Summary
在这里，我们描述了DNA纤维测定的两种修饰，以研究病变诱导后复制DNA的单链DNA间隙。S1纤维测定能够使用ssDNA特异性S1内切酶检测复制后间隙，而间隙填充测定允许间隙修复的可视化和定量。
Abstract
DNA纤维测定是一种简单而稳健的复制叉动力学分析方法，基于在人类细胞DNA合成过程中掺入的核苷酸类似物的免疫检测。然而，这种技术的分辨率有限，只有几千个千基。因此，标准测定无法检测到小至几百个碱基的复制后单链DNA（ssDNA）间隙。在这里，我们描述了利用S1核酸酶的DNA纤维测定的修饰版本，S1核酸酶是一种特异性切割ssDNA的酶。在存在复制后ssDNA间隙的情况下，S1核酸酶将靶向并切割间隙，产生较短的束，可用作正在进行的分叉上ssDNA间隙的读数。这些复制后ssDNA间隙是在不连续复制受损DNA时形成的。它们可以通过与基因组复制分离 的机制进行 修复，该过程称为间隙填充或复制后修复。由于间隙填充机制涉及独立于S期的DNA合成，因此DNA纤维标记方案的改变也可用于监测间隙填充事件。总而言之，DNA纤维测定的这些修饰是了解复制后间隙如何在人类细胞基因组中形成和填充的强大策略。
Introduction
开创性工作提供了在细菌1和人类细胞2，3中用DNA损伤剂处理后复制后单链（ssDNA）间隙积累的证据。在复制受损的DNA模板期间，DNA合成机制可以通过采用特定的转座合成DNA聚合酶或通过模板切换机制来绕过病变。或者，重复体也可以简单地跳过病变，留下一个ssDNA间隙，以便以后修复。最近，一项研究清楚地表明，利用电子显微镜可视化复制中间体的特定结构，用基因毒性剂治疗会导致真核生物中的ssDNA间隙4。这些复制后间隙区域的形成最初被认为是DNA复制2的半不连续模式的简单结果。在这种情况下，滞后链上的病变可以阻断冈崎片段的伸长，但叉子进展自然被以下冈崎片段挽救，留下ssDNA间隙。然而，进一步的研究表明，在前导链上形成间隙也是可能的，如细菌5所示。在真核生物中，PRIMPOL是一种具有primase活性的独特DNA聚合酶，被证明能够通过其重注活性6，7，8，9，10，11在复制阻断病变下游重新开始DNA合成。因此，PRIMPOL primase活性可以解释在用DNA损伤剂处理人细胞12时在前链中形成复制后ssDNA间隙。尽管如此，直到最近，这些间隙的检测以及间隙修复都需要间接或耗时的方法，例如电子显微镜4或基于质粒的测定13。使用ssDNA特异性S1核酸酶来检测人类细胞中的间隙是四十多年前早期研究的先驱，使用蔗糖梯度技术2，3。最近，我们的小组应用这种核酸酶来检测使用其他方法（如DNA纤维和彗星测定14）复制DNA（复制后间隙）中的ssDNA。这些新方法为目前关于复制后差距的研究激增铺平了道路。在这里，我们描述了一种使用S1核酸酶通过DNA纤维测定来检测复制后ssDNA间隙的策略，并解释了DNA纤维方案中的差异标记方案如何允许研究这些间隙的修复。
DNA纤维测定是一种强大的技术，已被越来越多的实验室使用，并为复制叉动力学和复制应激反应机制提供了有价值的见解。简而言之，该技术基于在复制DNA中连续掺入核苷酸类似物（例如CldU -5-氯-2'-脱氧尿苷和IdU-5-碘-2'-脱氧尿苷）。收获后，裂解细胞，DNA分子在正涂层的载玻片上扩散。然后通过特异性抗体检测CldU和IdU，这些抗体可以在荧光显微镜中可视化为双色纤维。最后，测量IdU和CldU束的长度，以识别DNA损伤诱导引起的DNA复制动力学的任何改变。该技术可用于研究不同的现象，例如叉子失速，分叉减速，新生DNA降解以及起源放电频率的变化15，16。
DNA纤维测定的一个局限性是其对几千碱基的分辨率。由于复制后ssDNA间隙可能在数百个碱基的范围内，因此不可能通过标准DNA纤维方案直接可视化这些间隙。ssDNA间隙在用基因毒性药物处理的人类细胞中复制DNA的存在以前已经间接涉及。例如，通过在S期外的细胞中募集ssDNA结合蛋白，复制蛋白A（RPA）来评估ssDNA的观察，或者通过碱性DNA解卷检测到的ssDNA的形成，以及DNA纤维测定12，17，18，19，20，21没有长时间的分叉失速 归因于ssDNA间隙的积累。此外，复制后ssDNA间隙诱导ATR依赖性G2 / M相检查点并阻止用复制毒物处理的细胞18，19，20，21，22。
S1核酸酶降解单链核酸，释放5'-磷酸基单核苷酸或寡核苷酸，与RNA相比，对ssDNA的亲和力高5倍。双链核酸（DNA：DNA、DNA：RNA 或 RNA：RNA）对 S1 核酸酶具有抗性，除非在极高浓度下使用。S1核酸酶还可以在由缺口，间隙，不匹配或环引起的单链区域切割双链DNA。因此，S1核酸酶是一种ssDNA特异性内切酶，能够切割ssDNA间隙，最终产生双链断裂23，24。因此，将S1核酸酶消化步骤添加到DNA纤维方案中间接能够检测复制后ssDNA间隙。在存在间隙的情况下，在DNA扩散之前用S1核酸酶处理暴露的细胞核将产生较短的束，这是由于ssDNA的S1裂解固有地存在于间隙14中。因此，束缩短是使用这种方法的ssDNA间隙的读出。与标准DNA纤维方案相比，具有S1核酸酶的DNA纤维只需要两个额外的步骤：细胞核暴露（细胞通透化）和用S1核酸酶处理。重要的是要注意，适当的对照是强制性的，例如用遗传毒性剂处理但没有S1核酸酶的样品和用S1核酸酶处理的没有遗传毒性剂的样品。方案本身，包括类似物的掺入，S1处理和扩散，可以在一天内完成，不需要特殊的材料。它只需要胸苷类似物，纯化的S1核酸酶，适当的一抗和二抗以及荧光显微镜。总体而言，采用S1核酸酶的DNA纤维使用相对简单的方法检测正在进行的复制分叉上的ssDNA间隙。
复制应激反应机制产生的复制后ssDNA间隙可以通过不同的机制进行修复（或填充），包括转座DNA合成或模板切换，该过程称为间隙填充或复制后修复（PRR）25。这些过程发生在前进的分叉后面，涉及复制无关的DNA合成14，26，27。基于这些发现，可以执行与标准DNA纤维测定不同的标记方案，以直接可视化G2相14，16，26，28中的间隙填充事件。具体而言，一个胸苷类似物可用于在遗传毒性治疗和复制后ssDNA间隙形成时标记复制叉，而另一个胸苷类似物可用于标记间隙填充事件。在该方案中，在基因毒性治疗1小时后立即或同时用第一胸苷类似物（例如IdU）标记细胞，以便在间隙形成时标记新生的DNA。在处理12-24小时之间的任何地方添加诺考达唑以阻止G2 / M中的细胞，防止以下S期。对于诺考达唑治疗的最后4小时，将第二个胸苷类似物（例如CldU）添加到要在间隙填充期间掺入的培养基中。重要的是，该测定只能用于检测G2中的间隙填充事件，因为来自CldU的间隙填充信号无法与由于CldU掺入S期复制DNA的信号而与信号区分开来。因此，为了最大限度地减少背景信号，损伤诱导后加入CldU的时间应与大多数细胞群进入G2相14的时间相吻合。因此，这个时间会根据细胞系和治疗条件而有所不同。建议在采用该测定之前优化细胞周期进展。这些胸苷类似物的共染色允许在基因毒性治疗期间合成的新生DNA（IdU束）上间隙填充（PRR）束（CldU贴片）的可视化，当ssDNA间隙产生时。
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Protocol
由于该研究使用人类细胞，这项工作得到了圣保罗大学生物医学科学研究所伦理委员会（ICB-USP，批准号#48347515.3.00005467）的批准，用于人类样本的研究。
注：此处描述的协议在以前的出版物中使用，但略有修改14，16，28。这里的重点是使用紫外线C（UVC）作为DNA损伤剂。然而，其它DNA损伤剂如顺铂和羟基脲也已成功采用28种。该方案可以在一系列细胞系中进行，包括U2OS，HEK293T，人成纤维细胞和其他14，28，29。在执行此协议之前，必须确定实验问题。使用S1核酸酶（以下称为S1纤维）的DNA纤维测定用于检测复制后ssDNA间隙的存在，而进行间隙填充（或PRR）测定以量化G2期的间隙填充事件。因此，如果分析复制后ssDNA间隙的存在，研究者应执行方案的第2部分（S1纤维实验设置）并直接进入方案的第4部分（通过铺展制备DNA纤维）。如果分析间隙填充事件，研究者应直接进入第3部分（间隙填充（PRR）实验设置）。
1. 试剂和设置
- 胸苷类似物：将5-碘-2'-脱氧尿苷（IdU）和5-氯-2'-脱氧尿苷（CldU）重悬于1 N NH4OH中至终浓度为100mM。通过无菌注射器过滤器（0.2μm），等分试样过滤类似物，并将其储存在-20°C。
- 抗体：原代 - 抗BrdU大鼠（Biorad）和抗BrdU小鼠（BD）;次级 - 抗鼠Alexa Fluor 488和抗鼠Alexa Fluor 594。
- 用于S1纤维的细胞通透性CSK100缓冲液：在蒸馏的H 2 O中加入100 mM NaCl，10 mM MOPS [pH 7]，3 mM MgCl2 [pH7.2]，300 mM蔗糖和0.5%Triton X-100。
- S1 核酸酶缓冲液 [pH 4.6]：在 H2O 中加入 30 mM 乙酸钠 [pH 4.6]、10 mM 乙酸锌、50 mM NaCl 和 5% 甘油。
注意：S1核酸酶缓冲液的最终pH值必须为4.6，因为S1活性在pH值>4.9时下降50%。 - 等分试样并将从米 曲 霉中纯化的S1核酸酶在制造商提供的S1核酸酶稀释缓冲液中预先稀释的S1核酸酶储存在-20°C。
- 将DMSO中的诺考达唑重构至终浓度为2mM以进行间隙填充。测定。
- 裂解缓冲液：在H2 O中加入200 mM Tris-HCl [pH 7.5]，50 mM EDTA和0.5%SDS。
- 制备磷酸盐缓冲盐水（PBS）。
- 通过在PBS中添加0.1%吐温-20来制备PBS-T。
- 在PBS中制备5%牛血清白蛋白（BSA）。
- 在PBS中准备0.1%的BSA。
- 通过在PBS-T中添加1%的BSA来制备PBS-T-BSA。
注意：使用带有510 nm波长和42 nm带宽GFP（FITC，Alexa Fluor 488）发射滤光片和624 nm波长和40 nm带宽德克萨斯红（Alexa Fluor 594）发射滤光片的汞或氙气灯的落射荧光显微镜，或使用488 nm线（蓝色）激光检测绿色荧光（在510和560 nm之间检测到）和561 nm线（黄色）激光以检测红色荧光（在575和680 nm之间检测到）。浸入式物镜（40x、63x 或 100x）。
2. S1光纤实验设置（2天）
- 第1天：为每个细胞系建立4个孔：±UVC和±S1核酸酶与70-90%汇合的细胞。
注意：实验可以以小至12孔板的格式进行。在这种情况下，所有溶液均以0.5 mL /孔使用。 - 第2天：在预热（37°C）细胞培养基中制备20μM的新鲜IdU和200μM的CldU。
- 吸出培养基并立即加入20μM IdU培养基，并将细胞在37°C，5%CO2 （细胞培养箱）下孵育20分钟。
- 用预热（37°C）PBS快速洗涤细胞两次。
- 用20 J / m2 UVC照射细胞。使用未经处理的细胞作为对照。
- 立即加入200μM CldU培养基，并将细胞在37°C，5%CO2 （细胞培养箱）下孵育60分钟。
注意：IdU和CldU标签可以互换，但第二个模拟物的浓度应比第一个模拟物高5-10倍。模拟孵育的时间可以适应所使用的遗传毒性剂，但是第二次类似物孵育的时间应足够长，以确保有足够的时间形成间隙14，16。如果使用DNA损伤药物，请将药物与CldU28，29，30一起加入。 - 用预热（37°C）PBS洗涤细胞两次。
- 用CSK100缓冲液在室温（RT）下透化细胞8-10分钟。
注意：成功的透化可以在明场显微镜下检查，其中只有原子核是可观察的 - 用PBS小心地洗涤细胞核（将0.5 mL倒入每个孔的侧面，只需几秒钟）。
- 用S1缓冲液小心地洗涤细胞核（将0.5mL倒入每个孔的侧面，只需几秒钟）。
- 用S1缓冲液与S1核酸酶（20 U / mL）或无（作为对照）在37°C（细胞培养箱）下孵育细胞核30分钟。
- 吸出S1缓冲液并在PBS中加入0.1%BSA。
- 刮取细胞核并将其转移到适当注释的1.5 mL管中。始终将管子放在冰上。
注意：可以在明场显微镜下检查细胞核的成功分离。 - 沉淀细胞核：在4°C下以〜4600× g 离心5分钟。
注意：与标准DNA纤维测定不同，细胞核不能计数，因此请考虑接种细胞的初始数量。或者，可以使用未经透化的额外孔来估计使用血细胞计数器或细胞计数器的细胞计数。 - 将沉淀以约1500个细胞/ μL的浓度在PBS中充分重悬，将试管放在冰上，并通过铺展（第4节）方案立即进行DNA纤维制备
3. 填隙（PRR）实验设置（3天）
- 第1天：为每个细胞系建立2个孔：±UVC，细胞汇合度约为70%。
- 第2天：在预热（37°C）细胞培养基中以20μM制备新鲜的IdU。
- 用20 J / m2 UVC照射细胞。
- 立即加入20μM IdU培养基，并将细胞在37°C，5%CO 2（细胞培养箱）下孵育60分钟。
- 用预热（37°C）PBS洗涤细胞两次。
- 立即加入200ng / mL诺考达唑的培养基，并将细胞在37°C，5%CO2 （细胞培养箱）下孵育12-24小时（此步骤的时间必须在实验之间保持一致）。
注意：诺考达唑的浓度可能需要根据所使用的细胞系进行调整。如果使用遗传毒性药物，则将细胞与IdU±药物28一起孵育。 - 第3天：吸出培养基，加入培养基与20μM CldU +诺考达唑，并在37°C，5%CO2 （细胞培养箱）下孵育诺考达唑处理的最后4小时。
- 用预热（37°C）PBS洗涤细胞。
- 加入胰蛋白酶并在37°C，5%CO 2（细胞培养箱）下孵育1-2 分钟以分离细胞。
- 加入相同体积的细胞培养基，并将细胞（培养基+胰蛋白酶）收集在适当注释的1.5mL试管中。始终将管子放在冰上。
- 使用血细胞计数器或细胞计数器计数细胞。
- 沉淀细胞：在4°C下以〜350× g 离心5分钟。
- 除去上清液，以~1500个细胞/μL的速度将细胞重悬于PBS中，将细胞保持在冰上，并通过立即铺展方案开始DNA纤维制备（第3天或第4天）。
4.通过铺展制备DNA纤维（约1小时，12张载玻片）
- 用碳铅笔注释显微镜载玻片，并将其平放在托盘上。
- 点击管的底部以确保均质化。
- 在相应载玻片的顶部加入2μL细胞。
注：可以添加两滴，一滴在载玻片的顶部，另一滴在载玻片的中间。 - 加入6μL裂解缓冲液，并通过上下移液约5次来裂解细胞（避免产生气泡）。
- 用移液器吸头将液滴向载玻片底部稍微拉一点（以引导液滴扩散的路径）。
- 在室温下孵育5分钟以裂解细胞核。
注意：如果裂解液干燥过快或干燥不够，可以调整裂解缓冲液的体积和裂解时间。裂解缓冲液体积可在5-7μL之间变化，时间可在4-10分钟之间变化。 - 将载玻片倾斜约20-40°，让液滴以恒定的低速扩散到载玻片的底部。
- 让载玻片在黑暗中在室温下干燥（10-15分钟）。
- 新鲜制备固色液：以3：1的比例混合甲醇：冰醋酸。
- 将载玻片浸入含有固定溶液的罐中，并在室温下孵育5分钟以将DNA固定在载玻片上。
注意：甲醇具有高毒性，应保存在化学罩下。丢弃在适当的容器中。 - 在黑暗中在室温下干燥载玻片，并在4°C下储存，避免光照直至染色。
5. DNA纤维的免疫染色（约6小时）
- 用PBS洗涤载玻片两次5分钟。
- 用新鲜制备的2.5M盐酸盐在室温下使DNA变性40-60分钟。
注意：要制备2.5 M HCl，请将酸倒入水中，切勿相反。这是一种放热反应，因此会略微变暖。 - 用PBS洗涤载玻片三次，持续5分钟。
- 用5%BSA（可在20°C下储存最多三次使用）的块，先前在37°C下在37°C下加热30-60分钟。
- 通过轻轻敲击纸张从载玻片中取出多余的液体。
- 向载玻片滴加30μL一抗（小鼠抗BrdU 1/20（用于IdU）和在PBS-T-BSA中稀释的大鼠抗BrdU 1/100（用于CldU））并在上面放置盖玻片。在黑暗潮湿的室中在室温下孵育1-1.5小时。
- 将载玻片放入装有PBS的罐中1-2分钟，然后小心地取下盖玻片。
- 用PBS-T在罐子中洗涤三次5分钟，然后将载玻片放入PBS中。
- 轻轻拍打纸张，取出多余的液体。
- 向载玻片滴加30μL二抗（在PBS-T-BSA中以1/75稀释的抗小鼠Alexa Fluor 594和抗鼠Alexa Fluor 488）滴加到载玻片中，并在上面放置盖玻片。在黑暗潮湿的室中在室温下孵育45-60分钟。
- 将载玻片放入装有PBS的罐中1-2分钟，然后小心地取下盖玻片。
- 用PBS-T在罐子中洗涤三次5分钟，然后将载玻片放入PBS中。
- 轻轻拍打纸张，取出多余的液体。
- 将20μL安装试剂滴加到载玻片中，并将盖玻片放在顶部。避免气泡。
- 让载玻片在黑暗中在室温下干燥，然后在4°C（或-20°C以延长保存时间）下储存。
6. 图像采集和分析（每个样品约1小时）
注意：落射荧光显微镜可用于两种方案。然而，对于间隙填充（PRR）测定，强烈建议使用共聚焦显微镜来提高图像的分辨率。
- 在玻片顶部附近放置一滴浸油（显微镜特异性），该载玻片裂解细胞，并通过搜索背景中的绿点（可以使用40x，63x和100x物镜）使用绿色通道找到焦点。
- 找到纤维的主要浓度，并移动到边缘，以找到铺展良好的非重叠的单个光纤，仅使用一个通道来选择图片区域并避免潜在的偏差。
- 每张幻灯片在绿色和红色通道处与整个幻灯片一起拍摄约15-20张照片，并将两个通道合并以获得双色DNA纤维。
注意：如果使用共聚焦显微镜，请以高分辨率（1024 x 1024像素）拍摄照片，并对红色和绿色荧光使用接近1的针孔值。 - 使用ImageJ（NIH提供的免费软件，https://imagej.nih.gov/ij/）进行IdU和CldU管道长度测量。
- 通过将图片拖动到 ImageJ 框中来打开图片。
- 使用显微镜软件生成的比例尺（经过适当校准）将长度转换为千分尺。通过在 ImageJ 框中从左到右选择第 5 个图标来使用直线工具，以测量图片中提供的微米级比例尺，并获得以像素为单位的测量值。单击“分析>设置比例，然后将”以像素为单位的距离“替换为适当的数字，并将”长度单位“替换为μm。
- 在 ImageJ 框中，选择分割 线 工具，方法是从左到右左单击第 5 个 图标，然后从上到下选择第二个选项。
- 通过左键单击绘制红色 （IdU） 或绿色 （CldU） 区域的确切路径，通过右键单击停止绘制。按下键盘上的 M 按钮以测量长度。
- 对于 S1 光纤，仅分析红绿色（双色光纤）16。通过跟踪每根光纤的红色和绿色区域测量值，测量来自不同图片的至少150根光纤的红色和绿色区域长度。
- 对于间隙填充测定，仅测量含有至少1个CldU（绿色）贴片但没有连续CldU染色的IdU（红色）束的长度。从不同的图片中评分至少10-15个IdU束，至少1个CldU贴片。
注：其他软件可用于分析，例如蔡司LSM图像浏览器。
- 对于 S1 光纤，将 IdU 区域长度、CldU 区域长度和比率（CldU/IdU 或反之亦然）绘制为具有中位数的散点图。
- 以“每千基密度”为单位测量间隙填充事件，将给定长度的IdU（红色）束上的CldU（PRR，绿色）斑块总数除以千基的红色束总长度（考虑1μm = 2.59千基31）。然后将数据绘制为具有中位数的散点点图。
- 在这两个实验中，使用Mann-Whitney（非参数检验）在两个样本之间进行统计分析，并使用Kruskal-Wallis在两个以上的样本之间进行统计分析，然后进行Dunn的多重比较检验。
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Representative Results
在S1纤维测定中，如果用基因毒性剂处理导致复制后ssDNA间隙，则与未处理的样品以及用遗传毒性剂处理但未提交S1裂解的样品相比，S1处理过的细胞核的DNA纤维的总长度在处理DNA损伤时将更短（图1）。
或者，如果与未处理的细胞相比，用S1核酸酶治疗不会显着影响DNA纤维的长度，则可能有不同的解释：（1）使用所使用的遗传毒性剂治疗时，和/或在研究的特定遗传背景中，不会形成复制后ssDNA间隙。事实上，我们之前已经证明，紫外线诱导的6-4光产物（6-4PP）而不是环丁烷嘧啶二聚体（CPD）导致在缺乏核苷酸切除修复的细胞（NER，XP-C细胞）中形成ssDNA间隙14。（2）ssDNA间隙被修复，无法再检测。（3）单独使用遗传毒性剂治疗诱导的缩短太明显，无法通过S1裂解检测到进一步的缩短。
值得注意的是，S1的缺乏效果也可能反映技术问题，例如S1活性受损的条件，包括S1缓冲液的pH值不合适或锌的量有限。
图1：通过S1纤维测定检测正在进行的叉子上的复制后ssDNA间隙。 （A）使用ssDNA特异性S1核酸酶（S1纤维）进行DNA纤维测定的示意图。进行中的复制叉用胸苷类似物（IdU，CldU）标记，并且可以在DNA扩散和免疫染色后进行测量。左图，没有间隙的标准前进分叉不易被S1核酸酶切割。是的，新生DNA中传统上无法检测到的间隙将被S1核酸酶靶向，并将可视化为较短的CldU束。（B） S1 光纤协议的方案。（C）S1光纤的代表性图像。顶部，控制新生DNA束无间隙，不受S1核酸酶切割的影响。底部，DNA 束阳性，用于由 S1 核酸酶切割的间隙，导致 CldU（绿色）束长度较短。 请点击此处查看此图的大图。
在间隙填充（PRR）测定中，IdU束上短CldU贴片密度的显着增加表明间隙填充事件增加（图2）。高密度的PRR事件可以通过短IdU区域中的1个PRR事件（绿色/ CldU贴片）以及长区域中的多个PRR事件来反映（参见代表性图像 图2C）。必须严格执行分析，仅对位于 IdU 区域顶部的 CldU 贴片进行评分，因为 CldU 贴片很小，很容易被误认为是染色背景（参见代表性图像 图 2C）。
图 2：通过间隙填充检测复制后修复。 （A） 红色 （IdU） 束与绿色 （CldU） 贴片的方案，表示间隙填充事件。（B） 用于检测差距填补情况的议定书方案。（C）来自间隙填充（PRR）测定的代表性图像。左侧较长的 IdU 束至少具有一个 CldU 贴片和/或较少的 CldU 贴片总数，对应于低间隙填充密度（更少的间隙填充事件）。右图，具有至少一个 CldU 贴片的较短 IdU 束和具有更多 CldU 贴片的较长 IdU 束总值对应于高间隙填充密度（更多间隙填充事件）。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
标准DNA纤维测定方案的关键步骤在先前的出版物32中进行了讨论。在这里，我们描述了标准DNA纤维测定的修饰版本，以研究复制后ssDNA间隙的存在以及通过间隙填充对其进行修复，最初在14中描述。在复制后ssDNA间隙存在的背景下，在S1 Fiber方案中使用S1核酸酶很可能是在暴露于遗传毒性剂至少1小时后，以允许间隙形成和随后检测的时间。然而，必须注意的是，在某些细胞系或遗传背景中，即使没有用遗传毒性剂33，34进行额外处理，使用S1核酸酶也可能产生较短的束。因此，至关重要的是要包括所有对照，以确保正确得出结论，使用基因毒性药物治疗是否会导致间隙积累。此外，重要的是通过在ssDNA间隙不再形成或修复的条件下重复测定来进一步验证S1纤维结果。
关于间隙填充（PRR）测定，重要的是优化不影响DNA纤维总长度的UVC剂量/药物浓度，因为结果是按每千碱基密度计算的。如果使用诱导尿路缩短的浓度，结果可能会被人为地偏向增加的间隙填充密度，使数据解释变得困难。为了抵消这种限制，通过使用抗ssDNA抗体染色总DNA，可以在非标记DNA之上可视化间隙填充事件，如前所述14，16。此外，可以进行动力学实验以确保最大限度地检测间隙填充事件。
请注意，当允许细胞在用S1核酸酶处理之前恢复时，也可以使用S1 Fiber测定来监测间隙填充事件。具体而言，当复制后间隙被填充时，DNA纤维对S1核酸酶的切割变得不敏感，因此DNA纤维长度可以用作在此上下文中填充间隙的读数28。因此，这种方法可用于研究整个细胞周期中的间隙填充，与仅限于研究G2 / M中间隙填充的PRR测定不同。
最后，使用S1 Fiber28验证了PRR测定获得的数据，表明诺考达唑和PRR测定期间G2 / M中细胞的人工阻塞不影响间隙填充。其他诱导G2 / M相阻塞的药物可用于该测定
S1纤维已被世界各地的实验室越来越多地使用，为ssDNA间隙形成的机制提供了新的见解，并揭示了以前未被重视的这些间隙可以形成的条件14，29，34，35，36。对于未来的研究，将这些修改后的协议与量子点方法相结合将是很有趣的，量子点方法允许直接可视化DNA病变37 ，以阐明复制后ssDNA间隙形成和DNA修复之间的串扰，以及损伤的性质如何定义复制应激反应的机制。作为S1纤维测定的替代方法，S1核酸酶也可用于研究改良的中性彗星测定中的间隙填充过程。简而言之，如果存在间隙，则用S1核酸酶处理彗星会导致双链断裂的形成，可通过中性彗星测定法检测到。中性彗星测定以及酶修饰彗星测定的方案先前发表了38，39。特别是，这种方法允许在细胞周期的所有阶段进行ssDNA间隙检测，而无需在G2阶段阻止细胞。使用这种方法，结合此处描述的S1纤维和间隙填充（PRR）方案，我们发现REV3L（DNA聚合酶zeta催化单元）负责填充当紫外线诱导的6-4PP存在于人类基因组14中时形成的间隙。
由于可用的技术方法有限，复制后ssDNA间隙形成，特别是间隙填充事件在人类细胞中在很大程度上仍未被探索。总而言之，这些修饰的技术（S1纤维，间隙填充（PRR）测定和S1彗星）为研究ssDNA间隙的存在以及这些间隙如何在人类基因组中最终填充提供了新的策略。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
C.F.M.M.实验室的工作得到了圣保罗国家卫生安全基金（FAPESP，巴西圣保罗，资助#2019/19435-3，#2013/08028-1和2017/05680-0）的支持，由FAPESP和荷兰科学研究组织（NWO，荷兰）进行国际合作研究;Científico e Tecnológico （CNPq， Brasília， DF， Brazil， Grants # 308868/2018-8] 和 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal do Ensino Superior （CAPES， Brasília， DF， Brazil， Finance Code 001）.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid, Glacial | Synth | 64-19-7 | Alternatively, BSA - Biosera - REF PM-T1725/100 |
| Ammonium hydroxide | Synth | 1336-21-6 | Or similar |
| Antibody anti-mouse IgG1 Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11005 | - |
| Antibody anti-rat Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21470 | - |
| Antibody Mouse anti-BrdU | Becton Disckson | 347580 | - |
| Antibody Rat anti-BrdU | Abcam | Ab6326 | - |
| Biological security hood | Pachane | PA 410 | Use hood present in the laboratory |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A3294 | Or similar |
| Cell scraper | Thermo Scientific | 179693 | Or similar |
| CldU | Millipore-Sigma | C6891 | - |
| Cloridric acid | Synth | 7647-01-0 | Or similar |
| Confocal Zeiss LSM Series (7, 8 or 9) | Zeiss | - | Or similar |
| Cover glass (or coverslips) | Thermo Scientific | 152460 | Alternatively, Olen - Kasvi Cover Glass (24 x 60 mm) - K5-2460 |
| DMEM - High Glucose | LGC/Gibco | BR30211-05/12100046 | Use culture media specific for the cell line used. |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate) | Sigma-Aldrich | E5314 | Or similar |
| Epifluorescence Microscope Axiovert 200 | Zeiss | - | Or similar |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Gibco | 12657-029 | Or similar |
| Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific 3110 | 13-998-074 | Use cell incubator present in the laboratory |
| Glass slide jar | Sigma-Aldrich | S5516 | Or similar |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | Or similar |
| Idu | Millipore-Sigma | I7125 | - |
| Magnesium Chloride | Synth | 7791-18-6 | Or similar |
| Methanol | Merck | 67-56-1 | Or similar |
| Microscope slides | Denville | M1021 | Alternatively, Olen - Kasvi Microscope Slides - K5-7105 OR Precision Glass Line - 7105-1 |
| MOPS (Ácido 3-morfolinopropano 1-sulfônico) | Synth | 1132-61-2 | Or similar |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | 31430-18-9 | - |
| PBS (Phosphate Buffer Saline) | Life Thechnologies | 3002 | Or similar |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Or similar |
| ProLong Gold AntiFade Mountant | Invitrogen | P36930 | Any antifade moutant solution for immunofluorescence could be used |
| S1 nuclease purified from Aspergillus oryzae | Invitrogen | 18001-016 | Pre-dilute the S1 nuclease (1/100 - 1/200) in S1 nuclease dilution buffer provided by the manufacturer, aliquote and store at -20 °C |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | BioRad | 161-0302 | Or similar |
| Sodium Acetate Trihydrate | Sigma-Aldrich | 6131-90-4 | Or similar |
| Sodium Chloride | Synth | 7647-14-5 | Or similar |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 57-50-1 | Or similar |
| Tris Base | West Lab Research | BP152-1 | Or similar |
| Triton X-100 | Synth | 9002-93-1 | Or similar |
| Trypsin | Gibco | 25200072 | Or similar |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Or similar |
| UVC Lamp | Non Specific | - | Essential: emission lenght of 254 nm |
| VLX-3W UV Radiometer | Vilber Loumart | - | Or similar |
| Zinc Acetate | Sigma-Aldrich | 557-34-6 | Or similar |
References
- Rupp, W. D., Howard-Flanders, P. Discontinuities in the DNA synthesized in an excision-defective strain of Escherichia coli following ultraviolet irradiation. Journal of Molecular Biology. 31 (2), 291-304 (1968).
- Meneghini, R. Gaps in DNA synthesized by ultraviolet light-irradiated WI38 human cells. Biochimica et Biophysica Acta. 425 (4), 419-427 (1976).
- Meneghini, R., Cordeiro-Stone, M., Schumacher, R. I. Size and frequency of gaps in newly synthesized DNA of xeroderma pigmentosum human cells irradiated with ultraviolet light. Biophysical Journal. 33 (1), 81-92 (1981).
- Lopes, M., Foiani, M., Sogo, J. M. Multiple mechanisms control chromosome integrity after replication fork uncoupling and restart at irreparable UV lesions. Molecular Cell. 21 (1), 15-27 (2006).
- Heller, R. C., Marians, K. J. Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand. Nature. 439 (7076), 557-562 (2006).
- Bianchi, J., et al. PrimPol bypasses UV photoproducts during eukaryotic chromosomal DNA replication. Molecular Cell. 52 (4), 566-573 (2013).
- García-Gómez, S., et al. PrimPol, an archaic primase/polymerase operating in human cells. Molecular Cell. 52 (4), 541-553 (2013).
- Mourón, S., et al. Repriming of DNA synthesis at stalled replication forks by human PrimPol. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (12), 1383-1389 (2013).
- Wan, L., et al. hPrimpol1/CCDC111 is a human DNA primase-polymerase required for the maintenance of genome integrity. EMBO Reports. 14 (12), 1104-1112 (2013).
- Keen, B. A., Jozwiakowski, S. K., Bailey, L. J., Bianchi, J., Doherty, A. J. Molecular dissection of the domain architecture and catalytic activities of human PrimPol. Nucleic Acids Research. 42 (9), 5830-5845 (2014).
- Tirman, S., Cybulla, E., Quinet, A., Meroni, A., Vindigni, A.
- Quinet, A., Lerner, L. K., Martins, D. J., Menck, C. F. M. Filling gaps in translesion DNA synthesis in human cells. Mutation Research, Genetic Toxicology Environmental Mutagenesis. 836, 127-142 (2018).
- Ziv, O., Diamant, N., Shachar, S., Hendel, A., Livneh, Z. Quantitative measurement of translesion DNA synthesis in mammalian cells. DNA Repair Protocols. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Bjergbæk, L. 920, Humana Press. Totowa, NJ. (2012).
- Quinet, A., et al. Translesion synthesis mechanisms depend on the nature of DNA damage in UV-irradiated human cells. Nucleic Acids Research. 44 (12), 5717-5731 (2016).
- Técher, H., et al. Replication dynamics: biases and robustness of DNA fiber analysis. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).
- Quinet, A., Carvajal-Maldonado, D., Lemacon, D., Vindigni, A. DNA fiber analysis: Mind the gap. Methods in Enzymology. 591, 55-82 (2017).
- Elvers, I., Johansson, F., Groth, P., Erixon, K., Helleday, T. UV stalled replication forks restart by re-priming in human fibroblasts. Nucleic Acids Research. 39 (16), 7049-7057 (2011).
- Diamant, N., et al. DNA damage bypass operates in the S and G2 phases of the cell cycle and exhibits differential mutagenicity. Nucleic Acids Research. 40 (1), 170-180 (2012).
- Temviriyanukul, P., et al. Temporally distinct translesion synthesis pathways for ultraviolet light-induced photoproducts in the mammalian genome. DNA Repair. 11 (6), 550-558 (2012).
- Jansen, J. G., et al. Redundancy of mammalian Y family DNA polymerases in cellular responses to genomic DNA lesions induced by ultraviolet light. Nucleic Acids Research. 42 (17), 11071 (2014).
- Quinet, A., et al. Gap-filling and bypass at the replication fork are both active mechanisms for tolerance of low-dose ultraviolet-induced DNA damage in the human genome. DNA Repair. 14 (1), 27-38 (2014).
- Callegari, A. J., Clark, E., Pneuman, A., Kelly, T. J. Postreplication gaps at UV lesions are signals for checkpoint activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8219-8224 (2010).
- Vogt, V. M. Purification and further properties of single-strand-specific nuclease from Aspergillus oryzae. European Journal of Biochemistry. 33 (1), 192-200 (1973).
- Cordeiro-Stone, M., Schumacher, R. I., Meneghini, R. Structure of the replication fork in ultraviolet light-irradiated human cells. Biophysical Journal. 27 (2), 287-300 (1979).
- Lehmann, A. R., Fuchs, R. P. Gaps and forks in DNA replication: Rediscovering old models. DNA Repair (Amst). 5 (12), 1495-1498 (2006).
- Daigaku, Y., Davies, A. A., Ulrich, H. D. Ubiquitin-dependent DNA damage bypass is separable from genome replication. Nature. 465 (7300), 951-955 (2010).
- Karras, G. I., Jentsch, S. The RAD6 DNA damage tolerance pathway operates uncoupled from the replication fork and is functional beyond S phase. Cell. 141 (2), 255-267 (2010).
- Tirman, S., et al. Temporally distinct post-replicative repair mechanisms fill PRIMPOL-dependent ssDNA gaps in human cells. Molecular Cell. 81 (19), 4026-4040 (2021).
- Cong, K., et al. Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency. Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).
- Quinet, A., et al. PRIMPOL-mediated adaptive response suppresses replication fork reversal in BRCA-deficient cells. Molecular Cell. 77 (3), 461-474 (2020).
- Jackson, D. A., Pombo, A. Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells. The Journal of Cell Biology. 140 (6), 1285-1295 (1998).
- Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. Visualization of DNA replication in the vertebrate model system DT40 using the DNA fiber technique. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (56), e3255 (2011).
- Simoneau, A., Xiong, R., Zou, L. The trans cell cycle effects of PARP inhibitors underlie their selectivity toward BRCA1/2-deficient cells. Genes & Development. 35 (17-18), 1271-1289 (2021).
- Taglialatela, A., et al. REV1-Polζ maintains the viability of homologous recombination-deficient cancer cells through mutagenic repair of PRIMPOL-dependent ssDNA gaps. Molecular Cell. 81 (19), 4008-4025 (2021).
- Lim, K. S., et al. USP1 Is required for replication fork protection in BRCA1-deficient tumors. Molecular Cell. 72 (6), 925-941 (2018).
- Peng, M., et al. Opposing roles of FANCJ and HLTF protect forks and restrain replication during stress. Cell Reports. 24 (12), 3251-3261 (2018).
- Huang, J., et al. The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks. Molecular Cell. 52 (3), 434-446 (2013).
- Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. In vivo alkaline comet assay and enzyme-modified alkaline comet assay for measuring DNA strand breaks and oxidative DNA damage in rat liver. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53833 (2016).
- Lu, Y., Liu, Y., Yang, C. Evaluating in vitro DNA damage using comet assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56450 (2017).
