Summary
Denne protokol præsenterer et detaljeret resumé af strategier til podning af planterødder med jordbårne mikrober. Eksemplificeret for svampene Verticillium longisporum og Verticillium dahliae beskrives tre forskellige rodinfektionssystemer. Potentielle anvendelser og mulige downstream-analyser fremhæves, og fordele eller ulemper diskuteres for hvert system.
Abstract
Rhizosfæren har et meget komplekst mikrobielt samfund, hvor planterødder konstant udfordres. Rødder er i tæt kontakt med en lang række mikroorganismer, men undersøgelser af jordbårne interaktioner ligger stadig bag dem, der udføres på overjordiske organer. Selvom nogle podningsstrategier til infektion af modelplanter med modelrodpatogener er beskrevet i litteraturen, er det fortsat vanskeligt at få et omfattende metodologisk overblik. For at løse dette problem er tre forskellige rodpodningssystemer præcist beskrevet, der kan anvendes til at få indsigt i biologien af rod-mikrobeinteraktioner. Til illustration blev Verticillium-arter (nemlig V. longisporum og V. dahliae) anvendt som rodinvaderende modelpatogener. Metoderne kan dog let tilpasses andre rodkoloniserende mikrober - både patogene og gavnlige. Ved at kolonisere planten xylem udviser vaskulære jordbårne svampe som Verticillium spp. en unik livsstil. Efter rodinvasion spredes de via xylemkarrene akropetalt, når skuddet og fremkalder sygdomssymptomer. Tre repræsentative plantearter blev valgt som modelværter: Arabidopsis thaliana, økonomisk vigtig raps (Brassica napus) og tomat (Solanum lycopersicum). Trin-for-trin protokoller gives. Repræsentative resultater af patogenicitetsassays, transkriptionelle analyser af markørgener og uafhængige bekræftelser fra reporterkonstruktioner vises. Desuden diskuteres fordele og ulemper ved hvert podningssystem grundigt. Disse dokumenterede protokoller kan hjælpe med at give tilgange til forskningsspørgsmål om rod-mikrobe-interaktioner. At vide, hvordan planter håndterer mikrober i jorden, er afgørende for at udvikle nye strategier til forbedring af landbruget.
Introduction
Naturlig jord er beboet af et forbløffende antal mikrober, der kan være neutrale, skadelige eller gavnlige for planter1. Mange plantepatogener er jordbårne, omgiver rødderne og angriber det underjordiske organ. Disse mikroorganismer tilhører en lang række klader: svampe, oomycetes, bakterier, nematoder, insekter og nogle vira 1,2. Når miljøforholdene favoriserer infektion, vil modtagelige planter blive syge, og afgrødeudbyttet falder. Virkningerne af klimaændringer, såsom global opvarmning og ekstreme vejrforhold, vil øge andelen af jordbårne plantepatogener3. Derfor vil det blive mere og mere vigtigt at studere disse destruktive mikrober og deres indvirkning på fødevare- og foderproduktionen, men også på naturlige økosystemer. Derudover er der mikrobielle mutualister i jorden, der tæt interagerer med rødder og fremmer plantevækst, udvikling og immunitet. Når de konfronteres med patogener, kan planter aktivt rekruttere specifikke modstandere i rhizosfæren, der kan understøtte værtsoverlevelse ved at undertrykke patogener 4,5,6,7. Imidlertid er mekanistiske detaljer og veje involveret i gavnlige rod-mikrobe-interaktioner ofte stadig ukendte6.
Det er derfor vigtigt at udvide den generelle forståelse af rod-mikrobe-interaktioner. Pålidelige metoder til inokulering af rødder med jordbårne mikroorganismer er nødvendige for at udføre modelundersøgelser og overføre resultaterne til landbrugsapplikationer. Gavnlige interaktioner i jorden undersøges for eksempel med Serendipita indica (tidligere kendt som Piriformospora indica), nitrogenfikserende Rhizobium spp. eller mykorrhizale svampe, mens kendte jordbårne plantepatogener omfatter Ralstonia solanacearum, Phytophthora spp., Fusarium spp. og Verticillium spp.1. De to sidstnævnte er svampeslægter, der er globalt fordelt og forårsager vaskulære sygdomme2. Verticillium spp. (Ascomycota) kan inficere hundredvis af plantearter - stort set dicotyledoner, herunder urteagtige enårige, træagtige stauder og mange afgrødeplanter 2,8. Hyfer af Verticillium kommer ind i roden og vokser både intercellulært og intracellulært mod den centrale cylinder for at kolonisere xylemkarrene 2,9. I disse fartøjer forbliver svampen i det meste af sin livscyklus. Da xylemsaften er næringsfattig og bærer planteforsvarsforbindelser, skal svampen tilpasse sig dette unikke miljø. Dette opnås ved udskillelse af koloniseringsrelaterede proteiner, der gør det muligt for patogenet at overleve i sin vært10,11. Efter at have nået rodvaskulaturen kan svampen spredes inden for xylemkarrene akropetalt til løvet, hvilket fører til systemisk kolonisering af værten 9,12. På dette tidspunkt påvirkes planten negativt i vækst 9,10,13. For eksempel forekommer stunting og gule blade samt for tidlig ældning 13,14,15,16.
Et medlem af denne slægt er Verticillium longisporum, som er stærkt tilpasset brassicaceous værter, såsom den agronomisk vigtige oliefrø raps, blomkål og modelplanten Arabidopsis thaliana12. Flere undersøgelser kombinerede V. longisporum og A. thaliana for at få omfattende indsigt i jordbårne vaskulære sygdomme og de resulterende rodforsvarsresponser 13,15,16,17. Ligetil modtagelighedstest kan realiseres ved hjælp af V. longisporum / A. thaliana modelsystemet, og veletablerede genetiske ressourcer er tilgængelige for begge organismer. Nært beslægtet med V. longisporum er patogenet Verticillium dahliae. Selvom begge svampearter udfører en lignende vaskulær livsstil og invasionsproces, er deres formeringseffektivitet fra rødder til blade og de fremkaldte sygdomssymptomer i A. thaliana forskellige: mens V. longisporum normalt inducerer tidlig ældning, resulterer V. dahliae-infektion i visning18. For nylig præsenterede et metodologisk resumé forskellige rodpodningsstrategier til infektion af A. thaliana med V. longisporum eller V. dahliae, der hjælper med at planlægge eksperimentelle opsætninger19. I marken forårsager V. longisporum lejlighedsvis betydelig skade i rapsproduktionen12, mens V. dahliae har et meget bredt værtsområde bestående af flere dyrkede arter, såsom vinranke, kartoffel og tomat8. Dette gør begge patogener økonomisk interessante modeller at studere.
