Summary
في هذه المقالة ، نقدم بروتوكولا للكشف عن الخلايا قليلة التغصن المحملة بالأنابيب الدقيقة في نموذج لاعتلال الأنابيب من خلال نهج الفحص المجهري التوافقي الثاني البسيط والمبتكر.
Abstract
يمثل التصور المرضي للمكونات الهيكلية الخلوية في الدماغ تحديا. إن التوزيع في كل مكان لشبكات الأنابيب الدقيقة والشعيرات الدقيقة والخيوط الوسيطة في جميع الأنسجة العصبية ، جنبا إلى جنب مع التباين في نتائج استراتيجيات اندماج البروتين الفلوري وقابليتها المحدودة للتطبيق على الدراسات الديناميكية للأجسام المضادة والأدوية كمركبات كروموفور ، تجعل الأساليب البصرية الكلاسيكية ليست فعالة مثل البروتينات الأخرى. عندما يحتاج التوبولين إلى الدراسة ، فإن الجيل الخالي من الملصقات من التوافقيات الثانية يعد خيارا مناسبا جدا بسبب التنظيم غير المتماثل للجزيء. يمكن لهذه التقنية ، عند اقترانها بالفحص المجهري ، أن تصف نوعيا التوزيع الحجمي للحزم المتوازية من الأنابيب الدقيقة في العينات البيولوجية ، مع ميزة إضافية تتمثل في العمل مع الأنسجة الطازجة غير الثابتة وغير المنفذة. يصف هذا العمل كيفية تصوير التوبولين باستخدام إعداد مجهري تجاري من الجيل التوافقي الثاني لتسليط الضوء على الأنابيب الدقيقة في الهياكل المخصبة بالأنبوبين في الخلايا قليلة التغصن ، كما هو الحال في نقص الميالين مع ضمور العقد القاعدية والمخيخ (H-ABC) اعتلال الأنابيب ، وهو اضطراب المايلين الموصوف مؤخرا.
Introduction
التصوير البصري للهياكل الهيكلية الخلوية في الأنسجة ومستحضرات الأعضاء ليست مهمة سهلة. خيوط الهيكل الخلوي موجودة في كل مكان ، لذلك إذا تم إجراء تلطيخ عام ، على سبيل المثال ، ضد ألفا توبولين أو بيتا أكتين أو يحتمل أن يكون الكيراتين في عينة ظهارية ، فمن المحتمل أن يتم توزيع الإشارة بشكل متجانس إلى حد ما في جميع أنحاء العينة. لتقييد التلوين إلى مجموعة فرعية أكثر وضوحا من المكونات الخلوية ، يمكن للمرء إما استخدام الفئران المعدلة وراثيا مع التعبير المستهدف1 أو التخطيط لاستخدام الأجسام المضادة الخاصة بالشكل المتساوي. في حين أن عددا قليلا جدا من هذه الأخيرة موجودة في السوق (ويوجد عدد قليل جدا منها على الإطلاق2،3،4) ، قد يتوفر نموذج حيواني معدل وراثيا. ومع ذلك ، يجب أن يحصل عليها المختبر وأن يتم إيواؤها بشكل صحيح ، مع جميع النفقات التي تنطوي عليها العملية. قد تكون بعض الأجسام المضادة أو المواد الكيميائية ، على سبيل المثال ، الأدوية المترافقة بالفلوروفور مثل phalloidin أو paclitaxel ، غير متوافقة جزئيا أو كليا مع الاستخدام في الخلايا أو الأنسجة الحية ، مما يحد من قابليتها للتطبيق على دراسات العينات الثابتة فقط.
في حالة التوبولين ، يجب أخذ جانب إضافي في الاعتبار ، وهو حساسية البوليمر للتثبيت. من المعروف أن التثبيت الكيميائي التقليدي بالفورمالديهايد غير كاف للحفاظ على سلامة الأنابيب الدقيقة على النحو الأمثل5. بالإضافة إلى ذلك ، يؤكد تقرير حديث أن تشابك الفورمالديهايد يؤدي إلى تغييرات طفيفة في البنية التحتية للأنابيب الدقيقة ، على غرار ما يحدث مع ربط بعض الأدوية أو الجزيئات الفسيولوجية مثل GTP6.
لذلك ، غالبا ما يكون التصور المباشر للأنابيب الدقيقة في العينات غير الملوثة وغير الثابتة أمرا مرغوبا فيه. لتحقيق ذلك ، فإن أحد الحلول التقنية هو الفحص المجهريللجيل التوافقي الثاني (SHG) 7 ، والذي يعتمد على قدرة حزم الأنابيب الدقيقة المتوازية على العمل كهارمونوفور وإصدار ضوء مضاعف التردد عند إضاءته بشكل صحيح باستخدام ليزر الأشعة تحت الحمراء النبضي المكثف. على الرغم من أنه يمكن توليد إشارة توافقية ثانية أقوى وأكثر استقرارا من الكولاجين والميوسين ، وهما المادتان البيولوجيتان الأخريان الوحيدتان المعروفتان بأنهما قادران على مضاعفة التردد ، فقد تم استخدام الإشارة من التوبولين حتى الآن في الغالب لدراسة إعادة ترتيب المغزل الانقسامي8،9،10 ومورفولوجيا الأنابيب الدقيقة المحورية11،12،13.
