Summary
I den här artikeln presenterar vi ett protokoll för att detektera mikrotubulibelastade oligodendrocyter i en modell av tubulinopati genom en enkel, innovativ andra harmonisk generationens mikroskopimetod.
Abstract
Den tillfredsställande visualiseringen av cytoskelettkomponenter i hjärnan är utmanande. Den allestädes närvarande fördelningen av nätverken av mikrotubuli, mikrofilament och mellanliggande filament i alla neurala vävnader, tillsammans med variationen i resultaten av fluorescerande proteinfusionsstrategier och deras begränsade tillämplighet på dynamiska studier av antikroppar och läkemedel som kromoforfordon, gör klassiska optiska tillvägagångssätt inte lika effektiva som för andra proteiner. När tubulin behöver studeras är den etikettfria genereringen av andra övertoner ett mycket lämpligt alternativ på grund av molekylens icke-centrosymmetriska organisation. Denna teknik, när den konjugeras till mikroskopi, kan kvalitativt beskriva den volymetriska fördelningen av parallella buntar av mikrotubuli i biologiska prover, med den ytterligare fördelen att arbeta med färska vävnader som är ofixerade och oparfymerade. Detta arbete beskriver hur man avbildar tubulin med en kommersiell andra harmonisk generationens mikroskopiinställning för att markera mikrotubuli i oligodendrocyternas tubulinberikade strukturer, som vid hypomyelinering med atrofi av de basala ganglierna och cerebellum (H-ABC) tubulinopati, en nyligen beskriven myelinstörning.
Introduction
Den optiska avbildningen av cytoskelettstrukturer i vävnader och organpreparat är inte en lätt uppgift. Cytoskeletala filament är allestädes närvarande, så om generisk färgning utförs, till exempel mot alfa-tubulin eller beta-aktin eller potentiellt keratin i ett epitelprov, kommer signalen sannolikt att fördelas ganska homogent över hela provet. För att begränsa färgningen till en mer meningsfull delmängd av cellulära komponenter kan man antingen använda transgena möss med riktat uttryck1 eller planera att använda isoformspecifika antikroppar. Även om väldigt få av de senare finns på marknaden (och väldigt få finns alls 2,3,4), kan en transgen djurmodell finnas tillgänglig. Det måste dock förvärvas av labbet och ordentligt inrymmas, med alla kostnader som är involverade i processen. Vissa antikroppar eller kemikalier, till exempel fluoroforkonjugerade läkemedel som falloidin eller paklitaxel, kan vara delvis eller helt oförenliga med användning i levande celler eller vävnader, vilket begränsar deras tillämplighet till endast studier av fasta prover.
När det gäller tubulin måste en ytterligare aspekt beaktas, vilket är polymerens känslighet för fixering. Konventionell kemisk fixering med formaldehyd är känd för att inte vara tillräcklig för att optimalt bevara mikrotubuliens integritet5. Dessutom bekräftar en ny rapport att formaldehydkorsbindning inducerar subtila förändringar i mikrotubuliens ultrastruktur, liknande vad som händer med bindningen av vissa läkemedel eller fysiologiska molekyler som GTP6.
Den direkta visualiseringen av mikrotubuli i ostoppade, ofixerade prover är därför ofta önskvärt. För att uppnå detta är en teknisk lösning andra harmoniska generationens (SHG) mikroskopi7, som bygger på förmågan hos buntar av parallella mikrotubuli att fungera som harmonoforer och att avge frekvensfördubblat ljus när de är ordentligt upplysta med en intensiv, pulserad infraröd laser. Även om en starkare och stabilare andra harmonisk signal kan genereras från kollagen och myosin, som är de enda andra två biologiska materialen som är kända för att kunna frekvensfördubblas, har signalen från tubulin hittills använts mest för att studera mitotiska spindelomläggningar 8,9,10 och axonal mikrotubulimorfologi11,12,13.
