Summary
该协议详细介绍了用土壤微生物接种植物根部的策略。以真菌黄霉菌和大丽黄萎病为例，描述了三种不同的根部感染系统。重点介绍潜在应用和可能的下游分析，并讨论每个系统的优缺点。
Abstract
根际拥有高度复杂的微生物群落，其中植物根系不断受到挑战。根系与各种各样的微生物密切接触，但对土壤相互作用的研究仍然落后于对地上器官进行的研究。虽然文献中描述了一些用模型根病原体感染模型植物的接种策略，但仍然难以获得全面的方法学概述。为了解决这个问题，精确描述了三种不同的根接种系统，可以应用于深入了解根 - 微生物相互作用的生物学。为了说明， 黄萎病 菌种（即 长孢子虫 和 大丽弧菌）被用作根入侵模型病原体。然而，这些方法可以很容易地适应其他根定植微生物 - 包括致病性和有益性。通过在植物木质部定殖，维管束土生真菌（如 黄萎病 属）表现出独特的生活方式。根系侵袭后，它们 通过 木质部血管向肢扩散，到达芽部，并引起疾病症状。选择三种代表性植物物种作为模型宿主： 拟南芥，经济上重要的油菜（Brassica napus）和番茄（Solanum lycopersicum）。给出了分步实验方案。显示了致病性测定的代表性结果，标记基因的转录分析以及报告基因构建的独立确认。此外，还彻底讨论了每种接种系统的优缺点。这些经过验证的协议可以帮助为根 - 微生物相互作用的研究问题提供方法。了解植物如何应对土壤中的微生物对于制定改善农业的新策略至关重要。
Introduction
天然土壤中栖息着数量惊人的微生物，这些微生物可能是中性的，有害的或对植物有益的1。许多植物病原体是土壤传播的，围绕着根部，并攻击地下器官。这些微生物属于各种各样的分支：真菌，卵菌，细菌，线虫，昆虫和一些病毒1，2。一旦环境条件有利于感染，易感植物就会患病，作物产量就会下降。气候变化的影响，如全球变暖和极端天气，将增加土壤传播植物病原体的比例3.因此，研究这些破坏性微生物及其对粮食和饲料生产的影响，以及对自然生态系统的影响将变得越来越重要。此外，土壤中存在与根系紧密相互作用并促进植物生长，发育和免疫力的微生物互助剂。当面对病原体时，植物可以积极地在根际中招募特定的对手，这些对手可以通过抑制病原体来支持宿主的生存4，5，6，7。然而，参与有益根 - 微生物相互作用的机制细节和途径通常仍然是未知的6。
因此，必须扩大对根 - 微生物相互作用的一般理解。用土壤微生物接种根系的可靠方法对于进行模型研究并将研究结果转移到农业应用中是必要的。例如，研究了土壤中的有益相互作用，例如，与Serendipita indica（以前称为Piriformospora indica），固氮根茎属或菌根真菌，而已知的土生植物病原体包括Ralstonia solanacearum，Phytophthora spp.，Fusarium spp.和Verticillium spp.1。后两者是真菌属，分布全球，可引起血管疾病2。黄萎病属（子囊菌）可以感染数百种植物物种 - 主要是双子叶植物，包括草本一年生植物，木本多年生植物和许多作物植物2，8。黄萎病菌丝进入根部，并在细胞间和细胞内向中央圆柱体生长以定植木质部血管2，9。在这些容器中，真菌在其大部分生命周期中保持存在。由于木质部汁液营养贫乏，并且携带植物防御化合物，真菌必须适应这种独特的环境。这是通过分泌与定植相关的蛋白质来实现的，这些蛋白质使病原体能够在其宿主10，11中存活。到达根脉管系统后，真菌可以在木质部血管内向半向扩散到叶子，这导致宿主9，12的全身定植。在这一点上，植物在生长中受到负面影响9，10，13。例如，发育迟缓和黄叶以及过早衰老13，14，15，16。
该属的一个成员是Verticillium longisporum，它高度适应芸苔属宿主，例如农学上重要的油菜，花椰菜和模型植物拟南芥12。几项研究结合了V. longisporum和A. thaliana，以获得对土壤传播的血管疾病和由此产生的根系防御反应13，15，16，17的广泛见解。通过使用长孢弧菌/拟南芥杆菌模型系统可以实现直接的药敏性测试，并且两种生物体都可以获得完善的遗传资源。与长孢子虫密切相关的是病原体大丽黄萎病菌。虽然两种真菌在血管生活方式和侵袭过程中表现相似，但它们从根到叶的繁殖效率和拟南芥引发的疾病症状是不同的：虽然长孢子虫通常诱导早期衰老，但大丽弧菌感染导致枯萎18。最近，一个方法学摘要提出了用长孢子虫或大丽弧菌感染拟南芥的不同根接种策略，有助于规划实验设置19。在田间，长孢子虫偶尔会对油菜生产12造成重大损害，而大丽弧菌的宿主范围非常广泛，包括几种栽培物种，如葡萄藤、马铃薯和番茄8。这使得这两种病原体在经济上都很有趣。
