Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

אופטיקה לא ליניארית ללא תווית לחקר פגמים תלויי טובולין במיאלין המרכזי

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/63449
Automatic Translation
1, 1, 2, 3,4, 3
1Centro de Investigaciones en Óptica A.C. (CIO), 2Division of Sciences and Engineering, Department of Chemical, Electronic, and Biomedical Engineering, Universidad de Guanajuato, 3Institute of Physiology, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, 4Dirección General de Desarrollo Internacional, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla

Summary

במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי אוליגודנדרוציטים טעונים במיקרוטובולים במודל של טובולינופתיה באמצעות גישה פשוטה וחדשנית של מיקרוסקופיה הרמונית מהדור השני.

Abstract

ההדמיה המשביעת רצון של מרכיבים ציטוסקטליים במוח היא מאתגרת. ההתפלגות בכל מקום של רשתות של מיקרוטובולים, מיקרופילמנטים וחוטי ביניים בכל הרקמות העצביות, יחד עם השונות בתוצאות של אסטרטגיות היתוך חלבונים פלואורסצנטיים ויישומם המוגבל למחקרים דינמיים של נוגדנים ותרופות ככלי כרומופור, הופכים את הגישות האופטיות הקלאסיות ללא יעילות כמו עבור חלבונים אחרים. כאשר יש צורך לחקור טובולין, הדור ללא תווית של הרמוניות שניות הוא אופציה מתאימה מאוד בשל הארגון הלא צנטרוסימטרי של המולקולה. טכניקה זו, כאשר מצומדים למיקרוסקופיה, יכולה לתאר באופן איכותי את ההתפלגות הנפחית של צרורות מקבילים של מיקרוטובולים בדגימות ביולוגיות, עם היתרון הנוסף של עבודה עם רקמות טריות שאינן מסודרות ובלתי מנוצלות. עבודה זו מתארת כיצד לדמות טובולין עם מערך מיקרוסקופיה הרמוני מסחרי מהדור השני כדי להדגיש מיקרוטובולים במבנים המועשרים בטובולינים של האוליגודנדרוציטים, כמו בהיפומיאלינציה עם ניוון של הגרעינים הבסיסיים וטובולינופתיה של המוח הקטן (H-ABC), הפרעת מיאלין שתוארה לאחרונה.

Introduction

ההדמיה האופטית של מבנים ציטוסקטליים ברקמות ובהכנות איברים אינה משימה קלה. חוטים ציטוסקטליים נמצאים בכל מקום, כך שאם מבוצעת צביעה גנרית, למשל, נגד אלפא-טובולין או בטא-אקטין או אולי קרטין בדגימת אפיתל, סביר להניח שהאות יופץ בצורה הומוגנית למדי בכל רחבי הדגימה. כדי להגביל את הכתמים לתת-קבוצה משמעותית יותר של רכיבים תאיים, ניתן להשתמש בעכברים מהונדסים עם ביטוי ממוקד1 או לתכנן להשתמש בנוגדנים ספציפיים לאיזופורם. בעוד שמעט מאוד מהאחרונים נמצאים בשוק (ומעטים מאוד קיימים בכלל 2,3,4), מודל של בעלי חיים מהונדסים עשוי להיות זמין. עם זאת, הוא צריך להירכש על ידי המעבדה ולשכן אותו כראוי, עם כל ההוצאות הכרוכות בתהליך. נוגדנים או כימיקלים מסוימים, לדוגמה, תרופות מצומדות פלואורופור כמו פלואידין או פקליטקסל, עשויים להיות לא תואמים באופן חלקי או מלא לשימוש בתאים חיים או ברקמות, ובכך להגביל את תחולתם רק למחקרים של דגימות קבועות.

במקרה של טובולין, יש לקחת בחשבון היבט נוסף, שהוא הרגישות של הפולימר לקיבוע. קיבוע כימי קונבנציונלי עם פורמלדהיד ידוע בכך שאינו מספיק לשמירה אופטימלית על שלמות המיקרוטובולים5. בנוסף, דו"ח שפורסם לאחרונה מאשר כי הצלבת פורמלדהיד גורמת לשינויים עדינים במבנה האולטרה-מבנה של המיקרוטובול, בדומה למה שקורה עם קשירה של תרופות מסוימות או מולקולות פיזיולוגיות כגון GTP6.

