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Stratégies d’inoculation pour infecter les racines des plantes avec des micro-organismes transmis par le sol

Published: March 1, 2022 doi: 10.3791/63446
Automatic Translation
1, 1
1Department of Pharmaceutical Biology, Julius-von-Sachs-Institute, Julius-Maximilians-Universität Würzburg

Summary

Ce protocole présente un résumé détaillé des stratégies pour inoculer les racines des plantes avec des microbes transmis par le sol. Exemple pour les champignons Verticillium longisporum et Verticillium dahliae, trois systèmes d’infection racinaire différents sont décrits. Les applications potentielles et les analyses en aval possibles sont mises en évidence, et les avantages ou les inconvénients sont discutés pour chaque système.

Abstract

La rhizosphère abrite une communauté microbienne très complexe dans laquelle les racines des plantes sont constamment remises en question. Les racines sont en contact étroit avec une grande variété de micro-organismes, mais les études sur les interactions dans le sol sont encore en retard sur celles effectuées sur les organes en surface. Bien que certaines stratégies d’inoculation pour infecter les plantes modèles avec des agents pathogènes racinaires modèles soient décrites dans la littérature, il reste difficile d’obtenir un aperçu méthodologique complet. Pour résoudre ce problème, trois systèmes d’inoculation racinaire différents sont décrits avec précision qui peuvent être appliqués pour mieux comprendre la biologie des interactions racine-microbe. À titre d’illustration, les espèces de Verticillium (à savoir , V. longisporum et V. dahliae) ont été utilisées comme agents pathogènes modèles envahissant les racines. Cependant, les méthodes peuvent être facilement adaptées à d’autres microbes colonisateurs de racines - à la fois pathogènes et bénéfiques. En colonisant le xylème végétal, les champignons vasculaires transmis par le sol tels que Verticillium spp. présentent un mode de vie unique. Après l’invasion racinaire, ils se propagent par les vaisseaux du xylème par voie acropétale, atteignent la pousse et provoquent des symptômes de la maladie. Trois espèces végétales représentatives ont été choisies comme hôtes modèles : Arabidopsis thaliana, colza économiquement important (Brassica napus) et tomate (Solanum lycopersicum). Des protocoles étape par étape sont donnés. Des résultats représentatifs des tests de pathogénicité, des analyses transcriptionnelles des gènes marqueurs et des confirmations indépendantes par des constructions de rapporteurs sont présentés. En outre, les avantages et les inconvénients de chaque système d’inoculation sont discutés en profondeur. Ces protocoles éprouvés peuvent aider à fournir des approches pour les questions de recherche sur les interactions racine-microbe. Savoir comment les plantes font face aux microbes dans le sol est crucial pour développer de nouvelles stratégies visant à améliorer l’agriculture.

Introduction

Les sols naturels sont habités par un nombre étonnant de microbes qui peuvent être neutres, nocifs ou bénéfiques pour les plantes1. De nombreux agents pathogènes des plantes sont transmis par le sol, entourent les racines et attaquent l’organe souterrain. Ces micro-organismes appartiennent à une grande variété de clades : champignons, oomycètes, bactéries, nématodes, insectes et certains virus 1,2. Une fois que les conditions environnementales favorisent l’infection, les plantes sensibles deviennent malades et les rendements des cultures diminuent. Les effets du changement climatique, tels que le réchauffement de la planète et les conditions météorologiques extrêmes, augmenteront la proportion d’agents pathogènes des plantes transmis par le sol3. Par conséquent, il deviendra de plus en plus important d’étudier ces microbes destructeurs et leur impact sur la production de denrées alimentaires et d’aliments pour animaux, mais aussi sur les écosystèmes naturels. De plus, il y a des mutualistes microbiens dans le sol qui interagissent étroitement avec les racines et favorisent la croissance, le développement et l’immunité des plantes. Lorsqu’elles sont confrontées à des agents pathogènes, les plantes peuvent recruter activement des adversaires spécifiques dans la rhizosphère qui peuvent soutenir la survie de l’hôte en supprimant les agents pathogènes 4,5,6,7. Cependant, les détails mécanistes et les voies impliquées dans les interactions bénéfiques racine-microbe sont souvent encore inconnus6.

Il est donc essentiel d’élargir la compréhension générale des interactions racine-microbe. Des méthodes fiables d’inoculation des racines avec des micro-organismes transmis par le sol sont nécessaires pour effectuer des études de modèles et transférer les résultats à des applications agricoles. Les interactions bénéfiques dans le sol sont étudiées, par exemple, avec Serendipita indica (anciennement connu sous le nom de Piriformospora indica), Rhizobium spp. fixateur d’azote ou champignons mycorhiziens, tandis que les agents pathogènes des plantes connus dans le sol comprennent Ralstonia solanacearum, Phytophthora spp., Fusarium spp. et Verticillium spp.1. Ces deux derniers sont des genres fongiques qui sont répartis dans le monde entier et causent des maladies vasculaires2. Verticillium spp. (Ascomycota) peut infecter des centaines d’espèces végétales - principalement des dicotylédones, y compris des annuelles herbacées, des plantes vivaces ligneuses et de nombreuses plantes cultivées 2,8. Les hyphes de Verticillium pénètrent dans la racine et se développent à la fois intercellulairement et intracellulairement vers le cylindre central pour coloniser les vaisseaux du xylème 2,9. Dans ces vaisseaux, le champignon reste pendant la majeure partie de son cycle de vie. Comme la sève du xylème est pauvre en nutriments et transporte des composés de défense des plantes, le champignon doit s’adapter à cet environnement unique. Ceci est accompli par la sécrétion de protéines liées à la colonisation qui permettent à l’agent pathogène de survivre dans son hôte10,11. Après avoir atteint le système vasculaire racinaire, le champignon peut se propager dans les vaisseaux du xylème par voie acropétale jusqu’au feuillage, ce qui conduit à une colonisation systémique de l’hôte 9,12. À ce stade, la plante est affectée négativement dans la croissance 9,10,13. Par exemple, un retard de croissance et des feuilles jaunes se produisent ainsi qu’une sénescence prématurée 13,14,15,16.