I detta arbete introducerar vi en ny användning av SHG-mikroskopi som ett diagnostiskt verktyg för att skilja vävnader i centrala nervsystemet (CNS) som påverkas av tubulin beta 4 A (TUBB4A) tubulinopati från deras friska motsvarigheter14. Några av de mutationer som förekommer i denna övervägande neurala isoform av tubulin, som de som orsakar hypomyelinisering och atrofi av de basala ganglierna och cerebellum (H-ABC), inducerar mikrotubuliöverfyllning i oligodendrocyterna15,16; Cytoskelettförändringarna är i sin tur förknippade med nedströms effekter som dysmyelinisering, med djup försämring av motoriska och sensoriska vägar16,17,18,19. Taiep-murinmodellen som används i detta arbete visar onormalt mikrotubuliinnehåll i oligodendrocyterna och rekapitulerar de flesta sensoriska motoriska symtomen hos H-ABC-patienter17. Protokollet förklarar hur man avbildar strukturer som corpus callosum och lillhjärnan, som vanligtvis är mycket myeliniserade och som påverkas allvarligt hos mänskliga patienter såväl som i taiepråttan 19, för att belysa skillnaderna i SH-signaler mellan friska och mutanta vävnader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla beskrivna förfaranden gjordes i enlighet med de lagar och koder som godkänts i den sjunde titeln i förordningen om den allmänna hälsolagen om hälsoforskning från den mexikanska regeringen (NOM-062-ZOO-1999) och i enlighet med rekommendationerna från National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Experimental Animals och godkändes av den institutionella kommittén för bioetik i forskning vid Universidad de Guanajuato och Benemérita Universidad Autónoma de Puebla.
1. Inställningar för mikroskop
- Slå på mikroskopisystemet.
- Slå på den pulserade lasern för att garantera att den är redo att lasa på en optimal och stadig effektnivå efter provextraktion och beredning.
- Ställ in lasern på 810 nm. För att studera tisulär mikrotubuli används 10%-20% av den tillgängliga lasereffekten, vilket i det beskrivna systemet motsvarar 13-26 mW mätt vid målets bakre fokalplan.
- Se till att mikroskopet är Köhler-justerat (tilläggsfil 1), med det mål som kommer att användas för SHG-avbildning.
OBS: Detta är viktigt eftersom detekteringen i den kommersiella installationen som används i detta arbete utförs i överföringsläge och genom kondensorn. - Ta bort oönskade filter från den optiska detekteringsvägen (bild 1A).
- Se till att kondensormembranet är helt öppet för att säkerställa att inget ljus stoppas i onödan på denna nivå.
- Förbered ett 25x/0,8 numeriskt bländarmål (NA) med nedsänkning med en liten droppe nedsänkningsolja i linsen.
OBS: Detta mål användes för att bäst matcha kondensorn NA, som var 0,55 (helst NAcond≥ NAobj).
2. Mikroskop preliminära kontroller
OBS: Utför de preliminära mikroskopkontrollerna en gång, såvida inte installationen ändras.
- Bild torr majsstärkelse inklämd mellan glasskivor med SHG-parametrar för att generera SHG-bilder som avslöjar laserpolarisationsriktningen. Följ stegen som rapporteras i tilläggsfil 2, förutom lasereffekten, som är mindre än 5% för majsstärkelse.
- Ta en bild av glesa majsstärkelsekorn och markera orienteringen av SHG-lobulerna i x-y-planet. Denna orientering motsvarar laserorienteringen (figur 2A).
- Som en kontroll, ta en annan bild av samma prov och sätt in en halvvågsplatta (position som visas i figur 1A) i den optiska banan för att ändra laserns svängningsriktning. Den resulterande bilden visar roterade SHG-signallobuler (figur 2B, C).
- Om du använder en annan typ av bandpassfilter för SHG:n, se till att den har optimala överföringsegenskaper genom att jämföra bilderna (figur 2D, E) och signalintensiteterna pixel för pixel längs en linjeskanning (figur 2F).
3. Vävnadsextraktion
OBS: Använd alltid rena verktyg för att utföra de kirurgiska ingreppen.