因此，以下方案使用 长孢子虫 和 大丽弧菌 作为根部病原体的模型，以举例说明根部接种的可能方法。拟南芥（拟南芥），油菜（Brassica napus）和番茄（Solanum lycopersicum）被选为模型宿主。有关这些方法的详细说明，请参阅下面的文本和随附的视频。讨论了每种接种系统的优缺点。总而言之，该协议收集可以帮助确定根 - 微生物相互作用背景下特定研究问题的合适方法。
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Protocol
1. 真菌培养基和植物接种系统
- 液体马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）：在热稳定的烧瓶中用超纯水制备21克/ L PDB。
- 液体恰佩克葡萄糖肉汤（CDB）：在热稳定的烧瓶中用超纯水制备42克/ L CDB。
- 培养皿接种系统的培养基：在超纯水中制备具有1.5 g / L Murashige和Skoog培养基（MS）以及8 g / L琼脂的热稳定烧瓶。
注意：避免在这种培养基中含糖，因为它会导致接种后真菌过度生长。 - 用于基于塑料杯的接种系统的培养基：在超纯水中制备具有4.4 g / L MS，0.2 g / L MgSO4，1 g / L KNO3，0.5 g / L 2-（N-吗啉基）乙烷磺酸（MES）和6.0 g / L琼脂的热稳定烧瓶，并用5 M KOH调节pH值至5.7。
注意：避免在这种培养基中含糖，因为它会导致接种后真菌过度生长。 - 1/4 MS 培养基：在超纯水中制备 1.2 g/L MS。
- 使用高压灭菌器对上述所有溶液进行灭菌。将玻璃烧瓶放入篮中，关闭盖子并在121°C和98.9 kPa下灭菌15分钟。
2.对植物种子表面进行杀菌
注意：在播种前，始终使用以下方案对拟南芥，油菜和番茄的种子表面进行灭菌。
- 将种子转移到2 mL反应管中。将管子放在内部容量为5.8 L的激化器中。
- 通过将6 mL 33%盐酸（HCl）加入100 mL的12%次氯酸钠（NaClO）水溶液中，在清除器中产生氯气。
- 立即关闭执行器的盖子，并将种子在气体中孵育3小时。
3.用黄 萎孢 子（无性分生孢子）制备接种物
注意：以与长孢菌（菌株Vl43）17，18，19相同的方式培养大丽弧菌（菌株JR2）。确保所有设备和培养基无菌，并且所有步骤都在层流罩中执行，以保持接种物的轴性。
- 在500 mL烧瓶中填充150 mL液体PDB（步骤1.1），并用500mg / L头孢噻肟补充培养基。
- 将甘油储备中的黄萎 病菌 添加到PDB培养基中。用无菌泡沫塞关闭烧瓶。
- 在室温（RT）下，在连续水平振荡（旋转振荡器;60rpm）下在暗箱中孵育培养物7-10天。这导致小的白色菌丝体球体。
- 小心地取出并丢弃PDB上清液。大多数菌丝体应保留在烧瓶中。
- 在菌瓶中的菌丝体上加入100mL液体CDB（步骤1.2），并用500mg / L头孢噻肟补充培养基。
- 在室温下在暗箱中孵育4-5天，在连续的水平振荡（旋转振荡器，60rpm）下诱导孢子形成。随着分生孢子的释放，上清液会变成黄灰色。
- 通过滤纸（颗粒保留水平为8-12μm）过滤一部分（5-10mL）含分生孢子的液体，进入无菌的50mL收集管中。这将孢子与菌丝体分开。
- 通过使用细胞计数室和显微镜确定孢子浓度。用无菌1/4 MS培养基在超纯水中稀释，直到获得下面给出的孢子浓度。
注意：在显微镜下， 来自V. longisporum 的分生孢子大多是长绘的，大小为7.1-8.8μm，而 V. dahliae 分生孢子较短（3.5-5.5μm），相当球形20。 - 使用这些新鲜收获的分生孢子作为接种物。确保始终使用新鲜收获的分生孢子而不是冷冻库存进行实验，因为冷冻可显着减少活孢子的数量19。
- 对于长期储存，将孢子作为高浓度孢子溶液（约1 x 108 孢子/ mL）在-80°C下在25%甘油中冷冻（可储存长达1年）。对于下一步的实验，使用这些甘油储备在步骤3.2中接种PDB培养基。
4. 基于培养皿的无菌 体外 接种系统
注意：对于培养皿系统17，确保所有设备和培养基均无菌，并且所有步骤都在层流罩中执行。
- 高压灭菌后，将培养基（见步骤1.3）倒入培养皿中。
- 培养基硬化后，将培养皿重新包装在无菌塑料袋中，并将其倒置存放在冰箱（4-10°C）中过夜。冷却的介质有助于防止介质在后续步骤中滑动。
- 用手术刀切除感染通道和凝固培养基的上三分之一（图1A）。切割时避免将液体或空气吸入琼脂介质下方;否则，培养基会滑落并关闭感染通道。