ההדמיה הישירה של מיקרוטובולים בדגימות לא מוכתמות ולא מתוקנות היא, אם כן, רצויה לעתים קרובות. כדי להשיג זאת, פתרון טכני אחד הוא מיקרוסקופיה שנייה של הדור ההרמוני (SHG)7, המבוססת על היכולת של צרורות של מיקרוטובולים מקבילים לפעול כהרמונופורים ולפלוט אור כפול תדר כאשר הוא מואר כראוי בלייזר אינפרא אדום אינטנסיבי ופועם. למרות שניתן להפיק אות הרמוני שני חזק ויציב יותר מקולגן וממיוזין, שהם שני החומרים הביולוגיים האחרים היחידים הידועים כבעלי יכולת להכפיל תדרים, האות מטובולין שימש עד כה בעיקר לחקר סידור מחדש של צירים מיטוטיים 8,9,10 ומורפולוגיה של מיקרוטובולים אקסונאליים11,12,13.

בעבודה זו, אנו מציגים שימוש חדשני במיקרוסקופיית SHG ככלי אבחון להבחנה בין רקמות מערכת העצבים המרכזית (CNS) המושפעות מטובולין בטא 4 A (TUBB4A) טובולינופתיה לבין עמיתיהן הבריאים14. חלק מהמוטציות המתרחשות באיזופורם העצבי הזה של טובולין, כמו אלה הגורמות להיתמיאלינציה וניוון של הגרעינים הבסיסיים והמוח הקטן (H-ABC), גורמות למילוי יתר של מיקרוטובול באוליגודנדרוציטים15,16; השינויים הציטוסקטליים, בתורם, קשורים להשפעות במורד הזרם כמו דיסמיאלינציה, עם פגיעה עמוקה במסלולים המוטוריים והחושיים16,17,18,19. מודל הטייפ מורין המשמש בעבודה זו מציג תכולת מיקרוטובולים חריגה באוליגודנדרוציטים ומשחזר את רוב הסימפטומים החושיים-מוטוריים של חולי H-ABC17. הפרוטוקול מסביר כיצד לדמות מבנים כמו קורפוס קלוסום והמוח הקטן, שהם בדרך כלל מאוד מיאלינים ואשר מושפעים קשות בחולים אנושיים, כמו גם בחולדה taiep 19, כדי להדגיש את ההבדלים באותות SH בין רקמות בריאות ומוטנטיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים המתוארים נעשו בהתאם לחוקים ולקודים שאושרו בכותרת השביעית של תקנת חוק הבריאות הכללי בנוגע למחקר בריאותי של ממשלת מקסיקו (NOM-062-ZOO-1999) ובהתאם להמלצות מדריך המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בחיות ניסוי ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לביואתיקה במחקר של אוניברסיטת גואנחואטו ובנמריטה אוניברסידד אוטונומה דה פואבלה.

1. הגדרות מיקרוסקופ

  1. הפעל את מערכת המיקרוסקופיה.
  2. הפעל את הלייזר הפועם כדי להבטיח שהוא יהיה מוכן ללזיה ברמת הספק אופטימלית ויציבה לאחר מיצוי הדגימה והכנתה.
  3. כוונן את הלייזר ל-810 ננומטר. כדי ללמוד microtubules tissular, 10%-20% של כוח הלייזר הזמין משמש, אשר, במערכת המתוארת, מתאים 13-26 mW נמדד במישור המוקד האחורי של המטרה.
  4. ודא שהמיקרוסקופ מיושר על ידי Köhler (קובץ משלים 1), במטרה שתשמש להדמיית SHG.
    הערה: זה חשוב מכיוון שבמערך המסחרי המשמש בעבודה זו, הזיהוי מתבצע במצב שידור ודרך המעבה.
  5. הסר מסננים לא רצויים מנתיב הגילוי האופטי (איור 1A).
  6. ודא שדיאפרגמה המעבה פתוחה במלואה כדי להבטיח שאף אור לא ייעצר שלא לצורך ברמה זו.
  7. הכינו יעד טבילת שמן עם מפתח צמצם מספרי (NA) של 25x/0.8 עם טיפה קטנה של שמן טבילה בעדשה.
    הערה: מטרה זו שימשה כדי להתאים בצורה הטובה ביותר את המעבה NA, שהיה 0.55 (באופן אידיאלי,NA cond≥NA obj).

2. בקרות ראשוניות במיקרוסקופ

הערה: בצע את פקדי המיקרוסקופ הראשוניים פעם אחת, אלא אם כן ההתקנה תשתנה.

  1. תמונה עמילן תירס יבש דחוק בין שקופיות זכוכית עם פרמטרים SHG כדי ליצור תמונות SHG החושפות את כיוון קיטוב הלייזר. בצע את השלבים המדווחים בקובץ משלים 2, למעט עוצמת הלייזר, שהיא פחות מ-5% עבור עמילן תירס.
  2. צלם תמונה אחת של גרגרי עמילן תירס דלילים, וסמן את הכיוון של אונות SHG במישור x-y. כיוון זה מתאים לכיוון הלייזר (איור 2A).
  3. כבקרה, צלם תמונה נוספת של אותה דגימה, והכנס לנתיב האופטי לוח חצי גל (מיקום המוצג באיור 1A) כדי לשנות את כיוון התנודה של הלייזר. התמונה המתקבלת מציגה אונות אות SHG מסובבות (איור 2B, C).
  4. אם אתם משתמשים בסוג אחר של מסנן פסים עבור SHG, ודאו שיש לו תכונות שידור אופטימליות על-ידי השוואת התמונות (איור 2D, E) ועוצמות האות פיקסל אחר פיקסל לאורך סריקת קו (איור 2F).

