Summary
In diesem Artikel stellen wir ein Protokoll zum Nachweis von Mikrotubuli-beladenen Oligodendrozyten in einem Modell der Tubulinopathie durch einen einfachen, innovativen Mikroskopieansatz der zweiten harmonischen Generation vor.
Abstract
Die zufriedenstellende Visualisierung von Zytoskelettkomponenten im Gehirn ist eine Herausforderung. Die ubiquitäre Verteilung der Netzwerke von Mikrotubuli, Mikrofilamenten und intermediären Filamenten in allen neuronalen Geweben, zusammen mit der Variabilität der Ergebnisse von fluoreszierenden Proteinfusionsstrategien und ihrer begrenzten Anwendbarkeit auf dynamische Studien von Antikörpern und Medikamenten als Chromophorvehikel, machen klassische optische Ansätze nicht so effektiv wie für andere Proteine. Wenn Tubulin untersucht werden muss, ist die markierungsfreie Erzeugung von zweiten Oberschwingungen aufgrund der nicht-zentrosymmetrischen Organisation des Moleküls eine sehr geeignete Option. Diese Technik kann, wenn sie mit der Mikroskopie konjugiert wird, die volumetrische Verteilung paralleler Bündel von Mikrotubuli in biologischen Proben qualitativ beschreiben, mit dem zusätzlichen Vorteil, mit frischem Gewebe zu arbeiten, das nicht fixiert und nicht permeabilisiert ist. Diese Arbeit beschreibt, wie Tubulin mit einem kommerziellen Mikroskopieaufbau der zweiten harmonischen Generation abgebildet werden kann, um Mikrotubuli in den mit Tubulin angereicherten Strukturen der Oligodendrozyten hervorzuheben, wie bei der Hypomyelinisierung mit Atrophie der Basalganglien und der Tbulinopathie des Kleinhirns (H-ABC), einer kürzlich beschriebenen Myelinerkrankung.
Introduction
Die optische Bildgebung von Zytoskelettstrukturen in Geweben und Organpräparaten ist keine leichte Aufgabe. Zytoskelettfilamente sind allgegenwärtig, so dass, wenn eine generische Färbung durchgeführt wird, zum Beispiel gegen Alpha-Tubulin oder Beta-Aktin oder möglicherweise Keratin in einer Epithelprobe, das Signal wahrscheinlich ziemlich homogen über die gesamte Probe verteilt wird. Um die Färbung auf eine aussagekräftigere Teilmenge zellulärer Komponenten zu beschränken, kann man entweder transgene Mäuse mit gezielter Expression1 verwenden oder isoformspezifische Antikörper verwenden. Während nur sehr wenige der letzteren auf dem Markt sind (und nur sehr wenige existieren 2,3,4), könnte ein transgenes Tiermodell verfügbar sein. Es muss jedoch vom Labor erworben und ordnungsgemäß untergebracht werden, mit allen Kosten, die mit dem Prozess verbunden sind. Bestimmte Antikörper oder Chemikalien, z. B. Fluorophor-konjugierte Arzneimittel wie Phalloidin oder Paclitaxel, können teilweise oder vollständig mit der Anwendung in lebenden Zellen oder Geweben unvereinbar sein, so dass ihre Anwendbarkeit auf Studien an festen Proben beschränkt ist.
Im Falle von Tubulin muss ein weiterer Aspekt berücksichtigt werden, nämlich die Empfindlichkeit des Polymers gegenüber der Fixierung. Die konventionelle chemische Fixierung mit Formaldehyd ist dafür bekannt, dass sie nicht ausreicht, um die Integrität von Mikrotubuli optimal zu erhalten5. Darüber hinaus bestätigt ein kürzlich veröffentlichter Bericht, dass die Formaldehydvernetzung subtile Veränderungen in der Ultrastruktur des Mikrotubuli induziert, ähnlich wie bei der Bindung einiger Medikamente oder physiologischer Moleküle wie GTP6.
Die direkte Visualisierung von Mikrotubuli in ungefärbten, nicht fixierten Proben ist daher oft wünschenswert. Um dies zu erreichen, ist die Mikroskopie der zweiten harmonischen Generation (SHG)7, die auf der Fähigkeit von Bündeln paralleler Mikrotubuli basiert, als Harmonophore zu fungieren und frequenzverdoppeltes Licht zu emittieren, wenn sie mit einem intensiven, gepulsten Infrarotlaser richtig beleuchtet werden. Obwohl ein stärkeres und stabileres Signal der zweiten Harmonischen aus Kollagen und Myosin erzeugt werden kann, die die einzigen beiden anderen biologischen Materialien sind, von denen bekannt ist, dass sie zur Frequenzverdopplung fähig sind, wurde das Signal von Tubulin bisher hauptsächlich verwendet, um mitotische Spindelumlagerungen 8,9,10 und axonale MikrotubuliMorphologie 11,12,13 zu untersuchen.
