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मिट्टी जनित सूक्ष्मजीवों के साथ पौधे की जड़ों को संक्रमित करने के लिए इनोक्यूलेशन रणनीतियाँ

Published: March 1, 2022 doi: 10.3791/63446
Automatic Translation
1, 1
1Department of Pharmaceutical Biology, Julius-von-Sachs-Institute, Julius-Maximilians-Universität Würzburg

Summary

यह प्रोटोकॉल मिट्टी-जनित रोगाणुओं के साथ पौधे की जड़ों को टीका लगाने के लिए रणनीतियों का एक विस्तृत सारांश प्रस्तुत करता है। कवक Verticillium longisporum और Verticillium dahliae के लिए उदाहरण, तीन अलग-अलग जड़ संक्रमण प्रणालियों का वर्णन किया गया है। संभावित अनुप्रयोगों और संभावित डाउनस्ट्रीम विश्लेषणों पर प्रकाश डाला गया है, और प्रत्येक प्रणाली के लिए फायदे या नुकसान पर चर्चा की जाती है।

Abstract

राइजोस्फीयर एक अत्यधिक जटिल माइक्रोबियल समुदाय को आश्रय देता है जिसमें पौधों की जड़ों को लगातार चुनौती दी जाती है। जड़ें विभिन्न प्रकार के सूक्ष्मजीवों के साथ निकट संपर्क में हैं, लेकिन मिट्टी से उत्पन्न इंटरैक्शन पर अध्ययन अभी भी जमीन के ऊपर के अंगों पर किए गए लोगों के पीछे हैं। यद्यपि मॉडल रूट रोगजनकों के साथ मॉडल पौधों को संक्रमित करने के लिए कुछ टीकाकरण रणनीतियों को साहित्य में वर्णित किया गया है, लेकिन एक व्यापक पद्धतिगत अवलोकन प्राप्त करना मुश्किल बना हुआ है। इस समस्या को हल करने के लिए, तीन अलग-अलग रूट इनोक्यूलेशन सिस्टम को सटीक रूप से वर्णित किया गया है जिसे रूट-माइक्रोब इंटरैक्शन के जीव विज्ञान में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए लागू किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, वर्टिसिलियम प्रजातियों (अर्थात्, वी. लॉन्गिस्पोरम और वी. डहलिया) को रूट इनवाइडिंग मॉडल रोगजनकों के रूप में नियोजित किया गया था। हालांकि, विधियों को आसानी से अन्य जड़ उपनिवेशीकरण रोगाणुओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता है - रोगजनक और लाभकारी दोनों। पौधे के जाइलम का उपनिवेशीकरण करके, संवहनी मिट्टी जनित कवक जैसे कि वर्टीसिलियम एसपीपी एक अद्वितीय जीवन शैली प्रदर्शित करते हैं। जड़ आक्रमण के बाद, वे जाइलम जहाजों के माध्यम से फैलते हैं, शूट तक पहुंचते हैं, और बीमारी के लक्षणों को प्राप्त करते हैं। तीन प्रतिनिधि पौधों की प्रजातियों को मॉडल मेजबान के रूप में चुना गया था: Arabidopsis thaliana, आर्थिक रूप से महत्वपूर्ण तिलहन बलात्कार (ब्रासिका नेपस), और टमाटर (सोलनम लाइकोपर्सिकम)। चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल दिए गए हैं। रोगजनकता assays के प्रतिनिधि परिणाम, मार्कर जीन के transcriptional विश्लेषण, और रिपोर्टर निर्माणों द्वारा स्वतंत्र पुष्टिकरण दिखाए गए हैं। इसके अलावा, प्रत्येक टीकाकरण प्रणाली के फायदे और नुकसान पर पूरी तरह से चर्चा की जाती है। ये सिद्ध प्रोटोकॉल रूट-माइक्रोब इंटरैक्शन पर अनुसंधान प्रश्नों के लिए दृष्टिकोण प्रदान करने में सहायता कर सकते हैं। यह जानना कि पौधे मिट्टी में रोगाणुओं का सामना कैसे करते हैं, कृषि में सुधार के लिए नई रणनीतियों को विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है।

Introduction

प्राकृतिक मिट्टी में रोगाणुओं की एक आश्चर्यजनक संख्या का निवास होता हैजो पौधों के लिए तटस्थ, हानिकारक या फायदेमंद हो सकता है। कई पौधे रोगजनक मिट्टी से उत्पन्न होते हैं, जड़ों को घेरते हैं, और भूमिगत अंग पर हमला करते हैं। ये सूक्ष्मजीव क्लैड की एक विस्तृत विविधता से संबंधित हैं: कवक, ऊमिसेट्स, बैक्टीरिया, नेमाटोड, कीड़े, और कुछ वायरस 1,2। एक बार पर्यावरणीय स्थितियां संक्रमण के पक्ष में होने के बाद, अतिसंवेदनशील पौधे रोगग्रस्त हो जाएंगे और फसल की पैदावार में गिरावट आएगी। जलवायु परिवर्तन के प्रभाव, जैसे कि ग्लोबल वार्मिंग और मौसम की चरम सीमाएं, मिट्टी-जनितपौधों के रोगजनकों के अनुपात में वृद्धि करेंगी। इसलिए, इन विनाशकारी रोगाणुओं और भोजन और फ़ीड उत्पादन पर उनके प्रभाव का अध्ययन करना अधिक से अधिक महत्वपूर्ण हो जाएगा, लेकिन प्राकृतिक पारिस्थितिक तंत्र पर भी। इसके अतिरिक्त, मिट्टी में माइक्रोबियल पारस्परिकतावादी हैं जो जड़ों के साथ कसकर बातचीत करते हैं और पौधे के विकास, विकास और प्रतिरक्षा को बढ़ावा देते हैं। जब रोगजनकों का सामना करना पड़ता है, तो पौधे सक्रिय रूप से राइजोस्फीयर में विशिष्ट विरोधियों की भर्ती कर सकते हैं जो रोगजनकोंको 4,5,6,7 को दबाकर मेजबान अस्तित्व का समर्थन कर सकते हैं। हालांकि, लाभकारी रूट-माइक्रोब इंटरैक्शन में शामिल यांत्रिक विवरण और मार्ग अक्सर अभी भी अज्ञात हैं।

इसलिए, रूट-माइक्रोब इंटरैक्शन की सामान्य समझ का विस्तार करना आवश्यक है। मिट्टी जनित सूक्ष्मजीवों के साथ जड़ों को टीका लगाने के लिए विश्वसनीय तरीके मॉडल अध्ययन करने और निष्कर्षों को कृषि अनुप्रयोगों में स्थानांतरित करने के लिए आवश्यक हैं। मिट्टी में लाभकारी इंटरैक्शन का अध्ययन किया जाता है, उदाहरण के लिए, सेरेन्डिपिटा इंडिका (जिसे पहले पिरिफॉर्मोस्पोरा इंडिका के रूप में जाना जाता था), नाइट्रोजन-फिक्सिंग राइजोबियम एसपीपी, या माइकोराइजल कवक के साथ, जबकि ज्ञात मिट्टी-जनित पौधों के रोगजनकों में राल्स्टोनिया सोलानेसेरम, फाइटोफ्थोरा एसपीपी, फुसेरियम एसपीपी और वर्टिलियम एसपीपी.1 शामिल हैं। बाद के दो फंगल जेनेरा हैं जो विश्व स्तर पर वितरित किए जाते हैं और संवहनी रोगों का कारण बनतेहैं 2। Verticillium spp. (Ascomycota) पौधों की प्रजातियों के सैकड़ों को संक्रमित कर सकते हैं - काफी हद तक dicotyledons, जड़ी बूटी वार्षिक, वुडी बारहमासी, और कई फसल पौधों 2,8 सहित। Verticillium के Hyphae जड़ में प्रवेश करते हैं और जाइलम वाहिकाओं 2,9 उपनिवेश करने के लिए केंद्रीय सिलेंडर की ओर अंतरकोशिकीय और intracellularly दोनों बढ़ते हैं। इन जहाजों में, कवक अपने अधिकांश जीवन चक्र के लिए रहता है। चूंकि जाइलम का रस पोषक तत्व-गरीब है और पौधे की रक्षा यौगिकों को वहन करता है, कवक को इस अद्वितीय वातावरण के अनुकूल होना चाहिए। यह उपनिवेशीकरण से संबंधित प्रोटीन के स्राव द्वारा पूरा किया जाता है जो रोगज़नक़ को अपने मेजबान10,11 में जीवित रहने में सक्षम बनाता है। जड़ वास्कुलचर तक पहुंचने के बाद, कवक जाइलम वाहिकाओं के भीतर पत्ते तक फैल सकता है, जो मेजबान 9,12 के प्रणालीगत उपनिवेशीकरण की ओर जाता है। इस बिंदु पर, पौधे 9,10,13 की वृद्धि में नकारात्मक रूप से प्रभावित होता है। उदाहरण के लिए, स्टंटिंग और पीले पत्ते होते हैं और साथ ही समय से पहले सेनेसेंस 13,14,15,16 होते हैं।

