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Estrategias de inoculación para infectar las raíces de las plantas con microorganismos transmitidos por el suelo

Published: March 1, 2022 doi: 10.3791/63446
Automatic Translation
1, 1
1Department of Pharmaceutical Biology, Julius-von-Sachs-Institute, Julius-Maximilians-Universität Würzburg

Summary

Este protocolo presenta un resumen detallado de las estrategias para inocular las raíces de las plantas con microbios transmitidos por el suelo. Ejemplificado para los hongos Verticillium longisporum y Verticillium dahliae, se describen tres sistemas diferentes de infección radicular. Se destacan las aplicaciones potenciales y los posibles análisis posteriores, y se discuten las ventajas o desventajas para cada sistema.

Abstract

La rizosfera alberga una comunidad microbiana altamente compleja en la que las raíces de las plantas son constantemente desafiadas. Las raíces están en estrecho contacto con una amplia variedad de microorganismos, pero los estudios sobre las interacciones transmitidas por el suelo aún están detrás de los realizados en los órganos sobre el suelo. Aunque algunas estrategias de inoculación para infectar plantas modelo con patógenos de raíces modelo se describen en la literatura, sigue siendo difícil obtener una visión general metodológica completa. Para abordar este problema, se describen con precisión tres sistemas diferentes de inoculación radicular que se pueden aplicar para obtener información sobre la biología de las interacciones raíz-microbio. A modo de ejemplo, las especies de Verticillium (a saber, V. longisporum y V. dahliae) se emplearon como patógenos modelo invasores de raíces. Sin embargo, los métodos se pueden adaptar fácilmente a otros microbios colonizadores de raíces, tanto patógenos como beneficiosos. Al colonizar el xilema de la planta, los hongos vasculares transmitidos por el suelo como Verticillium spp. exhiben un estilo de vida único. Después de la invasión de la raíz, se propagan a través de los vasos del xilema acropétalo, llegan al brote y provocan síntomas de enfermedad. Se eligieron tres especies de plantas representativas como huéspedes modelo: Arabidopsis thaliana, colza de importancia económica (Brassica napus) y tomate (Solanum lycopersicum). Se dan protocolos paso a paso. Se muestran resultados representativos de ensayos de patogenicidad, análisis transcripcionales de genes marcadores y confirmaciones independientes por parte de constructos reporteros. Además, se discuten a fondo las ventajas y desventajas de cada sistema de inoculación. Estos protocolos probados pueden ayudar a proporcionar enfoques para preguntas de investigación sobre las interacciones raíz-microbio. Saber cómo las plantas hacen frente a los microbios en el suelo es crucial para desarrollar nuevas estrategias para mejorar la agricultura.

Introduction

Los suelos naturales están habitados por un número asombroso de microbios que pueden ser neutros, dañinos o beneficiosos para las plantas1. Muchos patógenos de plantas son transmitidos por el suelo, rodean las raíces y atacan el órgano subterráneo. Estos microorganismos pertenecen a una amplia variedad de clados: hongos, oomicetos, bacterias, nematodos, insectos y algunos virus 1,2. Una vez que las condiciones ambientales favorecen la infección, las plantas susceptibles se enfermarán y los rendimientos de los cultivos disminuirán. Los efectos del cambio climático, como el calentamiento global y los fenómenos meteorológicos extremos, aumentarán la proporción de patógenos de plantas transmitidos por el suelo3. Por lo tanto, será cada vez más importante estudiar estos microbios destructivos y su impacto en la producción de alimentos y piensos, pero también en los ecosistemas naturales. Además, hay mutualistas microbianos en el suelo que interactúan estrechamente con las raíces y promueven el crecimiento, el desarrollo y la inmunidad de las plantas. Cuando se enfrentan a patógenos, las plantas pueden reclutar activamente oponentes específicos en la rizosfera que pueden apoyar la supervivencia del huésped mediante la supresión de patógenos 4,5,6,7. Sin embargo, los detalles mecanicistas y las vías involucradas en las interacciones beneficiosas entre la raíz y el microbio a menudo aún sedesconocen 6.

Por lo tanto, es esencial ampliar la comprensión general de las interacciones raíz-microbio. Se necesitan métodos confiables para inocular raíces con microorganismos transmitidos por el suelo para realizar estudios de modelos y transferir los hallazgos a aplicaciones agrícolas. Se estudian las interacciones beneficiosas en el suelo, por ejemplo, con Serendipita indica (anteriormente conocida como Piriformospora indica), Rhizobium spp. fijador de nitrógeno u hongos micorrícicos, mientras que los patógenos conocidos de plantas transmitidas por el suelo incluyen Ralstonia solanacearum, Phytophthora spp., Fusarium spp. y Verticillium spp.1. Estos dos últimos son géneros fúngicos que están distribuidos globalmente y causan enfermedades vasculares2. Verticillium spp. (Ascomycota) puede infectar a cientos de especies de plantas, en gran parte dicotiledóneas, incluidas las plantas herbáceas anuales, las plantas leñosas perennes y muchas plantas de cultivo 2,8. Las hifas de Verticillium entran en la raíz y crecen tanto intercelular como intracelularmente hacia el cilindro central para colonizar los vasos del xilema 2,9. En estos vasos, el hongo permanece durante la mayor parte de su ciclo de vida. Como la savia del xilema es pobre en nutrientes y lleva compuestos de defensa de las plantas, el hongo debe adaptarse a este entorno único. Esto se logra mediante la secreción de proteínas relacionadas con la colonización que permiten que el patógeno sobreviva en su huésped10,11. Después de llegar a la vasculatura de la raíz, el hongo puede propagarse dentro de los vasos del xilema acropétalo al follaje, lo que conduce a la colonización sistémica del huésped 9,12. En este punto, la planta se ve afectada negativamente en el crecimiento 9,10,13. Por ejemplo, se produce retraso en el crecimiento y hojas amarillas, así como senescencia prematura 13,14,15,16.