In dieser Arbeit stellen wir eine neuartige Anwendung der SHG-Mikroskopie als diagnostisches Werkzeug vor, um Gewebe des zentralen Nervensystems (ZNS), die von Tubulin-beta-4-A (TUBB4A)-Tubulinopathie betroffen sind, von ihren gesunden Gegenstückenzu unterscheiden 14. Einige der Mutationen, die in dieser überwiegend neuralen Isoform von Tubulin auftreten, wie diejenigen, die Hypomyelinisierung und Atrophie der Basalganglien und des Kleinhirns (H-ABC) verursachen, induzieren eine Überfüllung der Mikrotubuli in den Oligodendrozyten15,16; Die Veränderungen des Zytoskeletts sind wiederum mit nachgeschalteten Effekten wie Dysmyelinisierung verbunden, mit einer tiefgreifenden Beeinträchtigung der motorischen und sensorischen Bahnen16,17,18,19. Das in dieser Arbeit verwendete Taiep-Mausmodell zeigt einen abnormalen Mikrotubuli-Gehalt in den Oligodendrozyten und rekapituliert die meisten sensomotorischen Symptome von H-ABC-Patienten17. Das Protokoll erklärt, wie Strukturen wie das Corpus callosum und das Kleinhirn, die normalerweise stark myelinisiert sind und die sowohl bei menschlichen Patienten als auch bei der Taiep-Ratte 19 stark betroffen sind, abgebildet werden können, um die Unterschiede in den SH-Signalen zwischen gesundem und mutiertem Gewebe hervorzuheben.
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Protocol
Alle beschriebenen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Gesetzen und Kodizes durchgeführt, die im siebten Titel der Verordnung des Allgemeinen Gesundheitsgesetzes über die Gesundheitsforschung der mexikanischen Regierung (NOM-062-ZOO-1999) genehmigt wurden, und in Übereinstimmung mit den Empfehlungen des Leitfadens der Nationalen Gesundheitsinstitute für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren und wurden vom institutionellen Ausschuss für Bioethik in der Forschung der Universidad de Guanajuato und der Benemérita Universidad Autónoma de Guanajuato genehmigt. Puebla.
1. Mikroskop-Einstellungen
- Schalten Sie das Mikroskopiesystem ein.
- Schalten Sie den gepulsten Laser ein, um sicherzustellen, dass er nach der Probenextraktion und -vorbereitung mit einem optimalen und konstanten Leistungsniveau lasieren kann.
- Stellen Sie den Laser auf 810 nm ein. Zur Untersuchung von Tisular-Mikrotubuli werden 10%-20% der verfügbaren Laserleistung verwendet, was im beschriebenen System 13-26 mW entspricht, gemessen an der hinteren Brennebene des Objektivs.
- Stellen Sie sicher, dass das Mikroskop Köhler-ausgerichtet ist (Ergänzungsdatei 1) mit dem Objektiv, das für die SHG-Bildgebung verwendet wird.
HINWEIS: Dies ist wichtig, da in der kommerziellen Einrichtung, die in dieser Arbeit verwendet wird, die Detektion im Übertragungsmodus und durch den Kondensator durchgeführt wird. - Entfernen Sie unerwünschte Filter aus dem optischen Erkennungspfad (Abbildung 1A).
- Stellen Sie sicher, dass die Kondensatormembran vollständig geöffnet ist, um sicherzustellen, dass kein Licht unnötig auf diesem Niveau gestoppt wird.
- Bereiten Sie ein 25x/0,8-faches Ölimmersionsobjektiv mit numerischer Apertur (NA) und einem kleinen Tropfen Immersionsöl im Objektiv vor.
HINWEIS: Dieses Objektiv wurde verwendet, um am besten mit dem Kondensator NA übereinzustimmen, der 0,55 betrug (idealerweise NAcond≥ NAobj).
2. Vorkontrollen des Mikroskops
HINWEIS: Führen Sie die vorbereitenden Mikroskopkontrollen einmal durch, es sei denn, der Aufbau wurde geändert.
- Stellen Sie trockene Maisstärke zwischen Objektträgern mit SHG-Parametern dar, um SHG-Bilder zu erzeugen, die die Polarisationsrichtung des Lasers anzeigen. Befolgen Sie die in Ergänzungsdatei 2 beschriebenen Schritte, mit Ausnahme der Laserleistung, die bei Maisstärke weniger als 5% beträgt.
- Nehmen Sie ein Bild von spärlichen Maisstärkekörnern und markieren Sie die Ausrichtung der SHG-Läppchen in der x-y-Ebene. Diese Ausrichtung entspricht der Laserorientierung (Abbildung 2A).
- Nehmen Sie zur Kontrolle ein weiteres Bild derselben Probe auf, indem Sie eine Halbwellenplatte (Position in Abbildung 1A) in den optischen Pfad einfügen, um die Schwingungsrichtung des Lasers zu ändern. Das resultierende Bild zeigt gedrehte SHG-Signalläppchen (Abbildung 2B, C).