3. מיצוי רקמות

הערה: השתמש תמיד בכלים נקיים לביצוע ההליכים הכירורגיים.

  1. השתמשו בחולדות טאייפ בנות 6-12 חודשים ובבקרות Sprague-Dawley (WT) תואמות גיל.
  2. הרדימו את בעלי החיים בהזרקת i.p. של תערובת קטמין-קסילזין (0.125 מ"ג/ק"ג ו-5 מ"ג/ק"ג) מדוללת בתמיסת NaCl סטרילית של 0.9%.
    1. בדוק את רפלקסי הכאב, ולהמשיך רק אם הם נעדרים.
  3. להקריב את החיה באמצעות עריפת ראשים.
  4. לאחר בידוד הראש, פתחו בזהירות את עצמות קמרון הגולגולת לאורך קו האמצע, החל מהנקודה הקאודלית ביותר בחלק העליון לכיוון האף, מחללי המסלול לכיוון קו האמצע, ולאחר מכן מהנקודה הקאודלית ביותר אל מתחת למוח ולמוח הקטן.
    הערה: חותכי עצם ורונג'ורס מאפשרים הסרה נכונה של עצמות הראש מבלי לפגוע במבני המוח.
  5. שחררו את המוח ואת המוח הקטן מהעצם. ניתן היה להפריד בין שתי ההמיספרות. אם חצאי הכדור מחולקים, השתמשו בחצי אחד להדמיית SHG, וקבעו את החצי השני ב-3.7% פרפורמלדהיד בתמיסת מלח עם פוספט (PBS) למשך 20 דקות בתוך מכסה מנוע כימי לחיתוך והכתמה הבאים.

4. חתך ויברטום

  1. הכינו מגש חיץ רטט מלא בתמיסת מלח מאוזנת חמה (37 מעלות צלזיוס) של האנק (HBSS).
  2. הצמידו את המוח לצלחת הדגימה באמצעות דבק ציאנואקרילט באמצעות פיסת סרט מיסוך. החלק/האזור הקאודלי ביותר יוצר קשר עם הדבק כך שניתן לחתוך את החלקים הקורונליים השמישים מהחלק ההפוך, הרוסטרלי.
    1. אפשר ~ 10 s עבור הדבק כדי להתפלמר כדי לקבל חיבור יעיל של הדגימה.
      הערה: התוצאות הטובות ביותר מתקבלות כאשר המוח מכוון כך שהלהב חותך "מלמעלה למטה" ולא "מצד לצד" (איור 1B).
  3. העבירו את לוחית הדגימה לתמיכה המגנטית שלה בתוך מגש החיץ.
  4. התחילו לחתוך חתכים של 300-500 מיקרומטר עד שהפרוסות המיוצרות יקיפו את כל פני השטח של המוח.
  5. בשלב זה, להקטין את עובי הקטע ל 160 מיקרומטר.
  6. לאחר שחתך שלם של 160 מיקרומטר נחתך ברמה של קורפוס קלוסום, שחזר אותו עם פיפטה פסטר מזכוכית מותאמת עם פתח גדול ובוער (איור 1C).
  7. העבירו אותו לצלחת פטרי נקייה עם HBSS חדש וחם או ישירות על תמיכת הזכוכית למיקרוסקופיה (כיסוי או צלחת תחתית זכוכית).
    הערה: עבור תנאי הניסוי המתוארים, הוספת כיסוי מעל הדגימה מזיקה להדמיה.