Un miembro de este género es Verticillium longisporum, que está altamente adaptado a los huéspedes de brassicácea, como la colza de importancia agronómica, la coliflor y la planta modelo Arabidopsis thaliana12. Varios estudios combinaron V. longisporum y A. thaliana para obtener una amplia información sobre las enfermedades vasculares transmitidas por el suelo y las respuestas de defensa radicular resultantes 13,15,16,17. Las pruebas de susceptibilidad directas se pueden realizar utilizando el sistema modelo V. longisporum / A. thaliana y hay recursos genéticos bien establecidos disponibles para ambos organismos. Estrechamente relacionado con V. longisporum está el patógeno Verticillium dahliae. Aunque ambas especies de hongos realizan un estilo de vida vascular similar y un proceso de invasión, su eficiencia de propagación desde las raíces hasta las hojas y los síntomas de la enfermedad provocada en A. thaliana son diferentes: mientras que V. longisporum generalmente induce senescencia temprana, la infección por V. dahliae resulta en marchitamiento18. Recientemente, un resumen metodológico presentó diferentes estrategias de inoculación radicular para infectar A. thaliana con V. longisporum o V. dahliae, ayudando en la planificación de configuraciones experimentales19. En el campo, V. longisporum ocasionalmente causa daños significativos en la producción de colza12, mientras que V. dahliae tiene un rango de huéspedes muy amplio que comprende varias especies cultivadas, como vid, papa y tomate8. Esto hace que ambos patógenos sean modelos económicamente interesantes para estudiar.

Por lo tanto, los siguientes protocolos utilizan tanto V. longisporum como V. dahliae como patógenos de raíz modelo para ejemplificar posibles enfoques para las inoculaciones radiculares. Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), colza oleaginosa (Brassica napus) y tomate (Solanum lycopersicum) fueron elegidos como huéspedes modelo. Las descripciones detalladas de las metodologías se pueden encontrar en el texto a continuación y en el video que lo acompaña. Se discuten las ventajas y desventajas para cada sistema de inoculación. En conjunto, esta colección de protocolos puede ayudar a identificar un método adecuado para preguntas de investigación específicas en el contexto de las interacciones raíz-microbio.

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Protocol

1. Medios para cultivos de hongos y sistemas de inoculación de plantas

  1. Caldo líquido de dextrosa de patata (PDB): Preparar 21 g/L de PDB en agua ultrapura en un matraz termoestable.
  2. Caldo líquido de dextrosa Czapek (CDB): Prepare 42 g/L CDB en agua ultrapura en un matraz termoestable.
  3. Medio para el sistema de inoculación de placas de Petri: Preparar un matraz termoestable con 1,5 g/L murashige y Skoog medio (MS) y 8 g/L de agar en agua ultrapura.
    NOTA: Evite el azúcar en este medio, ya que conducirá a un crecimiento excesivo de hongos después de la inoculación.
  4. Medio para el sistema de inoculación a base de vasos de plástico: Preparar un matraz termoestable con 4,4 g/L de MS, 0,2 g/L de MgSO4, 1 g/L de KNO3, 0,5 g/L de ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES) y 6,0 g/L de agar en agua ultrapura y ajustar el pH a 5,7 con 5 M koh.
    NOTA: Evite el azúcar en este medio, ya que conducirá a un crecimiento excesivo de hongos después de la inoculación.
  5. 1/4 MS medio: Preparar 1.2 g/L MS en agua ultrapura.
  6. Utilice el autoclave para esterilizar todas las soluciones anteriores. Coloque los matraces de vidrio en la cesta, cierre la tapa y esterilice durante 15 min a 121 °C y 98,9 kPa.

2. Esterilización de la superficie de las semillas de las plantas

NOTA: Utilice el siguiente protocolo siempre para esterilizar la superficie de las semillas de Arabidopsis, colza y tomate antes de la siembra.

  1. Transfiera las semillas a un tubo de reacción de 2 ml. Coloque el tubo en un exsecador con una capacidad interna de 5,8 L.
  2. Genere gas cloro en el exsecador agregando 6 ml de ácido clorhídrico (HCl) al 33% en 100 ml de hipoclorito de sodio acuoso al 12% (NaClO).
  3. Cierre inmediatamente la tapa del exsecador e incube las semillas durante 3 h en el gas.

3. Preparación del inóculo con esporas de Verticillium (conidios derivados de la asexualidad)

NOTA: Cultivar V. dahliae (cepa JR2) de la misma manera que V. longisporum (cepa Vl43)17,18,19. Asegúrese de que todos los equipos y medios estén libres de gérmenes y que todos los pasos se realicen en una campana de flujo laminar para mantener el inóculo axénico.

  1. Llene 150 ml de PDB líquido (paso 1.1) en un matraz de artimaña de 500 ml y complemente el medio con 500 mg / L de cefotaxima.
  2. Agregue Verticillium conida del almacenamiento de stock de glicerol al medio PDB. Cierre el matraz con un tapón de espuma estéril.
  3. Incubar el cultivo durante 7-10 días en una caja oscura a temperatura ambiente (RT) bajo agitación continua y horizontal (agitador rotativo; 60 rpm). Esto da como resultado pequeñas esferas de micelios blancos.
  4. Retire y deseche el sobrenadante PDB con cuidado. La mayor parte del micelio debe permanecer en el matraz.
  5. Añadir 100 ml de CDB líquido (paso 1.2) sobre el micelio en el matraz de artimañas y complementar el medio con 500 mg/L de cefotaxima.
  6. Incubar otros 4-5 días en una caja oscura en RT bajo agitación continua y horizontal (agitador rotativo, 60 rpm) para inducir la esporulación. El sobrenadante se volverá amarillento-grisáceo a medida que se liberen los conidios.
  7. Filtre una porción (5-10 ml) del líquido que contiene conidios a través de un papel de filtro (nivel de retención de partículas de 8-12 μm) en un tubo de recolección estéril de 50 ml. Esto separa las esporas del micelio.
  8. Determine la concentración de esporas mediante el uso de una cámara de conteo celular y un microscopio. Diluir con medio 1/4 MS libre de gérmenes en agua ultrapura hasta obtener las concentraciones de esporas que se indican a continuación.
    NOTA: Bajo el microscopio, los conidios de V. longisporum son en su mayoría de largo dibujo y de 7.1-8.8 μm de tamaño, mientras que los conidios de V. dahliae son más cortos (3.5-5.5 μm) y bastante esféricos20.
  9. Use estos conidios recién cosechados como inóculo. Asegúrese de realizar los experimentos siempre con conidios recién cosechados y no con existencias congeladas, ya que la congelación reduce significativamente el número de esporas viables19.
  10. Para el almacenamiento a largo plazo, congele las esporas como solución de esporas altamente concentrada (aproximadamente 1 x 108 esporas/ml) en glicerol al 25% a -80 °C (almacenable hasta 1 año). Para los siguientes experimentos, use estas existencias de glicerol para inocular el medio PDB en el paso 3.2.