- Wenn Sie einen anderen Bandpassfilter für das SHG verwenden, stellen Sie sicher, dass es optimale Übertragungseigenschaften aufweist, indem Sie die Bilder (Abbildung 2D, E) und die Signalintensitäten Pixel für Pixel entlang einer Zeilenabtastung vergleichen (Abbildung 2F).
3. Gewebeentnahme
HINWEIS: Verwenden Sie immer saubere Werkzeuge, um die chirurgischen Eingriffe durchzuführen.
- Verwenden Sie 6-12 Monate alte Taiep-Ratten und altersangepasste Sprague-Dawley-Kontrollen (WT).
- Betäuben Sie die Tiere mit einer i.p. Injektion einer Mischung aus Ketamin und Xylazin (0,125 mg/kg und 5 mg/kg), verdünnt in einer 0,9%igen sterilen NaCl-Lösung.
- Überprüfen Sie die Schmerzreflexe und fahren Sie nur fort, wenn sie fehlen.
- Opfere das Tier durch Enthauptung.
- Sobald der Kopf isoliert ist, öffnen Sie die Knochen des Schädelgewölbes vorsichtig entlang der Mittellinie, beginnend mit dem kaudalsten Punkt oben in Richtung Nase, von den Augenhöhlen in Richtung der Mittellinie und dann vom kaudalsten Punkt bis unter das Gehirn und das Kleinhirn.
HINWEIS: Knochenschneider und Rongeurs ermöglichen eine ordnungsgemäße Entfernung der Kopfknochen, ohne die Gehirnstrukturen zu beschädigen. - Lösen Sie das Gehirn und das Kleinhirn vom Knochen. Die beiden Hemisphären konnten getrennt werden. Wenn die Hemisphären geteilt sind, verwenden Sie eine Hälfte für die SHG-Bildgebung und fixieren Sie die andere Hälfte in 3,7% Paraformaldehyd in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für 20 Minuten in einer chemischen Haube für das anschließende Schneiden und Färben.
4. Vibratom-Schnitte
- Bereiten Sie eine Vibratom-Pufferschale vor, die mit warmer (37 °C) Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) gefüllt ist.
- Befestigen Sie das Gehirn mit Cyanacrylatkleber über ein Stück Klebeband an der Probenplatte. Der kaudalste Teil / die kaudalste Region berührt den Klebstoff, so dass die verwendbaren koronalen Abschnitte aus dem gegenüberliegenden, rostralen Teil geschnitten werden können.
- Lassen Sie ~10 s für die Polymerisation des Klebstoffs zu, um eine effektive Bindung der Probe zu erhalten.
HINWEIS: Die besten Ergebnisse werden erzielt, wenn das Gehirn so ausgerichtet ist, dass die Klinge "von oben nach unten" und nicht "von einer Seite zur anderen" schneidet (Abbildung 1B).
- Lassen Sie ~10 s für die Polymerisation des Klebstoffs zu, um eine effektive Bindung der Probe zu erhalten.
- Übertragen Sie die Probenplatte auf ihre magnetische Halterung in der Pufferschale.
- Beginnen Sie mit dem Schneiden von 300-500 μm-Abschnitten, bis die produzierten Scheiben die gesamte Oberfläche des Gehirns umfassen.
- Reduzieren Sie an dieser Stelle die Dicke des Abschnitts auf 160 μm.
- Sobald ein vollständiger 160-μm-Schnitt auf Höhe des Corpus callosum geschnitten wurde, wird er mit einer modifizierten Pasteur-Glaspipette mit einer großen, geflammten Öffnung zurückgewonnen (Abbildung 1C).
- Übertragen Sie es in eine saubere Petrischale mit neuem warmen HBSS oder direkt auf den Glasträger für die Mikroskopie (Deckglas oder Glasbodenschale).
HINWEIS: Unter den beschriebenen Versuchsbedingungen ist das Hinzufügen eines Deckglases über der Probe schädlich für die Bildgebung.
5. Übertragung auf das Mikroskop
- Wenn sich das Mikroskop in einem anderen Raum befindet, bereiten Sie eine isolierte Box mit erwärmten Gelpackungen vor, um die Gewebeschnitte unter Beibehaltung der Temperatur zu übertragen. Die Box dient auch dazu, die Abschnitte warm zu halten, bis sie abgebildet sind.
- Legen Sie die Probe unter das Mikroskop und stellen Sie sicher, dass sie durch direkte Beobachtung durch das Okular mit Durchlicht richtig unter dem Objektiv positioniert ist.