5. העברה למיקרוסקופ

  1. אם המיקרוסקופ נמצא בחדר אחר, הכינו קופסה מבודדת עם חבילות ג'ל מחוממות להעברת חלקי הרקמה תוך שמירה על הטמפרטורה. הקופסה משמשת גם כדי לשמור על חום החלקים עד שהם מצולמים.
  2. שים את הדגימה מתחת למיקרוסקופ, וודא שהיא ממוקמת כראוי מתחת למטרה על ידי תצפית ישירה דרך העיניים עם האור המועבר.
    הערה: המטרה היא ליישר את המבנים הפולטים החזויים עם כיוון התנודה של הלייזר כדי למקסם את אות ה- SHG הנפלט (ולכן זוהה).
  3. הסר את עודף HBSS כך שסרט נוזלי דק יכסה את כל הדגימה. בדוק חזותית את הסרט הנוזלי כל כמה דקות כדי למנוע אידוי יתר וייבוש של הדגימה.
    הערה: בתנאים המתוארים, נעשה שימוש בקטע למשך לא יותר מ-20 דקות. ייבוש הדגימה גורם להשפעות ארטיפקטיות דרסטיות (איור משלים 1A). במקום להוסיף עוד HBSS, מומלץ להשרות את החתך במדיום חם וטרי אם יש צורך בזמני הדמיה ארוכים יותר. השימוש בתאי זלוף ודבק או אגרוז נמס נמוך כדי לשתק את הרקמה מומלץ גם כאשר יש לבצע ניסויים ארוכים יותר.
  4. הכינו את שלב המיקרוסקופ להדמיה לא מיואשת, שעשויה לכלול סגירה של כל הדלתות של תא הדגירה הכהה או כיסוי תא הדגירה בבד מצופה פוליאוריתן ניילון שחור.

6. הדמיה

  1. בחר את מצב ההדמיה "non-descanned" לאורך נתיב השידור. בדרך זו, לכידת אות SH חלש של טובולין יהיה מותאם.
  2. בחר את המטרה LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA.
  3. הגדר עוצמת לייזר בין 13 mW ל- 26 mW, עם זמן שהייה של פיקסל של 12.6 μs. צלם תמונות בגודל שאינו עולה על 512 פיקסלים x 512 פיקסלים, עם מהירות 5 וממוצע של 2, לזמן רכישה ממוצע של כ-15 שניות.
    הערה: שימוש בעוצמות לייזר גבוהות יותר ו/או זמני שהייה ארוכים יותר עלולים לגרום נזק לדגימה (איור משלים 1B).
  4. צלם תמונות תחילה באמצעות מסנן פס קצר של 485 ננומטר (SP485), ובשלב שני, הוסף מסנן פס פס חד של 405 ננומטר (BP405; איור 3). בצע את השלבים המדווחים בקובץ משלים 2.
    הערה: ניתן לצלם תמונות שדה פסאודו-בהירות דרך אותו גלאי באמצעות אור הלייזר השיורי של קו נראה לעין (לייזרים של 405 ננומטר או 488 ננומטר פועלים בצורה הטובה ביותר).

7. עיבוד המוח הקטן

  1. ראשית, לחתוך את המוח הקטן עם אזמל לשני חצאי כדור, ולאחר מכן להדביק אותם לתמיכה ויברטום על ידי החלק האמצעי (החלק השטוח המתקבל לאחר חיתוך).
  2. חתך ותמונה של המוח הקטן באותו אופן כפי שתואר עבור המוח (160 מיקרומטר מקטעים, אותן הגדרות ויברטום, אותו להב, אותן הגדרות מיקרוסקופ וכו ').
    הערה: בשל האנטומיה של המוח הקטן, האוריינטציה שלו ברגע החתך אינה קריטית; ברוב הפרוסות הנוצרות מפני השטח, תהיה פוליה חתוכה היטב לתוך החומר הלבן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

לתמונות המתקבלות במתודולוגיה זו יש רמת רקע נמוכה מהותית בשל המספר המצומצם מאוד של הרמונופורים הקיימים ברקמות ביולוגיות, וזה אחד היתרונות המשמעותיים של השיטה.

כאשר מדמיינים את הסיבים של קורפוס קלוסום, מבנים קצרים דמויי סיבים ואלמנטים מעוגלים יכולים להימצא באופן עקבי במוח הטאייפ (איור 3B), בעוד שהקורפוס קלוסום של מוח הבקרה מראה אות הרבה יותר הטרוגני ואיזוטרופי בכל אזור המוח (איור 3A). מקורו של האות הדיפרנציאלי טמון באופן ספציפי בתופעת הדור ההרמוני השני, מאחר שהוספת מסנן פס הפס הצר רק מקטינה את עוצמת האות הלא ספציפי מתמונות הבקרה (איור 3C-D) תוך הסרה סלקטיבית של האות הנמוך והמפוזר הזה מסביב למבנים דמויי סומה והמבנים הקצרים והמוארכים בתמונות הטאייפ, שתמיד מייצרים אור SH עז (איור 3E-F).

המבנה האחר שנותח, החומר הלבן של המוח הקטן, נותן תוצאות דומות. באופן ספציפי, בעוד שברקמת הבקרה יש היעדר כמעט מוחלט של אות SH (איור 4B), ותאי Purkinje בקושי נראים כאשר משתמשים במסנן המעבר הקצר, המבנים המוארכים והמעוגלים נשארים בתמונת SH מרקמת הטאייפ (איור 4D).