इस जीनस का एक सदस्य वर्टीसिलियम लॉन्गिस्पोरम है, जो अत्यधिक ब्रासिकेशियस मेजबानों के लिए अनुकूलित है, जैसे कि कृषि संबंधी रूप से महत्वपूर्ण तिलहन बलात्कार, फूलगोभी, और मॉडल संयंत्र Arabidopsis thaliana12। कई अध्ययनों ने मिट्टी से उत्पन्न संवहनी रोगों और परिणामस्वरूप जड़ रक्षा प्रतिक्रियाओं 13,15,16,17 में व्यापक अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए वी. लॉन्गिस्पोरम और ए. थैलियाना को संयुक्त किया। सीधे संवेदनशीलता परीक्षण को वी. लॉन्गिस्पोरम / ए थैलियाना मॉडल सिस्टम का उपयोग करके महसूस किया जा सकता है और दोनों जीवों के लिए अच्छी तरह से स्थापित आनुवंशिक संसाधन उपलब्ध हैं। V. longisporum से निकटता से संबंधित रोगज़नक़ Verticillium dahliae है। यद्यपि दोनों कवक प्रजातियां एक समान संवहनी जीवन शैली और आक्रमण प्रक्रिया का प्रदर्शन करती हैं, जड़ों से पत्तियों तक उनकी प्रसार दक्षता और ए थालियाना में रोग के लक्षण अलग-अलग होते हैं: जबकि वी. लॉन्गिस्पोरम आमतौर पर शुरुआती सेनेसेंस को प्रेरित करता है, वी। हाल ही में, एक methodological सारांश V. longisporum या V. dahliae के साथ A. thaliana को संक्रमित करने के लिए विभिन्न रूट इनोक्यूलेशन रणनीतियों को प्रस्तुत किया, प्रयोगात्मक setups19 की योजना बनाने में सहायता। क्षेत्र में, वी लॉन्गिस्पोरम कभी-कभी तिलहन बलात्कार उत्पादन12 में महत्वपूर्ण क्षति का कारण बनता है, जबकि वी डहलिया में एक बहुत ही व्यापक मेजबान रेंज होती है जिसमें कई खेती की गई प्रजातियां शामिल होती हैं, जैसे कि अंगूर, आलू और टमाटर8। यह दोनों रोगजनकों को अध्ययन करने के लिए आर्थिक रूप से दिलचस्प मॉडल बनाता है।

इस प्रकार, निम्नलिखित प्रोटोकॉल रूट इनोक्यूलेशन के लिए संभावित दृष्टिकोणों का उदाहरण देने के लिए मॉडल रूट रोगजनकों के रूप में वी . लॉन्गिस्पोरम और वी. डहलिया दोनों का उपयोग करते हैं। Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), तिलहन बलात्कार (Brasica napus), और टमाटर (सोलनम लाइकोपर्सिकम) को मॉडल होस्ट के रूप में चुना गया था। तरीकों का विस्तृत विवरण नीचे दिए गए पाठ और साथ के वीडियो में पाया जा सकता है। प्रत्येक टीकाकरण प्रणाली के लिए फायदे और नुकसान पर चर्चा की जाती है। एक साथ लिया गया, यह प्रोटोकॉल संग्रह रूट-माइक्रोब इंटरैक्शन के संदर्भ में विशिष्ट शोध प्रश्नों के लिए एक उपयुक्त विधि की पहचान करने में मदद कर सकता है।

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Protocol

1. कवक संस्कृतियों और संयंत्र टीकाकरण प्रणालियों के लिए मीडिया

  1. तरल आलू डेक्सट्रोज शोरबा (पीडीबी): एक गर्मी-स्थिर फ्लास्क में अल्ट्राप्योर पानी में 21 ग्राम / एल पीडीबी तैयार करें।
  2. तरल Czapek Dextrose शोरबा (CDB): एक गर्मी स्थिर फ्लास्क में अल्ट्राप्योर पानी में 42 ग्राम / एल सीडीबी तैयार करें।
  3. पेट्री डिश इनोक्यूलेशन सिस्टम के लिए मध्यम: अल्ट्राप्योर पानी में 1.5 ग्राम / एल मुराशिगे और स्कूग माध्यम (एमएस) और 8 ग्राम / एल आगर के साथ एक गर्मी-स्थिर फ्लास्क तैयार करें।
    नोट: इस माध्यम में चीनी से बचें क्योंकि यह टीकाकरण के बाद अत्यधिक कवक विकास का कारण बनेगा।
  4. प्लास्टिक-कप-आधारित इनोक्यूलेशन सिस्टम के लिए मध्यम: 4.4 ग्राम / एल एमएस, 0.2 ग्राम / एल एमजीएसओ4, 1 ग्राम / एल केएनओ3, 0.5 ग्राम / एल 2- (एन-मॉर्फोलिनो) एथेनसल्फोनिक एसिड (एमईएस), और अल्ट्राप्योर पानी में 6.0 ग्राम / एल आगर के साथ एक गर्मी-स्थिर फ्लास्क तैयार करें और पीएच को 5 एम कोह के साथ 5.7 में समायोजित करें।
    नोट: इस माध्यम में चीनी से बचें क्योंकि यह टीकाकरण के बाद अत्यधिक कवक विकास का कारण बनेगा।
  5. 1/4 एमएस माध्यम: अल्ट्राप्योर पानी में 1.2 ग्राम / एल एमएस तैयार करें।
  6. उपरोक्त सभी समाधानों को निष्फल करने के लिए आटोक्लेव का उपयोग करें। कांच के फ्लास्क को टोकरी में डालें, ढक्कन को बंद करें और 121 डिग्री सेल्सियस और 98.9 केपीए पर 15 मिनट के लिए निष्फल करें।

2. पौधे के बीज की सतह को स्टरलाइज़ करना

नोट: नीचे दिए गए प्रोटोकॉल का उपयोग हमेशा Arabidopsis, तिलहन बलात्कार, और बुवाई से पहले टमाटर से बीज की सतह sterilize करने के लिए।

  1. बीज को 2 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब में स्थानांतरित करें। ट्यूब को 5.8 एल की आंतरिक क्षमता के साथ एक एक्सिकेटर में रखें।
  2. 12% जलीय सोडियम हाइपोक्लोराइट (NaClO) के 100 मिलीलीटर में 33% हाइड्रोक्लोरिक एसिड (HCl) के 6 mL को जोड़कर एक्सिकेटर में क्लोरीन गैस उत्पन्न करें।
  3. तुरंत एक्सिकेटर के ढक्कन को बंद करें और गैस में 3 घंटे के लिए बीज को इनक्यूबेट करें।

3. Verticillium बीजाणुओं के साथ इनोकुलम की तैयारी (अलैंगिक व्युत्पन्न conidia)

नोट: V. dahliae (तनाव JR2) की खेती उसी तरह से करें जैसे V. longisporum (तनाव Vl43)17,18,19. सुनिश्चित करें कि सभी उपकरण और मीडिया रोगाणु मुक्त हैं और इनोकुलम एक्सनिक को रखने के लिए सभी चरणों को एक लैमिनर प्रवाह हुड में किया जाता है।

  1. एक 500 mL चिकेनरी फ्लास्क में तरल PDB (चरण 1.1) के 150 मिलीलीटर भरें और 500 मिलीग्राम / एल cefotaxime के साथ माध्यम पूरक।
  2. पीडीबी माध्यम के लिए ग्लिसरॉल-स्टॉक भंडारण से वर्टीसिलियम कोनिडा जोड़ें। एक बाँझ फोम स्टॉपर के साथ फ्लास्क बंद करें।
  3. निरंतर, क्षैतिज मिलाते हुए (रोटरी शेकर; 60 आरपीएम) के तहत कमरे के तापमान (आरटी) पर एक अंधेरे बॉक्स में 7-10 दिनों के लिए संस्कृति को इनक्यूबेट करें। इसके परिणामस्वरूप छोटे, सफेद माइसेलिया गोले होते हैं।
  4. निकालें और PDB supernatant ध्यान से छोड़ दें। अधिकांश मायसेलिया फ्लास्क में रहना चाहिए।
  5. चिकेनरी फ्लास्क में माइसेलिया पर तरल सीडीबी (चरण 1.2) के 100 मिलीलीटर जोड़ें और 500 मिलीग्राम / एल सेफोटैक्सिम के साथ माध्यम को पूरक करें।
  6. निरंतर, क्षैतिज मिलाते हुए (रोटरी शेकर, 60 आरपीएम) के तहत आरटी में एक अंधेरे बॉक्स में एक और 4-5 दिनों को इनक्यूबेट करें ताकि स्पोरुलेशन को प्रेरित किया जा सके। supernatant पीले-भूरे रंग की बारी के रूप में conidia जारी कर रहे हैं.
  7. एक बाँझ 50 एमएल संग्रह ट्यूब में एक फिल्टर पेपर (8-12 μm के कण प्रतिधारण स्तर) के माध्यम से कोनिडिया युक्त तरल के एक हिस्से (5-10 मिलीलीटर) को फ़िल्टर करें। यह माइसेलिया से बीजाणुओं को अलग करता है।
  8. एक सेल गिनती कक्ष और एक माइक्रोस्कोप का उपयोग करके बीजाणु एकाग्रता निर्धारित करें। अल्ट्राप्योर पानी में रोगाणु मुक्त 1/4 एमएस माध्यम के साथ पतला करें जब तक कि नीचे दिए गए बीजाणु सांद्रता प्राप्त न हो जाए।
    नोट: माइक्रोस्कोप के तहत, V. longisporum से conidia ज्यादातर लंबे समय से तैयार और आकार में 7.1-8.8 μm हैं, जबकि V. dahliae conidia छोटे (3.5-5.5 μm) और बल्कि गोलाकार20 हैं।
  9. इन ताजा काटे गए कोनिडिया को इनोकुलम के रूप में उपयोग करें। प्रयोगों को हमेशा ताजा काटे गए कोनिडिया के साथ और जमे हुए स्टॉक के साथ नहीं, सुनिश्चित करें, क्योंकि ठंडव्यवहार्य बीजाणुओं की संख्या को काफी कम कर देती है।
  10. लंबी अवधि के भंडारण के लिए, बीजाणुओं को -80 डिग्री सेल्सियस (1 वर्ष तक स्टोर करने योग्य) पर 25% ग्लिसरॉल में उच्च केंद्रित बीजाणु समाधान (लगभग 1 x 10 8 बीजाणु / एमएल) के रूप में फ्रीज करें। अगले प्रयोगों के लिए, चरण 3.2 में पीडीबी माध्यम को टीका लगाने के लिए इन ग्लिसरॉल स्टॉक का उपयोग करें।