HINWEIS: Ziel ist es, die vorhergesagten emittierenden Strukturen mit der Schwingungsrichtung des Lasers in Einklang zu bringen, um das emittierte (und damit detektierte) SHG-Signal zu maximieren. - Entfernen Sie das überschüssige HBSS, so dass ein dünner Flüssigkeitsfilm die gesamte Probe bedeckt. Überprüfen Sie den Flüssigkeitsfilm alle paar Minuten, um eine übermäßige Verdunstung und Trocknung der Probe zu vermeiden.
HINWEIS: Unter den beschriebenen Bedingungen wird ein Abschnitt nicht länger als 20 Minuten verwendet. Das Trocknen der Probe verursacht drastische künstliche Effekte (ergänzende Abbildung 1A). Anstatt mehr HBSS hinzuzufügen, wird ein regelmäßiges Einweichen des Abschnitts in warmem, frischem Medium empfohlen, wenn längere Bildgebungszeiten erforderlich sind. Die Verwendung von Perfusionskammern und Klebstoff oder niedrigschmelzender Agarose zur Immobilisierung des Gewebes wird auch empfohlen, wenn längere Experimente durchgeführt werden sollen. - Bereiten Sie den Mikroskoptisch für die nicht gescannte Bildgebung vor, die das Schließen aller Türen der dunklen Inkubationskammer oder das Abdecken der Inkubationskammer mit einem schwarzen Nylon-Polyurethan-beschichteten Gewebe umfassen kann.
6. Bildgebung
- Wählen Sie den Bildgebungsmodus "nicht gescannt" entlang des Übertragungspfads. Auf diese Weise wird die Erfassung des schwachen SH-Signals von Tubulin optimiert.
- Wählen Sie das Ziel LCI Plan-Neofluar 25x/0,8 NA aus.
- Stellen Sie eine Laserleistung zwischen 13 mW und 26 mW ein, mit einer Pixelverweilzeit von 12,6 μs. Nehmen Sie Bilder mit einer Größe von nicht mehr als 512 x 512 Pixeln mit einer Geschwindigkeit von 5 und einem Durchschnitt von 2 auf, was einer durchschnittlichen Aufnahmezeit von etwa 15 s entspricht.
HINWEIS: Die Verwendung höherer Laserleistungen und/oder längerer Verweilzeiten kann die Probe beschädigen (ergänzende Abbildung 1B). - Nehmen Sie zunächst Bilder mit einem 485-nm-Kurzpassfilter (SP485) auf und fügen Sie in einem zweiten Schritt einen scharfen 405-nm-Bandpassfilter (BP405; Abbildung 3). Befolgen Sie die in Ergänzungsdatei 2 beschriebenen Schritte.
HINWEIS: Pseudo-Hellfeld-Bilder können durch den gleichen Detektor mit dem verbleibenden Laserlicht einer sichtbaren Linie aufgenommen werden (405 nm oder 488 nm Laser funktionieren am besten).
7. Verarbeitung des Kleinhirns
- Schneiden Sie zuerst das Kleinhirn mit einem Skalpell in zwei Hemisphären und kleben Sie sie dann mit dem mittleren Teil (dem flachen Teil, der nach dem Schneiden erhalten wird) auf die Vibratomstütze.
- Schnitt und Bild des Kleinhirns auf die gleiche Weise, wie es für das Gehirn beschrieben wurde (160 μm Schnitte, gleiche Vibratomeinstellungen, gleiche Klinge, gleiche Mikroskopeinstellungen usw.).
HINWEIS: Aufgrund der Anatomie des Kleinhirns ist seine Ausrichtung zum Zeitpunkt des Schneidens nicht kritisch. In den meisten Schichten, die von der Oberfläche entfernt erzeugt werden, werden Folien gut in die weiße Substanz geschnitten.
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Representative Results
Die mit dieser Methodik erhaltenen Bilder weisen aufgrund der sehr begrenzten Anzahl von Harmonophoren, die in biologischen Geweben vorhanden sind, ein intrinsisch niedriges Hintergrundniveau auf, was einer der wesentlichen Vorteile der Methode ist.
Wenn die Fasern des Corpus callosum abgebildet werden, finden sich im Taiep-Gehirn durchweg faserartige Kurzstrukturen und abgerundete Elemente (Abbildung 3B), während das Corpus callosum des Kontrollgehirns ein viel heterogeneres und isotroperes Signal in der gesamten Hirnregion zeigt (Abbildung 3A). Der Ursprung des Differenzsignals liegt speziell im Phänomen der zweiten harmonischen Erzeugung, da durch Hinzufügen des schmalen Bandpassfilters nur die unspezifische Signalintensität aus den Kontrollbildern verringert wird (Abbildung 3C-D), während dieses niedrige, diffuse Signal selektiv aus der Umgebung der somaartigen und der kurzen, länglichen Strukturen in den Taiep-Bildern entfernt wird, die immer intensives SH-Licht erzeugen (Abbildung 3E-F).