4. Un sistema de inoculación in vitro estéril basado en placas de Petri

NOTA: Para el sistema de placas de Petri17, asegúrese de que todos los equipos y medios estén libres de gérmenes y que todos los pasos se realicen en una campana de flujo laminar.

  1. Después del autoclave, vierta el medio (ver paso 1.3) en placas de Petri.
  2. Después del endurecimiento del medio, vuelva a empacar las placas de Petri en una bolsa de plástico estéril y guárdelas boca abajo durante la noche en el refrigerador (4-10 ° C). Un medio refrigerado ayuda a evitar el deslizamiento del medio en los siguientes pasos.
  3. Cortar y extraer un canal de infección y el tercio superior del medio solidificado con un bisturí (Figura 1A). Evite obtener líquido o aire debajo del medio de agar mientras corta; de lo contrario, el medio se deslizará y cerrará el canal de infección.
  4. Distribuya 50-100 semillas de Arabidopsis esterilizadas en la superficie con una punta de pipeta estéril en la superficie superior cortada. Coloque las semillas en el ángulo donde la superficie del agar cortado entre en contacto con la pared de la placa de Petri para que las raíces puedan crecer entre el medio y la pared de la placa de Petri. Esto facilitará la inoculación posteriormente.
  5. Cierre las placas de Petri y séllelas con cinta adhesiva permeable al aire para permitir el intercambio de gases.
  6. Después de la estratificación durante 2 días en la oscuridad a 4 ° C, coloque las placas verticalmente en un estante adecuado y cultive las plantas a 22 ° C ± 1 ° C en condiciones de día largo (16 h de luz / 8 h de oscuridad) en una cámara de crecimiento.
  7. Cuando la mayoría de las raíces alcanzan el canal de infección (aproximadamente plántulas de 9-11 días de edad), coloque las placas horizontalmente, ábralas y agregue 500 μL de Verticillium conidia recién cosechado con una concentración de 4 x 105 esporas / ml directamente en el canal de infección, asegurándose de que el líquido se distribuya uniformemente en el canal.
  8. Del mismo modo, prepare placas de control agregando 500 μL de una solución simulada en lugar de esporas (medio 1/4 MS libre de gérmenes).
  9. Incubar las placas horizontalmente durante un par de minutos hasta que el líquido se haya empapado y no pueda filtrarse cuando las placas se configuren verticalmente de nuevo. Luego, cierre la tapa y selle las placas con cinta adhesiva permeable al aire.
  10. Incubar las placas verticalmente en la cámara de crecimiento. Opcionalmente, cubra las partes de la raíz con cajas de papel negras para oscurecer las raíces y los hongos transmitidos por el suelo (ver19).
  11. Realice los análisis en los puntos de tiempo preferidos después de la inoculación dependiendo de la pregunta de investigación (consulte las leyendas de las figuras para conocer los puntos de tiempo exactos utilizados aquí). A continuación se presentan algunas sugerencias.
    1. Cortar las hojas de las raíces y cosechar ambas por separado. Saque las tiras de agar de las placas de Petri para acceder fácilmente a las raíces y sáquelas cuidadosamente del agar con fórceps. Congelar todo el material vegetal inmediatamente en nitrógeno líquido.
      1. Moler las muestras en nitrógeno líquido. Extraer ADN total de 100 mg de material foliar para determinar mediante una PCR cuantitativa (qPCR) la cantidad de ADN fúngico en relación con el ADN de la planta (ver19).
      2. Moler las muestras en nitrógeno líquido. Tomar 100 mg de material vegetal y extraer arn total. Realizar PCR de transcripción inversa cuantitativa (qRT-PCR) para determinar la expresión de genes de plantas (o genes fúngicos) durante la infestación (ver19).
    2. Retire cuidadosamente las raíces del agar evitando lesiones y examínelas bajo el microscopio fluorescente.
      1. Determinar la inducción de genes marcadores en líneas reporteras de plantas (por ejemplo, luciferasa, β-glucuronidasa o reporteros fluorescentes 17,19,21).
      2. Visualice la propagación de hongos en la raíz mediante el uso de líneas mensajeras de hongos (por ejemplo, V. longisporum que expresa constitutivamente la proteína verde fluorescente mejorada, Vl-sGFP 9) o mediante técnicas de tinción (por ejemplo, a través de 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-N-acetil-beta-d-glucosaminida (X-beta-D-Glc-Nac)18).

5. Un sistema de inoculación in vitro estéril organizado con vasos de plástico

NOTA: Como se señaló en la primera descripción de esta técnica19, asegúrese de que todos los equipos y medios estén libres de gérmenes y que todos los pasos se realicen en una campana de flujo laminar.

  1. Utilice vasos de plástico transparentes con un volumen total de 500 ml y esterilícelos en un baño de etanol al 70% -75% durante al menos 20 minutos. Seque las tazas en la campana de flujo laminar.
  2. Vierta el medio en autoclave (ver paso 1.4) en los vasos de plástico. Opcionalmente, agregue cefotaxima (concentración final de 50 mg / L) al medio en autoclave para evitar contaminaciones bacterianas. Use 150 ml de medio por taza para experimentos con Arabidopsis o más medio (250-300 ml por taza) para experimentos con especies de plantas más grandes (colza, tomate).
  3. Coloque una capa de plástico (esterilizada antes incubando en etanol al 70%-75% durante 20 min) en el medio antes de que se solidifique (Figura 1B).
    NOTA: Esta capa de plástico contiene cuatro orificios prefabricados en las esquinas para colocar semillas esterilizadas en la superficie. Esto permite que las semillas accedan al medio. Más tarde, esta capa de separación evita que las hojas toquen el medio que contiene hongos, de modo que los microbios no pueden atacar directamente a las hojas y deben tomar la vía de la raíz. Otro agujero está en el centro, lo que permite cortar el canal de infección.
  4. Cuando el medio se haya solidificado, corte el agar con un bisturí a través del orificio central prefabricado a una profundidad de aproximadamente 1,5 cm. Retire el agar cortado para crear un canal de infección en el que las esporas de hongos se puedan agregar más tarde.
  5. Rasque ligeramente el medio de agar con una punta de pipeta en los cuatro orificios más pequeños para interrumpir la piel solidificada (esto permite que las semillas absorban el agua del medio de agar acuoso). Coloque las semillas con una punta de pipeta en los orificios más pequeños.
  6. Cierre el vaso de plástico con un segundo vaso de plástico invertido y selle con cinta adhesiva permeable al aire. La cinta debe permitir el intercambio de gases.
  7. Después de la estratificación durante 3 días en la oscuridad a 4 ° C, incube los sistemas de copas bajo 12 h de luz / 12 h de oscuridad (Arabidopsis, colza oleaginosa) o 16 h de luz / 8 h de condiciones de oscuridad (tomate) en cámaras de crecimiento a una temperatura constante de 22 ° C y 60% de humedad.
  8. Siga la edad recomendada de las plantas para la inoculación: 21 días para Arabidopsis; 5-7 días para la colza oleaginosa; 12 días para tomate.
  9. Inocular las plántulas con Verticillium añadiendo 1 ml de solución de conidios (concentración recomendada: 4 x 105 esporas/ml) en el canal de infección. Para preparar muestras de control, agregue 1 ml de solución simulada sin esporas (medio 1/4 MS libre de gérmenes) en el canal.
  10. Realice los análisis en los puntos de tiempo preferidos después de la inoculación dependiendo de la pregunta de investigación (consulte las leyendas de las figuras para conocer los puntos de tiempo exactos utilizados aquí). A continuación se presentan algunas sugerencias.
    1. Tome fotografías de las plantas con una cámara digital desde arriba manteniendo la misma distancia para cada foto. Cuantifique el área de la hoja (por ejemplo, con ImageJ22 o BlattFlaeche17,19; use la longitud de las copas para establecer la escala) y compare los grupos infectados y de control. Categorizar el desarrollo de los síntomas de la enfermedad (por ejemplo, hojas más pequeñas, más amarillentas o necróticas).
      NOTA: Si hay tallos en Arabidopsis, retírelos para obtener mejores fotos de las rosetas.
    2. Retire las raíces y defina la biomasa (peso fresco) de los brotes de las muestras infectadas y controle las muestras pesando. Determine el peso fresco relativo19.
    3. Recoja las muestras para los análisis moleculares de la siguiente manera.
    4. Arabidopsis: Retire los tallos si los hay. Corta las rosetas en la base de las raíces. Asegúrese de excluir todo el material de raíz de la muestra y cosechar rosetas enteras. Combine 4-5 rosetas de diferentes plantas en una muestra y congele el material de la hoja en nitrógeno líquido.
    5. Saque las raíces con cuidado del medio con fórceps, presiónelas y aplíquelas con una toalla de papel para eliminar los restos de agar y combine 4-5 raíces de diferentes plantas en una muestra. Congelar inmediatamente en nitrógeno líquido.
    6. Colza/tomate: Corte los segmentos del tallo del hipocótilo (por ejemplo, 1 cm de longitud; siempre tome la misma región del tallo). Combine el material de 4-5 plantas en cada muestra y congele en nitrógeno líquido.
    7. Moler las muestras en nitrógeno líquido. Extraiga el ADN total de 100 mg del material de la hoja o del tallo para determinar a través de qPCR la cantidad de ADN fúngico en relación con el ADN de la planta (ver19).
    8. Moler las muestras en nitrógeno líquido, tomar 100 mg de material vegetal y extraer ARN total. Realizar qRT-PCR para determinar la expresión de genes de plantas (o genes fúngicos) tras la infestación (ver19).