- 在切割的上表面上分配50-100个表面灭菌的拟南芥种子，用无菌移液器尖端。将种子放在切好的琼脂表面接触培养皿壁的角度，以便根部可以在培养基和培养皿壁之间生长。这将有助于以后的接种。
- 关闭培养皿并用透气胶带密封，以便进行气体交换。
- 在4°C的黑暗中分层2天后，将板垂直放置在合适的架子中，并在生长室中以22°C±1°C在长日照条件下（16小时光照/ 8小时黑暗）生长植物。
- 当大部分根部到达感染通道（约9-11天大的幼苗）时，水平放置板，打开它们并加入500μL新鲜收获的分生 孢子 ，浓度为4×105 孢子/ mL直接进入感染通道，确保液体均匀地分布在通道中。
- 同样，通过加入500μL模拟溶液而不是孢子（无菌1/4 MS培养基）来制备对照板。
- 将板水平孵育几分钟，直到液体浸入并且再次垂直设置板时不会泄漏出来。然后，合上盖子并用透气胶带密封板。
- 在生长室中垂直孵育板。或者，用黑色纸盒覆盖根部，使根部和土生真菌变暗（见19）。
- 根据研究问题，在接种后的首选时间点执行分析（请参阅此处使用的确切时间点的图例）。以下是一些建议。
- 从根部切下叶子，分别收获。从培养皿中取出琼脂条，以便轻松取出根部，并用镊子小心地将它们从琼脂中拉出。立即将所有植物材料在液氮中冷冻。
- 在液氮中研磨样品。从100mg叶材料中提取总DNA， 通过 定量PCR（qPCR）测定相对于植物DNA的真菌DNA量（见19）。
- 在液氮中研磨样品。取100毫克植物材料，提取总RNA。进行定量逆转录PCR（qRT-PCR）以确定侵扰期间植物基因（或真菌基因）的表达（见19）。
- 小心地从琼脂上取下根部，避免受伤，并在荧光显微镜下检查它们。
- 确定植物报告基因系中标记基因的诱导（例如，荧光素酶，β-葡萄糖醛酸酶或荧光报告基因17，19，21）。
- 通过使用真菌报告线（例如，组成性表达增强的绿色荧光蛋白 Vl-sGFP9）或染色技术（例如，通过 5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-乙酰基-β-d-氨基葡萄糖苷 （X-β-D-Glc-Nac）18）可视化真菌在根部的繁殖。
- 从根部切下叶子，分别收获。从培养皿中取出琼脂条，以便轻松取出根部，并用镊子小心地将它们从琼脂中拉出。立即将所有植物材料在液氮中冷冻。
5. 用塑料杯组织的无菌 体外 接种系统
注：如该技术的第一描述19所述，确保所有设备和介质均无菌，并且所有步骤均在层流罩中执行。
- 使用总体积为500 mL的透明塑料杯，并在70%-75%乙醇浴中对其进行灭菌至少20分钟。在层流罩中干燥杯子。
- 将高压灭菌的培养基（见步骤1.4）倒入塑料杯中。任选地，将头孢噻肟（终浓度为50mg / L）加入高压灭菌培养基中以防止细菌污染。每杯使用150 mL培养基进行拟南芥实验，或使用更多培养基（每杯250-300 mL）进行较大植物物种（油菜，番茄）的实验。
- 在固化之前，将塑料层（通过在70%-75%乙醇中孵育20分钟之前在培养基中灭菌）放在培养基上（图1B）。
注意：该塑料层在角落处包含四个预制孔，用于放置表面灭菌的种子。这允许种子进入培养基。之后，该分离层可防止叶子接触含真菌的培养基，因此微生物不能直接攻击叶子，必须采取根途径。另一个孔位于中心，可以切断感染通道。 - 当培养基凝固后，用手术刀将琼脂穿过预制的中心孔切至约1.5厘米的深度。取出切好的琼脂以形成一个感染通道，以后可以将真菌孢子添加到其中。
- 用移液器尖端在四个较小的孔中稍微划伤琼脂培养基，以中断凝固的皮肤（这允许种子从含水的琼脂培养基中吸收水分）。使用移液器吸头将种子放入较小的孔中。
- 用第二个倒置塑料杯关闭塑料杯，并用透气胶带密封。胶带必须允许气体交换。
- 在4°C的黑暗中分层3天后，在12小时光照/ 12小时黑暗（拟南芥，油菜）或16小时光照/ 8小时黑暗条件（番茄）下在生长室中在22°C的恒定温度和60%湿度下孵育杯系统。
- 遵循植物接种的建议年龄：拟南芥21天;油菜5-7天;番茄12天。
- 通过在感染通道中加入1mL分生孢子溶液（推荐浓度：4 x 105孢子/ mL）来接种黄萎病菌。为了制备对照样品，将1mL无孢子的模拟溶液（无菌1/4 MS培养基）加入通道中。
- 根据研究问题，在接种后的首选时间点执行分析（请参阅此处使用的确切时间点的图例）。以下是一些建议。
- 用数码相机从上面拍摄植物的照片，保持每张照片的距离相同。量化叶面积（例如，使用 ImageJ22 或 BlattFlaeche17，19;使用杯子的长度来设置规模）并比较感染组和对照组。对疾病症状的发展进行分类（例如，更小、更淡或坏死的叶子）。
