen und einige Fähigkeiten der gegebenen Protokolle hervorzuheben. Repräsentative Ergebnisse werden gezeigt.
Die expressionale Induktion von Genen, die an der antimikrobiellen Indol-Glucosinolat-Biosynthese (IG) beteiligt sind, ist ein zuverlässiger Indikator für die Beurteilung einer Verticillium-Infektion 17,19,26. In Arabidopsis ist MYB51 (MYB-Domänenprotein 51; AT1G18570) kodiert für einen Transkriptionsfaktor, der an der Aktivierung von Genen beteiligt ist, die für die IG-Biosynthese notwendig sind27. MYB51 kann als Markergen dienen, das auf einen erfolgreichen Befall hinweist, da es in den Wurzeln konsequent durch V. longisporum 26 oder andere bodenbürtige Pilze wie Phytophthora parasitica26 und Fusarium oxysporum21 induziert wird. Zwei Tage nach der Inokulation (2 dpi) im Petrischalen-basierten System wurde die Induktion von MYB51 in den Wurzeln der Arabidopsis visualisiert. Die Reporter-Pflanzenlinie PromMYB51::YFP 21 zeigte eine Promotoraktivierung und eine qRT-PCR-Analyse bestätigte eine signifikante transkriptionelle Induktion dieses Gens (Abbildung 2A-B). Solche Experimente zielen darauf ab, expressionale Veränderungen in den Wurzeln während der Infektion zu bestimmen.
Da die in dieser Studie verwendeten Verticillium-Arten einen vaskulären Lebensstil führen und sich von der Wurzel über die Xylemgefäße zum Spross ausbreiten, kann die Menge an Pilz-DNA in Blättern als Parameter für den Grad der Pilzvermehrung bestimmt werden. Arabidopsis wurde im In-vitro-System in Plastikbechern mit der Wurzel geimpft und die Rosetten wurden 12 Tage später geerntet. Im Vergleich zu dem in der Scheinkontrolle nachgewiesenen Hintergrundwert wurden erhebliche Mengen an Pilz-DNA in Blättern infizierter Pflanzen gefunden (Abbildung 2C). Dies zeigt, dass die Infektion erfolgreich fortgeschritten ist. Für weitere Untersuchungen kann die Menge an Pilz-DNA in verschiedenen Pflanzengenotypen quantifiziert werden, um Einblicke in die Wurzelabwehrreaktionen zu erhalten. Zusätzlich wurden zu diesem Zeitpunkt Wurzeln gesammelt, um die Induktion des Markergens mittels qRT-PCR zu testen. Die MYB51-Transkripthäufigkeit wurde signifikant angereichert (Abbildung 2D). Dies zeigt, dass Empfindlichkeitstests und Expressionalanalysen problemlos parallel zum Bechersystem durchgeführt werden können, was den großen Vorteil dieses Verfahrens unterstreicht.
Um Hinweise darauf zu geben, dass auch andere Modellpflanzenarten eingeführt werden können, wurde Raps mit V. longisporum und Tomaten mit V. dahliae im System in Plastikbechern infiziert. Am Tag 12 nach der Impfung an den Wurzeln wurde die Menge an Pilz-DNA in Stammsegmenten quantifiziert, die an der Basis der Sämlinge geschnitten wurden (Abbildung 2E-F). Pilz-DNA war in beiden Pflanzenarten nachweisbar, was auf die Vermehrung der Krankheitserreger innerhalb der Pflanze hinweist. Auch hier konnten verschiedene Pflanzengenotypen getestet werden, um Erkenntnisse über Abwehrmechanismen zu gewinnen.
Wenn sich die Wurzelbesiedelungsmikrobe von Interesse nicht von den Wurzeln zu den Blättern ausbreitet, ist es nicht möglich, die Menge an mikrobieller DNA in Blättern als Parameter für die Schwere der Erkrankung zu quantifizieren. Eine weitere Möglichkeit, die Schwere der Erkrankung zu messen, ist die Beurteilung und Extrapolation der Symptome am Pfad. Um dies zu veranschaulichen, wurde Arabidopsis im bodenbasierten System mit V. dahliae beimpft und die Grünblattfläche ausgewertet (Abbildung 2G-H). Während die Rosetten von Mock-behandelten Pflanzen gesund und grün aussahen, hatten pathogen-infizierte Pflanzen eine reduzierte Blattgröße und gelbliche oder sogar nekrotische Blätter. Auf diese Weise kann die Anfälligkeit verschiedener Pflanzengenotypen analysiert und bestätigt werden, beispielsweise durch die Quantifizierung des Frischgewichts.