4. पेट्री व्यंजन ों के आधार पर एक बाँझ इन विट्रो इनोक्यूलेशन सिस्टम

नोट: पेट्री डिश सिस्टम17 के लिए, सुनिश्चित करें कि सभी उपकरण और मीडिया रोगाणु मुक्त हैं और सभी चरणों को लैमिनर फ्लो हुड में किया जाता है।

  1. ऑटोक्लेविंग के बाद, पेट्री व्यंजनों में माध्यम (चरण 1.3 देखें) डालें।
  2. माध्यम के सख्त होने के बाद, पेट्री व्यंजनों को एक बाँझ प्लास्टिक बैग में फिर से पैक करें और उन्हें रेफ्रिजरेटर (4-10 डिग्री सेल्सियस) में रात भर उल्टा स्टोर करें। एक ठंडा माध्यम अगले चरणों में माध्यम के फिसलने को रोकने में मदद करता है।
  3. काटें और एक संक्रमण चैनल और एक scalpel (चित्रा 1A) के साथ ठोस माध्यम के ऊपरी तीसरे को हटा दें। काटने के दौरान आगर माध्यम के तहत तरल या हवा प्राप्त करने से बचें; अन्यथा, माध्यम पर्ची और संक्रमण चैनल बंद हो जाएगा.
  4. कटी हुई ऊपरी सतह पर एक बाँझ पिपेट टिप के साथ 50-100 सतह-निष्फल Arabidopsis बीज वितरित करें। बीज को उस कोण में रखें जहां कटी हुई आगर सतह पेट्री डिश की दीवार से संपर्क करती है ताकि जड़ें माध्यम और पेट्री डिश की दीवार के बीच बढ़ सकें। यह बाद में टीकाकरण की सुविधा प्रदान करेगा।
  5. पेट्री व्यंजन बंद करें और गैस विनिमय की अनुमति देने के लिए उन्हें हवा-पारगम्य चिपकने वाले टेप के साथ सील करें।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 2 दिनों के लिए स्तरीकरण के बाद, प्लेटों को एक उपयुक्त रैक में लंबवत रूप से रखें और एक विकास कक्ष में लंबे दिन की परिस्थितियों (16 एच प्रकाश / 8 घंटे अंधेरे) के तहत 22 डिग्री सेल्सियस ± 1 डिग्री सेल्सियस पर पौधों को विकसित करें।
  7. जब अधिकांश जड़ें संक्रमण चैनल (लगभग 9-11-दिन पुराने रोपाई) तक पहुंचती हैं, तो प्लेटों को क्षैतिज रूप से रखें, उन्हें खोलें और 4 x 10 5 बीजाणुओं / एमएल की एकाग्रता के साथ ताजा काटे गए वर्टीसिलियम कोनिडिया के500 μL को सीधे संक्रमण चैनल में जोड़ें, यह सुनिश्चित करें कि तरल समान रूप से चैनल में वितरित किया जाता है।
  8. इसी तरह, बीजाणुओं (रोगाणु मुक्त 1/4 एमएस माध्यम) के बजाय एक नकली समाधान के 500 μL जोड़कर नियंत्रण प्लेटें तैयार करें।
  9. प्लेटों को कुछ मिनटों के लिए क्षैतिज रूप से इनक्यूबेट करें जब तक कि तरल में भिगोया न जाए और प्लेटों को फिर से लंबवत रूप से सेट करने पर रिसाव नहीं हो सकता है। फिर, ढक्कन को बंद करें और हवा-पारगम्य चिपकने वाले टेप के साथ प्लेटों को सील करें।
  10. विकास कक्ष में लंबवत रूप से प्लेटों को इनक्यूबेट करें। वैकल्पिक रूप से, जड़ों को गहरा करने के लिए काले कागज-बक्से के साथ जड़ भागों को कवर करें और मिट्टी से उत्पन्न कवक (19 देखें)।
  11. अनुसंधान प्रश्न के आधार पर टीकाकरण के बाद पसंदीदा समय बिंदुओं पर विश्लेषण करें (यहां उपयोग किए गए सटीक समय बिंदुओं के लिए आंकड़ा किंवदंतियों को देखें)। निम्नलिखित कुछ सुझाव दिए गए हैं।
    1. पत्तियों को जड़ों से काटें और दोनों को अलग-अलग काट लें। आसानी से जड़ों तक पहुंचने के लिए पेट्री व्यंजनों से आगर स्ट्रिप्स को बाहर निकालें और ध्यान से उन्हें संदंश का उपयोग करके आगर से बाहर निकालें। तरल नाइट्रोजन में सभी पौधों की सामग्री को तुरंत फ्रीज करें।
      1. नमूनों को तरल नाइट्रोजन में पीसें। एक मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) के माध्यम से निर्धारित करने के लिए पत्ती सामग्री के 100 मिलीग्राम से कुल डीएनए निकालें पौधे के डीएनए के सापेक्ष कवक डीएनए की मात्रा (19 देखें)।
      2. नमूनों को तरल नाइट्रोजन में पीसें। पौधे की सामग्री के 100 मिलीग्राम ले लो और कुल आरएनए निकालने. संक्रमण के दौरान पौधे के जीन (या फंगल जीन) की अभिव्यक्ति निर्धारित करने के लिए मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर (क्यूआरटी-पीसीआर) का संचालन करें (19 देखें)।
    2. ध्यान से आगर से जड़ों को हटाने के लिए चोट से बचने और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत उन्हें जांच.
      1. प्लांट रिपोर्टर लाइनों में मार्कर जीन के प्रेरण का निर्धारण करें (उदाहरण के लिए, लूसिफेरस, β-ग्लूकोरोनिडेज़, या फ्लोरोसेंट रिपोर्टर 17,19,21)।
      2. फंगल रिपोर्टर लाइनों का उपयोग करके जड़ में कवक प्रसार की कल्पना करें (उदाहरण के लिए, वी लॉन्गिस्पोरम को बढ़ाया ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन, वीएल-एसजीएफपी 9) या धुंधला तकनीकों (उदाहरण के लिए, 5-ब्रोमो-4-क्लोरो-3-इंडोक्सिल-एन-एसिटाइल-बीटा-डी-ग्लूकोसामिनाइड (एक्स-बीटा-डी-जीएलसी-एनएसी)18 के माध्यम से) व्यक्त करके।

5. एक बाँझ इन विट्रो इनोक्यूलेशन सिस्टम प्लास्टिक कप के साथ आयोजित

नोट: जैसा कि इस तकनीक19 के पहले विवरण में उल्लेख किया गया है, सुनिश्चित करें कि सभी उपकरण और मीडिया रोगाणु मुक्त हैं और सभी चरणों को एक लैमिनर प्रवाह हुड में किया जाता है।