Således bruger de følgende protokoller både V. longisporum og V. dahliae som model rodpatogener for at eksemplificere mulige tilgange til rodpodninger. Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), raps (Brassica napus) og tomat (Solanum lycopersicum) blev valgt som modelværter. Detaljerede beskrivelser af metoderne findes i teksten nedenfor og den ledsagende video. Fordele og ulemper for hvert podningssystem diskuteres. Samlet set kan denne protokolsamling hjælpe med at identificere en passende metode til specifikke forskningsspørgsmål i forbindelse med rod-mikrobe-interaktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Medier til svampekulturer og plantepodningssystemer
- Flydende kartoffel dextrose bouillon (PDB): Forbered 21 g/l PDB i ultrarent vand i en varmestabil kolbe.
- Flydende Czapek Dextrose Broth (CDB): Tilbered 42 g/L CDB i ultrarent vand i en varmestabil kolbe.
- Medium til petriskålsokulationssystemet: Der fremstilles en varmestabil kolbe med 1,5 g/l Murashige og Skoog medium (MS) og 8 g/l agar i ultrarent vand.
BEMÆRK: Undgå sukker i dette medium, da det vil føre til overdreven svampevækst efter podning. - Medium til det plastkopbaserede podningssystem: Der fremstilles en varmestabil kolbe med 4,4 g/l MS, 0,2 g/l MgSO4, 1 g/L KNO3, 0,5 g/L 2-(N-morpholino)ethansulfonsyre (MES) og 6,0 g/l agar i ultrarent vand, og pH justeres til 5,7 med 5 M KOH.
BEMÆRK: Undgå sukker i dette medium, da det vil føre til overdreven svampevækst efter podning. - 1/4 MS medium: Tilbered 1,2 g/l MS i ultrarent vand.
- Brug autoklaven til at sterilisere alle ovennævnte opløsninger. Kom glaskolberne i kurven, luk låget og steriliser i 15 minutter ved 121 °C og 98,9 kPa.
2. Sterilisering af overfladen af plantefrø
BEMÆRK: Brug altid nedenstående protokol til at sterilisere overfladen af frø fra Arabidopsis, raps og tomat inden såning.
- Overfør frøene til et 2 ml reaktionsrør. Anbring røret i en exsiccator med en indvendig kapacitet på 5,8 L.
- Der genereres klorgas i exsiccatoren ved at tilsætte 6 ml 33% saltsyre (HCI) i 100 ml 12% vandig natriumhypochlorit (NaClO).
- Luk straks låget på exsiccatoren og inkuber frøene i 3 timer i gassen.
3. Forberedelse af inokulum med Verticillium sporer (aseksuel afledt conidia)
BEMÆRK: Dyrk V. dahliae (stamme JR2) på samme måde som V. longisporum (stamme Vl43)17,18,19. Sørg for, at alt udstyr og medier er kimfrie, og at alle trin udføres i en laminær flowhætte for at holde inokulumetaksenisk.
- Fyld 150 ml flydende PDB (trin 1.1) i en 500 ml chicanery-kolbe, og suppler mediet med 500 mg/l cefotaxim.
- Tilsæt Verticillium conida fra glycerollager til PDB-mediet. Luk kolben med en steril skumprop.
- Inkuber kulturen i 7-10 dage i en mørk kasse ved stuetemperatur (RT) under kontinuerlig, vandret omrystning (roterende ryster; 60 o / min). Dette resulterer i små, hvide mycelia kugler.
- Fjern og kassér PDB-supernatanten forsigtigt. Det meste af mycelien skal forblive i kolben.
- Der tilsættes 100 ml flydende CDB (trin 1.2) på mycelien i chicanerykolben, og mediet suppleres med 500 mg/l cefotaxim.
- Inkuber yderligere 4-5 dage i en mørk kasse ved RT under kontinuerlig, vandret rystelse (roterende ryster, 60 o / min) for at fremkalde sporulation. Supernatanten bliver gullig-grålig, når conidier frigives.
- En del (5-10 ml) af den conidiaholdige væske filtreres gennem et filterpapir (partikelretentionsniveau på 8-12 μm) i et sterilt opsamlingsrør på 50 ml. Dette adskiller sporer fra mycelier.
- Bestem sporekoncentrationen ved hjælp af et celletællekammer og et mikroskop. Fortynd med kimfrit 1/4 MS-medium i ultrarent vand, indtil nedenstående sporekoncentrationer er opnået.
BEMÆRK: Under mikroskopet er conidierne fra V. longisporum for det meste langtrukne og 7,1-8,8 μm i størrelse, mens V. dahliae conidia er kortere (3,5-5,5 μm) og ret sfæriske20. - Brug disse friskhøstede conidier som inokulum. Sørg for at udføre forsøgene altid med friskhøstede conidier og ikke med frosne lagre, da frysning reducerer antallet af levedygtige sporer betydeligt19.
- Ved langtidsopbevaring fryses sporerne som højkoncentreret sporeopløsning (ca. 1 x 108 sporer/ml) i 25 % glycerol ved -80 °C (kan opbevares i op til 1 år). Til de næste eksperimenter skal du bruge disse glycerollagre til at inokulere PDB-mediet i trin 3.2.
4. Et sterilt in vitro-podningssystem baseret på petriskåle
BEMÆRK: For petriskålssystemet17 skal du sørge for, at alt udstyr og medier er kimfrie, og at alle trin udføres i en laminær flowhætte.
- Efter autoklavering hældes mediet (se trin 1.3) i petriskåle.
- Efter hærdningen af mediet pakkes petriskålene om i en steril plastikpose og opbevares på hovedet natten over i køleskabet (4-10 °C). Et kølet medium hjælper med at forhindre glidning af mediet i de næste trin.
- Skær og fjern en infektionskanal og den øverste tredjedel af det størknede medium med en skalpel (figur 1A). Undgå at få væske eller luft under agarmediet, mens du skærer; Ellers glider mediet og lukker infektionskanalen.
- Fordel 50-100 overfladesteriliserede Arabidopsis frø med en steril pipettespids på den skårne øvre overflade. Sæt frøene i den vinkel, hvor den afskårne agaroverflade kommer i kontakt med petriskålens væg, så rødderne kan vokse mellem mediet og petriskålsvæggen. Dette vil lette podningen senere.
- Luk petriskålene og forsegl dem med luftgennemtrængeligt tape for at muliggøre gasudveksling.
- Efter stratificering i 2 dage i mørket ved 4 °C anbringes pladerne lodret i en passende rist og planterne dyrkes ved 22 °C ± 1 °C under lange dagsforhold (16 timers lys / 8 timer mørke) i et vækstkammer.