Figure 1
איור 1: מיקרוסקופ וחתך . (A) סכמת המיקרוסקופ שבה נעשה שימוש, עם מרכיבים רלוונטיים מודגשים. חצים: 1 = יציאת NDD שבה SP485 ממוקם קרוב לגלאי; 2 = מסגרות נשלפות שבהן ממוקם BP405; 3 = מיקום מתחת למטרה שבה צלחת חצי הגל (HWP) ממוקמת לניסויי בקרה. הכניסה מציגה את המסגרת שבה ניתן להוסיף את HWP. (B) מבט מלמעלה על מגש חיץ הוויברטום עם המוח המודבק מוכן לחתך עדין. (C) פיפטה פסטר המקורית (העליונה) והמתוקנת (התחתונה) ששימשה להעברת החלקים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: בקרות ראשוניות. (A) אות SHG הנפלט מגרגירי עמילן תירס מראה כיוון דומיננטי החופף לכיוון התנודה של הלייזר (אופקי במקרה זה). (B) לאחר הכנסת לוחית חצי גל כאשר הציר המהיר שלה מכוון ב-45° ביחס לאופקי, האות מסובב ב-90°. (C) מיזוג האות לפני ואחרי הכנסת לוחית חצי הגל. (D) האות מתחת ל-485 ננומטר הנפלט מגרגירי עמילן התירס. (E) אות SHG מגרגירי העמילן שזוהה ב-405/10 ננומטר. (F) גרף המציג השוואה בין שני האותות המתאימים לסריקות הקווים המוצגות בתוספות המוגדלות של D ו-E. מסנן SHG שבו נעשה שימוש גורם לאובדן אות זניח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: תמונות SHG מ-taiep ו-WT corpus callosum. דוגמאות מייצגות של (A) WT ו- (B) אותות taiep המתקבלים מקורפוס קלוסום. (C) SP485 תמונה מסוננת מתוך קורפוס WT callosum. (D) תמונה מסוננת BP405 מאותה דגימה כמו ב- C. (E) SP485 תמונה מסוננת מתוך taiep corpus callosum. (F) תמונה מסוננת BP405 של אותה דגימה כמו ב- E. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: תמונות SHG מהמוח הקטן טאייפ ו-WT. דוגמאות מייצגות של (A-B) WT ו-(C-D) אותות taiep המתקבלים מפוליה המוח הקטן. (A) תמונה מסוננת SP485 מפוליום WT; רק חלק מתאי Purkinje נראים לעין. (B) תמונה מסוננת מסוג BP405 מאותה דגימה כמו ב-A. (C) תמונה מסוננת SP485 מתוך פוליום טאייפ. (D) תמונה מסוננת BP405 של אותה דגימה כמו ב-C. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור משלים 1: דוגמאות לממצאים. (א) חפץ עקב ייבוש הדגימה. (ב) חפץ עקב חשיפה מוגזמת. סרגלי קנה מידה: 30 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 1: יישור קוהלר. הקובץ מציג את השלבים לביצוע יישור Köhler. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 2: שלבי תוכנת ZEN לרכישת תמונות SHG. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מיקרוסקופיית SHG היא חלק מקבוצה של טכניקות אופטיקה לא ליניאריות, הכוללות מיקרוסקופיית עירור של שני פוטונים, מיקרוסקופיה של הדור ההרמוני השלישי ומיקרוסקופיית פיזור קוהרנטית נגד סטוקס ראמאן, שתרמו להרחבת מגוון היישומים של מיקרוסקופיה אופטית קונבנציונלית למדעי החיים20.

באופן ספציפי, הכוח והחולשה העיקריים של מיקרוסקופיה SHG מתייחסים לאותו מצב: מחולל האותות אינו צנטרוסימטרי21. מצב אדריכלי ספציפי כזה נמצא לעתים קרובות בתחום הגבישים האנאורגניים והאורגניים, אך הוא נדיר בקרב עצמים ביולוגיים. יחד עם קולגן ומיוזין שרירי, microtubules מסוגלים ליצור אות הרמוני שני22, אשר ניתן לזהות עם מיקרוסקופ אם מספיק סיכום מתרחשת צרורות של פולימרים מקבילים. בתוך התאים, טובולין מקשר ליצירת צרורות מקבילים בליבות של אקסונים (מיקום ספציפי לסוג התא), בצירים מיטוטיים (התפלגות ספציפית לטמפורלית), וכפי שהוצג בעבודה זו, באיגוד המיקרוטובולים המסחרי של טובולינופתיה-היפומיאלינציה שתוארה לאחרונה עם ניוון של הגרעינים הבסיסיים והמוח הקטן, או H-ABC (המייצג את ההתפלגות הפתולוגית המדווחת הראשונה מסוג זה)14, 16,23.