Abbildung 2: Repräsentative Ergebnisse, die durch die Einhaltung der Protokolle erzielt wurden. (A,B) Arabidopsis-Wurzeln wurden mit V. longisporum im Petrischalensystem beimpft. Die Reporterlinie Prom MYB51::YFP 21 ergab eine starke Aktivierung des MYB51-Promotors in infizierten Wurzeln im Vergleich zur Scheinkontrolle (Mikroskopie bei 2 dpi; Skalenbalken: 50 μm). Die transkriptionelle Induktion von MYB51 in Wildtypwurzeln (WT) wurde mit einer qRT-PCR-Analyse (2 dpi) weiter bestätigt. Die Werte infizierter Proben werden relativ zu Scheinproben angegeben (auf 1 gesetzt) (n = 5; ± SD). (C) Systemische Besiedlung durch V. longisporum: Nach der Impfung von Arabidopsis-Wurzeln im Bechersystem wurde die relative Menge an Pilz-DNA in Blättern durch quantitative PCR (qPCR; 12 dpi) bestimmt. Werte infizierter Stichproben werden relativ zum Hintergrundpegel in Mock-Samples angegeben (auf 1 gesetzt) (n = 3; ± SD). (D) V. longisporum infizierte und mit Mock behandelte Wurzeln wurden aus dem Bechersystem geerntet und eine qRT-PCR-Analyse durchgeführt. Die Werte infizierter Proben werden relativ zu Scheinproben angegeben (auf 1 gesetzt) (n = 3; ± SD). Es wurde festgestellt, dass MYB51 transkriptionell induziert ist (12 dpi). (E) Raps wurde im Bechersystem mit V. longisporum geimpft, und die relative Menge an Pilz-DNA wurde durch qPCR in Stammsegmenten (12 dpi) quantifiziert. Die Werte infizierter Stichproben werden relativ zum Hintergrundniveau in Mock-Stichproben angegeben (auf 1 gesetzt) (n = 3; ± SD). (F) Die Tomate wurde im Bechersystem mit V. dahliae geimpft und die relative Menge an Pilz-DNA wurde durch qPCR in Stammsegmenten (12 dpi) quantifiziert. Werte infizierter Stichproben werden relativ zum Hintergrundniveau in Mock-Samples angegeben (auf 1 gesetzt) (n = 5; ± SD). (G,H) Arabidopsis wurde mit V. dahliae im bodenbasierten System beimpft und repräsentative Bilder von infizierten und simulierten Pflanzen werden gezeigt (21 dpi). Der grüne Blattbereich wurde untersucht. Relativ zu Mock (auf 1 gesetzt) hatten infizierte Pflanzen weniger grüne Blattfläche (n = 5; ± SD). (B-F,H) Für Primerpaare siehe19; Statistik: T-Test des Schülers relativ zum Mock, * p≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Aufgrund der enormen Ertragseinbußen durch bodenbürtigePhytopathogene 1 ist eine Verbesserung der Anbaustrategien oder Nutzpflanzensorten erforderlich. Der begrenzte Einblick in die Pathogenese bodenbürtigerer Krankheiten behindert die Entwicklung resistenterer Pflanzen. Es müssen die zugrunde liegenden Pathomechanismen erforscht werden, für die eine robuste methodische Plattform erforderlich ist. Berichtete Impfverfahren haben gezeigt, dass multifaktorielle Ereignisse in Wurzel-Mikroben-Interaktionen durch die Kombination verschiedener Systeme gut seziert werden können19. Die oben beschriebenen Protokolle sollen sowohl Experten als auch Forschern, die auf diesem Gebiet neu sind, einen routinemäßigen Workflow bieten. Die Handhabung ist unkompliziert, ermöglicht eine unabhängige Replikation und die erforderliche technische Ausrüstung ist in Standardlaboratorien für Anlagenwissenschaften vorhanden.