Die andere analysierte Struktur, die zerebelläre weiße Substanz, liefert vergleichbare Ergebnisse. Während im Kontrollgewebe ein fast vollständiges Fehlen des SH-Signals vorliegt (Abbildung 4B) und die Purkinje-Zellen bei Verwendung des Kurzpassfilters kaum sichtbar sind, bleiben die länglichen und abgerundeten Strukturen im SH-Bild des Taiep-Gewebes bestehen (Abbildung 4D).
Abbildung 1: Mikroskop und Schnitt . (A) Schematische Darstellung des verwendeten Mikroskops, wobei die relevanten Komponenten hervorgehoben sind. Pfeile: 1 = NDD-Anschluss, an dem sich der SP485 in der Nähe des Detektors befindet; 2 = abnehmbare Rahmen, in denen der BP405 platziert wird; 3 = Position unter dem Objektiv, an dem die Halbwellenplatte (HWP) für Kontrollexperimente platziert ist. Der Einschub zeigt den Rahmen, in den das HWP eingefügt werden könnte. (B) Draufsicht auf die Vibratom-Pufferschale mit dem geklebten Gehirn, das zum Feinschnitt bereit ist. (C) Die ursprüngliche (oben) und modifizierte (unten) Pasteur-Pipette, die zum Übertragen der Abschnitte verwendet wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Vorläufige Kontrollen . (A) Das von Maisstärkekörnern emittierte SHG-Signal zeigt eine vorherrschende Orientierung, die mit der Schwingungsrichtung des Lasers (in diesem Fall horizontal) übereinstimmt. (B) Nach dem Einsetzen einer Halbwellenplatte, deren schnelle Achse auf 45° in Bezug auf die Horizontale ausgerichtet ist, wird das Signal um 90° gedreht. (C) Verschmelzung des Signals vor und nach dem Einsetzen der Halbwellenplatte. (D) Das Signal unterhalb von 485 nm, das von den Maisstärkekörnern emittiert wird. (E) Das SHG-Signal der bei 405/10 nm detektierten Stärkekörner. (F) Graphische Darstellung eines Vergleichs der beiden Signale, die den Zeilenabtastungen entsprechen, die in den gezoomten Einschüben von D und E gezeigt werden. Der verwendete SHG-Filter verursacht vernachlässigbare Signalverluste. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: SHG-Aufnahmen von Taiep und WT Corpus callosum. Repräsentative Beispiele für (A) WT- und (B) Taiep-Signale , die aus dem Corpus callosum gewonnen wurden. (C) SP485 gefiltertes Bild aus einem WT-Corpus callosum. (D) BP405 gefiltertes Bild aus der gleichen Probe wie in C. (E) SP485 gefiltertes Bild aus einem Taiep-Corpus callosum. (F) BP405-gefiltertes Bild der gleichen Probe wie in E. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: SHG-Bilder von Taiep- und WT-Kleinhirn. Repräsentative Beispiele für (A-B) WT- und (C-D) Taiep-Signale, die aus Kleinhirnfolien gewonnen wurden. (A) Ein SP485-gefiltertes Bild aus einem WT-Folium; nur einige Purkinje-Zellen sind sichtbar. (B) Ein BP405-gefiltertes Bild aus derselben Probe wie in A. (C) Ein SP485-gefiltertes Bild aus einem Taiep-Folium. (D) Ein BP405-gefiltertes Bild der gleichen Probe wie in C. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzende Abbildung 1: Beispiele für Artefakte. (A) Artefakt durch Trocknen der Probe. (B) Artefakt aufgrund übermäßiger Exposition. Maßstabsbalken: 30 μm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzungsdatei 1: Köhler-Ausrichtung. Die Datei zeigt die Schritte zum Ausführen der Köhler-Ausrichtung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzungsdatei 2: ZEN-Softwareschritte für die SHG-Bildaufnahme. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Die SHG-Mikroskopie ist Teil einer Gruppe nichtlinearer optischer Techniken, zu denen die Zwei-Photonen-Anregungsmikroskopie, die Mikroskopie der dritten harmonischen Generation und die kohärente Anti-Stokes-Raman-Streumikroskopie gehören, die dazu beigetragen haben, das Anwendungsspektrum der konventionellen optischen Mikroskopie auf die Biowissenschaften auszudehnen20.
Insbesondere beziehen sich die Hauptstärken und Schwächen der SHG-Mikroskopie auf die gleiche Bedingung: Der Signalgenerator ist nicht-zentrosymmetrisch21. Eine solche spezifische architektonische Bedingung findet sich häufig im Bereich der anorganischen und organischen Kristalle, ist aber bei biologischen Objekten selten. Zusammen mit Kollagen und muskulärem Myosin sind Mikrotubuli in der Lage, ein zweites harmonisches Signal22 zu erzeugen, das mit einem Mikroskop detektiert werden kann, wenn genügend Summation in den Bündeln paralleler Polymere auftritt. Innerhalb der Zellen verbindet sich Tubulin zu parallelen Bündeln in den Kernen von Axonen (eine zelltypspezifische Lokalisation), in mitotischen Spindeln (eine zeitspezifische Verteilung) und, wie in dieser Arbeit dargestellt, in der charakteristischen Mikrotubuli-Assoziation einer kürzlich beschriebenen Tubulinopathie-Hypomyelinisierung mit Atrophie der Basalganglien und des Kleinhirns oder H-ABC (die die erste berichtete pathologische Verteilung dieser Art darstellt)14. 16,23.