في هذا العمل ، نقدم استخداما جديدا لمجهر SHG كأداة تشخيصية لتمييز أنسجة الجهاز العصبي المركزي (CNS) المتأثرة باعتلال الأنابيب tubulin beta 4 A (TUBB4A) عن نظيراتها الصحية14. بعض الطفرات التي تحدث في هذا الشكل العصبي في الغالب من التوبولين ، مثل تلك التي تسبب نقص الميالين وضمور العقد القاعدية والمخيخ (H-ABC) ، تحفز الأنابيب الدقيقة على ملء الخلايا قليلة التغصن15,16 ؛ ترتبط التغيرات الهيكلية الخلوية ، بدورها ، بتأثيرات المصب مثل خلل الميالين ، مع ضعف عميق في المسارات الحركية والحسية16،17،18،19. يعرض نموذج الفئران التايب المستخدم في هذا العمل محتوى الأنابيب الدقيقة غير الطبيعي في الخلايا قليلة التغصن ويلخص معظم الأعراض الحسية الحركية لمرضى H-ABC17. يشرح البروتوكول كيفية تصوير الهياكل مثل الجسم الثفني والمخيخ ، والتي عادة ما تكون شديدة الميالين والتي تتأثر بشدة في المرضى من البشر وكذلك في فأر تايب 19 ، لتسليط الضوء على الاختلافات في إشارات SH بين الأنسجة السليمة والمتحولة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تنفيذ جميع الإجراءات الموصوفة وفقا للقوانين والمدونات المعتمدة في العنوان السابع من لائحة قانون الصحة العامة فيما يتعلق بالبحوث الصحية للحكومة المكسيكية (NOM-062-ZOO-1999) ووفقا لتوصيات المعاهد الوطنية للصحة دليل رعاية واستخدام التجارب وتمت الموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لأخلاقيات البيولوجيا في أبحاث جامعة غواناخواتو وجامعة بينيميريتا المستقلة بويبلا.
1. إعدادات المجهر
- قم بتشغيل نظام الفحص المجهري.
- قم بتشغيل الليزر النبضي للتأكد من أنه سيكون جاهزا للتفريغ بمستوى طاقة مثالي وثابت بعد استخراج العينة وتحضيرها.
- اضبط الليزر على 810 نانومتر. لدراسة الأنابيب الدقيقة tissular ، يتم استخدام 10 ٪ -20 ٪ من طاقة الليزر المتاحة ، والتي ، في النظام الموصوف ، تتوافق مع 13-26 ميغاواط تقاس في المستوى البؤري الخلفي للهدف.
- تأكد من أن المجهر محاذ لكوهلر (الملف التكميلي 1) ، مع الهدف الذي سيتم استخدامه لتصوير SHG.
ملاحظة: هذا مهم لأنه في الإعداد التجاري المستخدم في هذا العمل ، يتم إجراء الكشف في وضع الإرسال ومن خلال المكثف. - قم بإزالة المرشحات غير المرغوب فيها من مسار الكشف البصري (الشكل 1 أ).
- تأكد من فتح غشاء المكثف بالكامل لضمان عدم توقف أي ضوء دون داع عند هذا المستوى.
- قم بإعداد هدف غمر الزيت بفتحة عددية 25x/0.8 (NA) مع قطرة صغيرة من زيت الغمر في العدسة.
ملاحظة: تم استخدام هذا الهدف لمطابقة المكثف NA بشكل أفضل ، والذي كان 0.55 (من الناحية المثالية ، NAcond ≥ NAobj).
2. الضوابط الأولية المجهر
ملاحظة: قم بإجراء عناصر التحكم المجهرية الأولية مرة واحدة، ما لم يتم تعديل الإعداد.
- صورة نشا الذرة الجافة محصورة بين الشرائح الزجاجية مع معلمات SHG لإنشاء صور SHG التي تكشف عن اتجاه استقطاب الليزر. اتبع الخطوات المذكورة في الملف التكميلي 2 ، باستثناء طاقة الليزر ، والتي تقل عن 5٪ لنشا الذرة.
- التقط صورة واحدة لحبيبات نشا الذرة المتناثرة ، وحدد اتجاه فصيصات SHG في المستوى x-y. يتوافق هذا الاتجاه مع اتجاه الليزر (الشكل 2 أ).