Frühe Verticillium-Infektionsereignisse (Stunden nach der Impfung auf 6 dpi) können im Petrischalensystem, späte Ereignisse (>21 dpi) im bodenbasierten System und im Bechersystem zeitlich dazwischen (4 bis 21 dpi) untersucht werden. Nach Zugabe der Sporen zum Infektionskanal des Petrischalensystems stehen sie in direktem Kontakt mit den Wurzeln. Dies ermöglicht die Untersuchung frühzeitiger Verteidigungsreaktionen. Wie am Beispiel der MYB51-Induktion veranschaulicht, können expressionale Veränderungen leicht mit Genreporterkonstrukten, qRT-PCR oder sogar genomweiten "-omics" -Ansätzenuntersucht werden 17,26. Im Vergleich zu den beiden anderen Infektionssystemen sind die Abwehrreaktionen in den Petrischalen kräftiger. Aufgrund ihrer geringen Größe in den Petrischalen werden die Pflänzchen schnell vom Pilz überwuchert und die Intensität der Abwehrreaktionen kann in solchen Assays eher unnatürlich sein19. Expressionale Veränderungen können auch in den Wurzeln des Plastikbechersystems untersucht werden, was zu Ergebnissen führt, die mit dem Petrischalensystem vergleichbar sind, wenn auch mit niedrigeren Induktionswerten für Markergene. Im Versuchsaufbau in Tassen steht das Inokulum nicht in unmittelbarem Kontakt mit den Wurzeln, die Sporen müssen keimen und der Erreger muss durch das Medium zu den Wurzeln wachsen. Das Fortschreiten der Infektion ist im Vergleich zum Petrischalensystem langsamer und daher näher an den natürlichen Bedingungen. Bei den Wurzeln hat das bodenbasierte System eher einen Nachteil, da sie für die Analyse ausreichend aus dem Boden geräumt werden müssen, ohne die Genexpression durch Waschen neu zu programmieren. Daher ist das Studium der expressionalen Veränderungen in den Wurzeln im Boden komplizierter. Es ist jedoch möglich, in Blättern zu testen, ob der Wurzelbefall dort Reaktionen auslöst.
In beiden In-vitro-Impfsystemen (Petrischalen und Plastikbecher) können externe Kontaminationen verhindert werden, solange jeder Schritt unter der Laminar-Flow-Haube mit sterilen Geräten ausgeführt wird. So können bilaterale Wechselwirkungen ungestört untersucht werden. Umgekehrt ist das bodenbasierte System nur "halbsteril", da die Pflanzen in der Wachstumskammer nicht hermetisch isoliert sind. Dennoch kann es als dasjenige angesehen werden, das den natürlichen Bedingungen am nächsten kommt, da Pflanzen im Boden wachsen. Wurzeln werden jedoch im bodenbasierten System durch die Aufwurzelung geschädigt, die mikrobiellen Zugang zu den Geweben bietet. Obwohl dies ein wenig künstlich sein könnte, könnte dies natürliche Bedingungen nachahmen, die Wurzeln verletzen, wie z.B. Nematodenfütterung28.