- Når størstedelen af rødderne når infektionskanalen (ca. 9-11 dage gamle frøplanter), skal du lægge pladerne vandret, åbne dem og tilsætte 500 μL friskhøstede Verticillium conidia med en koncentration på 4 x 105 sporer / ml direkte i infektionskanalen, og sørg for, at væsken fordeles jævnt i kanalen.
- Tilsvarende fremstilles kontrolplader ved tilsætning af 500 μL af en mock-opløsning i stedet for sporer (kimfrit 1/4 MS-medium).
- Inkuber pladerne vandret i et par minutter, indtil væsken er gennemblødt og ikke kan lække ud, når pladerne er sat lodret op igen. Luk derefter låget og forsegl pladerne med luftgennemtrængeligt tape.
- Inkuber pladerne lodret i vækstkammeret. Dæk eventuelt roddelene med sorte papirkasser for at gøre rødder og jordbårne svampe mørkere (se19).
- Udfør analyserne på de foretrukne tidspunkter efter podning afhængigt af forskningsspørgsmålet (se figurforklaringerne for de nøjagtige tidspunkter, der anvendes her). Følgende er nogle forslag.
- Skær bladene fra rødderne og høst begge separat. Tag agarstrimlerne ud af petriskålene for let at få adgang til rødderne og træk dem forsigtigt ud af agaren ved hjælp af tang. Frys alt plantemateriale straks i flydende nitrogen.
- Slib prøverne i flydende nitrogen. Ekstrakt total DNA fra 100 mg bladmateriale for via en kvantitativ PCR (qPCR) at bestemme mængden af svampe-DNA i forhold til plante-DNA (se19).
- Slib prøverne i flydende nitrogen. Tag 100 mg plantemateriale og ekstraher total RNA. Udfør kvantitativ omvendt transkription PCR (qRT-PCR) for at bestemme ekspressionen af plantegener (eller svampegener) under angreb (se19).
- Fjern forsigtigt rødderne fra agaren for at undgå skade og undersøge dem under det fluorescerende mikroskop.
- Bestem induktion af markørgener i plantereporterlinjer (f.eks. Luciferase, β-glucuronidase eller fluorescerende reportere 17,19,21).
- Visualiser svampeformering ved roden ved hjælp af svampereporterlinjer (f.eks . V. longisporum , der konstitutivt udtrykker forbedret grønt fluorescerende protein, Vl-sGFP 9) eller ved farvningsteknikker (f.eks. gennem 5-brom-4-chlor-3-indoxyl-N-acetyl-beta-d-glucosaminid (X-beta-D-Glc-Nac)18).
- Skær bladene fra rødderne og høst begge separat. Tag agarstrimlerne ud af petriskålene for let at få adgang til rødderne og træk dem forsigtigt ud af agaren ved hjælp af tang. Frys alt plantemateriale straks i flydende nitrogen.
5. Et sterilt in vitro-podningssystem organiseret med plastikkopper
BEMÆRK: Som nævnt i den første beskrivelse af denne teknik19 skal det sikres, at alt udstyr og alle medier er kimfrie, og at alle trin udføres i en laminær flowhætte.
- Brug gennemsigtige plastikkopper med et samlet volumen på 500 ml og steriliser dem i et 70% -75% ethanolbad i mindst 20 minutter. Tør kopperne i den laminære strømningshætte.
- Hæld det autoklavede medium (se trin 1.4) i plastikkopperne. Eventuelt tilsættes cefotaxim (endelig koncentration på 50 mg/l) til det autoklavede medium for at forhindre bakterielle kontamineringer. Brug 150 ml medium pr. kop til forsøg med Arabidopsis eller mere medium (250-300 ml pr. Kop) til forsøg med større plantearter (raps, tomat).
- Anbring et plastlag (steriliseret før ved at inkubere i 70% -75% ethanol i 20 minutter) på mediet, før det størkner (figur 1B).
BEMÆRK: Dette plastlag indeholder fire præfabrikerede huller i hjørnerne til placering af overfladeriliserede frø. Dette gør det muligt for frøene at få adgang til mediet. Senere forhindrer dette adskillelseslag bladene i at røre ved det svampeholdige medium, så mikroberne ikke direkte kan angribe bladene og skal tage rodvejen. Et andet hul er i midten, hvilket gør det muligt at skære infektionskanalen. - Når mediet er størknet, skæres agaren med en skalpel gennem det præfabrikerede midterhul til en dybde på ca. 1,5 cm. Fjern den afskårne agar for at skabe en infektionskanal, hvori svampesporerne kan tilsættes senere.
- Rids agarmediet lidt med en pipettespids i de fire mindre huller for at afbryde den størknede hud (dette gør det muligt for frøene at opsuge vand fra det vandige agarmedium). Læg frøene ved hjælp af en pipettespids i de mindre huller.
- Luk plastikkoppen med en anden, omvendt plastikkop og forsegl med luftgennemtrængelig tape. Båndet skal tillade gasudveksling.
- Efter stratificering i 3 dage i mørke ved 4 ° C inkuberes kopsystemerne under 12 timers lys / 12 timers mørke (Arabidopsis, raps) eller 16 timers lys / 8 timer mørkeforhold (tomat) i vækstkamre ved en konstant temperatur på 22 ° C og 60% fugtighed.
- Følg den anbefalede alder af planter til podning: 21 dage for Arabidopsis; 5-7 dage for raps; 12 dage for tomat.
- Inokuler planter med Verticillium ved at tilsætte 1 ml conidia-opløsning (anbefalet koncentration: 4 x 105 sporer/ml) i infektionskanalen. For at forberede kontrolprøver tilsættes 1 ml mock-opløsning uden sporer (kimfrit 1/4 MS-medium) i kanalen.
- Udfør analyserne på de foretrukne tidspunkter efter podning afhængigt af forskningsspørgsmålet (se figurforklaringerne for de nøjagtige tidspunkter, der anvendes her). Følgende er nogle forslag.
- Tag billeder af planterne med et digitalt kamera ovenfra, der holder afstanden den samme for hvert foto. Kvantificer bladarealet (f.eks. med ImageJ22 eller BlattFlaeche17,19; brug længden af kopperne til at indstille skalaen) og sammenlign inficerede og kontrolgrupper. Kategoriser udviklingen af sygdomssymptomer (f.eks. Mindre, mere gullige eller nekrotiske blade).
BEMÆRK: Hvis der er stængler på Arabidopsis, skal du fjerne dem for at få bedre billeder af rosetterne. - Fjern rødderne og definer biomassen (frisk vægt) af skud fra inficerede og kontroller prøver ved vejning. Bestem den relative friske vægt19.
- Prøverne indsamles til molekylære analyser som følger.