6. Un sistema de inoculación basado en el suelo en macetas

  1. Mezcle bien el suelo y la arena en una proporción volumétrica de 3: 1 (suelo: arena) para facilitar el lavado del sustrato de las raíces. Vierta la mezcla en una bolsa de autoclave. Si la mezcla está demasiado seca, agregue una cantidad adecuada de agua y mézclela en el sustrato. Vapor a 80 °C durante 20 min en autoclave para minimizar las contaminaciones microbianas.
    NOTA: Evite calentar a más de 80 ° C, ya que esto puede afectar los nutrientes orgánicos del suelo.
  2. Llene las macetas con la mezcla de tierra y arena y transfiéralas a bandejas. Agregue agua en las bandejas aproximadamente 1/3 de la altura de una maceta, de modo que la mezcla de tierra y arena se empape completamente con agua. Además, rocíe con agua el sustrato con una botella de spray para garantizar condiciones de arranque húmedas.
  3. Siembre 3-4 semillas en cada maceta (Figura 1C) asegurándose de que las semillas tengan suficiente distancia entre sí. Manténgalos durante 3 días en la oscuridad a 4 ° C para la estratificación para sincronizar la germinación.
    NOTA: Precultivar un exceso de plantas, lo que permite una selección de plantas de tamaño similar para los experimentos de inoculación y reduce las desviaciones debidas a diferencias individuales.
  4. Deje que las plántulas crezcan en condiciones de día largo (16 h de luz / 8 h de oscuridad; temperatura constante de 22 ° C; 60% de humedad) con riego regular.
  5. Siga la edad recomendada de las plantas para la inoculación: 21 días para Arabidopsis, 7 días para la colza y 10 días para el tomate. Escoge plantas de tamaño similar para realizar la "inoculación por inmersión radicular"15,17,23,24. Saque el suelo de las macetas y excave cuidadosamente las raíces.
  6. Lave suavemente solo las raíces en un recipiente de agua y mantenga las rosetas fuera del agua. Incubar las raíces lavadas durante 60 min en una placa de Petri que contenga la solución de esporas de Verticillium (concentración recomendada: 2 x 106 esporas/ml). Para el grupo de control no infectado, incube las raíces durante 60 min en la solución simulada sin esporas (medio 1/4 MS libre de gérmenes).
  7. Prepare macetas nuevas con tierra húmeda y esterilizada al vapor (80 °C durante 20 min) sin arena. Use una punta de pipeta para hacer un agujero en el centro del suelo en cada maceta.
  8. Coloque directamente las raíces en el agujero (transfiera solo una planta por maceta). Después de insertar las raíces, asegúrese de rellenar los agujeros cuidadosamente con tierra. Evite presionar el suelo, de lo contrario, replantar puede causar síntomas de estrés como hojas moradas.
  9. Cultive grupos infectados y de control en condiciones de día largo (16 h de luz / 8 h de oscuridad; una temperatura constante de 22 ° C; 60% de humedad) con riego regular.
  10. Realice los análisis en los puntos de tiempo preferidos después de la inoculación dependiendo de la pregunta de investigación (consulte las leyendas de las figuras para conocer los puntos de tiempo exactos utilizados aquí). A continuación se presentan algunas sugerencias.
    1. Tome fotografías de las plantas con una cámara digital desde arriba, manteniendo la distancia igual para cada foto. Cuantifique el área de la hoja (por ejemplo, con ImageJ22 o BlattFlaeche17,19; use el diámetro de las macetas para establecer la escala) y compare los grupos infectados y de control. Categorizar el desarrollo de síntomas de la enfermedad (por ejemplo, hojas más pequeñas, más amarillentas o necróticas)13.
      NOTA: La eliminación de tallos de Arabidopsis facilita la toma de fotos de las rosetas.
    2. Retire las raíces y defina la biomasa (peso fresco) de los brotes de las muestras infectadas y controle las muestras pesando. Determine el peso fresco relativo19.
    3. Alternativamente, mida la altura de la planta o clasifique el crecimiento de hongos de los segmentos del tallo para evaluar la gravedad de la enfermedad13.
    4. Recolectar muestras para análisis moleculares de la siguiente manera.
    5. Arabidopsis: Retirar los tallos. Cortar las rosetas en la corona de la raíz. Combine 4-5 rosetas de diferentes plantas en una muestra. Congelar el material de la hoja en nitrógeno líquido.
      NOTA: En el caso de las raíces, es difícil limpiarlas lo suficiente del suelo sin reprogramar la expresión génica a través del lavado.
    6. Colza/tomate: Corte los segmentos del tallo del hipocótilo (por ejemplo, 1 cm de longitud; siempre tome la misma región del tallo). Combine el material de 4-5 plantas en una muestra y congélelo en nitrógeno líquido.
    7. Moler las muestras en nitrógeno líquido. Extraiga el ADN total de 100 mg de material de hoja o tallo para determinar a través de qPCR la cantidad de ADN fúngico en relación con el ADN de la planta (ver19).
    8. Moler las muestras en nitrógeno líquido, tomar 100 mg de material vegetal y extraer ARN total. Realizar qRT-PCR para determinar la expresión de genes de plantas (o genes fúngicos) tras la infestación (ver19).

7. Análisis de los datos

  1. Calcular el promedio y la desviación estándar (± DE) en función de las réplicas biológicas.
  2. Calcule los valores relativos dividiendo todos los resultados del grupo infectado por el resultado del control. Muestre el promedio como, por ejemplo, "relativo a simulado" o "relativo a tipo salvaje".
  3. Determinar la significación estadística entre los grupos.

Figure 1
Figura 1: Compilación de los tres sistemas de inoculación y pasos individuales en los protocolos. Estas figuras ilustran los sistemas con la planta modelo Arabidopsis thaliana. Para otras especies de plantas, el tiempo debe ajustarse. Resaltan las cajas naranjas, para las cuales los análisis posteriores son los más recomendables con el sistema respectivo. (A) Para el sistema de inoculación en placas de Petri17, vierta el medio y deje que se solidifique. Mantenga los platos en la nevera durante la noche. Luego, corte y retire el tercio superior, así como el canal de infección (CI) con un bisturí (las áreas blancas en la ilustración se eliminaron del agar, mientras que las áreas azuladas representan el agar). Coloque las semillas en la superficie cortada y cierre las placas de Petri. Después de la estratificación, coloque las placas verticalmente y deje que las plantas crezcan. Una vez que la mayoría de las raíces hayan alcanzado el canal de infección, agregue la solución de esporas con una pipeta directamente en el canal. Asegúrese de que la solución esté distribuida uniformemente. Cierre las placas de Petri e incube verticalmente en una cámara de crecimiento. Los enfoques que pueden seguir son el análisis expresional con PCR de transcripción inversa cuantitativa (qRT-PCR), la microscopía con líneas reporteras y la cuantificación del ADN microbiano. (B) Para el sistema de inoculación en vasos de plástico19, vierta el medio y transfiera la capa de plástico separadora con los orificios prefabricados (cuatro pequeños orificios en las esquinas para colocar las semillas y un agujero grande en el centro para el canal de infección). Deja que el medio se solidifique. Cortar y retirar el medio de agar en el orificio central con un bisturí para obtener el canal de infección (CI). Rasca el medio en los agujeros más pequeños y transfiere las semillas. Cierre la taza con una taza invertida y selle con cinta permeable al aire (simbolizada en amarillo). Deja que las plantas crezcan. Para la inoculación, agregue la solución de esporas con una pipeta directamente en el canal de infección. Cierre el sistema y continúe el cultivo en la cámara de crecimiento. Los enfoques que pueden seguir son el análisis expresional con qRT-PCR, la cuantificación del ADN microbiano y la determinación del peso fresco, el área de la hoja u otras características de la enfermedad. (C) "Inoculación por inmersión de raíces"15,17,23,24: para el sistema de inoculación basado en el suelo, llene las macetas con una mezcla de tierra: arena. Transfiera las semillas y deje que las plántulas crezcan. Excava plantas de tamaño similar y lava las raíces en agua. Coloque las raíces lavadas en una placa de Petri que sostenga la solución con las esporas. Después de la incubación, inserte plantas individuales en macetas con tierra. Los enfoques que pueden seguir son el análisis expresional en hojas con qRT-PCR, la cuantificación del ADN microbiano y la determinación del peso fresco, el área de la hoja u otras características de la enfermedad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Representative Results

Siguiendo el protocolo, las plantas fueron cultivadas e inoculadas con V. longisporum (cepa Vl4325) o V. dahliae (aislado JR218). Se diseñaron varios escenarios para demostrar la efectividad y resaltar algunas capacidades de los protocolos dados. Se muestran resultados representativos.