- كعنصر تحكم ، التقط صورة أخرى لنفس العينة ، وأدخل في المسار البصري لوحة نصف موجة (الموضع الموضح في الشكل 1 أ) لتغيير اتجاه تذبذب الليزر. تعرض الصورة الناتجة فصيصات إشارة SHG الدوارة (الشكل 2B ، C).
- إذا كنت تستخدم نوعا مختلفا من مرشح تمرير النطاق الترددي ل SHG ، فتأكد من أنه يتمتع بخصائص إرسال مثالية من خلال مقارنة الصور (الشكل 2D ، E) وشدة الإشارة بكسل تلو الآخر على طول مسح الخط (الشكل 2F).
3. استخراج الأنسجة
ملاحظة: استخدم دائما أدوات نظيفة لإجراء العمليات الجراحية.
- استخدم فئران تايب البالغة من العمر 6-12 شهرا وعناصر تحكم Sprague-Dawley المطابقة للعمر (WT).
- تخدير الحيوانات بحقن حقن خليط من الكيتامين-زيلازين (0.125 ملغ/كغ و5 ملغ/كغ) المخفف في محلول كلوريد الصوديوم المعقم 0.9٪.
- تحقق من ردود الفعل الألم ، والمضي قدما فقط إذا كانت غائبة.
- التضحية بالحيوان عن طريق قطع الرأس.
- بمجرد عزل الرأس ، افتح عظام قبو الجمجمة بعناية على طول خط الوسط ، بدءا من النقطة الذيلية في الأعلى باتجاه الأنف ، ومن التجاويف المدارية نحو خط الوسط ، ثم من النقطة الذيلية إلى أسفل الدماغ والمخيخ.
ملاحظة: تسمح قواطع العظام و Rongeurs بالإزالة الصحيحة لعظام الرأس دون الإضرار بهياكل الدماغ. - حرر الدماغ والمخيخ من العظم. يمكن فصل نصفي الكرة الأرضية. إذا تم تقسيم نصفي الكرة الأرضية ، فاستخدم نصفا لتصوير SHG ، وقم بتثبيت النصف الآخر في 3.7٪ بارافورمالدهيد في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لمدة 20 دقيقة داخل غطاء كيميائي للتقسيم والتلوين اللاحق.
4. تقسيم الاهتزاز
- قم بإعداد صينية عازلة اهتزازية مملوءة بمحلول الملح المتوازن (HBSS) الدافئ (37 درجة مئوية).
- ثبت الدماغ على لوحة العينة باستخدام غراء cyanoacrylate عبر قطعة من الشريط اللاصق. يتصل الجزء / المنطقة الأكثر ذيلية بالغراء بحيث يمكن قطع الأجزاء الإكليلية القابلة للاستخدام من الجزء المعاكس المنقار.
- السماح ~ 10 ثانية للغراء لبلمرة للحصول على مرفق فعال للعينة.
ملاحظة: يتم الحصول على أفضل النتائج عندما يتم توجيه الدماغ بحيث تقطع الشفرة "من أعلى إلى أسفل" بدلا من "من جانب إلى آخر" (الشكل 1 ب).
- السماح ~ 10 ثانية للغراء لبلمرة للحصول على مرفق فعال للعينة.
- انقل لوحة العينة إلى دعامتها المغناطيسية داخل الدرج العازل.
- ابدأ في قطع أقسام 300-500 ميكرومتر حتى تشمل الشرائح المنتجة سطح الدماغ بالكامل.
- عند هذه النقطة ، قلل سمك القسم إلى 160 ميكرومتر.
- بمجرد قطع قسم كامل 160 ميكرومتر على مستوى الجسم الثفني ، قم باستعادته باستخدام ماصة باستور زجاجية معدلة مع فتحة كبيرة ملتهبة (الشكل 1C).
- انقله إلى طبق بتري نظيف مع HBSS دافئ جديد أو مباشرة على الدعامة الزجاجية للفحص المجهري (غطاء غطاء أو طبق ذو قاع زجاجي).
ملاحظة: بالنسبة للظروف التجريبية الموصوفة ، فإن إضافة غطاء فوق العينة يضر بالتصوير.
5. نقل إلى المجهر
- إذا كان المجهر في غرفة مختلفة ، فقم بإعداد صندوق معزول به عبوات هلام دافئة لنقل أقسام الأنسجة مع الحفاظ على درجة الحرارة. يعمل الصندوق أيضا على إبقاء الأقسام دافئة حتى يتم تصويرها.
- ضع العينة تحت المجهر ، وتأكد من وضعها بشكل صحيح تحت الهدف عن طريق الملاحظة المباشرة من خلال المنظار مع الضوء المرسل.
ملاحظة: الهدف هو محاذاة هياكل الانبعاث المتوقعة مع اتجاه تذبذب الليزر لزيادة إشارة SHG المنبعثة (وبالتالي المكتشفة). - قم بإزالة HBSS الزائد بحيث يغطي فيلم سائل رقيق العينة بأكملها. تحقق بصريا من الفيلم السائل كل بضع دقائق لتجنب التبخر المفرط وتجفيف العينة.