注意：如果拟南芥上有任何茎，请将其删除以获得更好的玫瑰花照片。 - 从受感染的芽中去除根部并确定其生物量（鲜重），并通过称重来控制样品。确定相对鲜重19。
- 收集样品进行分子分析，如下所示。
- 拟南芥：如果有的话，请去除茎。从根部切开基部的玫瑰花。确保从样品中排除所有根材料并收获整个玫瑰花序。将来自不同植物的4-5个玫瑰花串混合成一个样品，并将叶材料在液氮中冷冻。
- 用镊子小心地将根部从培养基中拉出，用纸巾按压并轻拍它们以去除琼脂残渣，并将来自不同植物的4-5根根合并成一个样品。立即在液氮中冷冻。
- 油菜/番茄：从下胚轴切下茎段（例如，1厘米长;始终采用相同的茎区域）。将来自4-5个植物的材料混合到每个样品中，并在液氮中冷冻。
- 在液氮中研磨样品。从100mg的叶子或茎材料中提取总DNA， 通过 qPCR确定真菌DNA相对于植物DNA的量（见19）。
- 在液氮中研磨样品，取100mg植物材料并提取总RNA。进行qRT-PCR以确定侵扰时植物基因（或真菌基因）的表达（见19）。
- 用数码相机从上面拍摄植物的照片，保持每张照片的距离相同。量化叶面积（例如，使用 ImageJ22 或 BlattFlaeche17，19;使用杯子的长度来设置规模）并比较感染组和对照组。对疾病症状的发展进行分类（例如，更小、更淡或坏死的叶子）。
6. 基于土壤的盆栽接种系统
- 以3：1（土壤：沙子）的体积比彻底混合土壤和沙子，以方便将基质从根部洗掉。将混合物倒入高压灭菌袋中。如果混合物太干，加入适量的水并将其混合到基材中。在高压灭菌器中以80°C蒸汽20分钟，以尽量减少微生物污染。
注意：避免加热到80°C以上，因为这可能会影响有机土壤养分。 - 用土沙混合物填充花盆，然后将其转移到托盘中。将水加入约锅高1/3的托盘中，使土沙混合物用水彻底浸泡。此外，用喷雾瓶对基材进行喷水，以确保湿启动条件。
- 在每个花盆中播种3-4粒种子（图1C），确保种子彼此之间有足够的距离。将它们在4°C的黑暗中保持3天，以进行分层以同步发芽。
注意：预先培养过量的植物，这样就可以选择相似大小的植物进行接种实验，并减少由于个体差异引起的偏差。 - 让幼苗在长日照条件下生长（16小时光照/ 8小时黑暗;恒温22°C;60%湿度），并定期浇水。
- 遵循植物接种的建议年龄：拟南芥21天，油菜7天，番茄10天。选择大小相似的植物进行“根浸接种”15，17，23，24。将土壤从花盆中取出，仔细挖掘根部。
- 在水容器中轻轻洗涤根部，并将玫瑰花花放在水外。将洗涤的根在含有 黄萎病 孢子溶液的培养皿中孵育60分钟（推荐浓度：2×106 孢子/ mL）。对于未感染的对照组，将根在没有孢子的模拟溶液中孵育60分钟（无菌1/4 MS培养基）。
- 用潮湿的蒸汽灭菌土壤（80°C，20分钟）准备新花盆，不要打沙。使用移液器吸头在每个花盆的土壤中心打一个洞。
- 直接将根放入孔中（每个盆仅转移一株植物）。插入根部后，确保用土壤仔细填充孔。避免压紧土壤，否则重新盆栽会导致压力症状，如紫色叶子。
- 在长日照条件下（16小时光明/ 8小时黑暗;恒温22°C;60%湿度）培养感染组和对照组，并定期浇水。
- 根据研究问题，在接种后的首选时间点执行分析（请参阅此处使用的确切时间点的图例）。以下是一些建议。
- 从上面用数码相机拍摄植物的照片，保持每张照片的距离相同。量化叶面积（例如，使用 ImageJ22 或 BlattFlaeche17，19;使用花盆的直径来设置规模）并比较感染组和对照组。对疾病症状的发展进行分类（例如，更小、更淡黄色或坏死的叶子）13。
注意：去除拟南芥的茎有助于拍摄玫瑰花的照片。 - 从受感染的芽中去除根部并确定其生物量（鲜重），并通过称重来控制样品。确定相对鲜重19。
- 或者，测量植物高度或对茎段的真菌生长进行分类，以评估疾病的严重程度13。
- 收集样品进行分子分析，如下所示。
- 拟南芥：去除茎。切开根冠上的玫瑰花。将来自不同植物的4-5个玫瑰花串组合成一个样品。将叶材料在液氮中冷冻。
注意：在根系的情况下，如果不通过洗涤重新编程基因表达，很难从土壤中充分清洁它们。 - 油菜/番茄：从下胚轴切下茎段（例如，1厘米长;始终采用相同的茎区域）。将来自4-5个植物的材料混合到一个样品中，并将其冷冻在液氮中。
- 在液氮中研磨样品。从100mg叶或茎材料中提取总DNA， 通过 qPCR确定真菌DNA相对于植物DNA的量（见19）。
- 在液氮中研磨样品，取100mg植物材料并提取总RNA。进行qRT-PCR以确定侵扰时植物基因（或真菌基因）的表达（见19）。