La inducción expresional de genes implicados en la biosíntesis antimicrobiana de indol-glucosinolato (IG) es un indicador fiable para la evaluación de una infección por Verticillium 17,19,26. En Arabidopsis, MYB51 (proteína de dominio MYB 51; AT1G18570) codifica un factor de transcripción implicado en la activación de genes necesarios para la biosíntesis de IG27. MYB51 puede servir como un gen marcador que indica una infestación exitosa, ya que es inducida consistentemente en las raíces por V. longisporum26 u otros hongos transmitidos por el suelo como Phytophthora parasitica26 y Fusarium oxysporum21. Dos días después de la inoculación (2 dpi) en el sistema basado en placas de Petri, se visualizó la inducción de MYB51 en raíces de Arabidopsis. La línea de planta reportera PromMYB51::YFP21 reveló una activación promotora y un análisis qRT-PCR confirmó una inducción transcripcional significativa de este gen (Figura 2A-B). Tales experimentos tienen como objetivo determinar los cambios expresionales en las raíces durante la infección.

Debido a que las especies de Verticillium utilizadas en este estudio realizan un estilo de vida vascular y se propagan desde la raíz hasta el brote a través de los vasos del xilema, la cantidad de ADN fúngico se puede determinar en las hojas como parámetro para el grado de propagación de hongos. Arabidopsis se inoculó la raíz en el sistema in vitro en vasos de plástico y las rosetas se cosecharon 12 días después. En comparación con el valor de fondo detectado en el simulacro de control, se han encontrado cantidades sustanciales de ADN fúngico en las hojas de plantas infectadas (Figura 2C). Esto demuestra que la infección ha progresado con éxito. Para exámenes adicionales, la cantidad de ADN fúngico se puede cuantificar en diferentes genotipos de plantas para obtener información sobre las respuestas de defensa de la raíz. Además, se recogieron raíces en este punto de tiempo para probar la inducción del gen marcador a través de qRT-PCR. La abundancia de transcripciones myB51 se enriqueció significativamente (Figura 2D). Esto ilustra que las pruebas de susceptibilidad y los análisis expresionales se pueden realizar fácilmente en paralelo con el sistema de copas, lo que subraya la gran ventaja de este procedimiento.

Para incluir evidencia de que también se pueden introducir otras especies de plantas modelo, la colza se infectó con V. longisporum y el tomate con V. dahliae en el sistema en vasos de plástico. El día 12 después de la inoculación en las raíces, se cuantificó la cantidad de ADN fúngico en segmentos de tallo cortados en la base de las plántulas (Figura 2E-F). El ADN fúngico fue detectable en ambas especies de plantas, lo que indica la propagación de los patógenos dentro de la planta. Una vez más, se podrían probar diferentes genotipos de plantas para obtener conocimientos sobre los mecanismos de defensa.

Si el microbio colonizador de raíces de interés no se propaga de raíces a hojas, no es posible cuantificar la cantidad de ADN microbiano en las hojas como parámetro para la gravedad de la enfermedad. Otra opción para medir la gravedad de la enfermedad es la evaluación y extrapolación de los síntomas en el huésped. Para ejemplificar esto, Arabidopsis fue inoculada por inmersión radicular con V. dahliae en el sistema basado en el suelo y se evaluó el área de hoja verde (Figura 2G-H). Mientras que las rosetas de las plantas tratadas simuladamente se veían sanas y verdes, las plantas infectadas por patógenos tenían un tamaño de hoja reducido y hojas amarillentas o incluso necróticas. De esta manera, la susceptibilidad de diferentes genotipos de plantas puede ser analizada y confirmada, por ejemplo, cuantificando el peso fresco.

Figure 2
Figura 2: Resultados representativos obtenidos siguiendo los protocolos. (A,B) Las raíces de Arabidopsis fueron inoculadas con V. longisporum en el sistema de placas de Petri. La línea reportera PromMYB51::YFP21 reveló una fuerte activación del promotor MYB51 en raíces infectadas en comparación con el control simulado (microscopía a 2 dpi; barra de escala: 50 μm). La inducción transcripcional de MYB51 en raíces de tipo salvaje (WT) se confirmó aún más con el análisis qRT-PCR (2 dpi). Los valores de las muestras infectadas se dan en relación con las muestras simuladas (establecidas en 1) (n = 5; ± SD). (C) Colonización sistémica a través de V. longisporum: Después de inocular las raíces de Arabidopsis en el sistema de copas, la cantidad relativa de ADN fúngico se determinó en las hojas mediante PCR cuantitativa (qPCR; 12 dpi). Los valores de las muestras infectadas se dan en relación con el nivel de fondo en las muestras simuladas (establecido en 1) (n = 3; ± SD). (D) Se extrajeron raíces infectadas con V. longisporum y tratadas con simulacros del sistema de copas y se realizó un análisis qRT-PCR. Los valores de las muestras infectadas se dan en relación con las muestras simuladas (establecidas en 1) (n = 3; ± SD). Se encontró que MYB51 era inducido transcripcionalmente (12 dpi). (E) La colza oleaginosa se inoculó en el sistema de copas con V. longisporum y la cantidad relativa de ADN fúngico se cuantificó a través de qPCR en segmentos de tallo (12 dpi). Los valores de las muestras infectadas se dan en relación con el nivel de fondo en las muestras simuladas (establecido en 1) (n = 3; ± SD). (F) El tomate se inoculó en el sistema de copas con V. dahliae y la cantidad relativa de ADN fúngico se cuantificó a través de qPCR en segmentos de tallo (12 dpi). Los valores de las muestras infectadas se dan en relación con el nivel de fondo en las muestras simuladas (establecido en 1) (n = 5; ± SD). (G,H) Arabidopsis fue inoculada por inmersión de raíz con V. dahliae en el sistema basado en el suelo y se muestran imágenes representativas de plantas infectadas y tratadas simuladamente (21 dpi). Se examinó el área de la hoja verde. En relación con el simulacro (establecido en 1), las plantas infectadas tenían menos área de hoja verde (n = 5; ± SD). (B-F,H) Para los pares de imprimación, véase19; estadísticas: prueba t del estudiante relativa al simulacro, * p≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0.001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Debido a las tremendas pérdidas de rendimiento causadas por los fitopatógenos transmitidos por el suelo1, se requiere una mejora de las estrategias agrícolas o las variedades de cultivos. La limitada comprensión de la patogénesis de las enfermedades transmitidas por el suelo dificulta el desarrollo de plantas más resistentes. Es necesario explorar los mecanismos patológicos subyacentes, para lo cual se requiere una plataforma metodológica robusta. Los procedimientos de inoculación reportados han demostrado que los eventos multifactoriales en las interacciones raíz-microbio pueden ser bien diseccionados mediante la combinación de diferentes sistemas19. Los protocolos descritos anteriormente están destinados a proporcionar un flujo de trabajo de rutina tanto para expertos como para investigadores nuevos en este campo. El manejo es sencillo, permite la replicación independiente y el equipo técnico requerido existe en los laboratorios de ciencias de plantas estándar.

Los eventos tempranos de infección por Verticillium (horas después de la inoculación a 6 dpi) se pueden examinar en el sistema de placa de Petri, los eventos tardíos (>21 dpi) en el sistema basado en el suelo y en el sistema de copa temporalmente en el medio (4 a 21 dpi). Después de agregar las esporas al canal de infección del sistema de placas de Petri, están en contacto directo con las raíces. Esto permite el examen de las respuestas tempranas de la defensa. Como se ejemplifica con la inducción MYB51, los cambios expresionales se pueden estudiar fácilmente con construcciones de reporteros de genes, qRT-PCR o incluso enfoques "-ómicos" de todo el genoma17,26. En comparación con los otros dos sistemas de infección, las respuestas de defensa son más vigorosas en las placas de Petri. Debido a su pequeño tamaño en las placas de Petri, las plántulas son rápidamente cubiertas por el hongo y la intensidad de las respuestas de defensa puede ser bastante antinatural en tales ensayos19. Los cambios expresionales también se pueden estudiar en las raíces del sistema de vasos de plástico, lo que lleva a resultados comparables al sistema de placas de Petri, aunque con valores de inducción más bajos para los genes marcadores. En la configuración experimental en tazas, el inóculo no está en contacto inmediato con las raíces, las esporas deben germinar y el patógeno debe crecer a través del medio hacia las raíces. La progresión de la infección es más lenta en comparación con el sistema de placas de Petri y, por lo tanto, más cercana a las condiciones naturales. Con respecto a las raíces, el sistema basado en el suelo más bien tiene una desventaja, porque deben estar suficientemente despejadas del suelo para su análisis sin reprogramar la expresión génica mediante lavado. Por lo tanto, estudiar los cambios expresionales en las raíces es más complicado en el suelo. Sin embargo, es posible probar en hojas si la infestación de raíces desencadena respuestas allí.

En ambos sistemas de inoculación in vitro (placas de Petri y vasos de plástico), se pueden prevenir contaminaciones externas siempre que cada paso se ejecute bajo la campana de flujo laminar con equipos estériles. Por lo tanto, las interacciones bilaterales pueden examinarse sin ser perturbadas. Por el contrario, el sistema basado en el suelo es simplemente "semiestéril", ya que las plantas no están aisladas herméticamente en la cámara de crecimiento. Sin embargo, puede considerarse como el más cercano a las condiciones naturales, ya que las plantas crecen en el suelo. Sin embargo, las raíces se dañan en el sistema basado en el suelo debido al enraizamiento ascendente, que ofrece acceso microbiano a los tejidos. Aunque esto podría ser un poco artificial, esto podría imitar las condiciones naturales que dañan las raíces, como la alimentación de nematodos28.

El sistema de placas de Petri es muy adecuado para visualizar la dinámica de propagación del patógeno utilizando cepas marcadas fluorescentemente (por ejemplo, V. longisporum cepa Vl-sGFP9). Los fenotipos radiculares resultantes de la colonización son bien observables. Por otro lado, la cuantificación de los síntomas de la enfermedad en las hojas / brotes en placas de Petri es difícilmente factible ya que el sistema es bastante pequeño. Además, es posible que no haya suficiente espacio para especies de plantas más grandes que Arabidopsis. Alternativamente, Behrens et al.29 establecieron un sistema de infección en placas adecuadas para la colza oleaginosa, donde un cepillo se sumerge en una suspensión de esporas y se utiliza para distribuir el inóculo a lo largo de las raíces que crecen en agar. Para evaluar los síntomas, los sistemas basados en copas y suelos son ciertamente preferibles. Aquí, el desarrollo de síntomas (por ejemplo, área foliar reducida, pérdida de peso fresco, disminución de la altura de la planta, la extensión del tejido necrótico) se puede evaluar en las hojas / brotes. La investigación de especies de plantas más grandes, como la colza y el tomate, no es un problema en los sistemas basados en copas y suelos, como se demuestra en los resultados representativos. Si el microbio transmitido por el suelo bajo investigación se propaga de raíz a brote, el ADN específico del patógeno puede amplificarse por PCR en relación con el ADN de la planta en el tejido del brote / hoja. Esto puede servir como marcador para la realización de pruebas de patogenicidad con diferentes genotipos de plantas 13,19 y es una ventaja cuando se utilizan patógenos vasculares como Verticillium como modelo. Viceversa, se pueden aplicar diferentes genotipos de patógenos para identificar los genes de virulencia necesarios para una colonización exitosa.

En todos los casos, el mejor momento para los análisis depende del genotipo, la especie de planta y el microbio. El paso más crítico es definir el mejor punto de tiempo para cada pregunta de investigación a través de pruebas preliminares. Además, cuando se emplean otros microbios distintos de Verticillium, inicialmente se deben determinar concentraciones adecuadas para la inoculación.

Además de las posibilidades ya mencionadas, el sistema de copas ofrece el potencial de ampliarlo para cribados de agroquímicos que podrían aplicarse para restringir la colonización con microbios parásitos específicos. El impacto de los productos biocidas en la colonización microbiana de las plantas podría probarse agregando el compuesto antimicrobiano putativo directamente en el medio de agar antes (o durante) de la inoculación y monitoreando el desarrollo de síntomas en el huésped. Esto puede facilitar la implementación de exámenes para acelerar el descubrimiento de nuevos tratamientos contra las enfermedades transmitidas por el suelo.

Aunque varios miembros del microbioma del suelo son patógenos, la gran mayoría son neutros o incluso beneficiosos para el crecimiento de las plantas1. Existe la oportunidad de utilizar los protocolos para inocular plantas con microorganismos beneficiosos. Anteriormente, se añadieron esporas de S. indica en el sistema de placas de Petri para examinar las respuestas posteriores en las raíces26. Esto amplía el espectro de los sistemas de infección explicados para estudiar no solo las interacciones patógenas sino también beneficiosas.

Dado que se sabe que los microbios en la rizosfera se influyen entre sí6, esto se puede simular mediante una inoculación paralela con diferentes especies microbianas (o tratamiento de las plantas primero con una y luego con otra). Esto permite modelos de co-, triple, o incluso multi-cultura. Es concebible una extensión más avanzada a comunidades sintéticas adecuadas (SynComs, colecciones de microorganismos), ya que esto ayuda a comprender las influencias de composiciones microbianas complejas30.

En resumen, los sistemas de inoculación permiten varias combinaciones para análisis posteriores y admiten una amplia gama de aplicaciones. Esta colección de métodos es ampliamente aplicable a varios microbios colonizadores de raíces (tanto beneficiosos como patógenos) y ofrece una plataforma robusta para analizar las interacciones raíz-microbio.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores reconocen a Tim Iven y Jaqueline Komorek por su trabajo previo en estos métodos, al grupo de Wolfgang Dröge-Laser (Departamento de Biología Farmacéutica, Universidad de Würzburg, Alemania) por proporcionar el equipo y los recursos necesarios para este trabajo, y a Wolfgang Dröge-Laser, así como a Philipp Kreisz (ambos de la Universidad de Würzburg) por la revisión crítica del manuscrito. Este estudio fue apoyado por la "Deutsche Forschungsgemeinschaft" (DFG, DR273/15-1,2).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar (Gelrite) Carl Roth Nr. 0039 all systems described require Gelrite
Arabidopsis thaliana wild-type NASC stock Col-0 (N1092)
Autoclave Systec VE-100
BlattFlaeche Datinf GmbH BlattFlaeche software to determine leaf areas
Brassica napus wild-type see Floerl et al., 2008 rapid-cycling rape genome ACaacc
Cefotaxime sodium Duchefa C0111
Chicanery flask 500 mL Duran Group / neoLab E-1090 Erlenmeyer flask with four baffles
Collection tubes 50 mL Sarstedt 62.547.254 114 x 28 mm
Czapek Dextrose Broth medium Duchefa C1714
Digital camera Nikon D3100 18-55 VR
Exsiccator (Desiccator ) Duran Group 200 DN, 5.8 L Seal with lid to hold chlorine gas
Fluorescence Microscope Leica Leica TCS SP5 II
HCl Carl Roth P074.3
KNO3 Carl Roth P021.1 ≥ 99 %
KOH Carl Roth 6751
Leukopor BSN medical GmbH 2454-00 AP non-woven tape 2.5 cm x 9.2 m
MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) Carl Roth 4256.2 Pufferan ≥ 99 %
MgSO4 Carl Roth T888.1 Magnesiumsulfate-Heptahydrate
Murashige & Skoog medium (MS) Duchefa M0222 MS including vitamins
NaClO Carl Roth 9062.1
Percival growth chambers CLF Plant Climatics GmbH AR-66L2
Petri-dishes Sarstedt 82.1473.001 size ØxH: 92 × 16 mm
Plastic cups (500 mL, transparent) Pro-pac, salad boxx 5070 size: 108 × 81 × 102 mm
Pleated cellulose filter Hartenstein FF12 particle retention level 8–12 μm
poly klima growth chamber poly klima GmbH PK 520 WLED
Potato Dextrose Broth medium SIGMA Aldrich P6685 for microbiology
Pots Pöppelmann GmbH TO 7 D or TO 9,5 D Ø 7 cm resp. Ø 9.5 cm
PromMYB51::YFP see Poncini et al., 2017 MYB51 reporter line YFP (i.e. 3xmVenus with NLS)
Reaction tubes 2 mL Sarstedt 72.695.400 PCR Performance tested
Rotary (orbital) shaker Edmund Bühler SM 30 C control
Sand (bird sand) Pet Bistro, Müller Holding 786157
Soil Einheitserde spezial SP Pikier (SP ED 63 P)
Solanum lycopersicum wild-type see Chavarro-Carrero et al., 2021 Type: Moneymaker
Thoma cell counting chamber Marienfeld 642710 depth 0.020 mm; 0.0025 mm2
Ultrapure water (Milli-Q purified water) MERK IQ 7003/7005 water obtained after purification
Verticillium dahliae see Reusche et al., 2014 isolate JR2
Verticillium longisporum Zeise and von Tiedemann, 2002 strain Vl43

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References

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Estrategias de inoculación para infectar las raíces de las plantas con microorganismos transmitidos por el suelo
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