Dieses sensomotorische Syndrom ist immer noch eine seltene Krankheit, da viele Neurologen noch nicht mit allen Symptomen vertraut sind und/oder sich das genetische Screening von Verdachtspatienten nicht leisten können, um die Diagnose zu bestätigen, was sehr wahrscheinlich zu einer Unterdiagnose führt, zumindest in einigen Populationen. Darüber hinaus ist nicht viel über die Pathologie auf molekularer und zellulärer Ebene bekannt, so dass die Techniken, die helfen könnten, die spezifischen Mechanismen dieses degenerativen Prozesses zu beleuchten, auch auf grundlegender Ebene sehr wertvoll sind.
Daher werden zwei Anwendungen der SHG-Mikroskopie in Bezug auf diese Myelinerkrankung vorgeschlagen. Langfristig könnte die SHG-Mikroskopie in diagnostische Ansätze für das Biopsie-Screening oder die direkte intrakranielle Analyse integriert werden, aber die größte Wirkung könnte mit dem Versuch verbunden sein, die molekularen Grundlagen der Krankheit zu entschlüsseln.
Es gibt viele Vorteile der SHG-Mikroskopie gegenüber anderen Mikroskopietechniken. In der Tat erfordert die SHG-Mikroskopie keine Fixierung des Gewebes, was bei Mikrotubuli ein besonders heikler Schritt der Probenvorbereitung ist, und erfordert keinerlei Färbung. Der größte Vorteil hängt mit dem physikalischen Phänomen zusammen. Einerseits bietet es aufgrund des praktisch fehlenden Hintergrunds einen hohen Kontrast trotz der schwachen Signale, und andererseits, da die für die Frequenzverdopplung erforderlichen Lichtintensitäten sehr hoch sind und diese Intensitäten nur in einem sehr begrenzten Volumen der Probe erreicht werden, bietet die Technik eine intrinsische optische Schnitterfassung und ermöglicht so 3D-Rekonstruktionen.
Die Haupteinschränkungen dieser Mikroskopietechnik hängen mit den Kosten der Ausrüstung zusammen. Ein gutes konfokales Mikroskop ist zusammen mit einem gepulsten Infrarot-Laser (IR) für diese Anwendung erforderlich, und obwohl in vielen neurowissenschaftlichen Laboren ein Zwei-Photonen-Anregungssystem verfügbar ist, das leicht in ein SHG-Setup umgewandelt werden kann, ist der Kostenunterschied im Vergleich zu einem herkömmlichen Epifluoreszenz-Setup immer noch signifikant. Darüber hinaus wird die Auflösung als beugungsbegrenzte Technik durch die Verwendung von IR-Licht für die Beleuchtung beeinflusst.
Wie bei vielen bahnbrechenden Anwendungen waren die Aufbauten, die für die frühen Experimente zur SHG-Mikroskopie in den Biowissenschaften verwendet wurden, völlig maßgeschneiderte optische Aufbauten, die als offene Systeme 11,24,25 gebaut wurden und den Experimentatoren die Möglichkeit gaben, jede einzelne Komponente zu optimieren. Da es in Life-Science-Laboren üblicher ist, Zugang zu einem kommerziellen Setup zu haben, wollten wir testen, ob eines dieser Systeme empfindlich genug ist, um das schwache Signal zu erkennen, das von Tisular-Mikrotubuli-Bündeln emittiert wird, von denen bekannt ist, dass sie nicht so starke Harmonophore sind wie Kollagen. Das NLO-System LSM710 von Zeiss besteht aus einem inversen konfokalen Mikroskop mit Modulen für die nicht-descannierte Detektion im Transmissions- und "epi"-Modus und mit einem abstimmbaren Coherent Chameleon-IR-Laser. Aufgrund der kohärenten Natur des SHG-Phänomens ist es entscheidend, den Übertragungspfad zu wählen, um die Sammlung von frequenzverdoppeltem Licht aus der Probe zu maximieren, und daher wurde die Detektion durch den 0,55 NA-Kondensor durch Integration durchgeführt. Ein LCI Plan-Neofluar 25X/0,8 NA Immersionsobjektiv wurde verwendet, um die Probe von unten zu beleuchten und die Kondensator-NA anzunähern. Mit den in dieser Arbeit beschriebenen Bedingungen konnten wir zuverlässig ein Signal aus dem Gewebe mit der TUBB4A-Mutation nachweisen, und dieses Signal fehlte in den Kontrollen immer.
Im berichteten Protokoll waren in zwei Schritten Anpassungen erforderlich, um die besten Bildgebungsbedingungen zu erzielen: die Dicke des Gewebeschnitts und die Öffnung der Kondensatormembran. Die Abschnitte sollten so dünn wie möglich sein, um eine übermäßige Absorption, Streuung und den Verlust von SH-Photonen zu vermeiden, zumal das Ziel aufgrund der kohärenten Natur des physikalischen Phänomens darin besteht, in der Transmission abzubilden. In unserem Fall war der limitierende Faktor die Konsistenz des Taiepgewebes , die das Schneiden in homogen dicken Abschnitten unter 160-180 μm verhinderte. Bei der konventionellen Köhler-Ausrichtung wird die Kondensormembran in der Regel auf etwa 60% ihrer Fläche geschlossen, um Kontrast im Durchlichtbild zu erzeugen; Umgekehrt geht es bei dieser Anwendung darum, so viele Photonen wie möglich zu sammeln, also die totale Öffnung der Membran.
Diese Anwendung der SHG-Mikroskopie ist wichtig, da sie die Möglichkeit bietet, Tubulin-reiches von Tubulin-normalem Gewebe zu unterscheiden, wobei das Tubulin-reiche Gewebe ein nachweisbares Signal aussendet. Es ist auch möglich, dass andere, noch zu beschreibende Tubulinopathie-Mutationen Störungen des Zytoskeletts in anderen Gewebenverursachen 26, die ebenfalls eine Tubulinanreicherung beinhalten können.
In Bezug auf andere mögliche Anwendungen könnte die SHG-Mikroskopie auf die Untersuchung schwächerer Signale ausgeweitet werden, wie sie in Tubulin-normalem Gewebe, in feinen, dissoziierten Axonen oder in intrazellulären Bündeln mit gemischter Polarität vorhanden sind. Um dies zu erreichen, könnten Setup-Modifikationen, wie der Austausch des Luftkondensators durch einen mit einer höheren numerischen Apertur und/oder mit Eintauchen oder die Verwendung eines empfindlicheren Detektors, einen wichtigen Unterschied machen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) durch die folgenden Zuschüsse unterstützt: infraestructura 226450 an VP-CIO, infraestructura 255277 an V.P. und FORDECYT-PRONACES/194171/2020 an V.H. Wir danken für die Unterstützung von Juvenal Hernández Guevara als CIO bei der Videoproduktion.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 405/10 nm BrightLine(R) single-band bandpass filter | Semrock | FF01-405/10-25 | 32 mm diameter, with housing ring |
| Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric | Thorlabs | BK5 | 5' x 9' (1.5 m x 2.7 m) x 0.005" (0.12 mm) Thick |
| Blades for vibratome | any commercial; e.g. Wilkinson Sword | Classic stainless steel double edge razor blades | |
| Cell culture dishes, 35 mm | any commercial; e.g. Falcon | 351008 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM710NLO AxioObserver Z1 | Inverted microscope, objective used is LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA |
| Cooler | any commercial | Any insulated, polystyrene box could work, to mantain the sample at about 37 °C | |
| Corn stach | e.g. Maizena | From the supermarket | |
| Coverslips #1.5 | any commercial | Rectangular | |
| Cyanoacrylate glue | e.g. Loctite | To glue the brain to the masking tape | |
| Fine forceps | fine science tools | 11412-11 | To manipulate tissue sections by handling from the meninges |
| Fine scissors | fine science tools | 14370-22 | To cut the skin |
| Fine scissors curved tip | fine science tools | 14061-09 | To cut along the midline |
| Formaldehyde 37% | Sigma-Aldrich | 252549 | To dilute 1:10 in PBS |
| Friedman Rongeur | fine science tools | 16000-14 | To cut the bone |
| Gel packs | any commercial | Prewarmed to 37 °C, to help mantaining the temperature inside the cooler | |
| Glass Pasteur pipette, modified | any commercial | To transfer the tissue section | |
| Hanks′ Balanced Salt solution (HBSS) | Gibco | 14025-076 | Could be prepared from powders |
| Kelly hemostats | fine science tools | 13018-14 | To separate the bone |
| Masking tape | any commercial | To protect th surface of the specimen plate | |
| NDD module, type C | Zeiss | 000000-1410-101 | To detect the signal, reducing light loss. Housing the 000000-1935-163 filter set with the SP485 |
| Offset bone nippers | fine science tools | 16101-10 | To cut the bone |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-031 | Could be prepared from powders or tabs |
| Pulsed laser | Coherent | Chameleon Vision II | 680–1080 nm tunable laser |
| Scalpel | any commercial | Straight blade with sharp point | |
| Standard pattern forceps | fine science tools | 11000-18 | |
| Vannas spring scissors | fine science tools | 15018-10 | To cut meninges that remain joined to both the slice obtained from vibratome cutting and the section glued to the specimen plate. |
| Vibratome | any commercial; e.g. Leica | VT1200 |
References
- Palmiter, R. D., et al. Cell lineage ablation in transgenic mice by cell-specific expression of a toxin gene. Cell. 50 (3), 435-443 (1987).