- Använd 6-12 månader gamla taiep-råttor och åldersmatchade Sprague-Dawley-kontroller (WT).
- Bedöva djuren med en i.p. injektion av en blandning av ketamin-xylazin (0,125 mg/kg och 5 mg/kg) utspädd i en 0,9% steril NaCl-lösning.
- Kontrollera smärtreflexerna och fortsätt bara om de är frånvarande.
- Offra djuret via halshuggning.
- När huvudet är isolerat, öppna benen i kranialvalvet försiktigt längs mittlinjen, från den mest kaudala punkten högst upp mot näsan, från orbitalhåligheterna mot mittlinjen och sedan från den mest kaudala punkten till under hjärnan och lillhjärnan.
OBS: Benskärare och Rongeurs möjliggör korrekt borttagning av huvudbenen utan att skada hjärnstrukturerna. - Släpp hjärnan och cerebellum från benet. De två halvkloten kunde separeras. Om halvklotet är uppdelat, använd den ena halvan för SHG-avbildning och fixera den andra halvan i 3,7% paraformaldehyd i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i 20 minuter inuti en kemisk huva för efterföljande sektionering och färgning.
4. Vibratomsektionering
- Förbered en vibratombuffertbricka fylld med varm (37 °C) Hank's Balanced Salt Solution (HBSS).
- Fäst hjärnan på provplattan med cyanoakrylatlim via en bit maskeringstejp. Den mest kaudala delen/regionen kommer i kontakt med limet så att de användbara koronasektionerna från den motsatta, rostrala delen kan skäras.
- Låt ~ 10 s för limet att polymerisera för att erhålla effektiv fastsättning av provet.
OBS: De bästa resultaten uppnås när hjärnan är orienterad så att bladet skär "från topp till botten" snarare än "från sida till sida" (figur 1B).
- Låt ~ 10 s för limet att polymerisera för att erhålla effektiv fastsättning av provet.
- Överför provplattan till dess magnetiska stöd inuti buffertbrickan.
- Börja skära 300-500 μm sektioner tills de producerade skivorna omfattar hela hjärnans yta.
- Vid denna tidpunkt, minska sektionens tjocklek till 160 μm.
- När en fullständig sektion på 160 μm har skurits i nivå med corpus callosum, återställ den med en pasteurpipett av modifierat glas med en stor, flammad öppning (figur 1C).
- Överför den till en ren petriskål med ny varm HBSS eller direkt på glasstödet för mikroskopi (täckglas eller glasbottenfat).
OBS: För de beskrivna experimentella betingelserna är det skadligt för avbildningen att lägga till ett täckglas ovanför provet.
5. Överför till mikroskopet
- Om mikroskopet är i ett annat rum, förbered en isolerad låda med uppvärmda gelpaket för att överföra vävnadssektionerna samtidigt som temperaturen bibehålls. Lådan tjänar också till att hålla sektionerna varma tills de avbildas.
- Sätt provet under mikroskopet och se till att det är ordentligt placerat under målet genom direkt observation genom kikaren med överfört ljus.
OBS: Målet är att anpassa de förutsagda emitterande strukturerna till laserns svängningsriktning för att maximera den utsända (och därför detekterade) SHG-signalen. - Ta bort överskottet av HBSS så att en tunn flytande film täcker hela provet. Kontrollera visuellt vätskefilmen med några minuters mellanrum för att undvika överdriven avdunstning och torkning av provet.
OBS: Under de beskrivna förhållandena används ett avsnitt i högst 20 minuter. Torkning av provet orsakar drastiska artefaktiska effekter (kompletterande figur 1A). I stället för att lägga till mer HBSS rekommenderas periodisk blötläggning av sektionen i varmt, friskt medium om längre bildtider behövs. Användning av perfusionskamrar och lim eller lågsmältande agaros för att immobilisera vävnaden rekommenderas också när längre experiment ska göras. - Förbered mikroskopsteget för icke-avskandad avbildning, vilket kan innefatta att stänga alla dörrar till den mörka inkubationskammaren eller täcka inkubationskammaren med ett svart nylonpolyuretanbelagt tyg.
6. Bildbehandling
- Välj bildläget "icke-avskannat" längs överföringsvägen. På så sätt optimeras fångsten av den svaga SH-signalen från tubulin.
- Välj LCI Plan-Neofluar 25x/0,8 NA-målet.
- Ställ in en lasereffekt mellan 13 mW och 26 mW, med en pixeluppehållstid på 12,6 μs. Ta bilder som inte är större än 512 pixlar x 512 pixlar, med hastighet 5 och i genomsnitt 2, under en genomsnittlig förvärvstid på cirka 15 s.
OBS: Användning av högre laserkrafter och/eller längre uppehållstider kan skada provet (kompletterande figur 1B). - Ta bilder först med ett 485 nm kortpassfilter (SP485) och lägg i ett andra steg till ett skarpt 405 nm bandpassfilter (BP405; Figur 3). Följ stegen som rapporteras i tilläggsfil 2.
OBS: Pseudo-ljusfältbilder kan tas genom samma detektor med hjälp av det återstående laserljuset från en synlig linje (405 nm eller 488 nm lasrar fungerar bäst).
7. Bearbetning av cerebellum
- Skär först cerebellum med en skalpell i två halvklot och lim dem sedan på vibratomstödet vid mittdelen (den plana delen som erhållits efter skärning).
- Sektion och bild av lillhjärnan på samma sätt som beskrevs för hjärnan (160 μm sektioner, samma vibratominställningar, samma blad, samma mikroskopinställningar etc.).
OBS: På grund av cerebellumets anatomi är dess orientering vid sektionstillfället inte kritisk; I de flesta skivor som genereras bort från ytan kommer det att finnas folia som delas väl in i den vita substansen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bilderna som erhållits med denna metod har en inneboende låg bakgrundsnivå på grund av det mycket begränsade antalet harmonoforer som finns i biologiska vävnader, vilket är en av de betydande fördelarna med metoden.
När fibrerna i corpus callosum avbildas kan fiberliknande korta strukturer och rundade element konsekvent hittas i taiep-hjärnan (figur 3B), medan corpus callosum i kontrollhjärnan visar en mycket mer heterogen och isotrop signal i hela hjärnregionen (Figur 3A). Ursprunget till differentialsignalen ligger specifikt i det andra harmoniska generationsfenomenet, eftersom tillägg av det smala bandpassfiltret endast minskar den ospecifika signalintensiteten från styrbilderna (figur 3C-D) samtidigt som man selektivt tar bort denna låga, diffusa signal från runt de soma-liknande och de korta, långsträckta strukturerna i taiep-bilderna, som alltid genererar intensivt SH-ljus (figur 3E-F).
Den andra analyserade strukturen, den cerebellära vita substansen, ger jämförbara resultat. Specifikt, medan det i kontrollvävnad finns en nästan fullständig frånvaro av SH-signal (figur 4B), och Purkinje-cellerna är knappt synliga när man använder kortpassfiltret, kvarstår de långsträckta och rundade strukturerna i SH-bilden från taiep-vävnaden (Figur 4D).
Figur 1: Mikroskop och sektionering . (A) Schematisk över det använda mikroskopet, med relevanta komponenter markerade. Pilar: 1 = NDD-port där SP485 ligger nära detektorn; 2 = avtagbara ramar där BP405 är placerad; 3 = position under målet där halvvågsplattan (HWP) placeras för kontrollexperiment. Infällningen visar ramen där HWP kan sättas in. (B) Ovanifrån av vibratombuffertbrickan med den limmade hjärnan redo att findelas. (C) Den ursprungliga (övre) och modifierade (nedre) Pasteurpipetten som används för att överföra sektionerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Preliminära kontroller. (A) SHG-signalen som emitteras av majsstärkelsekorn visar en dominerande orientering som sammanfaller med laserns svängningsriktning (horisontell i detta fall). (B) Efter att ha satt in en halvvågsplatta med sin snabba axel orienterad vid 45° i förhållande till horisontalplanet roteras signalen med 90°. (C) Sammanslagning av signalen före och efter halvvågsplattans införande. D) Den signal under 485 nm som släpps ut från majsstärkelsekornen. E) SHG-signalen från stärkelsekornen som påvisats vid 405/10 nm. (F) Diagram som visar en jämförelse av de två signaler som motsvarar de linjeskanningar som visas i de zoomade insatserna i D och E. Det SHG-filter som används orsakar försumbar signalförlust. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: SHG-bilder från taiep och WT corpus callosum. Representativa exempel på (A) WT- och (B) taiep-signaler erhållna från corpus callosum. (C) SP485-filtrerad bild från en WT corpus callosum. (D) BP405-filtrerad bild från samma prov som i C. (E) SP485-filtrerad bild från en taiep corpus callosum. (F) BP405-filtrerad bild av samma prov som i E. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: SHG-bilder från taiep och WT cerebellums. Representativa exempel på (A-B) WT- och (C-D) taiep-signaler erhållna från cerebellär folia. (A) En SP485-filtrerad bild från ett WT-blad; endast vissa Purkinje-celler är synliga. (B) En BP405-filtrerad bild från samma prov som i A. (C) En SP485-filtrerad bild från ett taiep-folium. D) En BP405-filtrerad bild av samma prov som i C. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1: Exempel på artefakter. (A) Artefakt på grund av torkning av provet. (B) Artefakt på grund av överdriven exponering. Skalstreck: 30 μm. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 1: Köhler-inriktning. Filen visar stegen för att utföra Köhler-justeringen. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 2: ZEN-programvarusteg för SHG-bildförvärv. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SHG-mikroskopi är en del av en grupp icke-linjära optiktekniker, som inkluderar tvåfotonexcitationsmikroskopi, tredje harmonisk generationsmikroskopi och koherent anti-Stokes Raman-spridningsmikroskopi, som har bidragit till att utöka utbudet av tillämpningar av konventionell optisk mikroskopi till livsvetenskaperna20.
Specifikt relaterar SHG-mikroskopins huvudsakliga styrka och svaghet till samma tillstånd: signalgeneratorn är icke-centrosymmetrisk21. Ett sådant specifikt arkitektoniskt tillstånd finns ofta i området för oorganiska och organiska kristaller men är sällsynt bland biologiska föremål. Tillsammans med kollagen och muskulös myosin kan mikrotubuli generera en andra harmonisk signal22, som kan detekteras med ett mikroskop om tillräcklig summering sker i buntarna av parallella polymerer. Inuti cellerna associeras tubulin för att bilda parallella buntar i axonkärnorna (en celltypspecifik plats), i mitotiska spindlar (en tidsspecifik fördelning) och, som presenteras i detta arbete, i varumärkesmikrotubuliföreningen av en nyligen beskriven tubulinopati-hypomyelinering med atrofi av de basala ganglierna och cerebellum, eller H-ABC (som representerar den första rapporterade patologiska fördelningen av detta slag)14, 16,23.
Detta sensorisk-motoriska syndrom är fortfarande en föräldralös sjukdom, eftersom många neurologer ännu inte känner till alla symtom och / eller inte har råd med genetisk screening av misstänkta patienter för att bekräfta diagnosen, vilket mycket troligt orsakar underdiagnostik, åtminstone i vissa populationer. Dessutom är inte mycket känt om patologin på molekylär och cellulär nivå, så de tekniker som kan hjälpa till att belysa de specifika mekanismerna i denna degenerativa process är mycket värdefulla, även på en grundläggande nivå.
Därför föreslås två användningar av SHG-mikroskopi angående denna myelinstörning. På lång sikt skulle SHG-mikroskopi kunna integreras i diagnostiska metoder för biopsiscreening eller direkt intrakraniell analys, men den största effekten kan vara förknippad med att försöka dechiffrera den molekylära grunden för sjukdomen.
Det finns många fördelar med SHG-mikroskopi jämfört med andra mikroskopitekniker. Faktum är att SHG-mikroskopi inte kräver fixering av vävnaden, vilket är ett särskilt känsligt steg i provberedningen vid mikrotubuli och kräver inte färgning av något slag. Den största fördelen är relaterad till det fysiska fenomenet som är inblandat. Å ena sidan, på grund av den praktiskt taget frånvarande bakgrunden, ger den hög kontrast trots de svaga signalerna som genereras, och å andra sidan, eftersom de ljusintensiteter som behövs för frekvensfördubbling är mycket höga och dessa intensiteter endast uppfylls i en mycket begränsad volym av provet, ger tekniken inneboende optisk sektionering, vilket möjliggör 3D-rekonstruktioner.
De största begränsningarna för denna mikroskopiteknik är relaterade till kostnaden för utrustningen. Ett bra konfokalmikroskop, tillsammans med en pulserad infraröd (IR) laser, är nödvändig för denna applikation, och även om ett tvåfotonexcitationssystem finns tillgängligt i många neurovetenskapliga laboratorier, som enkelt kan modifieras till en SHG-installation, är skillnaden i kostnad jämfört med en konventionell epifluorescensinstallation fortfarande betydande. Dessutom, som en diffraktionsbegränsad teknik, påverkas dess upplösning av användningen av IR-ljus för belysning.
Som med många banbrytande applikationer var de inställningar som användes för de tidiga experimenten på SHG-mikroskopi som tillämpades på biovetenskaperna helt anpassade optiska inställningar byggda som öppna system 11,24,25, vilket gav experimenterna möjlighet att optimera varje enskild komponent. Eftersom det i life science-laboratorier är vanligare att ha tillgång till en kommersiell installation, ville vi testa om ett av dessa system är tillräckligt känsligt för att upptäcka den svaga signalen som avges av tisulära mikrotubulibuntar, som är kända för att inte vara lika starka harmonoforer som kollagen. LSM710 NLO-systemet från Zeiss består av ett inverterat konfokalmikroskop med moduler för icke-avskansad detektering i överförings- och "epi" -läge och med en koherent kameleontavstämbar IR-laser. På grund av SHG-fenomenets sammanhängande karaktär är det viktigt att välja överföringsväg för att maximera insamlingen av frekvensfördubblat ljus från provet, och därför utfördes detekteringen genom 0,55 NA-kondensorn genom integration. Ett LCI Plan-Neofluar 25X/0.8 NA nedsänkningsmål användes för att belysa provet från botten och approximera kondensorn NA. Med de förhållanden som beskrivs i detta dokument kunde vi på ett tillförlitligt sätt upptäcka en signal från vävnaden som bär TUBB4A-mutationen, och denna signal var alltid frånvarande i kontrollerna.
I det rapporterade protokollet krävde två steg justeringar för att uppnå de bästa bildförhållandena: tjockleken på vävnadssektionen och öppningen av kondensorns membran. Sektionerna bör vara så tunna som möjligt för att förhindra överdriven absorbans, spridning och förlust av SH-fotoner, särskilt eftersom målet är att avbilda i överföring på grund av det fysiska fenomenets sammanhängande natur. I vårt fall var den begränsande faktorn konsistensen av taiep-vävnaden , vilket hindrade sektionering i homogent tjocka sektioner under 160-180 μm. Med den konventionella Köhler-inriktningen stängs kondensormembranet vanligtvis till cirka 60% av sitt område för att generera kontrast i den överförda ljusbilden; Omvänt, för denna applikation är målet att samla in så många fotoner som möjligt, därav membranets totala öppning.
Denna tillämpning av SHG-mikroskopi är viktig eftersom den ger möjlighet att urskilja tubulinrik kontra tubulinnormal vävnad, med den tubulinrika vävnaden som avger en detekterbar signal. Det är också möjligt att andra ännu inte beskrivna tubulinopatimutationer orsakar cytoskelettsjukdomar i andra vävnader26, vilket också kan innebära tubulinanrikning.
När det gäller andra möjliga tillämpningar kan SHG-mikroskopi utvidgas till studier av svagare signaler, som de som finns i tubulinnormal vävnad, i fina, dissocierade axoner eller i intracellulära buntar med blandad polaritet. För att göra det kan inställningsändringar, såsom ersättning av luftkondensorn med en med högre numerisk bländare och / eller med nedsänkning eller användning av en mer känslig detektor, göra en viktig skillnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) genom följande bidrag: infraestructura 226450 till VP-CIO, infraestructura 255277 till V.P. och FORDECYT-PRONACES/194171/2020 till V.H. Vi erkänner stödet från Juvenal Hernández Guevara på CIO i videoskapandet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 405/10 nm BrightLine(R) single-band bandpass filter | Semrock | FF01-405/10-25 | 32 mm diameter, with housing ring |
| Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric | Thorlabs | BK5 | 5' x 9' (1.5 m x 2.7 m) x 0.005" (0.12 mm) Thick |
| Blades for vibratome | any commercial; e.g. Wilkinson Sword | Classic stainless steel double edge razor blades | |
| Cell culture dishes, 35 mm | any commercial; e.g. Falcon | 351008 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM710NLO AxioObserver Z1 | Inverted microscope, objective used is LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA |
| Cooler | any commercial | Any insulated, polystyrene box could work, to mantain the sample at about 37 °C | |
| Corn stach | e.g. Maizena | From the supermarket | |
| Coverslips #1.5 | any commercial | Rectangular | |
| Cyanoacrylate glue | e.g. Loctite | To glue the brain to the masking tape | |
| Fine forceps | fine science tools | 11412-11 | To manipulate tissue sections by handling from the meninges |
| Fine scissors | fine science tools | 14370-22 | To cut the skin |
| Fine scissors curved tip | fine science tools | 14061-09 | To cut along the midline |
| Formaldehyde 37% | Sigma-Aldrich | 252549 | To dilute 1:10 in PBS |
| Friedman Rongeur | fine science tools | 16000-14 | To cut the bone |
| Gel packs | any commercial | Prewarmed to 37 °C, to help mantaining the temperature inside the cooler | |
| Glass Pasteur pipette, modified | any commercial | To transfer the tissue section | |
| Hanks′ Balanced Salt solution (HBSS) | Gibco | 14025-076 | Could be prepared from powders |
| Kelly hemostats | fine science tools | 13018-14 | To separate the bone |
| Masking tape | any commercial | To protect th surface of the specimen plate | |
| NDD module, type C | Zeiss | 000000-1410-101 | To detect the signal, reducing light loss. Housing the 000000-1935-163 filter set with the SP485 |
| Offset bone nippers | fine science tools | 16101-10 | To cut the bone |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-031 | Could be prepared from powders or tabs |
| Pulsed laser | Coherent | Chameleon Vision II | 680–1080 nm tunable laser |
| Scalpel | any commercial | Straight blade with sharp point | |
| Standard pattern forceps | fine science tools | 11000-18 | |
| Vannas spring scissors | fine science tools | 15018-10 | To cut meninges that remain joined to both the slice obtained from vibratome cutting and the section glued to the specimen plate. |
| Vibratome | any commercial; e.g. Leica | VT1200 |
References
- Palmiter, R. D., et al. Cell lineage ablation in transgenic mice by cell-specific expression of a toxin gene. Cell. 50 (3), 435-443 (1987).
- Banerjee, A., et al. A monoclonal antibody against the type II isotype of beta-tubulin. Preparation of isotypically altered tubulin. The Journal of Biological Chemistry. 263 (6), 3029-3034 (1988).
- Banerjee, A., Roach, M. C., Trcka, P., Luduena, R. F. Preparation of a monoclonal antibody specific for the class IV isotype of beta-tubulin. Purification and assembly of alpha beta II, alpha beta III, and alpha beta IV tubulin dimers from bovine brain. The Journal of Biological Chemistry. 267 (8), 5625-5630 (1992).