- Arabidopsis: Fjern stængler, hvis der er nogen. Skær rosetterne i bunden fra rødderne. Sørg for at udelukke alt rodmateriale fra prøven og høste hele rosetter. Kombiner 4-5 rosetter fra forskellige planter i en prøve og frys bladmaterialet i flydende nitrogen.
- Træk rødderne forsigtigt ud af mediet med tang, tryk og dup dem med et papirhåndklæde for at fjerne agarrrester, og kombiner 4-5 rødder fra forskellige planter i en prøve. Frys straks i flydende nitrogen.
- Raps/tomat: Skær stammesegmenter fra hypocotylen (f.eks. 1 cm i længden; tag altid det samme stammeområde). Kombiner materiale fra 4-5 planter i hver prøve og frys i flydende nitrogen.
- Slib prøverne i flydende nitrogen. Ekstrakt total DNA fra 100 mg af bladet eller stammaterialet for via qPCR at bestemme mængden af svampe-DNA i forhold til plante-DNA (se19).
- Slib prøverne i flydende nitrogen, tag 100 mg plantemateriale og ekstraher total RNA. Udfør qRT-PCR for at bestemme ekspressionen af plantegener (eller svampegener) ved angreb (se19).
- Tag billeder af planterne med et digitalt kamera ovenfra, der holder afstanden den samme for hvert foto. Kvantificer bladarealet (f.eks. med ImageJ22 eller BlattFlaeche17,19; brug længden af kopperne til at indstille skalaen) og sammenlign inficerede og kontrolgrupper. Kategoriser udviklingen af sygdomssymptomer (f.eks. Mindre, mere gullige eller nekrotiske blade).
6. Et jordbaseret podningssystem i potter
- Bland jord og sand grundigt i et volumetrisk forhold på 3:1 (jord:sand) for at gøre det lettere at vaske substratet af rødderne. Hæld blandingen i en autoklavepose. Hvis blandingen er for tør, tilsættes en passende mængde vand og blandes i substratet. Damp ved 80 °C i 20 minutter i en autoklave for at minimere mikrobielle kontamineringer.
BEMÆRK: Undgå opvarmning til over 80 °C, da dette kan påvirke organiske jordnæringsstoffer. - Fyld potter med jord-sandblandingen og overfør dem til bakker. Tilsæt vand i bakkerne ca. 1/3 af en grydes højde, så jord-sandblandingen bliver grundigt gennemblødt med vand. Derudover vandsprøjt substratet med en sprøjteflaske for at sikre våde startforhold.
- Så 3-4 frø i hver gryde (figur 1C), der sikrer, at frøene har tilstrækkelig afstand fra hinanden. Opbevar dem i 3 dage i mørke ved 4 °C til stratificering for at synkronisere spiring.
BEMÆRK: Fordyrk et overskud af planter, hvilket muliggør et udvalg af planter af samme størrelse til podningsforsøgene og reducerer afvigelser på grund af individuelle forskelle. - Lad frøplanterne vokse under lange dagsforhold (16 timers lys / 8 timer mørke; konstant temperatur på 22 °C; 60% fugtighed) med regelmæssig vanding.
- Følg den anbefalede alder af planter til podning: 21 dage for Arabidopsis, 7 dage for raps og 10 dage for tomat. Pluk planter af samme størrelse for at udføre "roddipokulation"15,17,23,24. Tag jorden ud af potterne og udgrave forsigtigt rødderne.
- Vask forsigtigt kun rødderne i en vandbeholder og hold rosetterne ude af vandet. Inkuber de vaskede rødder i 60 min i en petriskål indeholdende Verticillium sporeopløsningen (anbefalet koncentration: 2 x 106 sporer/ml). For den ikke-inficerede kontrolgruppe inkuberes rødderne i 60 minutter i mock-opløsningen uden sporer (kimfrit 1/4 MS-medium).
- Forbered nye potter med fugtig, dampsteriliseret jord (80 °C i 20 min) uden sand. Brug en pipettespids til at lave et hul i midten af jorden i hver gryde.
- Placer rødderne direkte i hullet (overfør kun en plante pr. Gryde). Efter indsættelse af rødderne skal du sørge for at genopfylde hullerne omhyggeligt med jord. Undgå at trykke på jorden, ellers kan repotting forårsage stresssymptomer som lilla blade.
- Dyrk inficerede og kontrolgrupper under lange dagsforhold (16 timers lys / 8 timers mørke; en konstant temperatur på 22 ° C; 60% fugtighed) med regelmæssig vanding.
- Udfør analyserne på de foretrukne tidspunkter efter podning afhængigt af forskningsspørgsmålet (se figurforklaringerne for de nøjagtige tidspunkter, der anvendes her). Følgende er nogle forslag.
- Tag fotografier af planterne med et digitalt kamera ovenfra, og hold afstanden den samme for hvert foto. Kvantificer bladarealet (f.eks. med ImageJ22 eller BlattFlaeche17,19; brug potternes diameter til at indstille skalaen) og sammenlign inficerede grupper og kontrolgrupper. Kategoriser udviklingen af sygdomssymptomer (f.eks. mindre, mere gullige eller nekrotiske blade)13.
BEMÆRK: Fjernelse af stængler af Arabidopsis letter at tage billeder af rosetterne. - Fjern rødderne og definer biomassen (frisk vægt) af skud fra inficerede og kontroller prøver ved vejning. Bestem den relative friske vægt19.
- Alternativt kan du måle plantens højde eller kategorisere svampeudvækst fra stammesegmenter for at evaluere sygdommens sværhedsgrad13.
- Der indsamles prøver til molekylære analyser som følger.
- Arabidopsis: Fjern stilkene. Skær rosetterne ved rodkronen. Kombiner 4-5 rosetter fra forskellige planter i en prøve. Frys bladmaterialet i flydende nitrogen.
BEMÆRK: I tilfælde af rødder er det vanskeligt at rense dem tilstrækkeligt fra jorden uden at omprogrammere genekspression gennem vask. - Raps/tomat: Skær stammesegmenter fra hypocotylen (f.eks. 1 cm i længden; tag altid det samme stammeområde). Kombiner materiale fra 4-5 planter i en prøve og frys det i flydende nitrogen.
- Slib prøverne i flydende nitrogen. Ekstrakt total DNA fra 100 mg blad- eller stammemateriale for via qPCR at bestemme mængden af svampe-DNA i forhold til plante-DNA (se19).
- Slib prøverne i flydende nitrogen, tag 100 mg plantemateriale og ekstraher total RNA. Udfør qRT-PCR for at bestemme ekspressionen af plantegener (eller svampegener) ved angreb (se19).