ملاحظة: في الظروف الموضحة ، يتم استخدام قسم لمدة لا تزيد عن 20 دقيقة. يؤدي تجفيف العينة إلى تأثيرات أثرية جذرية (الشكل التكميلي 1 أ). بدلا من إضافة المزيد من HBSS ، يوصى بالنقع الدوري للقسم في وسط دافئ وجديد إذا كانت هناك حاجة إلى أوقات تصوير أطول. يوصى أيضا باستخدام غرف التروية والغراء أو الأغاروز منخفض الانصهار لشل حركة الأنسجة عند إجراء تجارب أطول. - قم بإعداد مرحلة المجهر للتصوير غير الممسوح ضوئيا ، والذي قد يشمل إغلاق جميع أبواب غرفة الحضانة المظلمة أو تغطية غرفة الحضانة بنسيج أسود مطلي بالنايلون البولي يوريثين.
6. التصوير
- حدد وضع التصوير "غير الممسوح ضوئيا" على طول مسار الإرسال. بهذه الطريقة ، سيتم تحسين التقاط إشارة SH الضعيفة للتوبولين.
- حدد هدف خطة LCI-Neofluar 25x / 0.8 NA.
- اضبط طاقة الليزر بين 13 ميجاوات و 26 ميجاوات ، مع وقت سكون بكسل يبلغ 12.6 ميكرو ثانية. التقط صورا لا يزيد حجمها عن 512 بكسل × 512 بكسل ، بسرعة 5 ومتوسط 2 ، بمتوسط وقت اكتساب يبلغ حوالي 15 ثانية.
ملاحظة: قد يؤدي استخدام قوى ليزر أعلى و / أو أوقات مكوث أطول إلى إتلاف العينة (الشكل التكميلي 1 ب). - التقط الصور أولا باستخدام مرشح تمرير قصير 485 نانومتر (SP485) ، وفي الخطوة الثانية ، أضف مرشح تمرير نطاق حاد 405 نانومتر (BP405; الشكل 3). اتبع الخطوات الواردة في الملف التكميلي 2.
ملاحظة: يمكن التقاط صور الحقل الساطع الزائف من خلال نفس الكاشف باستخدام ضوء الليزر المتبقي لخط مرئي (يعمل الليزر 405 نانومتر أو 488 نانومتر بشكل أفضل).
7. معالجة المخيخ
- أولا ، قم بقطع المخيخ بمشرط إلى نصفي الكرة الأرضية ، ثم قم بلصقهما على دعم الاهتزاز بواسطة الجزء الأوسط (الجزء المسطح الذي تم الحصول عليه بعد القطع).
- قسم وصورة المخيخ بنفس الطريقة التي تم وصفها للدماغ (أقسام 160 ميكرومتر ، نفس إعدادات الاهتزاز ، نفس الشفرة ، نفس إعدادات المجهر ، إلخ).
ملاحظة: بسبب تشريح المخيخ ، فإن اتجاهه في لحظة التقسيم ليس حرجا ؛ في معظم الشرائح المتولدة بعيدا عن السطح ، ستكون هناك ورقة مقسمة جيدا إلى المادة البيضاء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الصور التي تم الحصول عليها باستخدام هذه المنهجية لها مستوى خلفية منخفض جوهري بسبب العدد المحدود جدا من harmonophores الموجودة في الأنسجة البيولوجية ، والتي تعد واحدة من المزايا الهامة للطريقة.
عندما يتم تصوير ألياف الجسم الثفني ، يمكن العثور باستمرار على هياكل قصيرة تشبه الألياف وعناصر مستديرة في دماغ تايب (الشكل 3 ب) ، بينما يظهر الجسم الثفني في الدماغ المتحكم إشارة أكثر تباينا وخواصا في جميع أنحاء منطقة الدماغ (الشكل 3 أ). يكمن أصل الإشارة التفاضلية على وجه التحديد في ظاهرة التوليد التوافقي الثاني ، نظرا لأن إضافة مرشح النطاق الضيق يقلل فقط من شدة الإشارة غير المحددة من صور التحكم (الشكل 3C-D) مع إزالة هذه الإشارة المنخفضة والمنتشرة بشكل انتقائي من حول الهياكل الشبيهة بالسوما والقصيرة الممدودة في صور taiep ، والتي تولد دائما ضوء SH مكثف (الشكل 3E-F).
الهيكل الآخر الذي تم تحليله ، المادة البيضاء المخيخية ، يعطي نتائج مماثلة. على وجه التحديد ، بينما يوجد في الأنسجة الضابطة غياب شبه كامل لإشارة SH (الشكل 4B) ، وخلايا Purkinje بالكاد مرئية عند استخدام مرشح التمرير القصير ، تستمر الهياكل الممدودة والمستديرة في صورة SH من نسيج taiep (الشكل 4D).