- Banerjee, A., et al. Localization of βv tubulin in the cochlea and cultured cells with a novel monoclonal antibody. Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 505-514 (2008).
- Cross, A. R., Williams, R. C. Kinky microtubules: Bending and breaking induced by fixation in vitro with glutaraldehyde and formaldehyde. Cell Motility and the Cytoskeleton. 20 (4), 272-278 (1991).
- Van Steenbergen, V., et al. Molecular understanding of label-free second harmonic imaging of microtubules. Nature Communications. 10 (1), 3530 (2019).
- Campagnola, P. J., Clark, H. A., Mohler, W. A., Lewis, A., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy of living cells. Journal of Biomedical Optics. 6 (3), 277 (2001).
- Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
- Yu, C. -H., et al. Measuring microtubule polarity in spindles with second-harmonic generation. Biophysical Journal. 106 (8), 1578-1587 (2014).
- Bancelin, S., et al. Probing microtubules polarity in mitotic spindles in situ using Interferometric Second Harmonic Generation Microscopy. Scientific Reports. 7, 6758 (2017).
- Dombeck, D. A., et al. Uniform polarity microtubule assemblies imaged in native brain tissue by second-harmonic generation microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7081-7086 (2003).
- Psilodimitrakopoulos, S., et al. Estimation of the effective orientation of the SHG source in primary cortical neurons. Optics Express. 17 (16), 14418 (2009).
- Sharoukhov, D., Bucinca-Cupallari, F., Lim, H. Microtubule imaging reveals cytoskeletal deficit predisposing the retinal ganglion cell axons to atrophy in DBA/2J. Investigative Opthalmology & Visual Science. 59 (13), 5292 (2018).
- Alata, M., Piazza, V., Eguibar, J. R., Cortes, C., Hernandez, V. H. H-ABC tubulinopathy revealed by label-free second harmonic generation microscopy. Scientific Reports. 12, 14417 (2022).
- Duncan, I. D., Lunn, K. F., Holmgren, B., Urba-Holmgren, R., Brignolo-Holmes, L. The taiep rat: A myelin mutant with an associated oligodendrocyte microtubular defect. Journal of Neurocytology. 21 (12), 870-884 (1992).
- Duncan, I. D., et al. A mutation in the Tubb4a gene leads to microtubule accumulation with hypomyelination and demyelination: Tubb4a Mutation. Annals of Neurology. 81 (5), 690-702 (2017).
- Garduno-Robles, A., et al. MRI features in a rat model of H-ABC tubulinopathy. Frontiers in Neuroscience. 14, 555 (2020).
- Lopez-Juarez, A., et al.
- Alata, M., et al. Longitudinal evaluation of cerebellar signs of H-ABC tubulinopathy in a patient and in the taiep model. Frontiers in Neurology. 12, 702039 (2021).
- Parodi, V., et al. Nonlinear optical microscopy: From fundamentals to applications in live bioimaging. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 585363 (2020).
- Lefort, C. A review of biomedical multiphoton microscopy and its laser sources. Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (42), 423001 (2017).
- Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nature Biotechnology. 21 (11), 1356-1360 (2003).
- vander Knaap, M. S., et al. New syndrome characterized by hypomyelination with atrophy of the basal ganglia and cerebellum. American Journal of Neuroradiology. 23 (9), 1466 (2002).
- Stoller, P., Kim, B. -M., Rubenchik, A. M., Reiser, K. M., Da Silva, L. B. Polarization-dependent optical second-harmonic imaging of a rat-tail tendon. Journal of Biomedical Optics. 7 (2), 205 (2002).
- Brown, E. B., et al. In vivo measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy. Nature Medicine. 7 (7), 864-868 (2001).
- Chakraborti, S., Natarajan, K., Curiel, J., Janke, C., Liu, J. The emerging role of the tubulin code: From the tubulin molecule to neuronal function and disease. Cytoskeleton. 73 (10), 521-550 (2016).