- Tag fotografier af planterne med et digitalt kamera ovenfra, og hold afstanden den samme for hvert foto. Kvantificer bladarealet (f.eks. med ImageJ22 eller BlattFlaeche17,19; brug potternes diameter til at indstille skalaen) og sammenlign inficerede grupper og kontrolgrupper. Kategoriser udviklingen af sygdomssymptomer (f.eks. mindre, mere gullige eller nekrotiske blade)13.
7. Analyse af dataene
- Beregn gennemsnits- og standardafvigelsen (± SD) baseret på de biologiske replikater.
- Beregn de relative værdier ved at dividere alle resultaterne fra den inficerede gruppe med resultatet af kontrollen. Vis gennemsnittet som f.eks. "i forhold til mock" eller "i forhold til vildtype".
- Bestem statistisk signifikans mellem grupper.
Figur 1: Samling af de tre podningssystemer og individuelle trin i protokollerne. Disse tal illustrerer systemerne med modelplanten Arabidopsis thaliana. For andre plantearter skal timingen justeres. Orange felter fremhæves, hvor efterfølgende analyser anbefales mest med det respektive system. (A) For podningssystemet i petriskåle17 hældes mediet og lades størkne. Opbevar tallerkenerne i køleskabet natten over. Skær derefter og fjern den øverste tredjedel samt infektionskanalen (IC) med en skalpel (hvide områder på illustrationen blev fjernet fra agaren, mens blålige områder repræsenterer agaren). Placer frøene på den skårne overflade og luk petriskålene. Efter stratificering skal du placere pladerne lodret og lade planterne vokse. Når de fleste rødder har nået infektionskanalen, tilsættes sporeopløsningen med en pipette direkte i kanalen. Sørg for, at opløsningen er jævnt fordelt. Luk petriskålene og inkuber dem lodret i et vækstkammer. Tilgange, der kan følge, er ekspressionsanalyse med kvantitativ omvendt transkription PCR (qRT-PCR), mikroskopi med reporterlinjer og kvantificering af mikrobielt DNA. (B) Til podningssystemet i plastikkopper19 hældes mediet og overføres det adskillende plastlag med de præfabrikerede huller (fire små huller i hjørnerne til placering af frøene og et stort hul i midten for infektionskanalen). Lad mediet størkne. Skær og fjern agarmediet i midterhullet med en skalpel for at opnå infektionskanalen (IC). Rids mediet i de mindre huller og overfør frøene. Luk koppen med en omvendt kop og forsegl med luftgennemtrængelig tape (symboliseret i gul). Lad planterne vokse. Til podning tilsættes sporeopløsningen med en pipette direkte i infektionskanalen. Luk systemet og fortsæt dyrkningen i vækstkammeret. Tilgange, der kan følge, er ekspressionsanalyse med qRT-PCR, kvantificering af mikrobielt DNA og bestemmelse af frisk vægt, bladareal eller andre sygdomskarakteristika. C) »Root dip inoculation«15,17,23,24: For det jordbaserede podningssystem fyldes potterne med en jord:sandblanding. Overfør frøene og lad frøplanterne vokse. Udgrave planter af samme størrelse og vask rødderne i vand. Læg de vaskede rødder i en petriskål, der holder opløsningen med sporerne. Efter inkubation indsættes enkeltplanter i potter med jord. Tilgange, der kan følge, er ekspressionel analyse i blade med qRT-PCR, kvantificering af mikrobielt DNA og bestemmelse af frisk vægt, bladareal eller andre sygdomskarakteristika. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter protokollen blev planterne dyrket og podet med V. longisporum (stamme Vl4325) eller V. dahliae (isolat JR218). Forskellige scenarier blev designet til at bevise effektiviteten og fremhæve nogle kapaciteter i de givne protokoller. Repræsentative resultater vises.
Ekspressionel induktion af gener involveret i den antimikrobielle indol-glucosinolat (IG) biosyntese er en pålidelig indikator for evaluering af en Verticillium-infektion 17,19,26. I Arabidopsis, MYB51 (MYB-domæneprotein 51; AT1G18570) koder for en transkriptionsfaktor involveret i aktiveringen af gener, der er nødvendige for IG-biosyntese27. MYB51 kan tjene som et markørgen, der indikerer vellykket angreb, da det konsekvent induceres i rødder af V. longisporum26 eller andre jordbårne svampe såsom Phytophthora parasitica26 og Fusarium oxysporum21. To dage efter podning (2 dpi) i det petriskålsbaserede system blev induktion af MYB51 visualiseret i rødder af Arabidopsis. Reporterplantelinjen PromMYB51::YFP21 afslørede en promotoraktivering, og en qRT-PCR-analyse bekræftede en signifikant transkriptionel induktion af dette gen (figur 2A-B). Sådanne eksperimenter sigter mod at bestemme ekspressionelle ændringer i rødder under infektion.
Fordi Verticillium-arterne , der anvendes i denne undersøgelse, udfører en vaskulær livsstil og spredes fra roden til skuddet via xylemkarrene, kan mængden af svampe-DNA bestemmes i blade som en parameter for graden af svampeformering. Arabidopsis blev rodpodet i in vitro-systemet i plastikkopper, og rosetterne blev høstet 12 dage senere. Sammenlignet med den baggrundsværdi, der blev påvist i mock-kontrollen, er der fundet betydelige mængder svampe-DNA i blade fra inficerede planter (figur 2C). Dette viser, at infektionen har udviklet sig med succes. For yderligere undersøgelser kan mængden af svampe-DNA kvantificeres i forskellige plantegenotyper for at få indsigt i rodforsvarsresponser. Derudover blev rødder indsamlet på dette tidspunkt for at teste induktionen af markørgenet via qRT-PCR. MYB51 transkription overflod blev signifikant beriget (figur 2D). Dette illustrerer, at modtagelighedstest og ekspressionelle analyser let kan udføres parallelt med kopsystemet, hvilket understreger den store fordel ved denne procedure.
For at inkludere bevis for, at andre modelplantearter også kan introduceres, blev raps inficeret med V. longisporum og tomat med V. dahliae i systemet i plastikkopper. På dag 12 efter podning ved rødderne blev mængden af svampe-DNA kvantificeret i stammesegmenter skåret i bunden af kimplanterne (figur 2E-F). Svampe-DNA kunne påvises i begge plantearter, hvilket indikerer formering af patogenerne i planten. Igen kunne forskellige plantegenotyper testes for at få viden om forsvarsmekanismer.