Un membre de ce genre est Verticillium longisporum, qui est très adapté aux hôtes brassicacés, tels que le colza agronomiquement important, le chou-fleur et la plante modèle Arabidopsis thaliana12. Plusieurs études ont combiné V. longisporum et A. thaliana pour obtenir des connaissances approfondies sur les maladies vasculaires transmises par le sol et les réponses de défense racinaire qui en résultent 13,15,16,17. Des tests de susceptibilité simples peuvent être réalisés en utilisant le système modèle V. longisporum / A. thaliana et des ressources génétiques bien établies sont disponibles pour les deux organismes. Étroitement lié à V. longisporum est l’agent pathogène Verticillium dahliae. Bien que les deux espèces fongiques effectuent un style de vie vasculaire et un processus d’invasion similaires, leur efficacité de propagation des racines aux feuilles et les symptômes de la maladie provoquée chez A. thaliana sont différents: alors que V. longisporum induit généralement une sénescence précoce, l’infection à V. dahliae entraîne un flétrissement18. Récemment, un résumé méthodologique a présenté différentes stratégies d’inoculation racinaire pour infecter A. thaliana avec V. longisporum ou V. dahliae, aidant à planifier des configurations expérimentales19. Sur le terrain, V. longisporum cause parfois des dommages importants dans la production de colza12, tandis que V. dahliae a une très large gamme d’hôtes comprenant plusieurs espèces cultivées, telles que la vigne, la pomme de terre et la tomate8. Cela rend les deux agents pathogènes économiquement intéressants à étudier.

Ainsi, les protocoles suivants utilisent à la fois V. longisporum et V. dahliae comme agents pathogènes racines modèles pour illustrer les approches possibles pour les inoculations racinaires. Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), colza (Brassica napus) et tomate (Solanum lycopersicum) ont été choisis comme hôtes modèles. Des descriptions détaillées des méthodologies peuvent être trouvées dans le texte ci-dessous et la vidéo qui l’accompagne. Les avantages et les inconvénients de chaque système d’inoculation sont discutés. Dans l’ensemble, cette collection de protocoles peut aider à identifier une méthode appropriée pour des questions de recherche spécifiques dans le contexte des interactions racine-microbe.

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Protocol

1. Milieux pour cultures fongiques et systèmes d’inoculation végétale

  1. Bouillon liquide de dextrose de pomme de terre (PDB) : Préparer 21 g/L de PDB dans de l’eau ultrapure dans une fiole thermostable.
  2. Bouillon liquide de dextrose Czapek (CDB) : Préparer 42 g/L de CDB dans de l’eau ultrapure dans une fiole thermostable.
  3. Milieu pour le système d’inoculation de la boîte de Petri : Préparer une fiole thermostable avec 1,5 g/L de milieu Murashige et Skoog (MS) et 8 g/L d’agar dans de l’eau ultrapure.
    REMARQUE: Évitez le sucre dans ce milieu car il entraînera une croissance fongique excessive après l’inoculation.
  4. Milieu pour le système d’inoculation à base de gobelet en plastique : Préparer une fiole thermostable contenant 4,4 g/L de MS, 0,2 g/L mgSO4, 1 g/L deKNO3, 0,5 g/L d’acide 2-(N-morpholino)éthanesulfonique (MES) et 6,0 g/L de gélose dans de l’eau ultrapure et ajuster le pH à 5,7 avec 5 M KOH.
    REMARQUE: Évitez le sucre dans ce milieu car il entraînera une croissance fongique excessive après l’inoculation.
  5. Milieu 1/4 MS : Préparer 1,2 g/L de SEP dans de l’eau ultrapure.
  6. Utilisez l’autoclave pour stériliser toutes les solutions ci-dessus. Mettez les flacons en verre dans le panier, fermez le couvercle et stérilisez pendant 15 min à 121 °C et 98,9 kPa.

2. Stérilisation de la surface des graines de plantes

REMARQUE: Utilisez toujours le protocole ci-dessous pour stériliser la surface des graines d’Arabidopsis, de colza et de tomate avant le semis.

  1. Transférer les graines dans un tube de réaction de 2 mL. Placez le tube dans un exsiccateur d’une capacité interne de 5,8 L.
  2. Générer du chlore gazeux dans l’exsiccateur en ajoutant 6 mL d’acide chlorhydrique à 33 % (HCl) dans 100 mL d’hypochlorite de sodium aqueux (NaClO) à 12 %.
  3. Fermez immédiatement le couvercle de l’exsiccateur et incubez les graines pendant 3 h dans le gaz.

3. Préparation de l’inoculum avec des spores de Verticillium (conidies dérivées asexuées)

REMARQUE: Cultiver V. dahliae (souche JR2) de la même manière que V. longisporum (souche Vl43)17,18,19. Assurez-vous que tout l’équipement et les milieux sont exempts de germes et que toutes les étapes sont effectuées dans une hotte à flux laminaire pour garder l’inoculum axenique.

  1. Remplir 150 mL de PDB liquide (étape 1.1) dans une fiole de chicanerie de 500 mL et compléter le milieu avec 500 mg/L de céfotaxime.
  2. Ajouter Verticillium conida du stockage du stock de glycérol au milieu PDB. Fermez la fiole avec un bouchon en mousse stérile.
  3. Incuber la culture pendant 7 à 10 jours dans une boîte sombre à température ambiante (RT) sous agitation continue et horizontale (agitateur rotatif; 60 tr / min). Il en résulte de petites sphères de mycélium blanches.
  4. Retirez et jetez soigneusement le surnageant PDB. La plupart des mycéliums doivent rester dans la fiole.
  5. Ajouter 100 mL de CDB liquide (étape 1.2) sur le mycélium dans la fiole de chicanerie et compléter le milieu avec 500 mg/L de céfotaxime.
  6. Incuber encore 4-5 jours dans une boîte sombre à RT sous agitation horizontale continue (agitateur rotatif, 60 tr / min) pour induire une sporulation. Le surnageant deviendra jaunâtre-grisâtre au fur et à mesure que les conidies seront libérées.
  7. Filtrer une partie (5-10 mL) du liquide contenant des conidies à travers un papier filtre (niveau de rétention des particules de 8-12 μm) dans un tube de collecte stérile de 50 mL. Cela sépare les spores du mycélium.
  8. Déterminez la concentration de spores à l’aide d’une chambre de comptage cellulaire et d’un microscope. Diluer avec un milieu 1/4 MS sans germes dans de l’eau ultrapure jusqu’à l’obtention des concentrations de spores indiquées ci-dessous.
    REMARQUE: Au microscope, les conidies de V. longisporum sont pour la plupart de longues dessinées et de taille 7,1-8,8 μm, tandis que les conidies de V. dahliae sont plus courtes (3,5-5,5 μm) et plutôtsphériques 20.
  9. Utilisez ces conidies fraîchement récoltées comme inoculum. Assurez-vous de mener les expériences toujours avec des conidies fraîchement récoltées et non avec des stocks congelés, car la congélation réduit considérablement le nombre de spores viables19.
  10. Pour un stockage à long terme, congeler les spores sous forme de solution de spores hautement concentrée (environ 1 x 108 spores/mL) dans du glycérol à 25 % à -80 °C (stockable jusqu’à 1 an). Pour les prochaines expériences, utilisez ces stocks de glycérol pour inoculer le milieu PDB à l’étape 3.2.

4. Un système d’inoculation stérile in vitro à base de boîtes de Pétri

REMARQUE: Pour le système de boîtede Petri 17, assurez-vous que tout l’équipement et les supports sont exempts de germes et que toutes les étapes sont effectuées dans une hotte à flux laminaire.

  1. Après l’autoclavage, versez le milieu (voir étape 1.3) dans des boîtes de Pétri.
  2. Après le durcissement du milieu, remballez les boîtes de Petri dans un sac en plastique stérile et conservez-les à l’envers pendant la nuit au réfrigérateur (4-10 °C). Un milieu réfrigéré aide à prévenir le glissement du milieu dans les étapes suivantes.
  3. Coupez et retirez un canal d’infection et le tiers supérieur du milieu solidifié avec un scalpel (Figure 1A). Évitez d’obtenir du liquide ou de l’air sous le milieu de la gélose pendant la coupe; sinon, le milieu glissera et fermera le canal d’infection.
  4. Distribuer 50 à 100 graines d’Arabidopsis stérilisées en surface avec une pointe de pipette stérile sur la surface supérieure coupée. Placez les graines dans l’angle où la surface de la gélose coupée entre en contact avec la paroi de la boîte de Pétri afin que les racines puissent pousser entre le milieu et la paroi de la boîte de Pétri. Cela facilitera l’inoculation plus tard.
  5. Fermez les boîtes de Petri et scellez-les avec du ruban adhésif perméable à l’air pour permettre l’échange de gaz.
  6. Après stratification pendant 2 jours dans l’obscurité à 4 °C, placez les plaques verticalement dans un rack approprié et faites pousser les plantes à 22 °C ± 1 °C dans des conditions de longue journée (16 h de lumière / 8 h d’obscurité) dans une chambre de croissance.
  7. Lorsque la majorité des racines atteignent le canal d’infection (environ 9 à 11 jours de semis), posez les plaques horizontalement, ouvrez-les et ajoutez 500 μL de conidies verticillium fraîchement récoltées avec une concentration de 4 x 105 spores / mL directement dans le canal infectieux, en s’assurant que le liquide est réparti uniformément dans le canal.
  8. De même, préparer les plaques de contrôle en ajoutant 500 μL d’une solution simulée au lieu de spores (milieu 1/4 MS sans germes).
  9. Incuber les plaques horizontalement pendant quelques minutes jusqu’à ce que le liquide ait trempé et ne puisse pas s’échapper lorsque les plaques sont à nouveau installées verticalement. Ensuite, fermez le couvercle et scellez les plaques avec du ruban adhésif perméable à l’air.
  10. Incuber les plaques verticalement dans la chambre de croissance. En option, couvrez les parties racinaires avec des boîtes en papier noires pour assombrir les racines et les champignons transmis par le sol (voir19).
  11. Effectuer les analyses aux points temporels préférés après l’inoculation en fonction de la question de recherche (se référer aux légendes de figure pour les points de temps exacts utilisés ici). Voici quelques suggestions.
    1. Coupez les feuilles des racines et récoltez les deux séparément. Sortez les bandes de gélose des boîtes de Pétri pour accéder facilement aux racines et retirez-les soigneusement de la gélose à l’aide d’une pince. Congeler immédiatement tout le matériel végétal dans de l’azote liquide.
      1. Broyer les échantillons dans de l’azote liquide. Extraire l’ADN total de 100 mg de matière foliaire pour déterminer par PCR quantitative (qPCR) la quantité d’ADN fongique par rapport à l’ADN végétal (voir19).
      2. Broyer les échantillons dans de l’azote liquide. Prendre 100 mg de matériel végétal et extraire l’ARN total. Effectuer une PCR quantitative par transcription inverse (qRT-PCR) pour déterminer l’expression des gènes végétaux (ou gènes fongiques) pendant l’infestation (voir19).
    2. Retirez soigneusement les racines de la gélose pour éviter toute blessure et examinez-les au microscope fluorescent.
      1. Déterminer l’induction de gènes marqueurs dans les lignées de rapporteurs végétaux (p. ex. luciférase, β-glucuronidase ou rapporteurs fluorescents 17,19,21).
      2. Visualiser la propagation fongique à la racine à l’aide de lignes rapporteures fongiques (p. ex., V. longisporum exprimant de manière constitutive la protéine fluorescente verte améliorée, Vl-sGFP9) ou par des techniques de coloration (p. ex., par l’intermédiaire du 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-N-acétyl-bêta-d-glucosaminide (X-bêta-D-Glc-Nac)18).

5. Un système d’inoculation stérile in vitro organisé avec des gobelets en plastique

REMARQUE: Comme indiqué dans la première description de cette technique19, assurez-vous que tout l’équipement et les milieux sont exempts de germes et que toutes les étapes sont effectuées dans une hotte à écoulement laminaire.

  1. Utilisez des gobelets en plastique transparent d’un volume total de 500 mL et stérilisez-les dans un bain d’éthanol à 70% à 75% pendant au moins 20 min. Séchez les tasses dans la hotte à écoulement laminaire.
  2. Versez le milieu autoclavé (voir étape 1.4) dans les gobelets en plastique. Éventuellement, ajouter le céfotaxime (concentration finale de 50 mg/L) au milieu autoclavé pour éviter les contaminations bactériennes. Utilisez 150 mL de milieu par tasse pour les expériences avec Arabidopsis ou plus de milieu (250-300 mL par tasse) pour les expériences avec des espèces végétales plus grandes (colza, tomate).
  3. Placer une couche de plastique (stérilisée avant par incubation dans de l’éthanol à 70 % à 75 % pendant 20 min) sur le milieu avant qu’il ne se solidifie (Figure 1B).
    REMARQUE: Cette couche de plastique contient quatre trous préfabriqués aux coins pour placer des graines stérilisées en surface. Cela permet aux graines d’accéder au milieu. Plus tard, cette couche de séparation empêche les feuilles de toucher le milieu contenant le champignon, de sorte que les microbes ne peuvent pas attaquer directement les feuilles et doivent emprunter la voie racinaire. Un autre trou est au centre, permettant de couper le canal d’infection.
  4. Lorsque le milieu s’est solidifié, coupez la gélose avec un scalpel à travers le trou central préfabriqué à une profondeur d’environ 1,5 cm. Retirez la gélose coupée pour créer un canal d’infection dans lequel les spores fongiques peuvent être ajoutées plus tard.
  5. Grattez légèrement le milieu de la gélose avec une pointe de pipette dans les quatre trous plus petits pour interrompre la peau solidifiée (cela permet aux graines d’absorber l’eau du milieu aqueux de la gélose). Placez les graines à l’aide d’une pointe de pipette dans les trous plus petits.
  6. Fermez le gobelet en plastique avec un deuxième gobelet en plastique inversé et scellez-le avec du ruban adhésif perméable à l’air. Le ruban doit permettre l’échange de gaz.
  7. Après stratification pendant 3 jours dans l’obscurité à 4 °C, incuber les systèmes de gobelets sous 12 h de lumière / 12 h d’obscurité (Arabidopsis, colza) ou 16 h de lumière / 8 h d’obscurité (tomate) dans des chambres de croissance à une température constante de 22 °C et 60% d’humidité.
  8. Suivez l’âge recommandé des plantes pour l’inoculation: 21 jours pour Arabidopsis; 5-7 jours pour le colza; 12 jours pour la tomate.
  9. Inoculez les plantules avec Verticillium en ajoutant 1 mL de solution de conidies (concentration recommandée : 4 x 105 spores/mL) dans le canal infectieux. Pour préparer les échantillons témoins, ajouter 1 mL de solution simulée sans spores (milieu 1/4 MS sans germes) dans le canal.
  10. Effectuer les analyses aux points temporels préférés après l’inoculation en fonction de la question de recherche (se référer aux légendes de figure pour les points de temps exacts utilisés ici). Voici quelques suggestions.
    1. Prenez des photos des plantes avec un appareil photo numérique d’en haut en gardant la même distance pour chaque photo. Quantifier la surface foliaire (p. ex., avec ImageJ22 ou BlattFlaeche17,19; utiliser la longueur des tasses pour définir l’échelle) et comparer les groupes infectés et témoins. Catégoriser le développement des symptômes de la maladie (p. ex., feuilles plus petites, plus jaunâtres ou nécrotiques).
      REMARQUE: S’il y a des tiges sur Arabidopsis, retirez-les pour obtenir de meilleures photos des rosettes.
    2. Enlever les racines et définir la biomasse (poids frais) des pousses des échantillons infectés et témoins en les pesant. Déterminer le poids relativement frais19.
    3. Prélever les échantillons pour les analyses moléculaires comme suit.
    4. Arabidopsis: Enlevez les tiges s’il y en a. Coupez les rosettes à la base des racines. Assurez-vous d’exclure tout le matériel racinaire de l’échantillon et de récolter des rosettes entières. Combinez 4-5 rosettes de différentes plantes en un seul échantillon et congelez la matière foliaire dans de l’azote liquide.
    5. Retirez soigneusement les racines du milieu avec des pinces, pressez-les et tamponnez-les avec une serviette en papier pour enlever les restes de gélose et combinez 4 à 5 racines de différentes plantes en un seul échantillon. Congeler immédiatement dans de l’azote liquide.
    6. Colza/tomate : Couper les segments de tige de l’hypocotyle (p. ex., 1 cm de longueur; toujours prendre la même région de tige). Mélanger le matériel de 4-5 plantes dans chaque échantillon et congeler dans de l’azote liquide.
    7. Broyer les échantillons dans de l’azote liquide. Extraire l’ADN total de 100 mg de la feuille ou de la tige pour déterminer par qPCR la quantité d’ADN fongique par rapport à l’ADN de la plante (voir19).
    8. Broyer les échantillons dans de l’azote liquide, prélever 100 mg de matériel végétal et extraire l’ARN total. Effectuer une qRT-PCR pour déterminer l’expression des gènes végétaux (ou gènes fongiques) lors de l’infestation (voir19).