الشكل 1: المجهر والتقسيم. (أ) رسم تخطيطي للمجهر المستخدم، مع إبراز المكونات ذات الصلة. الأسهم: 1 = منفذ NDD حيث يوجد SP485 بالقرب من الكاشف ؛ 2 = إطارات قابلة للإزالة حيث يتم وضع BP405 ؛ 3 = الموضع تحت الهدف حيث يتم وضع لوحة نصف الموجة (HWP) لتجارب التحكم. يظهر الجزء الداخلي الإطار حيث يمكن إدخال HWP. (ب) منظر علوي لدرج العازلة الاهتزازية مع الدماغ اللاصق الجاهز للتقطيع الدقيق. (ج) ماصة باستور الأصلية (العلوية) والمعدلة (السفلية) المستخدمة لنقل الأقسام. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: الضوابط الأولية. (أ) تظهر إشارة SHG المنبعثة من حبيبات نشا الذرة اتجاها سائدا يتزامن مع اتجاه تذبذب الليزر (أفقيا في هذه الحالة). (ب) بعد إدخال لوحة نصف موجة مع محورها السريع الموجه عند 45 درجة بالنسبة إلى الأفقي ، يتم تدوير الإشارة بمقدار 90 درجة. (ج) دمج الإشارة قبل وبعد إدخال لوحة نصف الموجة. د: الإشارة التي تقل عن 485 nm المنبعثة من حبيبات نشا الذرة. (ه) إشارة SHG من حبيبات النشا المكتشفة عند 405/10 نانومتر. (F) رسم بياني يوضح مقارنة بين الإشارتين المناظرتين لعمليات مسح الخطوط الموضحة في الإدخالات المكبرة ل D و E. يتسبب مرشح SHG المستخدم في فقدان إشارة ضئيل. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: صور SHG من taiep و WT corpus callosum. أمثلة تمثيلية لإشارات (A) WT و (B) taiep التي تم الحصول عليها من الجسم الثفني. (C) صورة مصفاة SP485 من جسم الثفني WT. (د) صورة BP405 المصفاة من نفس العينة كما في C. (E) SP485 صورة مصفاة من الجسم الثفني taiep . (F) صورة BP405 المفلترة لنفس العينة كما في E. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: صور SHG من مخيخ taiep و WT. أمثلة تمثيلية لإشارات (A-B) WT و (C-D) taiep التي تم الحصول عليها من foliar المخيخية. (أ) صورة مصفاة من طراز SP485 من ورقة WT ؛ فقط بعض خلايا Purkinje مرئية. (ب) صورة BP405 مصفاة من نفس العينة الموجودة في A. (ج) صورة مصفاة SP485 من ورقة طيب. (د) صورة مرشحة BP405 لنفس العينة كما في C. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل التكميلي 1: أمثلة على القطع الأثرية. (أ) قطعة أثرية بسبب جفاف العينة. (ب) قطعة أثرية بسبب التعرض المفرط. قضبان المقياس: 30 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 1: محاذاة كولر. يعرض الملف خطوات تنفيذ محاذاة كولر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 2: خطوات برنامج ZEN للحصول على صور SHG. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يعد الفحص المجهري SHG جزءا من مجموعة من تقنيات البصريات غير الخطية ، والتي تشمل الفحص المجهري للإثارة ثنائي الفوتون ، والمجهر من الجيل التوافقي الثالث ، والمجهر المتماسك المضاد لستوكس رامان ، والتي ساهمت في توسيع نطاق تطبيقات المجهر الضوئي التقليدي لعلوم الحياة20.
على وجه التحديد ، تتعلق القوة والضعف الرئيسية لمجهر SHG بنفس الحالة: مولد الإشارة غير متماثل21. غالبا ما توجد مثل هذه الحالة المعمارية المحددة في عالم البلورات العضوية وغير العضوية ولكنها نادرة بين الكائنات البيولوجية. جنبا إلى جنب مع الكولاجين والميوسين العضلي ، فإن الأنابيب الدقيقة قادرة على توليد إشارة توافقية ثانية22 ، والتي يمكن اكتشافها باستخدام المجهر إذا حدث جمع كاف في حزم البوليمرات المتوازية. داخل الخلايا ، يرتبط التوبولين لتشكيل حزم متوازية في نوى المحاور (موقع خاص بنوع الخلية) ، في المغازل الانقسامية (توزيع خاص بالصدغ) ، وكما هو موضح في هذا العمل ، في ارتباط الأنابيب الدقيقة للعلامة التجارية لنقص الميالين الأنبوبي الموصوف مؤخرا مع ضمور العقد القاعدية والمخيخ ، أو H-ABC (الذي يمثل أول توزيع مرضي تم الإبلاغ عنه من هذا النوع)14 ، 16,23.