Hvis den rodkoloniserende mikrobe af interesse ikke spredes fra rødder til blade, er det ikke muligt at kvantificere mængden af mikrobielt DNA i blade som en parameter for sygdommens sværhedsgrad. En anden mulighed for at måle sygdommens sværhedsgrad er vurdering og ekstrapolering af symptomer hos værten. For at eksemplificere dette blev Arabidopsis roddyppet podet med V. dahliae i det jordbaserede system, og det grønne bladareal blev evalueret (figur 2G-H). Mens rosetterne af mock-behandlede planter så sunde og grønne ud, havde patogeninficerede planter en reduceret bladstørrelse og gullige eller endda nekrotiske blade. På denne måde kan modtageligheden af forskellige plantegenotyper analyseres og bekræftes, for eksempel ved at kvantificere den friske vægt.
Figur 2: Repræsentative resultater opnået ved at følge protokollerne. (A,B) Arabidopsis rødder blev podet med V. longisporum i petriskålssystemet. Reporterlinjen PromMYB51::YFP21 afslørede en stærk aktivering af MYB51-promotoren i inficerede rødder sammenlignet med mock-kontrollen (mikroskopi ved 2 dpi; skalabjælke: 50 μm). Transkriptionel induktion af MYB51 i vildtyperødder (WT) blev yderligere bekræftet med qRT-PCR-analyse (2 dpi). Værdier af inficerede prøver gives i forhold til mock prøver (sat til 1) (n = 5; ± SD). (C) Systemisk kolonisering gennem V. longisporum: Efter inokulering af Arabidopsis rødder i kopsystemet blev den relative mængde svampe-DNA bestemt i blade ved kvantitativ PCR (qPCR; 12 dpi). Værdier af inficerede prøver gives i forhold til baggrundsniveau i mock prøver (indstillet til 1) (n = 3; ± SD). (D) V. longisporum inficerede og mock-behandlede rødder blev høstet fra kopsystemet, og qRT-PCR-analyse blev udført. Værdier af inficerede prøver gives i forhold til mock prøver (sat til 1) (n = 3; ± SD). MYB51 viste sig at være transkriptionelt induceret (12 dpi). (E) Raps blev podet i kopsystemet med V. longisporum, og den relative mængde svampe-DNA blev kvantificeret gennem qPCR i stammesegmenter (12 dpi). Værdier af inficerede prøver gives i forhold til baggrundsniveau i mock prøver (sat til 1) (n = 3; ± SD). (F) Tomat blev podet i kopsystemet med V. dahliae, og den relative mængde svampe-DNA blev kvantificeret gennem qPCR i stammesegmenter (12 dpi). Værdier af inficerede prøver gives i forhold til baggrundsniveau i mock prøver (sat til 1) (n = 5; ± SD). (G,H) Arabidopsis blev roddip podet med V. dahliae i det jordbaserede system, og der vises repræsentative billeder af inficerede og mock-behandlede planter (21 dpi). Det grønne bladområde blev undersøgt. I forhold til mock (indstillet til 1) havde inficerede planter mindre grønt bladareal (n = 5; ± SD). (B-F,H) For grundpar se19; statistik: elevens t-test i forhold til mock, * p≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grund af de enorme udbyttetab forårsaget af jordbårne fytopatogener1 er der behov for en forbedring af landbrugsstrategier eller afgrødesorter. Den begrænsede indsigt i patogenesen af jordbårne sygdomme hindrer udviklingen af mere resistente planter. Underliggende pathomechanismer skal undersøges, for hvilke der kræves en robust metodologisk platform. Rapporterede podningsprocedurer har vist, at multifaktorielle hændelser i rod-mikrobe-interaktioner kan dissekeres godt ved at kombinere forskellige systemer19. De ovenfor beskrevne protokoller er beregnet til at give en rutinemæssig arbejdsgang for både eksperter og forskere, der er nye på dette område. Håndteringen er ligetil, muliggør uafhængig replikering, og det nødvendige tekniske udstyr findes i standard plantevidenskabelige laboratorier.
Tidlige Verticillium-infektionshændelser (timer efter podning til 6 dpi) kan undersøges i petriskålssystemet, sene hændelser (>21 dpi) i det jordbaserede system og i kopsystemet tidsmæssigt imellem (4 til 21 dpi). Efter tilsætning af sporerne til infektionskanalen i petriskålssystemet er de i direkte kontakt med rødderne. Dette gør det muligt at undersøge tidlige forsvarsreaktioner. Som eksemplificeret med MYB51-induktionen kan ekspressionelle ændringer let studeres med genreporterkonstruktioner, qRT-PCR eller endda genom-dækkende "-omics" -tilgange17,26. Sammenlignet med de to andre infektionssystemer er forsvarsresponserne kraftigere i petriskålene. På grund af deres lille størrelse i petriskålene bliver plantene hurtigt overgroet af svampen, og intensiteten af forsvarsresponserne kan være ret unaturlig i sådanne assays19. Ekspressionelle ændringer kan også studeres i rødder af plastkopsystemet, hvilket fører til resultater, der kan sammenlignes med petriskålssystemet, dog med lavere induktionsværdier for markørgener. I forsøgsopstillingen i kopper er inokulumet ikke i umiddelbar kontakt med rødderne, sporerne skal spire, og patogenet skal vokse gennem mediet mod rødderne. Progression af infektion er langsommere sammenlignet med petriskålssystemet og derfor tættere på naturlige forhold. Med hensyn til rødder har det jordbaserede system snarere en ulempe, fordi de skal ryddes tilstrækkeligt fra jorden til analyse uden at omprogrammere genekspression ved vask. Således er det mere kompliceret at studere ekspressionelle ændringer i rødder i jorden. Det er dog muligt at teste i blade, om rodangrebet udløser reaktioner der.
I begge in vitro-podningssystemer (petriskåle og plastikkopper) kan ydre forurening forhindres, så længe hvert trin udføres under den laminære strømningshætte med sterilt udstyr. Således kan bilaterale interaktioner undersøges uforstyrret. Omvendt er det jordbaserede system bare "semisterilt", da planterne ikke er hermetisk isolerede i vækstkammeret. Ikke desto mindre kan det betragtes som den, der er tættest på naturlige forhold, da planter vokser i jord. Imidlertid er rødder beskadiget i det jordbaserede system på grund af up-rooting, hvilket giver mikrobiel adgang til vævene. Selvom dette kan være lidt kunstigt, kan dette efterligne naturlige forhold, der skader rødder, såsom nematode fodring28.
Petriskålssystemet er velegnet til at visualisere dynamikken i patogenspredning ved hjælp af fluorescerende mærkede stammer (f.eks. V. longisporumstamme Vl-sGFP 9). Rodfænotyper som følge af kolonisering er godt observerbare. På den anden side er kvantificering af sygdomssymptomer ved blade/skud i petriskåle næppe mulig, da systemet er ret lille. Desuden er der muligvis ikke plads nok til plantearter, der er større end Arabidopsis. Alternativt etablerede Behrens et al.29 et infektionssystem på plader, der er egnede til raps, hvor en børste dyppes i en sporesuspension og bruges til at fordele inokulumet langs rødder, der vokser på agar. Til vurdering af symptomer er de kop- og jordbaserede systemer bestemt at foretrække. Her kan udviklingen af symptomer (f.eks. reduceret bladareal, tab i frisk vægt, nedsat plantehøjde, omfanget af nekrotisk væv) vurderes ved blade/skud. Undersøgelse af større plantearter, såsom raps og tomat, er ikke et problem i kop- og jordbaserede systemer, som det fremgår af de repræsentative resultater. Hvis den jordbårne mikrobe, der undersøges, spredes fra rod til skud, kan patogenspecifikt DNA PCR-amplificeres i forhold til plante-DNA i skud/bladvæv. Dette kan tjene som en markør for udførelse af patogenicitetstest med forskellige plantegenotyper 13,19 og er en fordel ved anvendelse af vaskulære patogener såsom Verticillium som model. Omvendt kan forskellige genotyper af patogener anvendes til at identificere virulensgener, der er nødvendige for en vellykket kolonisering.
I alle tilfælde afhænger den bedste timing for analyser af genotype, plantearter og mikrobe. Det mest kritiske trin er at definere det bedste tidspunkt for hvert forskningsspørgsmål gennem indledende test. Ved anvendelse af andre mikrober end Verticillium bør der desuden i første omgang regnes tilstrækkelige koncentrationer til podning ud.
Udover de muligheder, der allerede er nævnt, giver kopsystemet potentialet til at udvide det til screeninger af landbrugskemikalier, der kan anvendes til at begrænse kolonisering med specifikke parasitære mikrober. Virkningen af biocidholdige kemikalier på plantens mikrobielle kolonisering kunne testes ved at tilføje den formodede antimikrobielle forbindelse direkte i agarmediet før (eller under) podning og overvåge symptomudvikling hos værten. Dette kan lette gennemførelsen af screeninger for at fremskynde opdagelsen af nye behandlinger mod jordbårne sygdomme.
Selvom flere medlemmer af jordens mikrobiom er patogene, er langt de fleste neutrale eller endda gavnlige forplantevæksten 1. Der er mulighed for at bruge protokollerne til at inokulere planter med gavnlige mikroorganismer. Tidligere blev S. indica sporer tilsat i petriskålssystemet for at undersøge de efterfølgende reaktioner i rødder26. Dette udvider spektret af de forklarede infektionssystemer til at studere ikke kun patogene, men også gavnlige interaktioner.
Da det er kendt, at mikrober i rhizosfæren påvirker hinanden6, kan dette simuleres ved en parallel podning med forskellige mikrobielle arter (eller behandling af planterne først med en og senere med en anden). Dette muliggør co-, triple- eller endda multikulturelle modeller. En mere avanceret udvidelse til passende syntetiske samfund (SynComs, samlinger af mikroorganismer) er tænkelig, da dette hjælper med at forstå indflydelsen af komplekse mikrobielle sammensætninger30.
Sammenfattende tillader podningssystemerne flere kombinationer til efterfølgende analyser og understøtter en række applikationer. Denne samling af metoder er bredt anvendelig på forskellige rodkoloniserende mikrober (både gavnlige og patogene) og tilbyder en robust platform til analyse af rod-mikrobeinteraktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender Tim Iven og Jaqueline Komorek for tidligere arbejde med disse metoder, gruppen Wolfgang Dröge-Laser (Institut for Farmaceutisk Biologi, University of Würzburg, Tyskland) for at levere det udstyr og de ressourcer, der er nødvendige for dette arbejde, og Wolfgang Dröge-Laser samt Philipp Kreisz (begge University of Würzburg) til kritisk korrekturlæsning af manuskriptet. Denne undersøgelse blev støttet af "Deutsche Forschungsgemeinschaft" (DFG, DR273/15-1,2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar (Gelrite) | Carl Roth | Nr. 0039 | all systems described require Gelrite |
| Arabidopsis thaliana wild-type | NASC stock | Col-0 (N1092) | |
| Autoclave | Systec | VE-100 | |
| BlattFlaeche | Datinf GmbH | BlattFlaeche | software to determine leaf areas |
| Brassica napus wild-type | see Floerl et al., 2008 | rapid-cycling rape | genome ACaacc |
| Cefotaxime sodium | Duchefa | C0111 | |
| Chicanery flask 500 mL | Duran Group / neoLab | E-1090 | Erlenmeyer flask with four baffles |
| Collection tubes 50 mL | Sarstedt | 62.547.254 | 114 x 28 mm |
| Czapek Dextrose Broth medium | Duchefa | C1714 | |
| Digital camera | Nikon | D3100 18-55 VR | |
| Exsiccator (Desiccator ) | Duran Group | 200 DN, 5.8 L | Seal with lid to hold chlorine gas |
| Fluorescence Microscope | Leica | Leica TCS SP5 II | |
| HCl | Carl Roth | P074.3 | |
| KNO3 | Carl Roth | P021.1 | ≥ 99 % |
| KOH | Carl Roth | 6751 | |
| Leukopor | BSN medical GmbH | 2454-00 AP | non-woven tape 2.5 cm x 9.2 m |
| MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) | Carl Roth | 4256.2 | Pufferan ≥ 99 % |
| MgSO4 | Carl Roth | T888.1 | Magnesiumsulfate-Heptahydrate |
| Murashige & Skoog medium (MS) | Duchefa | M0222 | MS including vitamins |
| NaClO | Carl Roth | 9062.1 | |
| Percival growth chambers | CLF Plant Climatics GmbH | AR-66L2 | |
| Petri-dishes | Sarstedt | 82.1473.001 | size ØxH: 92 × 16 mm |
| Plastic cups (500 mL, transparent) | Pro-pac, salad boxx | 5070 | size: 108 × 81 × 102 mm |
| Pleated cellulose filter | Hartenstein | FF12 | particle retention level 8–12 μm |
| poly klima growth chamber | poly klima GmbH | PK 520 WLED | |
| Potato Dextrose Broth medium | SIGMA Aldrich | P6685 | for microbiology |
| Pots | Pöppelmann GmbH | TO 7 D or TO 9,5 D | Ø 7 cm resp. Ø 9.5 cm |
| PromMYB51::YFP | see Poncini et al., 2017 | MYB51 reporter line | YFP (i.e. 3xmVenus with NLS) |
| Reaction tubes 2 mL | Sarstedt | 72.695.400 | PCR Performance tested |
| Rotary (orbital) shaker | Edmund Bühler | SM 30 C control | |
| Sand (bird sand) | Pet Bistro, Müller Holding | 786157 | |
| Soil | Einheitserde spezial | SP Pikier (SP ED 63 P) | |
| Solanum lycopersicum wild-type | see Chavarro-Carrero et al., 2021 | Type: Moneymaker | |
| Thoma cell counting chamber | Marienfeld | 642710 | depth 0.020 mm; 0.0025 mm2 |
| Ultrapure water (Milli-Q purified water) | MERK | IQ 7003/7005 | water obtained after purification |
| Verticillium dahliae | see Reusche et al., 2014 | isolate JR2 | |
| Verticillium longisporum | Zeise and von Tiedemann, 2002 | strain Vl43 |
References
- Mendes, R., Garbeva, P., Raaijmakers, J. M. The rhizosphere microbiome: significance of plant beneficial, plant pathogenic, and human pathogenic microorganisms. FEMS Microbiology Review. 37 (5), 634-663 (2013).