תסמונת חושית-מוטורית זו היא עדיין מחלה יתומה, שכן נוירולוגים רבים עדיין אינם מכירים את כל הסימפטומים ו/או אינם יכולים להרשות לעצמם בדיקה גנטית של חולים חשודים כדי לאשר את האבחנה, מה שככל הנראה גורם לתת-אבחון, לפחות בחלק מהאוכלוסיות. נוסף על כך, לא הרבה ידוע על הפתולוגיה ברמה המולקולרית והתאית, ולכן הטכניקות שיכולות לעזור לשפוך אור על המנגנונים הספציפיים של תהליך ניווני זה הן בעלות ערך רב, גם ברמה הבסיסית.

לכן, מוצעים שני שימושים במיקרוסקופיה SHG בנוגע להפרעת מיאלין זו. בטווח הארוך, מיקרוסקופיית SHG יכולה להיות משולבת בגישות אבחון לבדיקת ביופסיה או ניתוח תוך גולגולתי ישיר, אך ההשפעה הגדולה ביותר יכולה להיות קשורה לניסיון לפענח את הבסיס המולקולרי של המחלה.

ישנם יתרונות רבים של מיקרוסקופיית SHG על פני טכניקות מיקרוסקופיה אחרות. ואכן, מיקרוסקופיית SHG אינה דורשת קיבוע של הרקמה, שהיא צעד עדין במיוחד של הכנת הדגימה במקרה של microtubules, ואינו דורש צביעה מכל סוג שהוא. היתרון הגדול ביותר קשור לתופעה הפיזיקלית המעורבת. מצד אחד, בשל הרקע הנעדר כמעט, הוא מספק ניגודיות גבוהה למרות האותות החלשים שנוצרים, ומצד שני, מכיוון שעוצמות האור הדרושות להכפלת התדרים גבוהות מאוד ועוצמות אלה מתקיימות רק בנפח מוגבל מאוד של הדגימה, הטכניקה מספקת חתך אופטי פנימי, ובכך מאפשרת שחזורים תלת-ממדיים.

המגבלות העיקריות של טכניקת מיקרוסקופיה זו קשורות לעלות הציוד. מיקרוסקופ קונפוקלי טוב, יחד עם לייזר אינפרה-אדום (IR) פועם, נחוץ ליישום זה, ולמרות שמערכת עירור של שני פוטונים זמינה במעבדות רבות למדעי המוח, שניתן לשנות בקלות למערך SHG, ההבדל בעלות בהשוואה למערך אפיפלואורסצנטי קונבנציונלי עדיין משמעותי. בנוסף, כטכניקה מוגבלת עקיפה, הרזולוציה שלה מושפעת מהשימוש באור IR להארה.

כמו ביישומים חלוציים רבים, ההגדרות ששימשו לניסויים המוקדמים במיקרוסקופיית SHG שיושמה במדעי החיים היו מערכים אופטיים מותאמים אישית לחלוטין שנבנו כמערכות פתוחות 11,24,25, מה שנתן לנסיינים את האפשרות לייעל כל רכיב. מכיוון שבמעבדות למדעי החיים נפוץ יותר לקבל גישה למערך מסחרי, רצינו לבדוק אם אחת מהמערכות האלה רגישה מספיק כדי לזהות את האות החלש הנפלט על ידי צרורות מיקרוטובולים טיסולריים, שידוע כי אינם הרמונופורים חזקים כמו קולגן. מערכת LSM710 NLO מבית Zeiss מורכבת ממיקרוסקופ קונפוקלי הפוך עם מודולים לגילוי לא מסולף במצב שידור ו"אפי" ועם לייזר IR קוהרנטי Chameleon הניתן לכוונון. בשל האופי הקוהרנטי של תופעת SHG, חיוני לבחור את נתיב השידור כדי למקסם את איסוף האור המוכפל בתדר מהמדגם, ולכן הגילוי בוצע באמצעות מעבה 0.55 NA על ידי אינטגרציה. מטרת טבילה של LCI Plan-Neofluar 25X/0.8 NA שימשה כדי להאיר את הדגימה מלמטה ולהעריך את NA המעבה. עם התנאים המתוארים במאמר זה, יכולנו לזהות באופן מהימן אות מהרקמה הנושאת את המוטציה TUBB4A, ואות זה תמיד נעדר בבקרות.

בפרוטוקול המדווח, שני שלבים דרשו התאמות כדי להשיג את תנאי ההדמיה הטובים ביותר: עובי חתך הרקמה ופתיחת דיאפרגמת המעבה. המקטעים צריכים להיות דקים ככל האפשר כדי למנוע ספיגה מוגזמת, פיזור ואובדן של פוטונים SH, במיוחד מכיוון שהמטרה היא לצלם בהעברה בשל האופי הקוהרנטי של התופעה הפיזיקלית. במקרה שלנו, הגורם המגביל היה עקביות של רקמת taiep , אשר הפריע חתך בקטעים עבים הומוגניים מתחת 160-180 מיקרומטר. עם יישור Köhler הקונבנציונלי, דיאפרגמה המעבה סגורה בדרך כלל לכ-60% משטחה כדי ליצור ניגודיות בתמונת האור המועברת; לעומת זאת, עבור יישום זה, המטרה היא לאסוף כמה שיותר פוטונים, ומכאן הפתיחה הכוללת של הסרעפת.