لا تزال هذه المتلازمة الحسية الحركية مرضا يتيما ، حيث أن العديد من أطباء الأعصاب ليسوا على دراية بجميع الأعراض و / أو لا يستطيعون تحمل تكاليف الفحص الجيني للمرضى المشتبه بهم لتأكيد التشخيص ، والذي من المحتمل جدا أن يسبب نقص التشخيص ، على الأقل في بعض السكان. علاوة على ذلك ، لا يعرف الكثير عن علم الأمراض على المستوى الجزيئي والخلوي ، لذا فإن التقنيات التي يمكن أن تساعد في إلقاء الضوء على الآليات المحددة لهذه العملية التنكسية ذات قيمة كبيرة ، وأيضا على المستوى الأساسي.
لذلك ، يقترح استخدامان لمجهر SHG فيما يتعلق باضطراب المايلين هذا. على المدى الطويل ، يمكن دمج الفحص المجهري SHG في الأساليب التشخيصية لفحص الخزعة أو التحليل المباشر داخل الجمجمة ، ولكن يمكن أن يرتبط التأثير الأكبر بمحاولة فك تشفير الأساس الجزيئي للمرض.
هناك العديد من مزايا الفحص المجهري SHG على تقنيات الفحص المجهري الأخرى. في الواقع ، لا يتطلب الفحص المجهري SHG تثبيت الأنسجة ، وهي خطوة حساسة بشكل خاص لإعداد العينة في حالة الأنابيب الدقيقة ، ولا تتطلب تلطيخا من أي نوع. ترتبط أكبر ميزة بالظاهرة الفيزيائية المعنية. من ناحية ، نظرا للخلفية الغائبة تقريبا ، فإنه يوفر تباينا عاليا على الرغم من الإشارات الضعيفة المتولدة ، ومن ناحية أخرى ، نظرا لأن شدة الضوء اللازمة لمضاعفة التردد عالية جدا ويتم تلبية هذه الشدة فقط في حجم محدود للغاية من العينة ، توفر التقنية تقسيما بصريا جوهريا ، مما يسمح بإعادة بناء 3D.
ترتبط القيود الرئيسية لتقنية الفحص المجهري هذه بتكلفة المعدات. يعد المجهر البؤري الجيد ، جنبا إلى جنب مع ليزر الأشعة تحت الحمراء النبضي (IR) ، ضروريا لهذا التطبيق ، وعلى الرغم من توفر نظام إثارة ثنائي الفوتون في العديد من مختبرات علم الأعصاب ، والذي يمكن تعديله بسهولة إلى إعداد SHG ، فإن الفرق في التكلفة مقارنة بإعداد epifluorescence التقليدي لا يزال كبيرا. بالإضافة إلى ذلك ، كتقنية محدودة الحيود ، تتأثر دقتها باستخدام ضوء الأشعة تحت الحمراء للإضاءة.
كما هو الحال مع العديد من التطبيقات الرائدة ، كانت الإعدادات المستخدمة للتجارب المبكرة على الفحص المجهري SHG المطبقة على علوم الحياة عبارة عن إعدادات بصرية مخصصة بالكامل تم بناؤها كأنظمة مفتوحة11،24،25 ، مما يمنح المجربين إمكانية تحسين كل مكون على حدة. نظرا لأنه ، في مختبرات علوم الحياة ، من الشائع الوصول إلى إعداد تجاري ، أردنا اختبار ما إذا كان أحد هذه الأنظمة حساسا بما يكفي للكشف عن الإشارة الضعيفة المنبعثة من حزم الأنابيب الدقيقة tissular ، والتي من المعروف أنها ليست هارمونوفورات قوية مثل الكولاجين. يتكون نظام LSM710 NLO من Zeiss من مجهر متحد البؤر مقلوب مع وحدات للكشف غير الممسوح ضوئيا في وضع الإرسال ووضع "epi" ومع ليزر الأشعة تحت الحمراء القابل للضبط Cohereon Chameleon. نظرا للطبيعة المتماسكة لظاهرة SHG ، من الأهمية بمكان تحديد مسار الإرسال لزيادة جمع الضوء المضاعف التردد من العينة ، وبالتالي ، تم إجراء الكشف من خلال مكثف 0.55 NA عن طريق التكامل. تم استخدام هدف الغمر LCI Plan-Neofluar 25X / 0.8 NA لإلقاء الضوء على العينة من الأسفل وتقريب المكثف NA. مع الظروف الموضحة في هذه الورقة ، يمكننا اكتشاف إشارة موثوقة من الأنسجة التي تحمل طفرة TUBB4A ، وكانت هذه الإشارة غائبة دائما في عناصر التحكم.