- Yadeta, K. A., Thomma, B. P. H. J. The xylem as battleground for plant hosts and vascular wilt pathogens. Frontiers in Plant Science. 4, 97 (2013).
- Delgado-Baquerizo, M., et al. The proportion of soil-borne pathogens increases with warming at the global scale. Nature Climate Change. 10 (6), 550-554 (2020).
- Berendsen, R. L., et al. Disease-induced assemblage of a plant-beneficial bacterial consortium. The ISME Journal. 12 (6), 1496-1507 (2018).
- Yuan, J., et al. Root exudates drive the soil-borne legacy of aboveground pathogen infection. Microbiome. 6 (1), 156 (2018).
- Liu, H., et al. Evidence for the plant recruitment of beneficial microbes to suppress soil-borne pathogens. New Phytologist. 229 (5), 2873-2885 (2021).
- Wang, H., Liu, R., You, M. P., Barbetti, M. J., Chen, Y. Pathogen biocontrol using plant growth-promoting bacteria (PGPR): role of bacterial diversity. Microorganisms. 9 (9), 1988 (2021).
- Inderbitzin, P., Subbarao, K. V. Verticillium systematics and evolution: how confusion impedes Verticillium wilt management and how to resolve it. Phytopathology. 104 (6), 564-574 (2014).
- Eynck, C., Koopmann, B., Grunewaldt-Stoecker, G., Karlowsky, P., von Tiedemann, A. Differential interactions of Verticillium longisporum und V. dahliae with Brassica napus with molecular and histological techniques. European Journal of Plant Pathology. 118 (3), 259-274 (2007).
- Floerl, S., et al. Defence reactions in the apoplastic proteome of oilseed rape (Brassica napus var. napus) attenuate Verticillium longisporum growth but not disease symptoms. BMC Plant Biology. 8, 129 (2008).
- Leonard, M., et al. Verticillium longisporum elicits media-dependent secretome responses with capacity to distinguish between plant-related environments. Frontiers in Microbiology. 11, 1876 (2020).
- Depotter, J. R. L., et al. Verticillium longisporum, the invisible threat to oilseed rape and other brassicaceous plant hosts. Molecular Plant Pathology. 17 (7), 1004-1016 (2016).
- Fröschel, C., et al. A gain-of-function screen reveals redundant ERF transcription factors providing opportunities for resistance breeding toward the vascular fungal pathogen Verticillium longisporum. Molecular Plant-Microbe Interactions. 32 (9), 1095-1109 (2019).
- Zhou, L., Hu, Q., Johansson, A., Dixelius, C. Verticillium longisporum and V. dahliae: infection and disease in Brassica napus. Plant Pathology. 55 (1), 137-144 (2006).
- Ralhan, A., et al. The vascular pathogen Verticillium longisporum requires a jasmonic acid-independent COI1 function in roots to elicit disease symptoms in Arabidopsis shoots. Plant Physiology. 159 (3), 1192-1203 (2012).
- Reusche, M., et al. Stabilization of cytokinin levels enhances Arabidopsis resistance against Verticillium longisporum. Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 850-860 (2013).
- Iven, T., et al. Transcriptional activation and production of tryptophan-derived secondary metabolites in Arabidopsis roots contributes to the defense against the fungal vascular pathogen Verticillium longisporum. Molecular Plant. 5 (6), 1389-1402 (2012).
- Reusche, M., et al. Infections with the vascular pathogens Verticillium longisporum and Verticillium dahliae induce distinct disease symptoms and differentially affect drought stress tolerance of Arabidopsis thaliana. Environmental and Experimental Botany. 108, 23-37 (2014).
- Fröschel, C. In-depth evaluation of root infection systems using the vascular fungus Verticillium longisporum as soil-borne model pathogen. Plant Methods. 17 (1), 57 (2021).
- Karapapa, V. K., Bainbridge, B. W., Heale, J. B. Morphological and molecular characterization of Verticillium longisporum comb, nov., pathogenic to oilseed rape. Mycological Research. 101 (11), 1281-1294 (1997).
- Poncini, L., et al. In roots of Arabidopsis thaliana, the damage-associated molecular pattern AtPep1 is a stronger elicitor of immune signalling than flg22 or the chitin heptamer. PLoS One. 12 (10), 1-21 (2017).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Fradin, E. F., et al. Genetic dissection of Verticillium wilt resistance mediated by tomato Ve1. Plant Physiology. 150 (1), 320-332 (2009).
- Singh, S., et al. The plant host Brassica napus induces in the pathogen Verticillium longisporum the expression of functional catalase peroxidase which is required for the late phase of disease. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (4), 569-581 (2012).
- Zeise, K., von Tiedemann, A. Application of RAPD-PCR for virulence type analysis within Verticillium dahliae and Verticillium longisporum. Journal of Phytopathology. 150 (10), 557-563 (2002).
- Fröschel, C., et al. Plant roots employ cell-layer-specific programs to respond to pathogenic and beneficial microbes. Cell Host & Microbe. 29 (2), 299-310 (2021).
- Gigolashvili, T., et al. The transcription factor HIG1/MYB51 regulates indolic glucosinolate biosynthesis in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 50 (5), 886-901 (2007).
- Back, M. A., Haydock, P. P. J., Jenkinson, P. Disease complexes involving plant parasitic nematodes and soilborne pathogens. Plant Pathology. 51 (6), 683-697 (2002).
- Behrens, F. H., et al. Suppression of abscisic acid biosynthesis at the early infection stage of Verticillium longisporum in oilseed rape (Brassica napus). Molecular Plant Pathology. 20 (12), 1645-1661 (2019).
- Vorholt, J. A., Vogel, C., Carlström, C. I., Müller, D. B. Establishing causality: opportunities of synthetic communities for plant microbiome research. Cell Host & Microbe. 22 (2), 142-155 (2017).