  1. 500 मिलीलीटर की कुल मात्रा के साथ पारदर्शी प्लास्टिक कप का उपयोग करें और उन्हें कम से कम 20 मिनट के लिए 70% -75% इथेनॉल स्नान में निष्फल करें। लैमिनर प्रवाह हुड में कप सूखी.
  2. प्लास्टिक कप में autoclaved माध्यम (चरण 1.4 देखें) डालें। वैकल्पिक रूप से, जीवाणु संदूषणों को रोकने के लिए ऑटोक्लेव्ड माध्यम में सेफोटैक्सिम (50 मिलीग्राम / एल की अंतिम एकाग्रता) जोड़ें। बड़े पौधे प्रजातियों (तिलहन बलात्कार, टमाटर) के साथ प्रयोगों के लिए Arabidopsis या अधिक मध्यम (250-300 एमएल प्रति कप) के साथ प्रयोगों के लिए प्रति कप 150 मिलीलीटर माध्यम का उपयोग करें।
  3. एक प्लास्टिक परत रखें (20 मिनट के लिए 70% -75% इथेनॉल में incubating द्वारा पहले निष्फल) माध्यम पर इससे पहले कि यह solidifies (चित्रा 1B)।
    नोट: इस प्लास्टिक परत सतह-निष्फल बीज रखने के लिए कोनों पर चार prefabricated छेद शामिल हैं। यह बीज को माध्यम तक पहुंचने की अनुमति देता है। बाद में, यह अलग परत पत्तियों को कवक युक्त माध्यम को छूने से रोकती है, ताकि रोगाणु सीधे पत्तियों पर हमला न कर सकें और रूट मार्ग को लेना चाहिए। एक और छेद केंद्र में है, जो संक्रमण चैनल को काटने में सक्षम बनाता है।
  4. जब माध्यम ठोस हो जाता है, तो पूर्वनिर्मित केंद्र छेद के माध्यम से लगभग 1.5 सेमी की गहराई तक एक स्केलपेल के साथ आगर को काट लें। एक संक्रमण चैनल बनाने के लिए कट आगर को हटा दें जिसमें फंगल बीजाणुओं को बाद में जोड़ा जा सकता है।
  5. ठोस त्वचा को बाधित करने के लिए चार छोटे छेदों में एक पिपेट टिप के साथ आगर माध्यम को थोड़ा खरोंचें (यह बीजों को पानी के आगर माध्यम से पानी को सोखने की अनुमति देता है)। छोटे छेद में एक पिपेट टिप का उपयोग करके बीज रखें।
  6. एक दूसरे, उलटा प्लास्टिक कप के साथ प्लास्टिक कप बंद करें और हवा-पारगम्य चिपकने वाले टेप के साथ सील करें। टेप गैस विनिमय की अनुमति देनी चाहिए।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 3 दिनों के लिए स्तरीकरण के बाद, 22 डिग्री सेल्सियस और 60% आर्द्रता के स्थिर तापमान पर विकास कक्षों में 12 घंटे प्रकाश / 12 घंटे अंधेरे (Arabidopsis, तिलहन बलात्कार) या 16 घंटे प्रकाश / 8 घंटे अंधेरे की स्थिति (टमाटर) के तहत कप सिस्टम को इनक्यूबेट करें।
  8. टीकाकरण के लिए पौधों की अनुशंसित उम्र का पालन करें: Arabidopsis के लिए 21 दिन; तिलहन बलात्कार के लिए 5-7 दिन; टमाटर के लिए 12 दिन।
  9. संक्रमण चैनल में कोनिडिया समाधान (अनुशंसित एकाग्रता: 4 x 105 बीजाणु / एमएल) के 1 एमएल जोड़कर वर्टीसिलियम के साथ प्लांटलेट्स को संक्रमित करें। नियंत्रण नमूने तैयार करने के लिए, चैनल में बीजाणुओं (रोगाणु मुक्त 1/4 एमएस माध्यम) के बिना 1 मिलीलीटर नकली समाधान जोड़ें।
  10. अनुसंधान प्रश्न के आधार पर टीकाकरण के बाद पसंदीदा समय बिंदुओं पर विश्लेषण करें (यहां उपयोग किए गए सटीक समय बिंदुओं के लिए आंकड़ा किंवदंतियों को देखें)। निम्नलिखित कुछ सुझाव दिए गए हैं।
    1. प्रत्येक तस्वीर के लिए दूरी समान रखते हुए ऊपर से एक डिजिटल कैमरे के साथ पौधों की तस्वीरें लें। पत्ती क्षेत्र को मापें (उदाहरण के लिए, ImageJ22 या BlattFlaeche17,19 के साथ; पैमाने को सेट करने के लिए कप की लंबाई का उपयोग करें) और संक्रमित और नियंत्रण समूहों की तुलना करें। रोग के लक्षणों के विकास को वर्गीकृत करें (उदाहरण के लिए, छोटे, अधिक पीले, या नेक्रोटिक पत्ते)।
      नोट: यदि Arabidopsis पर कोई उपजी हैं, तो उन्हें rosettes की बेहतर तस्वीरें प्राप्त करने के लिए निकालें।
    2. जड़ों को निकालें और संक्रमित से शूट के बायोमास (ताजा वजन) को परिभाषित करें और वजन करके नमूनों को नियंत्रित करें। सापेक्ष ताजा वजन19 निर्धारित करें।
    3. निम्नानुसार आणविक विश्लेषण के लिए नमूने एकत्र करें।
    4. Arabidopsis: यदि कोई भी हैं तो उपजी को हटा दें। जड़ों से आधार पर rosettes काटें। नमूना से सभी जड़ सामग्री को बाहर करना सुनिश्चित करें और पूरे रोसेट की कटाई करें। एक नमूने में विभिन्न पौधों से 4-5 rosettes गठबंधन और तरल नाइट्रोजन में पत्ती सामग्री फ्रीज.
    5. संदंश के साथ जड़ों को सावधानीपूर्वक माध्यम से बाहर निकालें, आगर के अवशेषों को हटाने के लिए उन्हें एक पेपर तौलिया के साथ दबाएं और दबाएं, और विभिन्न पौधों से 4-5 जड़ों को एक नमूने में मिलाएं। तरल नाइट्रोजन में तुरंत फ्रीज करें।
    6. तिलहन बलात्कार / टमाटर: हाइपोकोटाइल से स्टेम सेगमेंट काटें (उदाहरण के लिए, लंबाई में 1 सेमी; हमेशा एक ही स्टेम क्षेत्र लें)। प्रत्येक नमूने में 4-5 पौधों से सामग्री को मिलाएं और तरल नाइट्रोजन में फ्रीज करें।
    7. नमूनों को तरल नाइट्रोजन में पीसें। क्यूपीसीआर के माध्यम से पौधे के डीएनए के सापेक्ष कवक डीएनए की मात्रा निर्धारित करने के लिए पत्ती या स्टेम सामग्री के 100 मिलीग्राम से कुल डीएनए निकालें (19 देखें)।
    8. तरल नाइट्रोजन में नमूनों को पीसें, 100 मिलीग्राम पौधे की सामग्री लें और कुल आरएनए निकालें। संक्रमण पर पौधे के जीन (या कवक जीन) की अभिव्यक्ति को निर्धारित करने के लिए क्यूआरटी-पीसीआर का संचालन करें (19 देखें)।

6. बर्तनों में एक मिट्टी आधारित टीका प्रणाली

  1. जड़ों से सब्सट्रेट को धोने की सुविधा के लिए 3: 1 (मिट्टी: रेत) वॉल्यूमेट्रिक अनुपात में मिट्टी और रेत को अच्छी तरह से मिलाएं। मिश्रण को एक आटोक्लेव बैग में डालें। यदि मिश्रण बहुत सूखा है, तो पानी की एक उचित मात्रा जोड़ें और इसे सब्सट्रेट में मिलाएं। माइक्रोबियल संदूषण को कम करने के लिए एक आटोक्लेव में 20 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर भाप लें।
    नोट: 80 डिग्री सेल्सियस से अधिक हीटिंग से बचें, क्योंकि यह कार्बनिक मिट्टी के पोषक तत्वों को प्रभावित कर सकता है।
  2. मिट्टी-रेत के मिश्रण के साथ बर्तनों को भरें और उन्हें ट्रे में स्थानांतरित करें। ट्रे में एक बर्तन की ऊंचाई के बारे में 1/3 पानी जोड़ें, ताकि मिट्टी-रेत मिश्रण अच्छी तरह से पानी के साथ भिगोया जा सके। इसके अतिरिक्त, गीली शुरुआती स्थितियों को सुनिश्चित करने के लिए एक स्प्रे बोतल के साथ सब्सट्रेट को पानी-स्प्रे करें।
  3. प्रत्येक बर्तन में 3-4 बीज बोएं (चित्रा 1 सी) यह सुनिश्चित करते हुए कि बीजों में एक-दूसरे से पर्याप्त दूरी है। अंकुरण को सिंक्रनाइज़ करने के लिए स्तरीकरण के लिए उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 3 दिनों के लिए रखें।
    नोट: पौधों की अधिकता को पूर्व-खेती करें, जो टीकाकरण प्रयोगों के लिए समान आकार के पौधों के चयन को सक्षम बनाता है और व्यक्तिगत मतभेदों के कारण विचलन को कम करता है।
  4. रोपाई को लंबे दिन की परिस्थितियों में बढ़ने दें (16 घंटे प्रकाश / 8 घंटे अंधेरा; 22 डिग्री सेल्सियस का निरंतर तापमान; 60% आर्द्रता) नियमित रूप से पानी के साथ।
  5. टीकाकरण के लिए पौधों की अनुशंसित उम्र का पालन करें: Arabidopsis के लिए 21 दिन, तिलहन बलात्कार के लिए 7 दिन, और टमाटर के लिए 10 दिन। "रूट डुबकी टीका" 15,17,23,24 करने के लिए समान आकार के पौधों को चुनें। मिट्टी को बर्तनों से बाहर निकालें और ध्यान से जड़ों की खुदाई करें।
  6. धीरे से केवल जड़ों को पानी के कंटेनर में धोएं और रोसेट को पानी से बाहर रखें। वर्टीसिलियम बीजाणु समाधान युक्त पेट्री डिश में 60 मिनट के लिए धोई गई जड़ों को इनक्यूबेट करें (अनुशंसित एकाग्रता: 2 x 106 बीजाणु / एमएल)। गैर-संक्रमित नियंत्रण समूह के लिए, बीजाणुओं (रोगाणु मुक्त 1/4 एमएस माध्यम) के बिना नकली समाधान में 60 मिनट के लिए जड़ों को इनक्यूबेट करें।
  7. रेत के बिना नम, भाप-निष्फल मिट्टी (20 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस) के साथ नए बर्तन तैयार करें। प्रत्येक बर्तन में मिट्टी के केंद्र में एक छेद बनाने के लिए एक पिपेट टिप का उपयोग करें।
  8. सीधे जड़ों को छेद में रखें (प्रति पॉट केवल एक पौधे को स्थानांतरित करें)। जड़ों को डालने के बाद, मिट्टी के साथ ध्यान से छेद को फिर से भरना सुनिश्चित करें। मिट्टी को दबाने से बचें, अन्यथा रीपॉटिंग तनाव के लक्षणों जैसे बैंगनी पत्तियों का कारण बन सकती है।
  9. नियमित रूप से पानी के साथ लंबे दिन की स्थितियों (16 घंटे प्रकाश / 8 घंटे अंधेरा; 22 डिग्री सेल्सियस का एक स्थिर तापमान; 60% आर्द्रता) के तहत संक्रमित और नियंत्रण समूहों की खेती करें।
  10. अनुसंधान प्रश्न के आधार पर टीकाकरण के बाद पसंदीदा समय बिंदुओं पर विश्लेषण करें (यहां उपयोग किए गए सटीक समय बिंदुओं के लिए आंकड़ा किंवदंतियों को देखें)। निम्नलिखित कुछ सुझाव दिए गए हैं।
    1. ऊपर से एक डिजिटल कैमरे के साथ पौधों की तस्वीरें लें, प्रत्येक तस्वीर के लिए दूरी समान रखें। पत्ती क्षेत्र को मापें (उदाहरण के लिए, ImageJ22 या BlattFlaeche17,19 के साथ; पैमाने को सेट करने के लिए बर्तनों के व्यास का उपयोग करें) और संक्रमित और नियंत्रण समूहों की तुलना करें। रोग के लक्षणों के विकास को वर्गीकृत करें (उदाहरण के लिए, छोटे, अधिक पीले, या नेक्रोटिक पत्ते)13।
      नोट: Arabidopsis के तने को हटाने rosettes की तस्वीरें लेने की सुविधा.
    2. जड़ों को निकालें और संक्रमित से शूट के बायोमास (ताजा वजन) को परिभाषित करें और वजन करके नमूनों को नियंत्रित करें। सापेक्ष ताजा वजन19 निर्धारित करें।
    3. वैकल्पिक रूप से, पौधे की ऊंचाई को मापें या रोग की गंभीरता का मूल्यांकन करने के लिए स्टेम सेगमेंट से फंगल आउटग्रोथ को वर्गीकृतकरें।
    4. निम्नानुसार आणविक विश्लेषण के लिए नमूने एकत्र करें।
    5. Arabidopsis: उपजी निकालें। रूट मुकुट पर rosettes काट. एक नमूने में विभिन्न पौधों से 4-5 rosettes गठबंधन. तरल नाइट्रोजन में पत्ती सामग्री फ्रीज.
      नोट: जड़ों के मामले में, धोने के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति को फिर से प्रोग्राम किए बिना उन्हें मिट्टी से पर्याप्त रूप से साफ करना मुश्किल है।
    6. तिलहन बलात्कार / टमाटर: हाइपोकोटाइल से स्टेम सेगमेंट काटें (उदाहरण के लिए, लंबाई में 1 सेमी; हमेशा एक ही स्टेम क्षेत्र लें)। एक नमूने में 4-5 पौधों से सामग्री को मिलाएं और इसे तरल नाइट्रोजन में फ्रीज करें।
    7. नमूनों को तरल नाइट्रोजन में पीसें। क्यूपीसीआर के माध्यम से पौधे के डीएनए के सापेक्ष कवक डीएनए की मात्रा निर्धारित करने के लिए 100 मिलीग्राम पत्ती या स्टेम सामग्री से कुल डीएनए निकालें (19 देखें)।
    8. तरल नाइट्रोजन में नमूनों को पीसें, 100 मिलीग्राम पौधे की सामग्री लें और कुल आरएनए निकालें। संक्रमण पर पौधे के जीन (या कवक जीन) की अभिव्यक्ति को निर्धारित करने के लिए क्यूआरटी-पीसीआर का संचालन करें (19 देखें)।

7. डेटा का विश्लेषण

  1. जैविक प्रतिकृतियों के आधार पर औसत और मानक विचलन (± एसडी) की गणना करें।
  2. संक्रमित समूह से सभी परिणामों को नियंत्रण के परिणाम से विभाजित करके सापेक्ष मानों की गणना करें. औसत के रूप में प्रदर्शित करें, उदाहरण के लिए, "मॉक के सापेक्ष" या "जंगली-प्रकार के सापेक्ष"।
  3. समूहों के बीच सांख्यिकीय महत्व निर्धारित करें।

Figure 1
चित्रा 1: प्रोटोकॉल में तीन इनोक्यूलेशन सिस्टम और व्यक्तिगत चरणों का संकलन। ये आंकड़े मॉडल संयंत्र Arabidopsis thaliana के साथ प्रणालियों को चित्रित करते हैं। अन्य पौधों की प्रजातियों के लिए, समय को समायोजित किया जाना चाहिए। नारंगी बक्से हाइलाइट करते हैं, जिसके लिए बाद के विश्लेषण संबंधित सिस्टम के साथ सबसे अधिक अनुशंसित होते हैं। (ए) पेट्री व्यंजन17 में इनोक्यूलेशन सिस्टम के लिए, माध्यम डालें और इसे ठोस होने दें। प्लेटों को रात भर फ्रिज में रखें। फिर, ऊपरी तीसरे के साथ-साथ संक्रमण चैनल (आईसी) को एक स्केलपेल के साथ काटें और हटा दें (चित्रण में सफेद क्षेत्रों को आगर से हटा दिया गया था, जबकि नीले क्षेत्र आगर का प्रतिनिधित्व करते हैं)। बीजों को कटी हुई सतह पर रखें और पेट्री व्यंजनों को बंद कर दें। स्तरीकरण के बाद, प्लेटों को लंबवत रखें और पौधों को बढ़ने दें। एक बार जब अधिकांश जड़ें संक्रमण चैनल तक पहुंच जाती हैं, तो सीधे चैनल में एक पिपेट के साथ बीजाणु समाधान जोड़ें। सुनिश्चित करें कि समाधान समान रूप से वितरित किया गया है। पेट्री व्यंजन बंद करें और उन्हें एक विकास कक्ष में लंबवत रूप से इनक्यूबेट करें। दृष्टिकोण जो अनुसरण कर सकते हैं वे मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर (क्यूआरटी-पीसीआर) के साथ अभिव्यक्तित्मक विश्लेषण, रिपोर्टर लाइनों के साथ माइक्रोस्कोपी और माइक्रोबियल डीएनए के परिमाणीकरण हैं। (बी) प्लास्टिक कप19 में इनोक्यूलेशन सिस्टम के लिए, माध्यम डालें और अलग-अलग प्लास्टिक की परत को पूर्वनिर्मित छेदों के साथ स्थानांतरित करें (बीज रखने के लिए कोनों में चार छोटे छेद और संक्रमण चैनल के लिए केंद्र में एक बड़ा छेद)। माध्यम को ठोस होने दें। संक्रमण चैनल (आईसी) प्राप्त करने के लिए एक स्केलपेल के साथ केंद्र छेद में आगर माध्यम को काटें और हटा दें। छोटे छेद में माध्यम खरोंच और बीज हस्तांतरण. एक उल्टे कप के साथ कप को बंद करें और हवा-पारगम्य टेप (पीले रंग में प्रतीक) के साथ सील करें। पौधों को बढ़ने दें। इनोक्यूलेशन के लिए, संक्रमण चैनल में सीधे एक पिपेट के साथ बीजाणु समाधान जोड़ें। सिस्टम को बंद करें और विकास कक्ष में खेती जारी रखें। जिन दृष्टिकोणों का पालन किया जा सकता है, वे क्यूआरटी-पीसीआर के साथ अभिव्यक्तित्मक विश्लेषण, माइक्रोबियल डीएनए का परिमाणीकरण, और ताजा वजन, पत्ती क्षेत्र, या अन्य रोग विशेषताओं का निर्धारण कर सकते हैं। (सी) "रूट डिप इनोक्यूलेशन" 15,17,23,24: मिट्टी-आधारित इनोक्यूलेशन सिस्टम के लिए, मिट्टी के साथ बर्तन भरें: रेत मिश्रण। बीजों को स्थानांतरित करें और रोपाई को बढ़ने दें। समान आकार के पौधों की खुदाई करें और जड़ों को पानी में धोएं। धोई हुई जड़ों को एक पेट्री डिश में रखें जो बीजाणुओं के साथ समाधान को पकड़े हुए है। इनक्यूबेशन बाद, मिट्टी के साथ बर्तनों में एकल पौधे डालें। जिन दृष्टिकोणों का पालन किया जा सकता है, वे क्यूआरटी-पीसीआर के साथ पत्तियों में अभिव्यक्तित्मक विश्लेषण, माइक्रोबियल डीएनए का परिमाणीकरण, और ताजा वजन, पत्ती क्षेत्र, या अन्य रोग विशेषताओं का निर्धारण कर सकते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Representative Results

प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, पौधों की खेती की गई और वी लॉन्गिस्पोरम (तनाव वीएल4325) या वी डहलिया (जेआर 218 को अलग करना) के साथ टीका लगाया गया। विभिन्न परिदृश्यों को प्रभावशीलता साबित करने और दिए गए प्रोटोकॉल की कुछ क्षमताओं को उजागर करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। प्रतिनिधि परिणाम दिखाए जाते हैं।

रोगाणुरोधी इंडोल-ग्लूकोसिनोलेट (आईजी) जैवसंश्लेषण में शामिल जीनों का अभिव्यक्तित्मक प्रेरण एक वर्टिलियम संक्रमण17,19,26 के मूल्यांकन के लिए एक विश्वसनीय संकेतक है। Arabidopsis में, MYB51 (MYB डोमेन प्रोटीन 51; AT1G18570) आईजी जैवसंश्लेषण27 के लिए आवश्यक जीन के सक्रियण में शामिल एक प्रतिलेखन कारक को एन्कोड करता है। MYB51 एक मार्कर जीन के रूप में काम कर सकता है जो सफल संक्रमण को इंगित करता है क्योंकि यह लगातार V. longisporum26 या अन्य मिट्टी जनित कवक जैसे Phytophthora parasitica26 और Fusarium oxysporum21 द्वारा जड़ों में प्रेरित होता है। पेट्री डिश आधारित प्रणाली में दो दिन बाद के टीकाकरण (2 डीपीआई), MYB51 के प्रेरण को Arabidopsis की जड़ों में कल्पना की गई थी। रिपोर्टर प्लांट लाइन प्रोमMYB51:: YFP21 ने एक प्रमोटर सक्रियण का खुलासा किया और एक qRT-PCR विश्लेषण ने इस जीन के एक महत्वपूर्ण ट्रांसक्रिप्शनल प्रेरण की पुष्टि की (चित्रा 2A-B)। इस तरह के प्रयोगों का उद्देश्य संक्रमण के दौरान जड़ों में अभिव्यक्तित्मक परिवर्तनों को निर्धारित करना है।

क्योंकि इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली वर्टीसिलियम प्रजातियां एक संवहनी जीवन शैली का प्रदर्शन करती हैं और जाइलम वाहिकाओं के माध्यम से जड़ से शूट तक फैलती हैं, कवक डीएनए की मात्रा को कवक प्रसार की डिग्री के लिए पैरामीटर के रूप में पत्तियों में निर्धारित किया जा सकता है। Arabidopsis प्लास्टिक कप में इन विट्रो प्रणाली में जड़ संक्रमित किया गया था और rosettes 12 दिन बाद काटा गया था। मॉक कंट्रोल में पाए गए पृष्ठभूमि मूल्य की तुलना में, संक्रमित पौधों से पत्तियों में पर्याप्त मात्रा में कवक डीएनए पाया गया है (चित्रा 2 सी)। यह दर्शाता है कि संक्रमण सफलतापूर्वक आगे बढ़ गया है। आगे की परीक्षाओं के लिए, फंगल डीएनए की मात्रा को रूट रक्षा प्रतिक्रियाओं में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए विभिन्न पौधों के जीनोटाइप में परिमाणित किया जा सकता है। इसके अलावा, क्यूआरटी-पीसीआर के माध्यम से मार्कर जीन के प्रेरण का परीक्षण करने के लिए इस समय बिंदु पर जड़ें एकत्र की गई थीं। MYB51 प्रतिलेख बहुतायत काफी समृद्ध था (चित्रा 2 डी). यह दर्शाता है कि संवेदनशीलता परीक्षण और अभिव्यक्तित्मक विश्लेषण आसानी से कप सिस्टम के समानांतर में किए जा सकते हैं, जो इस प्रक्रिया के महान लाभ को रेखांकित करता है।

इस बात के सबूत शामिल करने के लिए कि अन्य मॉडल पौधों की प्रजातियों को भी पेश किया जा सकता है, तिलहन बलात्कार को प्लास्टिक के कप में सिस्टम में वी. डहलिया के साथ वी. लॉन्गिस्पोरम और टमाटर से संक्रमित किया गया था। जड़ों में टीकाकरण के बाद 12 वें दिन, फंगल डीएनए की मात्रा को रोपाई के आधार पर काटे गए स्टेम सेगमेंट में परिमाणित किया गया था (चित्रा 2 ई-एफ)। कवक डीएनए दोनों पौधों की प्रजातियों में पता लगाने योग्य था जो पौधे के भीतर रोगजनकों के प्रसार का संकेत देता है। फिर से, रक्षा तंत्र पर ज्ञान प्राप्त करने के लिए विभिन्न पौधों के जीनोटाइप का परीक्षण किया जा सकता है।

यदि ब्याज की जड़ उपनिवेशीकरण माइक्रोब जड़ों से पत्तियों तक नहीं फैलती है, तो रोग की गंभीरता के लिए एक पैरामीटर के रूप में पत्तियों में माइक्रोबियल डीएनए की मात्रा को मापना संभव नहीं है। रोग की गंभीरता को मापने का एक और विकल्प मेजबान पर लक्षणों का मूल्यांकन और एक्सट्रपोलेशन है। इसका उदाहरण देने के लिए, Arabidopsis को मिट्टी-आधारित प्रणाली में V. dahliae के साथ संक्रमित रूट-डिप किया गया था और हरे पत्ते के क्षेत्र का मूल्यांकन किया गया था (चित्रा 2G-H)। जबकि नकली उपचारित पौधों के रोसेट स्वस्थ और हरे रंग के लग रहे थे, रोगज़नक़-संक्रमित पौधों में पत्ती का आकार कम था और पीले या यहां तक कि नेक्रोटिक पत्ते भी थे। इस तरह, विभिन्न पौधों के जीनोटाइप की संवेदनशीलता का विश्लेषण और पुष्टि की जा सकती है, उदाहरण के लिए, ताजा वजन को मापकर।