Das Petrischalensystem eignet sich gut, um die Dynamik der Krankheitserregerausbreitung mit fluoreszierend markierten Stämmen (z.B. V. longisporum Stamm Vl-sGFP 9) sichtbar zu machen. Wurzelphänotypen, die aus der Besiedlung resultieren, sind gut beobachtbar. Auf der anderen Seite ist eine Quantifizierung von Krankheitssymptomen an Blättern/Trieben in Petrischalen kaum realisierbar, da das System recht klein ist. Darüber hinaus könnte es nicht genug Platz für Pflanzenarten geben, die größer als Arabidopsis sind. Alternativ etablierten Behrens et al.29 ein Infektionssystem auf Rapsplatten, bei dem eine Bürste in eine Sporensuspension getaucht und verwendet wird, um das Inokulum entlang der auf Agar wachsenden Wurzeln zu verteilen. Zur Beurteilung der Symptome sind die becher- und bodenbasierten Systeme sicherlich vorzuziehen. Hier kann die Entwicklung von Symptomen (z.B. verkleinerte Blattfläche, Frischgewichtsverlust, verminderte Pflanzenhöhe, Ausmaß des nekrotischen Gewebes) an Blättern/Trieben beurteilt werden. Die Untersuchung größerer Pflanzenarten wie Raps und Tomaten ist in den becher- und bodenbasierten Systemen kein Problem, wie die repräsentativen Ergebnisse zeigen. Wenn sich die zu untersuchende bodenbürtige Mikrobe von Wurzel zu Spross ausbreitet, kann pathogenspezifische DNA relativ zur Pflanzen-DNA im Trieb- / Blattgewebe PCR-amplifiziert werden. Dies kann als Marker für die Durchführung von Pathogenitätstests mit verschiedenen Pflanzengenotypen13,19 dienen und ist ein Vorteil, wenn vaskuläre Erreger wie Verticillium als Modell verwendet werden. Umgekehrt können verschiedene Genotypen von Krankheitserregern angewendet werden, um Virulenzgene zu identifizieren, die für eine erfolgreiche Kolonisation notwendig sind.
In allen Fällen hängt das beste Timing für Analysen von Genotyp, Pflanzenart und Mikrobe ab. Der kritischste Schritt besteht darin, den besten Zeitpunkt für jede Forschungsfrage durch vorläufige Tests zu definieren. Darüber hinaus sollten bei der Verwendung anderer Mikroben als Verticillium zunächst ausreichende Konzentrationen für die Impfung ermittelt werden.
Neben den bereits erwähnten Möglichkeiten bietet das Bechersystem das Potenzial, es für Screenings von Agrochemikalien zu erweitern, die angewendet werden könnten, um die Besiedlung mit bestimmten parasitären Mikroben zu begrenzen. Der Einfluss biozider Chemikalien auf die mikrobielle Besiedlung von Pflanzen könnte durch Zugabe der mutmaßlichen antimikrobiellen Verbindung direkt in das Agarmedium vor (oder während) der Impfung und der Überwachung der Symptomentwicklung am Wirt getestet werden. Dies kann die Durchführung von Screenings erleichtern, um die Entdeckung neuartiger Behandlungen gegen durch den Boden übertragene Krankheiten zu beschleunigen.
Obwohl mehrere Mitglieder des Bodenmikrobioms pathogen sind, ist die überwiegende Mehrheit neutral oder sogar vorteilhaft für das Pflanzenwachstum1. Es besteht die Möglichkeit, die Protokolle zu verwenden, um Pflanzen mit nützlichen Mikroorganismen zu impfen. Zuvor wurden S. indica-Sporen im Petrischalensystem hinzugefügt, um die nachfolgenden Reaktionen in Wurzeln26 zu untersuchen. Dies erweitert das Spektrum der erklärten Infektionssysteme, um nicht nur pathogene, sondern auch vorteilhafte Wechselwirkungen zu untersuchen.