- 从上面用数码相机拍摄植物的照片，保持每张照片的距离相同。量化叶面积（例如，使用 ImageJ22 或 BlattFlaeche17，19;使用花盆的直径来设置规模）并比较感染组和对照组。对疾病症状的发展进行分类（例如，更小、更淡黄色或坏死的叶子）13。
7. 分析数据
- 根据生物重复计算平均值和标准偏差（± SD）。
- 通过将受感染组的所有结果除以对照的结果来计算相对值。例如，将平均值显示为“相对于模拟”或“相对于野生类型”。
- 确定组之间的统计显著性。
图1：三种接种系统和方案中各个步骤的汇编。 这些数字说明了模型植物 拟南芥的系统。对于其他植物物种，必须调整时间。橙色框突出显示，对于这些框，最建议使用相应系统进行后续分析。（A）对于培养皿17中的接种系统，倒入培养基并使其凝固。将盘子放在冰箱中过夜。然后，用手术刀切割并去除上三分之一以及感染通道（IC）（从琼脂中去除插图中的白色区域，而蓝色区域代表琼脂）。将种子放在切好的表面上，并关闭培养皿。分层后，垂直放置板，让植物生长。一旦大多数根部到达感染通道，用移液管将孢子溶液直接加入通道中。确保解决方案均匀分布。关闭培养皿并将其垂直孵育在生长室中。可能遵循的方法是使用定量逆转录PCR（qRT-PCR）进行表达分析，使用报告线进行显微镜检查以及微生物DNA的定量。（B）对于塑料杯19中的接种系统，倒入培养基并用预制孔转移分离塑料层（角落中的四个小孔用于放置种子，中心有一个大孔用于感染通道）。让介质固化。用手术刀切除中心孔中的琼脂培养基，以获得感染通道（IC）。在较小的孔中划伤培养基并转移种子。用倒置的杯子关闭杯子，并用透气胶带（以黄色符号）密封。让植物生长。对于接种，用移液管将孢子溶液直接加入感染通道。关闭系统，在生长室中继续栽培。可能遵循的方法包括使用qRT-PCR进行表达分析，定量微生物DNA，以及测定鲜重，叶面积或其他疾病特征。（C） “根浸接种”15、17、23、24：对于基于土壤的接种系统，用土壤：沙子混合物填充花盆。转移种子，让幼苗生长。挖掘类似大小的植物，并在水中清洗根部。将洗过的根放入培养皿中，将溶液与孢子一起放置。孵育后，将单株植物插入有土壤的花盆中。可能遵循的方法包括使用qRT-PCR对叶片进行表达分析，定量微生物DNA，以及测定鲜重，叶面积或其他疾病特征。 请点击此处查看此图的大图。
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Representative Results
按照方案，种植植物并接种 长孢菌 （菌株 Vl4325）或 大丽弧菌 （分离株JR218）。设计了各种方案来证明有效性并突出显示给定协议的某些功能。显示代表性结局。
参与抗菌吲哚-硫代葡萄糖苷（IG）生物合成的基因的表达诱导是评估黄萎病感染的可靠指标17，19，26。在拟南芥中，MYB51（MYB结构域蛋白51;AT1G18570）编码参与IG生物合成所需基因激活的转录因子27。MYB51可以作为表明成功侵扰的标志基因，因为它始终由V. longisporum26或其他土生真菌（如Phytophthora parasitica26和镰刀菌21）在根部诱导。在基于培养皿的系统中接种后两天（2 dpi），在拟南芥根部观察到MYB51的诱导。报告植物品系PromMYB51：：YFP21公开了启动子活化，qRT-PCR分析证实了该基因的显着转录诱导（图2A-B）。这些实验旨在确定感染期间根系的表达变化。
由于本研究中使用的 黄萎病 菌种执行血管生活方式并通过木质部血管从根部扩散 到芽， 因此可以确定叶片中真菌DNA的量作为真菌繁殖程度的参数。拟南芥在塑料杯 中在体外 系统中接种根，12天后收获玫瑰花。与在模拟对照中检测到的背景值相比，在受感染植物的叶子中发现了大量的真菌DNA（图2C）。这表明感染已成功进展。为了进一步检查，可以量化不同植物基因型中真菌DNA的量，以深入了解根防御反应。此外，此时收集根系以测试 通过 qRT-PCR诱导标记基因。 MYB51 转录本丰度显著富集（图2D）。这表明药敏试验和表达分析可以很容易地与杯子系统并行进行，这凸显了该程序的巨大优势。
为了包括其他模型植物物种也可以被引入的证据，油菜在塑料杯中感染了长孢子虫，番茄感染了大丽弧菌。在根部接种后的第12天，在幼苗基部切割的茎段中定量真菌DNA的量（图2E-F）。在两种植物物种中都可以检测到真菌DNA，表明病原体在植物内繁殖。同样，可以测试不同的植物基因型，以获得有关防御机制的知识。
如果感兴趣的根定植微生物没有从根传播到叶子，则不可能量化叶子中微生物DNA的数量作为疾病严重程度的参数。测量疾病严重程度的另一种选择是评估和推断宿主的症状。为了举例说明这一点，拟南芥在土壤系统中接种了大丽花弧菌，并评估了绿叶面积（图2G-H）。虽然经过模拟处理的植物的玫瑰花看起来健康和绿色，但感染病原体的植物的叶子尺寸减小，叶子变黄甚至坏死。以这种方式，可以分析和确认不同植物基因型的易感性，例如，通过量化新鲜重量。
图2：通过遵循方案获得的代表性结果。（A，B）拟南芥根在培养皿系统中接种了长孢弧菌。报告线PromMYB51：：YFP21显示，与模拟对照相比，MYB51启动子在受感染的根部中具有很强的活化作用（显微镜检查在2 dpi;比例尺：50μm）。通过qRT-PCR分析（2 dpi）进一步证实了MYB51在野生型（WT）根系中的转录诱导。受感染样本的值相对于模拟样本（设置为 1）（n = 5;± SD）给出。（C）通过长孢弧菌进行全身定植：在杯状系统中接种拟南芥根后，通过定量PCR（qPCR;12 dpi）测定叶片中真菌DNA的相对量。受感染样本的值相对于模拟样本中的背景水平（设置为 1）（n = 3;± SD）给出。（D）从杯子系统中收获感染的长孢菌和模拟处理的根部，并进行qRT-PCR分析。受感染样本的值相对于模拟样本（设置为 1）（n = 3;± SD）给出。发现MYB51是转录诱导的（12 dpi）。（E）在杯子系统中接种油菜，用长孢子虫接种，并通过qPCR定量茎段真菌DNA的相对量（12 dpi）。受感染样本的值相对于模拟样本中的背景水平（设置为 1）（n = 3;± SD）给出。（F）将番茄接种在杯子系统中，用大丽弧菌（12 dpi）通过qPCR定量真菌DNA的相对量。受感染样本的值相对于模拟样本中的背景水平（设置为 1）（n = 5;± SD）给出。（G，H）拟南芥在土壤系统中用大丽弧菌接种，并显示受感染和模拟处理的植物的代表性图片（21 dpi）。检查了绿叶区域。相对于模拟植物（设置为1），受感染植物的绿叶面积较小（n = 5;±SD）。（B-F，H）对于引物对，请参见19;统计：学生的 t 检验相对于模拟，* p≤ 0.05，** p ≤ 0.01，*** p ≤ 0.001。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
由于土壤传播的植物病原体1造成的巨大产量损失，需要改进耕作策略或作物品种。对土壤传播疾病的发病机制的有限了解阻碍了更具抗性的植物的发育。需要探索潜在的病理机制，为此需要一个强大的方法学平台。报道的接种程序已经表明，根 - 微生物相互作用中的多因素事件可以通过组合不同的系统很好地解剖19。上述协议旨在为该领域的专家和研究人员提供常规工作流程。操作简单，允许独立复制，并且标准植物科学实验室中存在所需的技术设备。
早期 黄萎病 感染事件（接种后数小时至6 dpi）可在培养皿系统中进行检查，晚期事件（>21 dpi）可在土壤系统中进行检查，在杯状系统中可进行时间检查（4至21 dpi）。将孢子添加到培养皿系统的感染通道后，它们与根部直接接触。这样可以检查早期的防御反应。正如 MYB51 诱导所举例的那样，表达变化可以很容易地用基因报告基因构建体，qRT-PCR，甚至全基因组的“组学”方法17，26进行研究。与其他两种感染系统相比，培养皿中的防御反应更为强烈。由于它们在培养皿中的尺寸很小，因此幼苗很快被真菌过度生长，并且在诸如测定19中防御反应的强度可能相当不自然。也可以在塑料杯系统的根部研究表达变化，从而获得与培养皿系统相当的结果，尽管标记基因的诱导值较低。在杯子的实验设置中，接种物不会立即与根部接触，孢子必须发芽，病原体必须通过培养基向根部生长。与培养皿系统相比，感染的进展较慢，因此更接近自然条件。关于根系，基于土壤的系统有一个缺点，因为它们必须从土壤中充分清除以进行分析，而无需通过洗涤重新编程基因表达。因此，研究土壤中根系的表达变化更为复杂。但是，可以在叶子中测试根侵扰是否触发那里的响应。
在 体外 接种系统（培养皿和塑料杯）中，只要每个步骤都在层流罩下使用无菌设备执行，就可以防止外部污染。因此，可以不受干扰地检查双边相互作用。相反，土壤系统只是“半无菌”，因为植物在生长室中没有密封隔离。然而，它可以被认为是最接近自然条件的植物，因为植物生长在土壤中。然而，由于上生根，根系在土壤系统中受损，这为微生物提供了对组织的访问。虽然这可能有点人为的，但这可能模仿伤害根系的自然条件，例如线虫喂养28。