יישום זה של מיקרוסקופיית SHG חשוב מכיוון שהוא מספק את האפשרות להבחין ברקמה עשירה בטובולינים לעומת רקמה נורמלית של טובולין, כאשר הרקמה העשירה בטובולינים פולטת אות הניתן לזיהוי. ייתכן גם שמוטציות אחרות של טובולינופתיה שטרם תוארו גורמות להפרעות ציטוסקטליות ברקמות אחרות26, שעשויות לכלול גם העשרת טובולין.

במונחים של יישומים אפשריים אחרים, ניתן להרחיב את המיקרוסקופיה של SHG לחקר אותות חלשים יותר, כמו אלה הנמצאים ברקמה נורמלית של טובולין, באקסונים עדינים ומנותקים, או בצרורות תוך-תאיים עם קוטביות מעורבת. לשם כך, שינויי התקנה, כגון החלפת מעבה האוויר במעבה אוויר עם מפתח צמצם מספרי גבוה יותר ו/או טבילה או שימוש בגלאי רגיש יותר, יכולים לעשות הבדל חשוב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) באמצעות המענקים הבאים: infraestructura 226450 ל- VP-CIO, infraestructura 255277 ל- V.P., ו- FORDECYT-PRONACES/194171/2020 ל- V.H. אנו מכירים בתמיכתו של יובנאל הרננדס גווארה במנמ"ר בהפקת הסרטונים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
405/10 nm BrightLine(R) single-band bandpass filter  Semrock FF01-405/10-25 32 mm diameter, with housing ring
Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric Thorlabs BK5 5' x 9' (1.5 m x 2.7 m) x 0.005" (0.12 mm) Thick 
Blades for vibratome any commercial; e.g. Wilkinson Sword  Classic stainless steel double edge razor blades
Cell culture dishes, 35 mm any commercial; e.g. Falcon 351008
Confocal microscope Zeiss LSM710NLO AxioObserver Z1 Inverted microscope, objective used is LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA 
Cooler any commercial Any insulated, polystyrene box could work, to mantain the sample at about 37 °C
Corn stach e.g. Maizena From the supermarket
Coverslips #1.5 any commercial Rectangular
Cyanoacrylate glue e.g. Loctite To glue the brain to the masking tape
Fine forceps fine science tools 11412-11 To manipulate tissue sections by handling from the meninges
Fine scissors fine science tools 14370-22 To cut the skin 
Fine scissors curved tip fine science tools 14061-09 To cut along the midline
Formaldehyde 37% Sigma-Aldrich 252549 To dilute 1:10 in PBS
Friedman Rongeur fine science tools 16000-14 To cut the bone
Gel packs any commercial Prewarmed to 37 °C, to help mantaining the temperature inside the cooler
Glass Pasteur pipette, modified any commercial To transfer the tissue section
Hanks′ Balanced Salt solution (HBSS) Gibco 14025-076 Could be prepared from powders
Kelly hemostats fine science tools 13018-14 To separate the bone 
Masking tape any commercial To protect th surface of the specimen plate
NDD module, type C Zeiss 000000-1410-101 To detect the signal, reducing light loss. Housing the 000000-1935-163 filter set with the SP485
Offset bone nippers fine science tools 16101-10 To cut the bone
Phosphate buffered saline (PBS) Gibco 10010-031 Could be prepared from powders or tabs
Pulsed laser Coherent Chameleon Vision II 680–1080 nm tunable laser
Scalpel any commercial Straight blade with sharp point
Standard pattern forceps fine science tools 11000-18
Vannas spring scissors fine science tools 15018-10 To cut meninges that remain joined to both the slice obtained from vibratome cutting and the section glued to the specimen plate.
Vibratome any commercial; e.g. Leica VT1200