Da bekannt ist, dass sich Mikroben in der Rhizosphäre gegenseitigbeeinflussen 6, kann dies durch eine parallele Impfung mit verschiedenen mikrobiellen Spezies (oder Behandlung der Pflanzen zuerst mit einer und später mit einer anderen) simuliert werden. Dies ermöglicht Co-, Triple- oder sogar Multi-Kultur-Modelle. Eine fortgeschrittenere Erweiterung auf adäquate synthetische Gemeinschaften (SynComs, Sammlungen von Mikroorganismen) ist denkbar, da dies hilft, die Einflüsse komplexer mikrobieller Zusammensetzungenzu verstehen 30.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Impfsysteme mehrere Kombinationen für nachfolgende Analysen ermöglichen und eine Reihe von Anwendungen unterstützen. Diese Sammlung von Methoden ist weitgehend auf verschiedene wurzelbesiedelnde Mikroben (sowohl nützliche als auch pathogene) anwendbar und bietet eine robuste Plattform für die Analyse von Wurzel-Mikroben-Interaktionen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Die Autoren danken Tim Iven und Jaqueline Komorek für ihre bisherigen Arbeiten zu diesen Methoden, der Gruppe von Wolfgang Dröge-Laser (Institut für Pharmazeutische Biologie, Universität Würzburg) für die Bereitstellung der Ausrüstung und der Ressourcen, die für diese Arbeit benötigt werden, und Wolfgang Dröge-Laser sowie Philipp Kreisz (beide Universität Würzburg) für das kritische Korrekturlesen des Manuskripts. Diese Studie wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG, DR273/15-1,2) gefördert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar (Gelrite) | Carl Roth | Nr. 0039 | all systems described require Gelrite |
| Arabidopsis thaliana wild-type | NASC stock | Col-0 (N1092) | |
| Autoclave | Systec | VE-100 | |
| BlattFlaeche | Datinf GmbH | BlattFlaeche | software to determine leaf areas |
| Brassica napus wild-type | see Floerl et al., 2008 | rapid-cycling rape | genome ACaacc |
| Cefotaxime sodium | Duchefa | C0111 | |
| Chicanery flask 500 mL | Duran Group / neoLab | E-1090 | Erlenmeyer flask with four baffles |
| Collection tubes 50 mL | Sarstedt | 62.547.254 | 114 x 28 mm |
| Czapek Dextrose Broth medium | Duchefa | C1714 | |
| Digital camera | Nikon | D3100 18-55 VR | |
| Exsiccator (Desiccator ) | Duran Group | 200 DN, 5.8 L | Seal with lid to hold chlorine gas |
| Fluorescence Microscope | Leica | Leica TCS SP5 II | |
| HCl | Carl Roth | P074.3 | |
| KNO3 | Carl Roth | P021.1 | ≥ 99 % |
| KOH | Carl Roth | 6751 | |
| Leukopor | BSN medical GmbH | 2454-00 AP | non-woven tape 2.5 cm x 9.2 m |
| MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) | Carl Roth | 4256.2 | Pufferan ≥ 99 % |
| MgSO4 | Carl Roth | T888.1 | Magnesiumsulfate-Heptahydrate |
| Murashige & Skoog medium (MS) | Duchefa | M0222 | MS including vitamins |
| NaClO | Carl Roth | 9062.1 | |
| Percival growth chambers | CLF Plant Climatics GmbH | AR-66L2 | |
| Petri-dishes | Sarstedt | 82.1473.001 | size ØxH: 92 × 16 mm |
| Plastic cups (500 mL, transparent) | Pro-pac, salad boxx | 5070 | size: 108 × 81 × 102 mm |
| Pleated cellulose filter | Hartenstein | FF12 | particle retention level 8–12 μm |
| poly klima growth chamber | poly klima GmbH | PK 520 WLED | |
| Potato Dextrose Broth medium | SIGMA Aldrich | P6685 | for microbiology |
| Pots | Pöppelmann GmbH | TO 7 D or TO 9,5 D | Ø 7 cm resp. Ø 9.5 cm |
| PromMYB51::YFP | see Poncini et al., 2017 | MYB51 reporter line | YFP (i.e. 3xmVenus with NLS) |
| Reaction tubes 2 mL | Sarstedt | 72.695.400 | PCR Performance tested |
| Rotary (orbital) shaker | Edmund Bühler | SM 30 C control | |
| Sand (bird sand) | Pet Bistro, Müller Holding | 786157 | |
| Soil | Einheitserde spezial | SP Pikier (SP ED 63 P) | |
| Solanum lycopersicum wild-type | see Chavarro-Carrero et al., 2021 | Type: Moneymaker | |
| Thoma cell counting chamber | Marienfeld | 642710 | depth 0.020 mm; 0.0025 mm2 |
| Ultrapure water (Milli-Q purified water) | MERK | IQ 7003/7005 | water obtained after purification |
| Verticillium dahliae | see Reusche et al., 2014 | isolate JR2 | |
| Verticillium longisporum | Zeise and von Tiedemann, 2002 | strain Vl43 |
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