- Banerjee, A., et al. A monoclonal antibody against the type II isotype of beta-tubulin. Preparation of isotypically altered tubulin. The Journal of Biological Chemistry. 263 (6), 3029-3034 (1988).
- Banerjee, A., Roach, M. C., Trcka, P., Luduena, R. F. Preparation of a monoclonal antibody specific for the class IV isotype of beta-tubulin. Purification and assembly of alpha beta II, alpha beta III, and alpha beta IV tubulin dimers from bovine brain. The Journal of Biological Chemistry. 267 (8), 5625-5630 (1992).
- Banerjee, A., et al. Localization of βv tubulin in the cochlea and cultured cells with a novel monoclonal antibody. Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 505-514 (2008).
- Cross, A. R., Williams, R. C. Kinky microtubules: Bending and breaking induced by fixation in vitro with glutaraldehyde and formaldehyde. Cell Motility and the Cytoskeleton. 20 (4), 272-278 (1991).
- Van Steenbergen, V., et al. Molecular understanding of label-free second harmonic imaging of microtubules. Nature Communications. 10 (1), 3530 (2019).
- Campagnola, P. J., Clark, H. A., Mohler, W. A., Lewis, A., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy of living cells. Journal of Biomedical Optics. 6 (3), 277 (2001).
- Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
- Yu, C. -H., et al. Measuring microtubule polarity in spindles with second-harmonic generation. Biophysical Journal. 106 (8), 1578-1587 (2014).
- Bancelin, S., et al. Probing microtubules polarity in mitotic spindles in situ using Interferometric Second Harmonic Generation Microscopy. Scientific Reports. 7, 6758 (2017).
- Dombeck, D. A., et al. Uniform polarity microtubule assemblies imaged in native brain tissue by second-harmonic generation microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7081-7086 (2003).
- Psilodimitrakopoulos, S., et al. Estimation of the effective orientation of the SHG source in primary cortical neurons. Optics Express. 17 (16), 14418 (2009).
- Sharoukhov, D., Bucinca-Cupallari, F., Lim, H. Microtubule imaging reveals cytoskeletal deficit predisposing the retinal ganglion cell axons to atrophy in DBA/2J. Investigative Opthalmology & Visual Science. 59 (13), 5292 (2018).
- Alata, M., Piazza, V., Eguibar, J. R., Cortes, C., Hernandez, V. H. H-ABC tubulinopathy revealed by label-free second harmonic generation microscopy. Scientific Reports. 12, 14417 (2022).
- Duncan, I. D., Lunn, K. F., Holmgren, B., Urba-Holmgren, R., Brignolo-Holmes, L. The taiep rat: A myelin mutant with an associated oligodendrocyte microtubular defect. Journal of Neurocytology. 21 (12), 870-884 (1992).
- Duncan, I. D., et al. A mutation in the Tubb4a gene leads to microtubule accumulation with hypomyelination and demyelination: Tubb4a Mutation. Annals of Neurology. 81 (5), 690-702 (2017).
- Garduno-Robles, A., et al. MRI features in a rat model of H-ABC tubulinopathy. Frontiers in Neuroscience. 14, 555 (2020).
- Lopez-Juarez, A., et al.
- Alata, M., et al. Longitudinal evaluation of cerebellar signs of H-ABC tubulinopathy in a patient and in the taiep model. Frontiers in Neurology. 12, 702039 (2021).
- Parodi, V., et al. Nonlinear optical microscopy: From fundamentals to applications in live bioimaging. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 585363 (2020).
- Lefort, C. A review of biomedical multiphoton microscopy and its laser sources. Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (42), 423001 (2017).
- Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nature Biotechnology. 21 (11), 1356-1360 (2003).
- vander Knaap, M. S., et al. New syndrome characterized by hypomyelination with atrophy of the basal ganglia and cerebellum. American Journal of Neuroradiology. 23 (9), 1466 (2002).
- Stoller, P., Kim, B. -M., Rubenchik, A. M., Reiser, K. M., Da Silva, L. B. Polarization-dependent optical second-harmonic imaging of a rat-tail tendon. Journal of Biomedical Optics. 7 (2), 205 (2002).
- Brown, E. B., et al. In vivo measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy. Nature Medicine. 7 (7), 864-868 (2001).
- Chakraborti, S., Natarajan, K., Curiel, J., Janke, C., Liu, J. The emerging role of the tubulin code: From the tubulin molecule to neuronal function and disease. Cytoskeleton. 73 (10), 521-550 (2016).