6. Un système d’inoculation à base de sol dans des pots

  1. Mélangez soigneusement le sol et le sable dans un rapport volumétrique de 3:1 (sol:sable) pour faciliter le lavage du substrat des racines. Versez le mélange dans un sac autoclave. Si le mélange est trop sec, ajoutez une quantité appropriée d’eau et mélangez-la dans le substrat. Cuire à la vapeur à 80 °C pendant 20 min dans un autoclave pour minimiser les contaminations microbiennes.
    REMARQUE: Évitez de chauffer à plus de 80 ° C, car cela pourrait affecter les nutriments organiques du sol.
  2. Remplissez les pots avec le mélange terre-sable et transférez-les dans des plateaux. Ajoutez de l’eau dans les plateaux à environ 1/3 de la hauteur d’un pot, de sorte que le mélange sol-sable soit bien trempé dans l’eau. De plus, vaporisez le substrat avec un flacon pulvérisateur pour assurer des conditions de départ humides.
  3. Semez 3 à 4 graines dans chaque pot (Figure 1C) en vous assurant que les graines sont suffisamment éloignées les unes des autres. Conservez-les pendant 3 jours dans l’obscurité à 4 °C pour la stratification afin de synchroniser la germination.
    REMARQUE: Pré-cultiver un excès de plantes, ce qui permet une sélection de plantes de taille similaire pour les expériences d’inoculation et réduit les écarts dus aux différences individuelles.
  4. Laissez les semis pousser dans des conditions de longue journée (16 h de lumière / 8 h d’obscurité; température constante de 22 ° C; 60% d’humidité) avec un arrosage régulier.
  5. Suivez l’âge recommandé des plantes pour l’inoculation: 21 jours pour Arabidopsis, 7 jours pour le colza et 10 jours pour la tomate. Cueillez des plantes de taille similaire pour effectuer l’inoculation par immersion racinaire 15,17,23,24. Retirez la terre des pots et excusez soigneusement les racines.
  6. Ne lavez doucement que les racines dans un récipient d’eau et gardez les rosettes hors de l’eau. Incuber les racines lavées pendant 60 min dans une boîte de Petri contenant la solution de spores de Verticillium (concentration recommandée : 2 x 106 spores/mL). Pour le groupe témoin non infecté, incuber les racines pendant 60 min dans la solution simulée sans spores (milieu 1/4 MS sans germes).
  7. Préparez de nouveaux pots avec un sol humide et stérilisé à la vapeur (80 °C pendant 20 min) sans sable. Utilisez une pointe de pipette pour faire un trou au centre du sol dans chaque pot.
  8. Placez directement les racines dans le trou (ne transférez qu’une seule plante par pot). Après avoir inséré les racines, assurez-vous de remplir soigneusement les trous avec de la terre. Évitez d’appuyer sur le sol, sinon le rempotage peut causer des symptômes de stress tels que des feuilles violettes.
  9. Cultivez des groupes infectés et témoins dans des conditions de longue journée (16 h de lumière / 8 h d’obscurité; une température constante de 22 ° C; 60% d’humidité) avec un arrosage régulier.
  10. Effectuer les analyses aux points temporels préférés après l’inoculation en fonction de la question de recherche (se référer aux légendes de figure pour les points de temps exacts utilisés ici). Voici quelques suggestions.
    1. Prenez des photos des plantes avec un appareil photo numérique d’en haut, en gardant la même distance pour chaque photo. Quantifier la surface foliaire (p. ex., avec ImageJ22 ou BlattFlaeche17,19; utiliser le diamètre des pots pour définir l’échelle) et comparer les groupes infectés et témoins. Catégoriser le développement des symptômes de la maladie (p. ex., feuilles plus petites, plus jaunâtres ou nécrotiques)13.
      REMARQUE: Enlever les tiges d’Arabidopsis facilite la prise de photos des rosettes.
    2. Enlever les racines et définir la biomasse (poids frais) des pousses des échantillons infectés et témoins en les pesant. Déterminer le poids relativement frais19.
    3. Alternativement, mesurez la hauteur de la plante ou catégorisez l’excroissance fongique des segments de tige pour évaluer la gravité de la maladie13.
    4. Prélever des échantillons pour des analyses moléculaires comme suit.
    5. Arabidopsis: Enlevez les tiges. Coupez les rosettes au niveau de la couronne racinaire. Combinez 4-5 rosettes de différentes plantes en un seul échantillon. Congeler la matière foliaire dans de l’azote liquide.
      REMARQUE: Dans le cas des racines, il est difficile de les nettoyer suffisamment du sol sans reprogrammer l’expression des gènes par lavage.
    6. Colza/tomate : Couper les segments de tige de l’hypocotyle (p. ex., 1 cm de longueur; toujours prendre la même région de tige). Combinez le matériel de 4 à 5 plantes en un seul échantillon et congelez-le dans de l’azote liquide.
    7. Broyer les échantillons dans de l’azote liquide. Extraire l’ADN total de 100 mg de feuille ou de tige pour déterminer par qPCR la quantité d’ADN fongique par rapport à l’ADN végétal (voir19).
    8. Broyer les échantillons dans de l’azote liquide, prélever 100 mg de matériel végétal et extraire l’ARN total. Effectuer une qRT-PCR pour déterminer l’expression des gènes végétaux (ou gènes fongiques) lors de l’infestation (voir19).

7. Analyse des données

  1. Calculer la moyenne et l’écart-type (± SD) en fonction des répliques biologiques.
  2. Calculez les valeurs relatives en divisant tous les résultats du groupe infecté par le résultat du contrôle. Affichez la moyenne comme, par exemple, « par rapport à la simulation » ou « par rapport au type sauvage ».
  3. Déterminer la signification statistique entre les groupes.

Figure 1
Figure 1 : Compilation des trois systèmes d’inoculation et des différentes étapes des protocoles. Ces figures illustrent les systèmes avec la plante modèle Arabidopsis thaliana. Pour les autres espèces végétales, le moment doit être ajusté. Les cases orange sont en surbrillance, pour lesquelles des analyses ultérieures sont les plus recommandées avec le système respectif. (A) Pour le système d’inoculation dans les boîtes de Pétri17, versez le milieu et laissez-le se solidifier. Conservez les assiettes au réfrigérateur pendant la nuit. Ensuite, coupez et retirez le tiers supérieur ainsi que le canal d’infection (CI) avec un scalpel (les zones blanches de l’illustration ont été retirées de la gélose, tandis que les zones bleuâtres représentent la gélose). Placez les graines sur la surface coupée et fermez les boîtes de Pétri. Après stratification, placez les plaques verticalement et laissez les plantes pousser. Une fois que la plupart des racines ont atteint le canal d’infection, ajoutez la solution de spores avec une pipette directement dans le canal. Assurez-vous que la solution est répartie uniformément. Fermez les boîtes de Petri et incuvrez-les verticalement dans une chambre de croissance. Les approches qui peuvent suivre sont l’analyse expressionnelle avec PCR quantitative à transcription inverse (qRT-PCR), la microscopie avec des lignes rapporteures et la quantification de l’ADN microbien. (B) Pour le système d’inoculation dans les gobelets en plastique19, versez le milieu et transférez la couche de plastique de séparation avec les trous préfabriqués (quatre petits trous dans les coins pour placer les graines et un grand trou au centre pour le canal d’infection). Laissez le milieu se solidifier. Coupez et retirez le milieu de la gélose dans le trou central avec un scalpel pour obtenir le canal d’infection (CI). Grattez le milieu dans les petits trous et transférez les graines. Fermez la tasse avec une tasse inversée et scellez-la avec du ruban adhésif perméable à l’air (symbolisé en jaune). Laissez les plantes pousser. Pour l’inoculation, ajouter la solution de spores avec une pipette directement dans le canal d’infection. Fermez le système et continuez la culture dans la chambre de croissance. Les approches qui peuvent suivre sont l’analyse expressionnelle avec qRT-PCR, la quantification de l’ADN microbien et la détermination du poids frais, de la surface foliaire ou d’autres caractéristiques de la maladie. (C) « Inoculation par immersion racinaire"15,17,23,24: pour le système d’inoculation à base de sol, remplir les pots avec un mélange sol/sable. Transférez les graines et laissez les semis pousser. Excaver des plantes de taille similaire et laver les racines dans l’eau. Placez les racines lavées dans une boîte de Pétri contenant la solution avec les spores. Après l’incubation, insérez des plantes individuelles dans des pots avec de la terre. Les approches qui peuvent suivre sont l’analyse expressionnelle dans les feuilles avec qRT-PCR, la quantification de l’ADN microbien et la détermination du poids frais, de la surface foliaire ou d’autres caractéristiques de la maladie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Representative Results

Conformément au protocole, les plantes ont été cultivées et inoculées avec V. longisporum (souche Vl4325) ou V. dahliae (isolat JR218). Divers scénarios ont été conçus pour prouver l’efficacité et mettre en évidence certaines capacités des protocoles donnés. Des résultats représentatifs sont présentés.

L’induction expressionnelle des gènes impliqués dans la biosynthèse antimicrobienne indol-glucosinolate (IG) est un indicateur fiable pour l’évaluation d’une infection à Verticillium 17,19,26. Chez Arabidopsis, MYB51 (protéine de domaine MYB 51; AT1G18570) code un facteur de transcription impliqué dans l’activation des gènes nécessaires à la biosynthèse IG27. MYB51 peut servir de gène marqueur qui indique une infestation réussie car il est systématiquement induit dans les racines par V. longisporum26 ou d’autres champignons du sol tels que Phytophthora parasitica26 et Fusarium oxysporum21. Deux jours après l’inoculation (2 dpi) dans le système à base de boîte de Petri, l’induction de MYB51 a été visualisée dans les racines d’Arabidopsis. La lignée végétale rapporteure Prom MYB51::YFP21 a révélé une activation du promoteur et une analyse qRT-PCR a confirmé une induction transcriptionnelle significative de ce gène (Figure 2A-B). De telles expériences visent à déterminer les changements expressionnels dans les racines pendant l’infection.

Étant donné que les espèces de Verticillium utilisées dans cette étude effectuent un mode de vie vasculaire et se propagent de la racine à la pousse via les vaisseaux du xylème, la quantité d’ADN fongique peut être déterminée dans les feuilles comme paramètre du degré de propagation fongique. Arabidopsis a été inoculé dans le système in vitro dans des gobelets en plastique et les rosettes ont été récoltées 12 jours plus tard. Par rapport à la valeur de fond détectée dans le contrôle fictif, des quantités substantielles d’ADN fongique ont été trouvées dans les feuilles de plantes infectées (Figure 2C). Cela démontre que l’infection a progressé avec succès. Pour des examens plus approfondis, la quantité d’ADN fongique peut être quantifiée dans différents génotypes de plantes pour mieux comprendre les réponses de défense des racines. De plus, des racines ont été collectées à ce moment-là pour tester l’induction du gène marqueur via qRT-PCR. L’abondance des transcriptions MYB51 a été considérablement enrichie (figure 2D). Cela montre que les tests de susceptibilité et les analyses expressionnelles peuvent facilement être effectués en parallèle avec le système de tasse, ce qui souligne le grand avantage de cette procédure.

Pour inclure des preuves que d’autres espèces végétales modèles peuvent également être introduites, le colza a été infecté par V. longisporum et la tomate par V. dahliae dans le système dans des gobelets en plastique. Le jour 12 après l’inoculation aux racines, la quantité d’ADN fongique a été quantifiée dans des segments de tige coupés à la base des semis (Figure 2E-F). L’ADN fongique était détectable chez les deux espèces végétales, ce qui indique la propagation des agents pathogènes dans la plante. Encore une fois, différents génotypes de plantes pourraient être testés pour acquérir des connaissances sur les mécanismes de défense.

Si le microbe colonisateur racinaire d’intérêt ne se propage pas des racines aux feuilles, il n’est pas possible de quantifier la quantité d’ADN microbien dans les feuilles comme paramètre de gravité de la maladie. Une autre option pour mesurer la gravité de la maladie est l’évaluation et l’extrapolation des symptômes chez l’hôte. À titre d’exemple, Arabidopsis a été inoculé avec V. dahliae dans le système à base de sol et la surface des feuilles vertes a été évaluée (figure 2G-H). Alors que les rosettes des plantes traitées par simulacre semblaient saines et vertes, les plantes infectées par des agents pathogènes avaient une taille de feuille réduite et des feuilles jaunâtres ou même nécrotiques. De cette manière, la susceptibilité de différents génotypes de plantes peut être analysée et confirmée, par exemple, en quantifiant le poids frais.

Figure 2
Figure 2: Résultats représentatifs obtenus en suivant les protocoles. (A,B) Les racines d’Arabidopsis ont été inoculées avec V. longisporum dans le système de boîte de Pétri. La ligne de rapporteur PromMYB51::YFP21 a révélé une forte activation du promoteur MYB51 dans les racines infectées par rapport au contrôle simulé (microscopie à 2 dpi; barre d’échelle: 50 μm). L’induction transcriptionnelle de MYB51 dans les racines de type sauvage (WT) a été confirmée par une analyse qRT-PCR (2 dpi). Les valeurs des échantillons infectés sont données par rapport aux échantillons fictifs (définies sur 1) (n = 5; ± SD). (C) Colonisation systémique par V. longisporum: Après avoir inoculé les racines d’Arabidopsis dans le système de coupe, la quantité relative d’ADN fongique a été déterminée dans les feuilles par PCR quantitative (qPCR; 12 dpi). Les valeurs des échantillons infectés sont données par rapport au niveau de fond dans les échantillons fictifs (réglés sur 1) (n = 3; ± SD). (D) Des racines infectées et simulées de V. longisporum ont été prélevées dans le système de coupe et une analyse qRT-PCR a été effectuée. Les valeurs des échantillons infectés sont données par rapport aux échantillons fictifs (définies sur 1) (n = 3; ± SD). MyB51 s’est avéré être induit par transcription (12 dpi). (E) Le colza a été inoculé dans le système de coupe avec V. longisporum et la quantité relative d’ADN fongique a été quantifiée par qPCR dans des segments de tige (12 dpi). Les valeurs des échantillons infectés sont données par rapport au niveau de fond dans les échantillons fictifs (définies sur 1) (n = 3; ± SD). (F) La tomate a été inoculée dans le système de coupe avec V. dahliae et la quantité relative d’ADN fongique a été quantifiée par qPCR dans des segments de tige (12 dpi). Les valeurs des échantillons infectés sont données par rapport au niveau de fond dans les échantillons fictifs (réglés sur 1) (n = 5; ± SD). (G,H) Arabidopsis a été inoculé avec V. dahliae dans le système à base de sol et des images représentatives de plantes infectées et traitées de manière simulée sont montrées (21 dpi). La zone des feuilles vertes a été examinée. Par rapport à la simulation (réglée sur 1), les plantes infectées avaient moins de surface foliaire verte (n = 5; ± SD). (B-F,H) Pour les paires d’amorces, voir19; statistiques: test t de l’élève par rapport à la simulation, * p≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

En raison des énormes pertes de rendement causées par les phytopathogènes transmis par le sol1, une amélioration des stratégies agricoles ou des variétés de cultures est nécessaire. La compréhension limitée de la pathogenèse des maladies transmises par le sol entrave le développement de plantes plus résistantes. Les mécanismes pathologiques sous-jacents doivent être explorés, pour lesquels une plate-forme méthodologique robuste est nécessaire. Les procédures d’inoculation rapportées ont montré que les événements multifactoriels dans les interactions racine-microbe peuvent être bien disséqués en combinant différents systèmes19. Les protocoles décrits ci-dessus sont destinés à fournir un flux de travail de routine pour les experts et les chercheurs nouveaux dans ce domaine. La manipulation est simple, permet une réplication indépendante et l’équipement technique requis existe dans les laboratoires standard de phytologie.

Les événements précoces d’infection par le verticillium (heures après l’inoculation à 6 dpi) peuvent être examinés dans le système de boîte de Pétri, les événements tardifs (>21 dpi) dans le système à base de sol et dans le système de tasse temporellement entre les deux (4 à 21 dpi). Après avoir ajouté les spores au canal d’infection du système de boîte de Pétri, elles sont en contact direct avec les racines. Cela permet d’examiner les premières réponses de défense. Comme l’illustre l’induction de MYB51, les changements expressionnels peuvent être facilement étudiés avec des constructions de rapporteurs de gènes, qRT-PCR, ou même des approches « -omiques » à l’échelle du génome17,26. Par rapport aux deux autres systèmes d’infection, les réponses de défense sont plus vigoureuses dans les boîtes de Pétri. En raison de leur petite taille dans les boîtes de Pétri, les plantules sont rapidement envahies par le champignon et l’intensité des réponses de défense peut être plutôt contre nature dans de tels essais19. Les changements expressionnels peuvent également être étudiés dans les racines du système de gobelets en plastique, ce qui conduit à des résultats comparables au système de boîte de Petri, bien qu’avec des valeurs d’induction plus faibles pour les gènes marqueurs. Dans la configuration expérimentale en coupes, l’inoculum n’est pas en contact immédiat avec les racines, les spores doivent germer et l’agent pathogène doit se développer à travers le milieu vers les racines. La progression de l’infection est plus lente par rapport au système de boîte de Petri et, par conséquent, plus proche des conditions naturelles. En ce qui concerne les racines, le système à base de sol présente plutôt un inconvénient, car elles doivent être suffisamment dégagées du sol pour être analysées sans reprogrammer l’expression des gènes par lavage. Ainsi, l’étude des changements expressionnels dans les racines est plus compliquée dans le sol. Cependant, il est possible de tester dans les feuilles si l’infestation racinaire y déclenche des réponses.

Dans les deux systèmes d’inoculation in vitro (boîtes de Petri et gobelets en plastique), les contaminations externes peuvent être évitées tant que chaque étape est exécutée sous la hotte à flux laminaire avec un équipement stérile. Ainsi, les interactions bilatérales peuvent être examinées sans être perturbées. Inversement, le système basé sur le sol est juste « semi-stérile » car les plantes ne sont pas isolées hermétiquement dans la chambre de croissance. Néanmoins, il peut être considéré comme celui qui se rapproche le plus des conditions naturelles lorsque les plantes poussent dans le sol. Cependant, les racines sont endommagées dans le système à base de sol en raison de l’enracinement ascendant, qui offre un accès microbien aux tissus. Bien que cela puisse être un peu artificiel, cela pourrait imiter les conditions naturelles qui blessent les racines, comme l’alimentation desnématodes 28.

Le système de boîte de Petri est bien adapté pour visualiser la dynamique de la propagation des agents pathogènes à l’aide de souches marquées par fluorescence (par exemple, la souche V. longisporum Vl-sGFP9). Les phénotypes racinaires résultant de la colonisation sont bien observables. D’autre part, la quantification des symptômes de la maladie au niveau des feuilles / pousses dans les boîtes de Pétri est difficilement réalisable car le système est assez petit. De plus, il pourrait ne pas y avoir assez d’espace pour les espèces végétales plus grandes qu’Arabidopsis. Alternativement, Behrens et al.29 ont établi un système d’infection sur des plaques adaptées au colza, où une brosse est trempée dans une suspension de spores et utilisée pour distribuer l’inoculum le long des racines poussant sur la gélose. Pour évaluer les symptômes, les systèmes à base de tasse et de sol sont certainement préférables. Ici, le développement de symptômes (p. ex., réduction de la surface foliaire, perte de poids frais, diminution de la hauteur de la plante, étendue du tissu nécrotique) peut être évalué au niveau des feuilles ou des pousses. L’étude d’espèces végétales plus importantes, telles que le colza et la tomate, n’est pas un problème dans les systèmes à base de tasses et de sols, comme le démontrent les résultats représentatifs. Si le microbe du sol étudié se propage d’une racine à l’autre, l’ADN spécifique à l’agent pathogène peut être amplifié par PCR par rapport à l’ADN de la plante dans le tissu des pousses et des feuilles. Cela peut servir de marqueur pour effectuer des tests de pathogénicité avec différents génotypes de plantes13,19 et constitue un avantage lors de l’utilisation d’agents pathogènes vasculaires tels que Verticillium comme modèle. Inversement, différents génotypes d’agents pathogènes peuvent être appliqués pour identifier les gènes de virulence nécessaires à une colonisation réussie.

Dans tous les cas, le meilleur moment pour les analyses dépend du génotype, des espèces végétales et des microbes. L’étape la plus critique consiste à définir le meilleur moment pour chaque question de recherche par le biais de tests préliminaires. En outre, lors de l’utilisation d’autres microbes que Verticillium, des concentrations adéquates pour l’inoculation doivent d’abord être déterminées.

Outre les possibilités déjà mentionnées, le système de gobelets offre la possibilité de l’étendre pour les criblages de produits agrochimiques qui pourraient être appliqués pour limiter la colonisation par des microbes parasites spécifiques. L’impact des produits chimiques biocides sur la colonisation microbienne des plantes pourrait être testé en ajoutant le composé antimicrobien putatif directement dans le milieu agar avant (ou pendant) l’inoculation et en surveillant le développement des symptômes chez l’hôte. Cela pourrait faciliter la mise en œuvre de dépistages pour accélérer la découverte de nouveaux traitements contre les maladies transmises par les sols.

Bien que plusieurs membres du microbiome du sol soient pathogènes, la grande majorité sont neutres ou même bénéfiques pour la croissance des plantes1. Il est possible d’utiliser les protocoles pour inoculer les plantes avec des micro-organismes bénéfiques. Auparavant, des spores de S. indica ont été ajoutées dans le système de boîtes de Petri pour examiner les réponses ultérieures dans les racines26. Cela élargit le spectre des systèmes d’infection expliqués pour étudier non seulement les interactions pathogènes, mais aussi bénéfiques.

Comme on sait que les microbes de la rhizosphère s’influencent mutuellement6, cela peut être simulé par une inoculation parallèle avec différentes espèces microbiennes (ou un traitement des plantes d’abord avec l’une puis avec une autre). Cela permet des modèles co-, triples ou même multi-cultures. Une extension plus avancée des communautés synthétiques adéquates (SynComs, collections de micro-organismes) est envisageable car cela aide à comprendre les influences des compositions microbiennes complexes30.

En résumé, les systèmes d’inoculation permettent plusieurs combinaisons pour des analyses ultérieures et prennent en charge une gamme d’applications. Cette collection de méthodes est largement applicable à divers microbes colonisateurs de racines (à la fois bénéfiques et pathogènes) et offre une plate-forme robuste pour analyser les interactions racine-microbe.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs remercient Tim Iven et Jaqueline Komorek pour leurs travaux antérieurs sur ces méthodes, le groupe de Wolfgang Dröge-Laser (Département de biologie pharmaceutique, Université de Würzburg, Allemagne) pour avoir fourni l’équipement et les ressources nécessaires à ce travail, et Wolfgang Dröge-Laser ainsi que Philipp Kreisz (tous deux de l’Université de Würzburg) pour la relecture critique du manuscrit. Cette étude a été soutenue par la « Deutsche Forschungsgemeinschaft » (DFG, DR273/15-1,2).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar (Gelrite) Carl Roth Nr. 0039 all systems described require Gelrite
Arabidopsis thaliana wild-type NASC stock Col-0 (N1092)
Autoclave Systec VE-100
BlattFlaeche Datinf GmbH BlattFlaeche software to determine leaf areas
Brassica napus wild-type see Floerl et al., 2008 rapid-cycling rape genome ACaacc
Cefotaxime sodium Duchefa C0111
Chicanery flask 500 mL Duran Group / neoLab E-1090 Erlenmeyer flask with four baffles
Collection tubes 50 mL Sarstedt 62.547.254 114 x 28 mm
Czapek Dextrose Broth medium Duchefa C1714
Digital camera Nikon D3100 18-55 VR
Exsiccator (Desiccator ) Duran Group 200 DN, 5.8 L Seal with lid to hold chlorine gas
Fluorescence Microscope Leica Leica TCS SP5 II
HCl Carl Roth P074.3
KNO3 Carl Roth P021.1 ≥ 99 %
KOH Carl Roth 6751
Leukopor BSN medical GmbH 2454-00 AP non-woven tape 2.5 cm x 9.2 m
MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) Carl Roth 4256.2 Pufferan ≥ 99 %
MgSO4 Carl Roth T888.1 Magnesiumsulfate-Heptahydrate
Murashige & Skoog medium (MS) Duchefa M0222 MS including vitamins
NaClO Carl Roth 9062.1
Percival growth chambers CLF Plant Climatics GmbH AR-66L2
Petri-dishes Sarstedt 82.1473.001 size ØxH: 92 × 16 mm
Plastic cups (500 mL, transparent) Pro-pac, salad boxx 5070 size: 108 × 81 × 102 mm
Pleated cellulose filter Hartenstein FF12 particle retention level 8–12 μm
poly klima growth chamber poly klima GmbH PK 520 WLED
Potato Dextrose Broth medium SIGMA Aldrich P6685 for microbiology
Pots Pöppelmann GmbH TO 7 D or TO 9,5 D Ø 7 cm resp. Ø 9.5 cm
PromMYB51::YFP see Poncini et al., 2017 MYB51 reporter line YFP (i.e. 3xmVenus with NLS)
Reaction tubes 2 mL Sarstedt 72.695.400 PCR Performance tested
Rotary (orbital) shaker Edmund Bühler SM 30 C control
Sand (bird sand) Pet Bistro, Müller Holding 786157
Soil Einheitserde spezial SP Pikier (SP ED 63 P)
Solanum lycopersicum wild-type see Chavarro-Carrero et al., 2021 Type: Moneymaker
Thoma cell counting chamber Marienfeld 642710 depth 0.020 mm; 0.0025 mm2
Ultrapure water (Milli-Q purified water) MERK IQ 7003/7005 water obtained after purification
Verticillium dahliae see Reusche et al., 2014 isolate JR2
Verticillium longisporum Zeise and von Tiedemann, 2002 strain Vl43

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References

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Ce mois-ci dans JoVE numéro 181
Stratégies d’inoculation pour infecter les racines des plantes avec des micro-organismes transmis par le sol
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Marsell, A., Fröschel, C. Inoculation Strategies to Infect Plant Roots with Soil-Borne Microorganisms. J. Vis. Exp. (181), e63446, doi:10.3791/63446 (2022).

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