培养皿系统非常适合使用荧光标记的菌株（例如， 长孢子虫 菌株 Vl-sGFP 9）可视化病原体传播的动态。定植产生的根表型是可以很好地观察到的。另一方面，量化培养皿中叶子/芽的疾病症状几乎不可行，因为该系统非常小。此外，可能没有足够的空间容纳比拟南芥更大的植物物种。或者，Behrens等人29 在适合油菜的平板上建立了感染系统，其中将刷子浸入孢子悬浮液中，并用于沿着生长在琼脂上的根部分布接种物。为了评估症状，基于杯子和土壤的系统当然是可取的。在这里，可以在叶子/芽处评估症状的发展（例如，叶面积减少，鲜重损失，植物高度降低，坏死组织的程度）。如代表性结果所示，对较大的植物物种（如油菜和番茄）的研究在杯基和土壤系统中不是问题。如果所研究的土生微生物从根部扩散到芽，则病原体特异性DNA可以相对于芽/叶组织中的植物DNA进行PCR扩增。这可以作为使用不同植物基因型13，19 进行致病性测试的标志物，并且在使用血管病原体（如 黄萎病 菌）作为模型时是一个优势。反之亦然，可以应用不同基因型的病原体来鉴定成功定植所需的毒力基因。
在所有情况下，分析的最佳时机取决于基因型、植物种类和微生物。最关键的一步是通过初步测试为每个研究问题定义最佳时间点。此外，当使用除 黄萎病以外的其他微生物时，应首先确定足够的接种浓度。
除了已经提到的可能性之外，杯子系统还提供了将其扩展到农用化学品筛选的潜力，这些农用化学品可能用于限制特定寄生虫的定植。杀菌化学品对植物微生物定植的影响可以通过在接种前（或接种期间）将推定的抗菌化合物直接添加到琼脂培养基中并监测宿主的症状发展来测试。这可能有助于实施筛查，以加速发现针对土壤传播疾病的新疗法。
虽然土壤微生物组的几个成员是致病性的，但绝大多数是中性的，甚至对植物生长有益1。有机会使用这些协议为植物接种有益微生物。以前，在培养皿系统中加入 S. indica 孢子以检查根26中的后续反应。这拓宽了所解释的感染系统的频谱，不仅可以研究致病性，还可以研究有益的相互作用。
由于已知根际中的微生物相互影响6，因此可以通过平行接种不同微生物物种（或首先用一种微生物处理植物，然后用另一种处理）来模拟。这实现了共培养、三重甚至多文化模式。可以设想到对足够合成群落（SynComs，微生物集合）的更高级的扩展，因为这有助于了解复杂微生物组合物30的影响。
总之，接种系统允许多种组合用于后续分析，并支持一系列应用。该方法集广泛适用于各种根定植微生物（有益和致病），并为分析根 - 微生物相互作用提供了一个强大的平台。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢Tim Iven和Jaqueline Komorek之前在这些方法上的工作，Wolfgang Dröge-Laser（德国维尔茨堡大学药物生物学系）为这项工作提供了所需的设备和资源，Wolfgang Dröge-Laser以及Philipp Kreisz（都是维尔茨堡大学）对手稿进行了批判性校对。这项研究得到了“Deutsche Forschungsgemeinschaft”（DFG，DR273/15-1，2）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar (Gelrite) | Carl Roth | Nr. 0039 | all systems described require Gelrite |
| Arabidopsis thaliana wild-type | NASC stock | Col-0 (N1092) | |
| Autoclave | Systec | VE-100 | |
| BlattFlaeche | Datinf GmbH | BlattFlaeche | software to determine leaf areas |
| Brassica napus wild-type | see Floerl et al., 2008 | rapid-cycling rape | genome ACaacc |
| Cefotaxime sodium | Duchefa | C0111 | |
| Chicanery flask 500 mL | Duran Group / neoLab | E-1090 | Erlenmeyer flask with four baffles |
| Collection tubes 50 mL | Sarstedt | 62.547.254 | 114 x 28 mm |
| Czapek Dextrose Broth medium | Duchefa | C1714 | |
| Digital camera | Nikon | D3100 18-55 VR | |
| Exsiccator (Desiccator ) | Duran Group | 200 DN, 5.8 L | Seal with lid to hold chlorine gas |
| Fluorescence Microscope | Leica | Leica TCS SP5 II | |
| HCl | Carl Roth | P074.3 | |
| KNO3 | Carl Roth | P021.1 | ≥ 99 % |
| KOH | Carl Roth | 6751 | |
| Leukopor | BSN medical GmbH | 2454-00 AP | non-woven tape 2.5 cm x 9.2 m |
| MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) | Carl Roth | 4256.2 | Pufferan ≥ 99 % |
| MgSO4 | Carl Roth | T888.1 | Magnesiumsulfate-Heptahydrate |
| Murashige & Skoog medium (MS) | Duchefa | M0222 | MS including vitamins |
| NaClO | Carl Roth | 9062.1 | |
| Percival growth chambers | CLF Plant Climatics GmbH | AR-66L2 | |
| Petri-dishes | Sarstedt | 82.1473.001 | size ØxH: 92 × 16 mm |
| Plastic cups (500 mL, transparent) | Pro-pac, salad boxx | 5070 | size: 108 × 81 × 102 mm |
| Pleated cellulose filter | Hartenstein | FF12 | particle retention level 8–12 μm |
| poly klima growth chamber | poly klima GmbH | PK 520 WLED | |
| Potato Dextrose Broth medium | SIGMA Aldrich | P6685 | for microbiology |
| Pots | Pöppelmann GmbH | TO 7 D or TO 9,5 D | Ø 7 cm resp. Ø 9.5 cm |
| PromMYB51::YFP | see Poncini et al., 2017 | MYB51 reporter line | YFP (i.e. 3xmVenus with NLS) |
| Reaction tubes 2 mL | Sarstedt | 72.695.400 | PCR Performance tested |
| Rotary (orbital) shaker | Edmund Bühler | SM 30 C control | |
| Sand (bird sand) | Pet Bistro, Müller Holding | 786157 | |
| Soil | Einheitserde spezial | SP Pikier (SP ED 63 P) | |
| Solanum lycopersicum wild-type | see Chavarro-Carrero et al., 2021 | Type: Moneymaker | |
| Thoma cell counting chamber | Marienfeld | 642710 | depth 0.020 mm; 0.0025 mm2 |
| Ultrapure water (Milli-Q purified water) | MERK | IQ 7003/7005 | water obtained after purification |
| Verticillium dahliae | see Reusche et al., 2014 | isolate JR2 | |
| Verticillium longisporum | Zeise and von Tiedemann, 2002 | strain Vl43 |
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