في البروتوكول المبلغ عنه ، تطلبت خطوتان تعديلات لتحقيق أفضل ظروف التصوير: سمك قسم الأنسجة وفتح الحجاب الحاجز المكثف. يجب أن تكون المقاطع رقيقة قدر الإمكان لمنع الامتصاص المفرط والتشتت وفقدان فوتونات SH ، خاصة وأن الهدف هو الصورة أثناء النقل بسبب الطبيعة المتماسكة للظاهرة الفيزيائية. في حالتنا ، كان العامل المحدد هو اتساق نسيج التايب ، مما أعاق التقسيم في أقسام سميكة متجانسة أقل من 160-180 ميكرومتر. مع محاذاة Köhler التقليدية ، عادة ما يتم إغلاق الحجاب الحاجز المكثف إلى حوالي 60٪ من مساحته لتوليد تباين في صورة الضوء المرسلة ؛ على العكس من ذلك ، بالنسبة لهذا التطبيق ، فإن الهدف هو جمع أكبر عدد ممكن من الفوتونات ، وبالتالي الفتح الكلي للحجاب الحاجز.
يعد تطبيق الفحص المجهري ل SHG مهما لأنه يوفر إمكانية تمييز الأنسجة الغنية بالتوبولين مقابل الأنسجة الطبيعية التوبولين ، حيث تصدر الأنسجة الغنية بالتوبولين إشارة يمكن اكتشافها. من الممكن أيضا أن تسبب طفرات اعتلال الأنبوب الأخرى التي لم يتم وصفها بعد اضطرابات هيكلية خلوية في الأنسجة الأخرى26 ، والتي قد تنطوي أيضا على إثراء التوبولين.
من حيث التطبيقات المحتملة الأخرى ، يمكن توسيع الفحص المجهري ل SHG لدراسة الإشارات الأضعف ، مثل تلك الموجودة في الأنسجة الطبيعية التوبولين ، أو في محاور عصبية دقيقة ومنفصلة ، أو في حزم داخل الخلايا ذات قطبية مختلطة. للقيام بذلك ، يمكن لتعديلات الإعداد ، مثل استبدال مكثف الهواء بآخر ذي فتحة عددية أعلى و / أو مع الغمر أو استخدام كاشف أكثر حساسية ، أن تحدث فرقا مهما.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس للمؤلفين مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل المجلس الوطني للعلوم والتكنولوجيا (CONACYT) من خلال المنح التالية: infraestructura 226450 إلى VP-CIO ، والبنية التحتية 255277 إلى V.P. ، و FORDECYT-PRONACES / 194171/2020 إلى V.H. نحن نعترف بدعم جوفينال هيرنانديز جيفارا في CIO في صناعة الفيديو.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 405/10 nm BrightLine(R) single-band bandpass filter | Semrock | FF01-405/10-25 | 32 mm diameter, with housing ring |
| Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric | Thorlabs | BK5 | 5' x 9' (1.5 m x 2.7 m) x 0.005" (0.12 mm) Thick |
| Blades for vibratome | any commercial; e.g. Wilkinson Sword | Classic stainless steel double edge razor blades | |
| Cell culture dishes, 35 mm | any commercial; e.g. Falcon | 351008 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM710NLO AxioObserver Z1 | Inverted microscope, objective used is LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA |
| Cooler | any commercial | Any insulated, polystyrene box could work, to mantain the sample at about 37 °C | |
| Corn stach | e.g. Maizena | From the supermarket | |
| Coverslips #1.5 | any commercial | Rectangular | |
| Cyanoacrylate glue | e.g. Loctite | To glue the brain to the masking tape | |
| Fine forceps | fine science tools | 11412-11 | To manipulate tissue sections by handling from the meninges |
| Fine scissors | fine science tools | 14370-22 | To cut the skin |
| Fine scissors curved tip | fine science tools | 14061-09 | To cut along the midline |
| Formaldehyde 37% | Sigma-Aldrich | 252549 | To dilute 1:10 in PBS |
| Friedman Rongeur | fine science tools | 16000-14 | To cut the bone |
| Gel packs | any commercial | Prewarmed to 37 °C, to help mantaining the temperature inside the cooler | |
| Glass Pasteur pipette, modified | any commercial | To transfer the tissue section | |
| Hanks′ Balanced Salt solution (HBSS) | Gibco | 14025-076 | Could be prepared from powders |
| Kelly hemostats | fine science tools | 13018-14 | To separate the bone |
| Masking tape | any commercial | To protect th surface of the specimen plate | |
| NDD module, type C | Zeiss | 000000-1410-101 | To detect the signal, reducing light loss. Housing the 000000-1935-163 filter set with the SP485 |
| Offset bone nippers | fine science tools | 16101-10 | To cut the bone |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-031 | Could be prepared from powders or tabs |
| Pulsed laser | Coherent | Chameleon Vision II | 680–1080 nm tunable laser |
| Scalpel | any commercial | Straight blade with sharp point | |
| Standard pattern forceps | fine science tools | 11000-18 | |
| Vannas spring scissors | fine science tools | 15018-10 | To cut meninges that remain joined to both the slice obtained from vibratome cutting and the section glued to the specimen plate. |
| Vibratome | any commercial; e.g. Leica | VT1200 |
References
- Palmiter, R. D., et al. Cell lineage ablation in transgenic mice by cell-specific expression of a toxin gene. Cell. 50 (3), 435-443 (1987).
- Banerjee, A., et al. A monoclonal antibody against the type II isotype of beta-tubulin. Preparation of isotypically altered tubulin. The Journal of Biological Chemistry. 263 (6), 3029-3034 (1988).
- Banerjee, A., Roach, M. C., Trcka, P., Luduena, R. F. Preparation of a monoclonal antibody specific for the class IV isotype of beta-tubulin. Purification and assembly of alpha beta II, alpha beta III, and alpha beta IV tubulin dimers from bovine brain. The Journal of Biological Chemistry. 267 (8), 5625-5630 (1992).
- Banerjee, A., et al. Localization of βv tubulin in the cochlea and cultured cells with a novel monoclonal antibody. Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 505-514 (2008).
- Cross, A. R., Williams, R. C. Kinky microtubules: Bending and breaking induced by fixation in vitro with glutaraldehyde and formaldehyde. Cell Motility and the Cytoskeleton. 20 (4), 272-278 (1991).
- Van Steenbergen, V., et al. Molecular understanding of label-free second harmonic imaging of microtubules. Nature Communications. 10 (1), 3530 (2019).
- Campagnola, P. J., Clark, H. A., Mohler, W. A., Lewis, A., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy of living cells. Journal of Biomedical Optics. 6 (3), 277 (2001).
- Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
- Yu, C. -H., et al. Measuring microtubule polarity in spindles with second-harmonic generation. Biophysical Journal. 106 (8), 1578-1587 (2014).
- Bancelin, S., et al. Probing microtubules polarity in mitotic spindles in situ using Interferometric Second Harmonic Generation Microscopy. Scientific Reports. 7, 6758 (2017).
- Dombeck, D. A., et al. Uniform polarity microtubule assemblies imaged in native brain tissue by second-harmonic generation microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7081-7086 (2003).
- Psilodimitrakopoulos, S., et al. Estimation of the effective orientation of the SHG source in primary cortical neurons. Optics Express. 17 (16), 14418 (2009).
- Sharoukhov, D., Bucinca-Cupallari, F., Lim, H. Microtubule imaging reveals cytoskeletal deficit predisposing the retinal ganglion cell axons to atrophy in DBA/2J. Investigative Opthalmology & Visual Science. 59 (13), 5292 (2018).
- Alata, M., Piazza, V., Eguibar, J. R., Cortes, C., Hernandez, V. H. H-ABC tubulinopathy revealed by label-free second harmonic generation microscopy. Scientific Reports. 12, 14417 (2022).
- Duncan, I. D., Lunn, K. F., Holmgren, B., Urba-Holmgren, R., Brignolo-Holmes, L. The taiep rat: A myelin mutant with an associated oligodendrocyte microtubular defect. Journal of Neurocytology. 21 (12), 870-884 (1992).
- Duncan, I. D., et al. A mutation in the Tubb4a gene leads to microtubule accumulation with hypomyelination and demyelination: Tubb4a Mutation. Annals of Neurology. 81 (5), 690-702 (2017).
- Garduno-Robles, A., et al. MRI features in a rat model of H-ABC tubulinopathy. Frontiers in Neuroscience. 14, 555 (2020).
- Lopez-Juarez, A., et al.
- Alata, M., et al. Longitudinal evaluation of cerebellar signs of H-ABC tubulinopathy in a patient and in the taiep model. Frontiers in Neurology. 12, 702039 (2021).
- Parodi, V., et al. Nonlinear optical microscopy: From fundamentals to applications in live bioimaging. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 585363 (2020).
- Lefort, C. A review of biomedical multiphoton microscopy and its laser sources. Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (42), 423001 (2017).
- Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nature Biotechnology. 21 (11), 1356-1360 (2003).
- vander Knaap, M. S., et al. New syndrome characterized by hypomyelination with atrophy of the basal ganglia and cerebellum. American Journal of Neuroradiology. 23 (9), 1466 (2002).
- Stoller, P., Kim, B. -M., Rubenchik, A. M., Reiser, K. M., Da Silva, L. B. Polarization-dependent optical second-harmonic imaging of a rat-tail tendon. Journal of Biomedical Optics. 7 (2), 205 (2002).
- Brown, E. B., et al. In vivo measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy. Nature Medicine. 7 (7), 864-868 (2001).
- Chakraborti, S., Natarajan, K., Curiel, J., Janke, C., Liu, J. The emerging role of the tubulin code: From the tubulin molecule to neuronal function and disease. Cytoskeleton. 73 (10), 521-550 (2016).