Figure 2
चित्रा 2: प्रोटोकॉल का पालन करके प्राप्त प्रतिनिधि परिणाम। (ए, बी) एराबिडोप्सिस जड़ों को पेट्री डिश सिस्टम में वी. लॉन्गिस्पोरम के साथ संक्रमित किया गया था। रिपोर्टर लाइन प्रोमMYB51:: YFP21 ने मॉक कंट्रोल (2 डीपीआई पर माइक्रोस्कोपी; स्केल बार: 50 μm) की तुलना में संक्रमित जड़ों में MYB51 प्रमोटर के एक मजबूत सक्रियण का खुलासा किया। वाइल्डटाइप (डब्ल्यूटी) जड़ों में MYB51 के ट्रांसक्रिप्शनल प्रेरण को आगे क्यूआरटी-पीसीआर विश्लेषण (2 डीपीआई) के साथ पुष्टि की गई थी। संक्रमित नमूनों के मान नकली नमूनों के सापेक्ष दिए जाते हैं (1 पर सेट) (एन = 5; ± एसडी)। (सी) वी लॉन्गिस्पोरम के माध्यम से प्रणालीगत उपनिवेशीकरण: कप प्रणाली में एराबिडोप्सिस जड़ों को टीका लगाने के बाद, कवक डीएनए की सापेक्ष मात्रा मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर; 12 डीपीआई) द्वारा पत्तियों में निर्धारित की गई थी। संक्रमित नमूनों के मान मॉक नमूनों में पृष्ठभूमि स्तर के सापेक्ष दिए जाते हैं (1 पर सेट) (एन = 3; ± एसडी)। (डी) वी लॉन्गिस्पोरम संक्रमित और नकली उपचारित जड़ों को कप प्रणाली से काटा गया था और क्यूआरटी-पीसीआर विश्लेषण किया गया था। संक्रमित नमूनों के मान नकली नमूनों के सापेक्ष दिए जाते हैं (1 पर सेट) (एन = 3; ± एसडी)। MYB51 को ट्रांसक्रिप्शनल रूप से प्रेरित (12 डीपीआई) पाया गया था। (ई) तिलहन बलात्कार को कप प्रणाली में वी लॉन्गिस्पोरम के साथ संक्रमित किया गया था और स्टेम खंडों (12 डीपीआई) में क्यूपीसीआर के माध्यम से कवक डीएनए की सापेक्ष मात्रा को परिमाणित किया गया था। संक्रमित नमूनों के मान नकली नमूनों में पृष्ठभूमि स्तर के सापेक्ष दिए जाते हैं (1 पर सेट) (एन = 3; ± एसडी)। (एफ) टमाटर को कप प्रणाली में वी. डहलिया के साथ संक्रमित किया गया था और कवक डीएनए की सापेक्ष मात्रा को स्टेम सेगमेंट (12 डीपीआई) में क्यूपीसीआर के माध्यम से परिमाणित किया गया था। संक्रमित नमूनों के मूल्यों को नकली नमूनों में पृष्ठभूमि स्तर के सापेक्ष दिया जाता है (1 पर सेट) (एन = 5; ± एसडी)। (G,H) Arabidopsis मिट्टी आधारित प्रणाली में V. dahliae के साथ संक्रमित जड़ डुबकी था और संक्रमित और नकली उपचारित पौधों के प्रतिनिधि चित्रों को दिखाया गया है (21 डीपीआई)। हरी पत्ती क्षेत्र की जांच की गई। मॉक (1 पर सेट) के सापेक्ष, संक्रमित पौधों में कम हरे रंग की पत्ती का क्षेत्र था (एन = 5; ± एसडी)। (B-F,H) प्राइमर जोड़े के लिए19 देखें; आँकड़े: छात्र के टी-परीक्षण के सापेक्ष मॉक, * पी≤ 0.05, ** पी ≤ 0.01, *** पी ≤ 0.001। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

मिट्टी जनित फाइटोपैथोजेन1 के कारण होने वाले जबरदस्त उपज नुकसान के कारण, खेती की रणनीतियों या फसल की किस्मों में सुधार की आवश्यकता है। मिट्टी जनित रोगों के रोगजनन में सीमित अंतर्दृष्टि अधिक प्रतिरोधी पौधों के विकास में बाधा डालती है। अंतर्निहित पैथोमैकेनिज्म का पता लगाने की आवश्यकता है, जिसके लिए एक मजबूत पद्धतिगत मंच की आवश्यकता होती है। रिपोर्ट की गई इनोक्यूलेशन प्रक्रियाओं से पता चला है कि रूट-माइक्रोब इंटरैक्शन में मल्टीफैक्टोरियल घटनाओं को विभिन्न प्रणालियों के संयोजन से अच्छी तरह से विच्छेदित किया जा सकताहै। ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का उद्देश्य इस क्षेत्र में नए विशेषज्ञों और शोधकर्ताओं दोनों के लिए एक नियमित वर्कफ़्लो प्रदान करना है। हैंडलिंग सीधा है, स्वतंत्र प्रतिकृति की अनुमति देता है, और आवश्यक तकनीकी उपकरण मानक संयंत्र विज्ञान प्रयोगशालाओं में मौजूद हैं।

प्रारंभिक वर्टिसिलियम संक्रमण की घटनाओं (6 डीपीआई के लिए टीकाकरण के बाद घंटे) की जांच पेट्री डिश सिस्टम में की जा सकती है, मिट्टी-आधारित प्रणाली में देर से होने वाली घटनाओं (>21 डीपीआई) और कप सिस्टम में अस्थायी रूप से (4 से 21 डीपीआई) के बीच में। पेट्री डिश सिस्टम के संक्रमण चैनल में बीजाणुओं को जोड़ने के बाद, वे जड़ों के साथ सीधे संपर्क में हैं। यह प्रारंभिक रक्षा प्रतिक्रियाओं की परीक्षा को सक्षम बनाता है। जैसा कि MYB51 प्रेरण के साथ उदाहरण दिया गया है, अभिव्यक्तित्मक परिवर्तनों का आसानी से जीन रिपोर्टर निर्माणों, qRT-PCR, या यहां तक कि जीनोम-वाइड "-ओमिक्स" दृष्टिकोण17,26 के साथ अध्ययन किया जा सकता है। अन्य दो संक्रमण प्रणालियों की तुलना में, पेट्री व्यंजनों में रक्षा प्रतिक्रियाएं अधिक जोरदार हैं। पेट्री व्यंजनों में उनके छोटे आकार के कारण, प्लांटलेट्स को कवक द्वारा जल्दी से अतिरंजित किया जाता है और रक्षा प्रतिक्रियाओं की तीव्रता इस तरह के assays19 में अप्राकृतिक हो सकती है। अभिव्यक्ति परिवर्तनों का अध्ययन प्लास्टिक कप प्रणाली की जड़ों में भी किया जा सकता है, जिससे पेट्री डिश सिस्टम के तुलनीय परिणाम होते हैं, हालांकि मार्कर जीन के लिए कम प्रेरण मूल्यों के साथ। कप में प्रयोगात्मक सेटअप में, इनोकुलम जड़ों के साथ तत्काल संपर्क में नहीं है, बीजाणुओं को अंकुरित होना चाहिए, और रोगज़नक़ को जड़ों की ओर माध्यम के माध्यम से बढ़ना चाहिए। पेट्री डिश सिस्टम की तुलना में संक्रमण की प्रगति धीमी है और इसलिए, प्राकृतिक स्थितियों के करीब है। जड़ों के बारे में, मिट्टी-आधारित प्रणाली का नुकसान है, क्योंकि उन्हें धोने से जीन अभिव्यक्ति को फिर से प्रोग्राम किए बिना विश्लेषण के लिए मिट्टी से पर्याप्त रूप से साफ किया जाना चाहिए। इस प्रकार, जड़ों में अभिव्यक्ति परिवर्तनों का अध्ययन करना मिट्टी में अधिक जटिल है। हालांकि, पत्तियों में परीक्षण करना संभव है कि क्या जड़ संक्रमण वहां प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर करता है।

इन विट्रो इनोक्यूलेशन सिस्टम (पेट्री डिश और प्लास्टिक कप) दोनों में, बाहरी संदूषणों को तब तक रोका जा सकता है जब तक कि प्रत्येक चरण को बाँझ उपकरणों के साथ लैमिनर प्रवाह हुड के तहत निष्पादित किया जाता है। इस प्रकार, द्विपक्षीय बातचीत की अबाधित जांच की जा सकती है। इसके विपरीत, मिट्टी-आधारित प्रणाली सिर्फ "अर्ध-बाँझ" है क्योंकि पौधों को विकास कक्ष में हर्मेटिक रूप से अलग नहीं किया जाता है। फिर भी, इसे प्राकृतिक परिस्थितियों के सबसे करीब माना जा सकता है क्योंकि पौधे मिट्टी में बढ़ते हैं। हालांकि, अप-रूटिंग के कारण मिट्टी-आधारित प्रणाली में जड़ें क्षतिग्रस्त हो जाती हैं, जो ऊतकों तक माइक्रोबियल पहुंच प्रदान करती हैं। यद्यपि यह थोड़ा कृत्रिम हो सकता है, यह प्राकृतिक परिस्थितियों की नकल कर सकता है जो जड़ों को चोट पहुंचाते हैं, जैसे कि नेमाटोड28 खिलाना।

पेट्री डिश सिस्टम फ्लोरोसेंटली लेबल किए गए उपभेदों का उपयोग करके रोगज़नक़ प्रसार की गतिशीलता की कल्पना करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है (उदाहरण के लिए, वी लॉन्गिस्पोरम तनाव वीएल-एसजीएफपी 9)। उपनिवेशीकरण के परिणामस्वरूप रूट फेनोटाइप अच्छी तरह से अवलोकन योग्य हैं। दूसरी ओर, पेट्री व्यंजनों में पत्तियों / शूट पर रोग के लक्षणों का परिमाणीकरण शायद ही संभव है क्योंकि सिस्टम काफी छोटा है। इसके अलावा, Arabidopsis से बड़ी पौधों की प्रजातियों के लिए पर्याप्त स्थान नहीं हो सकता है। वैकल्पिक रूप से, बेहरेन्स एट अल.29 ने तिलहन बलात्कार के लिए उपयुक्त प्लेटों पर एक संक्रमण प्रणाली स्थापित की, जहां एक ब्रश को बीजाणु निलंबन में डुबोया जाता है और आगर पर बढ़ती जड़ों के साथ इनोकुलम को वितरित करने के लिए उपयोग किया जाता है। लक्षणों का आकलन करने के लिए, कप- और मिट्टी-आधारित प्रणालियां निश्चित रूप से बेहतर हैं। यहां, लक्षणों के विकास (उदाहरण के लिए, कम पत्ती क्षेत्र, ताजा वजन में कमी, पौधे की ऊंचाई में कमी, परिगलित ऊतक की सीमा) का मूल्यांकन पत्तियों / शूट पर किया जा सकता है। तिलहन बलात्कार और टमाटर जैसी बड़ी पौधों की प्रजातियों की जांच, कप और मिट्टी आधारित प्रणालियों में एक समस्या नहीं है जैसा कि प्रतिनिधि परिणामों में दिखाया गया है। यदि जांच के तहत मिट्टी-जनित माइक्रोब जड़ से शूट तक फैलता है, तो रोगज़नक़-विशिष्ट डीएनए को शूट / पत्ती ऊतक में पौधे के डीएनए के सापेक्ष पीसीआर-प्रवर्धित किया जा सकता है। यह विभिन्न पौधों के जीनोटाइप13,19 के साथ रोगजनकता परीक्षण करने के लिए एक मार्कर के रूप में काम कर सकता है और एक मॉडल के रूप में वर्टीसिलियम जैसे संवहनी रोगजनकों का उपयोग करते समय एक लाभ है। इसके विपरीत, रोगजनकों के विभिन्न जीनोटाइप को सफल उपनिवेशीकरण के लिए आवश्यक वायरस जीन की पहचान करने के लिए लागू किया जा सकता है।

सभी मामलों में, विश्लेषण के लिए सबसे अच्छा समय जीनोटाइप, पौधों की प्रजातियों और माइक्रोब पर निर्भर करता है। सबसे महत्वपूर्ण कदम प्रारंभिक परीक्षण के माध्यम से प्रत्येक शोध प्रश्न के लिए सबसे अच्छा समय बिंदु परिभाषित करना है। इसके अलावा, जब वर्टिसिलियम की तुलना में अन्य रोगाणुओं को नियोजित किया जाता है, तो टीकाकरण के लिए पर्याप्त सांद्रता का शुरू में पता लगाया जाना चाहिए।

पहले से ही उल्लिखित संभावनाओं के अलावा, कप प्रणाली कृषि रसायनों की स्क्रीनिंग के लिए इसका विस्तार करने की क्षमता प्रदान करती है जिसे विशिष्ट परजीवी रोगाणुओं के साथ उपनिवेशीकरण को प्रतिबंधित करने के लिए लागू किया जा सकता है। पौधे के माइक्रोबियल उपनिवेशीकरण पर बायोसिडल रसायनों के प्रभाव का परीक्षण मेजबान पर लक्षण विकास की निगरानी करने से पहले (या उसके दौरान) आगर माध्यम में सीधे परिष्कृत रोगाणुरोधी यौगिक को जोड़कर किया जा सकता है। यह मिट्टी जनित बीमारियों के खिलाफ उपन्यास उपचार की खोज में तेजी लाने के लिए स्क्रीनिंग के कार्यान्वयन की सुविधा प्रदान कर सकता है।

यद्यपि मिट्टी माइक्रोबायोम के कई सदस्य रोगजनक हैं, विशाल बहुमत तटस्थ हैं या पौधे के विकास के लिए भी फायदेमंदहैं। लाभकारी सूक्ष्मजीवों के साथ पौधों को टीका लगाने के लिए प्रोटोकॉल का उपयोग करने का अवसर है। इससे पहले, एस इंडिका बीजाणुओं को पेट्री डिश सिस्टम में जोड़ा गया था ताकि जड़ों में बाद की प्रतिक्रियाओं की जांचकी जा सके। यह न केवल रोगजनक बल्कि लाभकारी इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए समझाए गए संक्रमण प्रणालियों के स्पेक्ट्रम को व्यापक बनाता है।

चूंकि यह ज्ञात है कि राइजोस्फीयर में रोगाणु एक-दूसरेको प्रभावित करते हैं 6, इसलिए इसे विभिन्न माइक्रोबियल प्रजातियों के साथ एक समानांतर टीकाकरण द्वारा अनुकरण किया जा सकता है (या पौधों का उपचार पहले एक के साथ और बाद में दूसरे के साथ)। यह सह-, ट्रिपल-, या यहां तक कि बहु-संस्कृति मॉडल को सक्षम बनाता है। पर्याप्त सिंथेटिक समुदायों (SynComs, सूक्ष्मजीवों के संग्रह) के लिए एक अधिक उन्नत विस्तार कल्पनीय है क्योंकि यह जटिल माइक्रोबियल रचनाओं के प्रभावों को समझने में मदद करता है।

संक्षेप में, इनोक्यूलेशन सिस्टम बाद के विश्लेषण के लिए कई संयोजनों की अनुमति देते हैं और अनुप्रयोगों की एक श्रृंखला का समर्थन करते हैं। विधियों का यह संग्रह मोटे तौर पर विभिन्न रूट-उपनिवेशीकरण रोगाणुओं (दोनों लाभकारी और रोगजनक) पर लागू होता है और रूट-माइक्रोब इंटरैक्शन का विश्लेषण करने के लिए एक मजबूत मंच प्रदान करता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों ने इन तरीकों पर पिछले काम के लिए टिम इवेन और जैकलीन कोमोरेक को स्वीकार किया, वोल्फगैंग ड्रोज-लेजर (फार्मास्युटिकल बायोलॉजी विभाग, वुर्जबर्ग विश्वविद्यालय, जर्मनी) के समूह को इस काम के लिए आवश्यक उपकरण और संसाधन प्रदान करने के लिए, और वोल्फगैंग ड्रोगे-लेजर के साथ-साथ फिलिप क्रेइज़ (दोनों विश्वविद्यालय वुर्जबर्ग) पांडुलिपि के महत्वपूर्ण प्रूफरीडिंग के लिए। इस अध्ययन को "ड्यूश Forschungsgemeinschaft" (DFG, DR273/15-1,2) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar (Gelrite) Carl Roth Nr. 0039 all systems described require Gelrite
Arabidopsis thaliana wild-type NASC stock Col-0 (N1092)
Autoclave Systec VE-100
BlattFlaeche Datinf GmbH BlattFlaeche software to determine leaf areas
Brassica napus wild-type see Floerl et al., 2008 rapid-cycling rape genome ACaacc
Cefotaxime sodium Duchefa C0111
Chicanery flask 500 mL Duran Group / neoLab E-1090 Erlenmeyer flask with four baffles
Collection tubes 50 mL Sarstedt 62.547.254 114 x 28 mm
Czapek Dextrose Broth medium Duchefa C1714
Digital camera Nikon D3100 18-55 VR
Exsiccator (Desiccator ) Duran Group 200 DN, 5.8 L Seal with lid to hold chlorine gas
Fluorescence Microscope Leica Leica TCS SP5 II
HCl Carl Roth P074.3
KNO3 Carl Roth P021.1 ≥ 99 %
KOH Carl Roth 6751
Leukopor BSN medical GmbH 2454-00 AP non-woven tape 2.5 cm x 9.2 m
MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) Carl Roth 4256.2 Pufferan ≥ 99 %
MgSO4 Carl Roth T888.1 Magnesiumsulfate-Heptahydrate
Murashige & Skoog medium (MS) Duchefa M0222 MS including vitamins
NaClO Carl Roth 9062.1
Percival growth chambers CLF Plant Climatics GmbH AR-66L2
Petri-dishes Sarstedt 82.1473.001 size ØxH: 92 × 16 mm
Plastic cups (500 mL, transparent) Pro-pac, salad boxx 5070 size: 108 × 81 × 102 mm
Pleated cellulose filter Hartenstein FF12 particle retention level 8–12 μm
poly klima growth chamber poly klima GmbH PK 520 WLED
Potato Dextrose Broth medium SIGMA Aldrich P6685 for microbiology
Pots Pöppelmann GmbH TO 7 D or TO 9,5 D Ø 7 cm resp. Ø 9.5 cm
PromMYB51::YFP see Poncini et al., 2017 MYB51 reporter line YFP (i.e. 3xmVenus with NLS)
Reaction tubes 2 mL Sarstedt 72.695.400 PCR Performance tested
Rotary (orbital) shaker Edmund Bühler SM 30 C control
Sand (bird sand) Pet Bistro, Müller Holding 786157
Soil Einheitserde spezial SP Pikier (SP ED 63 P)
Solanum lycopersicum wild-type see Chavarro-Carrero et al., 2021 Type: Moneymaker
Thoma cell counting chamber Marienfeld 642710 depth 0.020 mm; 0.0025 mm2
Ultrapure water (Milli-Q purified water) MERK IQ 7003/7005 water obtained after purification
Verticillium dahliae see Reusche et al., 2014 isolate JR2
Verticillium longisporum Zeise and von Tiedemann, 2002 strain Vl43

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References

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मिट्टी जनित सूक्ष्मजीवों के साथ पौधे की जड़ों को संक्रमित करने के लिए इनोक्यूलेशन रणनीतियाँ
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Marsell, A., Fröschel, C. Inoculation Strategies to Infect Plant Roots with Soil-Borne Microorganisms. J. Vis. Exp. (181), e63446, doi:10.3791/63446 (2022).

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