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Palmiter, R. D., et al. Cell lineage ablation in transgenic mice by cell-specific expression of a toxin gene. Cell. 50 (3), 435-443 (1987).
  2. Banerjee, A., et al. A monoclonal antibody against the type II isotype of beta-tubulin. Preparation of isotypically altered tubulin. The Journal of Biological Chemistry. 263 (6), 3029-3034 (1988).
  3. Banerjee, A., Roach, M. C., Trcka, P., Luduena, R. F. Preparation of a monoclonal antibody specific for the class IV isotype of beta-tubulin. Purification and assembly of alpha beta II, alpha beta III, and alpha beta IV tubulin dimers from bovine brain. The Journal of Biological Chemistry. 267 (8), 5625-5630 (1992).
  4. Banerjee, A., et al. Localization of βv tubulin in the cochlea and cultured cells with a novel monoclonal antibody. Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 505-514 (2008).
  5. Cross, A. R., Williams, R. C. Kinky microtubules: Bending and breaking induced by fixation in vitro with glutaraldehyde and formaldehyde. Cell Motility and the Cytoskeleton. 20 (4), 272-278 (1991).
  6. Van Steenbergen, V., et al. Molecular understanding of label-free second harmonic imaging of microtubules. Nature Communications. 10 (1), 3530 (2019).
  7. Campagnola, P. J., Clark, H. A., Mohler, W. A., Lewis, A., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy of living cells. Journal of Biomedical Optics. 6 (3), 277 (2001).
  8. Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
  9. Yu, C. -H., et al. Measuring microtubule polarity in spindles with second-harmonic generation. Biophysical Journal. 106 (8), 1578-1587 (2014).
  10. Bancelin, S., et al. Probing microtubules polarity in mitotic spindles in situ using Interferometric Second Harmonic Generation Microscopy. Scientific Reports. 7, 6758 (2017).
  11. Dombeck, D. A., et al. Uniform polarity microtubule assemblies imaged in native brain tissue by second-harmonic generation microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7081-7086 (2003).
  12. Psilodimitrakopoulos, S., et al. Estimation of the effective orientation of the SHG source in primary cortical neurons. Optics Express. 17 (16), 14418 (2009).
  13. Sharoukhov, D., Bucinca-Cupallari, F., Lim, H. Microtubule imaging reveals cytoskeletal deficit predisposing the retinal ganglion cell axons to atrophy in DBA/2J. Investigative Opthalmology & Visual Science. 59 (13), 5292 (2018).
  14. Alata, M., Piazza, V., Eguibar, J. R., Cortes, C., Hernandez, V. H. H-ABC tubulinopathy revealed by label-free second harmonic generation microscopy. Scientific Reports. 12, 14417 (2022).
  15. Duncan, I. D., Lunn, K. F., Holmgren, B., Urba-Holmgren, R., Brignolo-Holmes, L. The taiep rat: A myelin mutant with an associated oligodendrocyte microtubular defect. Journal of Neurocytology. 21 (12), 870-884 (1992).
  16. Duncan, I. D., et al. A mutation in the Tubb4a gene leads to microtubule accumulation with hypomyelination and demyelination: Tubb4a Mutation. Annals of Neurology. 81 (5), 690-702 (2017).
  17. Garduno-Robles, A., et al. MRI features in a rat model of H-ABC tubulinopathy. Frontiers in Neuroscience. 14, 555 (2020).
  18. Lopez-Juarez, A., et al. Auditory impairment in H-ABC tubulinopathy. Journal of Comparative Neurology. 529 (5), 957-968 (2021).
  19. Alata, M., et al. Longitudinal evaluation of cerebellar signs of H-ABC tubulinopathy in a patient and in the taiep model. Frontiers in Neurology. 12, 702039 (2021).
  20. Parodi, V., et al. Nonlinear optical microscopy: From fundamentals to applications in live bioimaging. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 585363 (2020).
  21. Lefort, C. A review of biomedical multiphoton microscopy and its laser sources. Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (42), 423001 (2017).
  22. Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nature Biotechnology. 21 (11), 1356-1360 (2003).
  23. vander Knaap, M. S., et al. New syndrome characterized by hypomyelination with atrophy of the basal ganglia and cerebellum. American Journal of Neuroradiology. 23 (9), 1466 (2002).
  24. Stoller, P., Kim, B. -M., Rubenchik, A. M., Reiser, K. M., Da Silva, L. B. Polarization-dependent optical second-harmonic imaging of a rat-tail tendon. Journal of Biomedical Optics. 7 (2), 205 (2002).
  25. Brown, E. B., et al. In vivo measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy. Nature Medicine. 7 (7), 864-868 (2001).
  26. Chakraborti, S., Natarajan, K., Curiel, J., Janke, C., Liu, J. The emerging role of the tubulin code: From the tubulin molecule to neuronal function and disease. Cytoskeleton. 73 (10), 521-550 (2016).

Tags

מדעי המוח גיליון 193
אופטיקה לא ליניארית ללא תווית לחקר פגמים תלויי טובולין במיאלין המרכזי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Piazza, V., Alata, M., Hernandez, V. … More

Piazza, V., Alata, M., Hernandez, V. H., Eguibar, J. R., Cortes, C. Label-Free Non-Linear Optics for the Study of Tubulin-Dependent Defects in Central Myelin. J. Vis. Exp. (193), e63449, doi:10.3791/63449 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter