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Neuroscience

सेंट्रल माइलिन में ट्यूबुलिन-निर्भर दोषों के अध्ययन के लिए लेबल-मुक्त गैर-रैखिक प्रकाशिकी

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/63449
Automatic Translation
1, 1, 2, 3,4, 3
1Centro de Investigaciones en Óptica A.C. (CIO), 2Division of Sciences and Engineering, Department of Chemical, Electronic, and Biomedical Engineering, Universidad de Guanajuato, 3Institute of Physiology, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, 4Dirección General de Desarrollo Internacional, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla

Summary

इस लेख में, हम एक सरल, अभिनव दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण के माध्यम से ट्यूबुलिनोपैथी के एक मॉडल में सूक्ष्मनलिका-लोडेड ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

मस्तिष्क में साइटोस्केलेटल घटकों का संतोषजनक विज़ुअलाइज़ेशन चुनौतीपूर्ण है। सभी तंत्रिका ऊतकों में सूक्ष्मनलिकाएं, माइक्रोफिलामेंट्स और मध्यवर्ती फिलामेंट्स के नेटवर्क का सर्वव्यापी वितरण, फ्लोरोसेंट प्रोटीन संलयन रणनीतियों के परिणामों में परिवर्तनशीलता और क्रोमोफोर वाहनों के रूप में एंटीबॉडी और दवाओं के गतिशील अध्ययन के लिए उनकी सीमित प्रयोज्यता, शास्त्रीय ऑप्टिकल दृष्टिकोण को अन्य प्रोटीनों के रूप में प्रभावी नहीं बनाता है। जब ट्यूबुलिन का अध्ययन करने की आवश्यकता होती है, तो अणु के गैर-सेंट्रोसिमेट्रिक संगठन के कारण दूसरे हार्मोनिक्स की लेबल-मुक्त पीढ़ी एक बहुत ही उपयुक्त विकल्प है। यह तकनीक, जब माइक्रोस्कोपी से संयुग्मित होती है, तो जैविक नमूनों में सूक्ष्मनलिकाएं के समानांतर बंडलों के वॉल्यूमेट्रिक वितरण का गुणात्मक रूप से वर्णन कर सकती है, ताजा ऊतकों के साथ काम करने के अतिरिक्त लाभ के साथ जो अनिर्धारित और अप्रतिबंधित हैं। यह काम बताता है कि ओलिगोडेंड्रोसाइट्स की ट्यूबुलिन-समृद्ध संरचनाओं में सूक्ष्मनलिकाएं उजागर करने के लिए एक वाणिज्यिक दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी माइक्रोस्कोपी सेटअप के साथ ट्यूबुलिन की छवि कैसे बनाई जाए, जैसा कि बेसल गैन्ग्लिया और सेरिबैलम (एच-एबीसी) ट्यूबुलिनोपैथी के शोष के साथ हाइपोमाइलिनेशन में है, जो हाल ही में वर्णित माइलिन विकार है।

Introduction

ऊतकों और अंग तैयारी में साइटोस्केलेटल संरचनाओं की ऑप्टिकल इमेजिंग एक आसान काम नहीं है। साइटोस्केलेटल फिलामेंट्स सर्वव्यापी हैं, इसलिए यदि जेनेरिक धुंधलापन किया जाता है, उदाहरण के लिए, उपकला नमूने में अल्फा-ट्यूबुलिन या बीटा-एक्टिन या संभावित रूप से केराटिन के खिलाफ, संकेत संभवतः पूरे नमूने में सजातीय रूप से वितरित किया जाएगा। सेलुलर घटकों के अधिक सार्थक उप-समूह तक धुंधलापन को प्रतिबंधित करने के लिए, कोई या तो लक्षित अभिव्यक्ति1 के साथ ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग कर सकता है या आइसोफॉर्म-विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करने की योजना बना सकता है। जबकि उत्तरार्द्ध में से बहुत कम बाजार पर हैं (और बहुत कम 2,3,4 पर मौजूद हैं), एक ट्रांसजेनिक पशु मॉडल उपलब्ध हो सकता है। हालांकि, इसे प्रयोगशाला द्वारा अधिग्रहित करने और प्रक्रिया में शामिल सभी खर्चों के साथ ठीक से रखा जाना चाहिए। कुछ एंटीबॉडी या रसायन, उदाहरण के लिए, फ्लोरोफोरे-संयुग्मित दवाएं जैसे फैलोइडिन या पैक्लिटैक्सेल, जीवित कोशिकाओं या ऊतकों में उपयोग के साथ आंशिक रूप से या पूरी तरह से असंगत हो सकती हैं, इस प्रकार उनकी प्रयोज्यता को केवल निश्चित नमूनों के अध्ययन तक सीमित कर सकती हैं।

ट्यूबुलिन के मामले में, एक अतिरिक्त पहलू को ध्यान में रखा जाना चाहिए, जो निर्धारण के लिए बहुलक की संवेदनशीलता है। फॉर्मलाडेहाइड के साथ पारंपरिक रासायनिक निर्धारण सूक्ष्मनलिकाएं5 की अखंडता को बेहतर ढंग से संरक्षित करने के लिए पर्याप्त नहीं होने के लिए जाना जाता है। इसके अतिरिक्त, एक हालिया रिपोर्ट पुष्टि करती है कि फॉर्मलाडेहाइड क्रॉसलिंकिंग सूक्ष्मनलिका के अल्ट्रास्ट्रक्चर में सूक्ष्म परिवर्तन को प्रेरित करता है, जैसा कि जीटीपी6 जैसे कुछ दवाओं या शारीरिक अणुओं के बंधन के साथ होता है।

इसलिए, बिना दाग वाले, अनिर्धारित नमूनों में सूक्ष्मनलिकाएं का प्रत्यक्ष विज़ुअलाइज़ेशन अक्सर वांछनीय होता है। इसे प्राप्त करने के लिए, एक तकनीकी समाधान दूसरा हार्मोनिक जनरेशन (एसएचजी) माइक्रोस्कोपी7 है, जो समानांतर सूक्ष्मनलिकाएं के बंडलों की हार्मोनोफोर के रूप में कार्य करने और तीव्र, स्पंदित अवरक्त लेजर के साथ ठीक से रोशन होने पर आवृत्ति-दोगुना प्रकाश उत्सर्जित करने की क्षमता पर आधारित है। यद्यपि कोलेजन और मायोसिन से एक मजबूत और अधिक स्थिर दूसरा हार्मोनिक संकेत उत्पन्न किया जा सकता है, जो केवल दो अन्य जैविक सामग्री हैं जो आवृत्ति-दोहरीकरण में सक्षम होने के लिए जाने जाते हैं, ट्यूबुलिन से संकेत का उपयोग अब तक ज्यादातर माइटोटिक स्पिंडल पुनर्व्यवस्था 8,9,10 और अक्षीय सूक्ष्मनलिका आकृति विज्ञान 11,12,13 का अध्ययन करने के लिए किया गया है।

इस काम में, हम ट्यूबुलिन बीटा 4 ए (टीयूबी 4 ए) ट्यूबुलिनोपैथी से प्रभावित केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस)ऊतकों को उनके स्वस्थ समकक्षों से अलग करने के लिए एक नैदानिक उपकरण के रूप में एसएचजी माइक्रोस्कोपी का एक नया उपयोग पेश करते हैं। ट्यूबुलिन के इस मुख्य रूप से तंत्रिका आइसोफॉर्म में होने वाले कुछ उत्परिवर्तन, जैसे बेसल गैन्ग्लिया और सेरिबैलम (एच-एबीसी) के हाइपोमाइलिनेशन और शोष का कारण बनते हैं, ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स15,16 में सूक्ष्मनलिका ओवरफिलिंग को प्रेरित करते हैं; साइटोस्केलेटल परिवर्तन, बदले में, डिस्माइलिनेशन जैसे डाउनस्ट्रीम प्रभावों से जुड़े होते हैं, जिसमें मोटर और संवेदी मार्गों की गहरी हानि होती है 16,17,18,19. इस काम में उपयोग किया जाने वाला टाइप मुराइन मॉडल ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स में असामान्य सूक्ष्मनलिका सामग्री प्रदर्शित करता है और एच-एबीसी रोगियों के अधिकांश संवेदी-मोटर लक्षणों को पुन: उत्पन्न करताहै। प्रोटोकॉल बताता है कि कॉर्पस कॉलोसम और सेरिबैलम के रूप में संरचनाओं को कैसे चित्रित किया जाए, जो आमतौर पर अत्यधिक माइलिनेटेड होते हैं और जो मानव रोगियों के साथ-साथ ताइप चूहे19 में गंभीर रूप से प्रभावित होते हैं, स्वस्थ और उत्परिवर्ती ऊतकों के बीच एसएच संकेतों में अंतर को उजागर करने के लिए।

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Protocol

वर्णित सभी प्रक्रियाओं को मैक्सिकन सरकार के स्वास्थ्य अनुसंधान के संबंध में सामान्य स्वास्थ्य कानून के विनियमन के सातवें शीर्षक (एनओएम -062-ZOO-1999) में अनुमोदित कानूनों और कोडों के अनुपालन में और प्रायोगिक जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ गाइड की सिफारिशों के अनुसार किया गया था और यूनिवर्सिड डी गुआनाजुआटो और बेनेमेरिता यूनिवर्सिड औटोनोमा डी के अनुसंधान में बायोएथिक्स की संस्थागत समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। पुएब्ला।

1. माइक्रोस्कोप सेटिंग्स

  1. माइक्रोस्कोपी सिस्टम पर स्विच करें।
  2. यह सुनिश्चित करने के लिए स्पंदित लेजर चालू करें कि यह नमूना निष्कर्षण और तैयारी के बाद इष्टतम और स्थिर शक्ति स्तर पर ले जाने के लिए तैयार होगा।
  3. लेजर को 810 एनएम तक ट्यून करें। टिसुलर सूक्ष्मनलिकाएं का अध्ययन करने के लिए, उपलब्ध लेजर शक्ति का 10% -20% उपयोग किया जाता है, जो वर्णित प्रणाली में, उद्देश्य के पीछे फोकल प्लेन पर मापा गया 13-26 एमडब्ल्यू से मेल खाता है।
  4. सुनिश्चित करें कि माइक्रोस्कोप कोहलर-संरेखित (पूरक फ़ाइल 1) है, जिसका उद्देश्य एसएचजी इमेजिंग के लिए उपयोग किया जाएगा।
    नोट: यह महत्वपूर्ण है क्योंकि, इस काम में उपयोग किए जाने वाले वाणिज्यिक सेटअप में, डिटेक्शन ट्रांसमिशन मोड में और कंडेनसर के माध्यम से किया जाता है।
  5. ऑप्टिकल डिटेक्शन पथ (चित्रा 1 ए) से अवांछित फ़िल्टर निकालें।
  6. सुनिश्चित करें कि कंडेनसर डायाफ्राम पूरी तरह से खोला गया है ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि इस स्तर पर कोई प्रकाश अनावश्यक रूप से नहीं रोका जाता है।
  7. लेंस में विसर्जन तेल की एक छोटी बूंद के साथ 25x/ 0.8 संख्यात्मक एपर्चर (NA) तेल-विसर्जन उद्देश्य तैयार करें।
    नोट: इस उद्देश्य का उपयोग कंडेनसर एनए से सबसे अच्छा मिलान करने के लिए किया गया था, जो 0.55 था (आदर्श रूप से, एनएकॉन्ड≥ एनएओबीजे)।

2. माइक्रोस्कोप प्रारंभिक नियंत्रण

नोट: प्रारंभिक माइक्रोस्कोप नियंत्रण एक बार करें, जब तक कि सेटअप संशोधित न हो।

  1. लेजर ध्रुवीकरण दिशा को प्रकट करने वाले एसएचजी छवियों को उत्पन्न करने के लिए एसएचजी मापदंडों के साथ ग्लास स्लाइड के बीच सैंडविच की छवि शुष्क मकई स्टार्च। पूरक फ़ाइल 2 में बताए गए चरणों का पालन करें, लेजर पावर को छोड़कर, जो मकई स्टार्च के लिए 5% से कम है।
  2. विरल मकई स्टार्च अनाज की एक छवि लें, और एक्स-वाई विमान में एसएचजी लोब्यूल्स के अभिविन्यास को चिह्नित करें। यह अभिविन्यास लेजर अभिविन्यास (चित्रा 2 ए) से मेल खाती है।
  3. एक नियंत्रण के रूप में, एक ही नमूने की एक और छवि लें, लेजर की दोलन दिशा को बदलने के लिए ऑप्टिकल पथ में एक अर्ध-तरंग प्लेट ( चित्रा 1 ए में दिखाई गई स्थिति) डालें। परिणामी छवि घुमाए गए एसएचजी सिग्नल लोब्यूल्स (चित्रा 2 बी, सी) प्रदर्शित करती है।
  4. यदि एसएचजी के लिए एक अलग प्रकार के बैंडपास फिल्टर का उपयोग कर रहे हैं, तो सुनिश्चित करें कि इसमें लाइन-स्कैन (चित्रा 2 एफ) के साथ छवियों (चित्रा 2 डी, ई) और पिक्सेल द्वारा पिक्सेल द्वारा सिग्नल तीव्रता पिक्सेल की तुलना करके इष्टतम संचरण गुण हैं।

3. ऊतक निष्कर्षण

नोट: सर्जिकल प्रक्रियाओं को करने के लिए हमेशा साफ उपकरणों का उपयोग करें।

  1. 6-12 महीने के ताइप चूहों और उम्र से मेल खाने वाले स्प्राग-डॉवले नियंत्रण (डब्ल्यूटी) का उपयोग करें।
  2. 0.9% बाँझ NaCl घोल में पतला केटामाइन-ज़ाइलज़िन (0.125 मिलीग्राम / किग्रा और 5 मिलीग्राम / किग्रा) के मिश्रण के आईपी इंजेक्शन के साथ जानवरों को एनेस्थेटाइज करें।
    1. दर्द रिफ्लेक्सिस की जांच करें, और केवल तभी आगे बढ़ें जब वे अनुपस्थित हों।
  3. विक्षेपण के माध्यम से जानवर की बलि दें।
  4. एक बार जब सिर अलग हो जाता है, तो कपाल तिजोरी की हड्डियों को मध्य रेखा के साथ सावधानी से खोलें, नाक की ओर शीर्ष पर सबसे पुच्छल बिंदु से शुरू करें, कक्षीय गुहाओं से मध्य रेखा की ओर, और फिर सबसे पुच्छल बिंदु से मस्तिष्क और सेरिबैलम के नीचे तक।
    नोट: हड्डी कटर और रोंगेर्स मस्तिष्क संरचनाओं को नुकसान पहुंचाए बिना सिर की हड्डियों को उचित हटाने की अनुमति देते हैं।
  5. हड्डी से मस्तिष्क और सेरिबैलम को छोड़ दें। दोनों गोलार्द्धों को अलग किया जा सकता है। यदि गोलार्धों को विभाजित किया जाता है, तो एसएचजी इमेजिंग के लिए एक आधे हिस्से का उपयोग करें, और बाद में सेक्शनिंग और धुंधला होने के लिए रासायनिक हुड के अंदर 20 मिनट के लिए फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) में 3.7% पैराफॉर्मलडिहाइड में दूसरे आधे हिस्से को ठीक करें।

4. विब्राटोम सेक्शनिंग

  1. हैंक के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) से भरे एक विब्राटोम बफर ट्रे तैयार करें।
  2. मास्किंग टेप के एक टुकड़े के माध्यम से साइनोएक्रिलेट गोंद का उपयोग करके मस्तिष्क को नमूना प्लेट में ठीक करें। सबसे पुच्छल भाग / क्षेत्र गोंद से संपर्क करता है ताकि विपरीत, रोस्ट्रल भाग से उपयोग करने योग्य कोरोनल वर्गों को काटा जा सके।
    1. नमूने के प्रभावी लगाव को प्राप्त करने के लिए गोंद को बहुलक बनाने के लिए ~ 10 एस की अनुमति दें।
      नोट: सबसे अच्छे परिणाम तब प्राप्त होते हैं जब मस्तिष्क उन्मुख होता है ताकि ब्लेड "साइड से साइड" के बजाय "ऊपर से नीचे" कट जाए (चित्रा 1 बी)।
  3. नमूना प्लेट को बफर ट्रे के अंदर अपने चुंबकीय समर्थन पर स्थानांतरित करें।
  4. 300-500 μm वर्गों को काटना शुरू करें जब तक कि उत्पादित स्लाइस मस्तिष्क की पूरी सतह को कवर न करें।
  5. इस बिंदु पर, अनुभाग की मोटाई को 160 μm तक कम करें।
  6. एक बार कॉर्पस कॉलोसम के स्तर पर एक पूर्ण 160 μm अनुभाग काट दिया जाता है, तो इसे एक बड़े, लौदार छिद्र के साथ एक संशोधित ग्लास पाश्चर पिपेट के साथ पुनर्प्राप्त करें (चित्रा 1 सी)।
  7. इसे नए गर्म एचबीएसएस के साथ एक साफ पेट्री डिश में स्थानांतरित करें या माइक्रोस्कोपी (कवरस्लिप या ग्लास-बॉटम डिश) के लिए ग्लास सपोर्ट पर सीधे जाएं।
    नोट: वर्णित प्रयोगात्मक स्थितियों के लिए, नमूने के ऊपर एक कवरस्लिप जोड़ना इमेजिंग के लिए हानिकारक है।

5. माइक्रोस्कोप में स्थानांतरण

  1. यदि माइक्रोस्कोप एक अलग कमरे में है, तो तापमान बनाए रखते हुए ऊतक वर्गों को स्थानांतरित करने के लिए गर्म जेल पैक के साथ एक इंसुलेटेड बॉक्स तैयार करें। बॉक्स अनुभागों को तब तक गर्म रखने का भी कार्य करता है जब तक कि वे छवि न बना लें।
  2. माइक्रोस्कोप के नीचे नमूना रखें, और सुनिश्चित करें कि यह संचारित प्रकाश के साथ ओकुलर के माध्यम से प्रत्यक्ष अवलोकन द्वारा उद्देश्य के तहत ठीक से तैनात है।
    नोट: लक्ष्य उत्सर्जित (और इसलिए, पता लगाया गया) एसएचजी सिग्नल को अधिकतम करने के लिए लेजर की दोलन दिशा के साथ अनुमानित उत्सर्जक संरचनाओं को संरेखित करना है।
  3. अतिरिक्त एचबीएसएस को हटा दें ताकि एक पतली तरल फिल्म पूरे नमूने को कवर करे। नमूने के अत्यधिक वाष्पीकरण और सूखने से बचने के लिए हर कुछ मिनट में तरल फिल्म की नेत्रहीन जांच करें।
    नोट: वर्णित शर्तों में, एक अनुभाग का उपयोग 20 मिनट से अधिक के लिए नहीं किया जाता है। नमूने को सुखाने से कठोर कृत्रिम प्रभाव पड़ता है (पूरक चित्रा 1 ए)। अधिक एचबीएसएस जोड़ने के बजाय, यदि लंबे इमेजिंग समय की आवश्यकता होती है तो गर्म, ताजा माध्यम में अनुभाग को आवधिक भिगोने की सिफारिश की जाती है। ऊतक को गतिहीन करने के लिए छिड़काव कक्षों और गोंद या कम पिघलने वाले अगारोस के उपयोग की भी सिफारिश की जाती है जब लंबे प्रयोग किए जाने होते हैं।
  4. गैर-डिसकैंच्ड इमेजिंग के लिए माइक्रोस्कोप चरण तैयार करें, जिसमें अंधेरे इनक्यूबेशन कक्ष के सभी दरवाजों को बंद करना या काले नायलॉन पॉलीयुरेथेन-लेपित कपड़े के साथ इनक्यूबेशन कक्ष को कवर करना शामिल हो सकता है।

6. इमेजिंग

  1. ट्रांसमिशन पथ के साथ "गैर-डिसकैंटेड" इमेजिंग मोड का चयन करें। इस तरह, ट्यूबुलिन के कमजोर एसएच सिग्नल का कब्जा अनुकूलित किया जाएगा।
  2. एलसीआई प्लान-नियोफ्लुअर 25x/0.8 NA उद्देश्य का चयन करें।
  3. 13 mW और 26 mW के बीच एक लेजर पावर सेट करें, जिसमें 12.6 μ का पिक्सेल निवास समय हो। लगभग 15 सेकंड के औसत अधिग्रहण समय के लिए गति 5 और औसत 2 के साथ 512 पिक्सेल x 512 पिक्सेल से बड़ी छवियां लें।
    नोट: उच्च लेजर शक्तियों और / या लंबे समय तक रहने के समय का उपयोग करने से नमूना को नुकसान हो सकता है (पूरक चित्रा 1 बी)।
  4. पहले 485 एनएम शॉर्ट-पास फिल्टर (एसपी 485) का उपयोग करके छवियां लें, और, दूसरे चरण में, एक तेज 405 एनएम बैंडपास फ़िल्टर (बीपी 405; चित्र 3)। पूरक फ़ाइल 2 में बताए गए चरणों का पालन करें।
    नोट: छद्म-उज्ज्वल क्षेत्र छवियों को एक दृश्यमान रेखा के अवशिष्ट लेजर प्रकाश का उपयोग करके एक ही डिटेक्टर के माध्यम से लिया जा सकता है (405 एनएम या 488 एनएम लेजर सबसे अच्छा काम करते हैं)।

7. सेरिबैलम का प्रसंस्करण

  1. सबसे पहले, सेरिबैलम को एक स्केलपेल के साथ दो गोलार्धों में काटें, और फिर उन्हें मध्य भाग (काटने के बाद प्राप्त सपाट भाग) द्वारा विब्राटोम समर्थन से गोंद करें।
  2. अनुभाग और छवि सेरिबैलम को उसी तरह से वर्णित किया गया था जैसा कि मस्तिष्क के लिए वर्णित किया गया था (160 μm अनुभाग, एक ही विब्राटोम सेटिंग्स, एक ही ब्लेड, समान माइक्रोस्कोप सेटिंग्स, आदि)।
    नोट: सेरिबैलम की शारीरिक रचना के कारण, सेक्शनिंग के समय इसका अभिविन्यास महत्वपूर्ण नहीं है; सतह से दूर उत्पन्न अधिकांश स्लाइस में, फोलिया को सफेद पदार्थ में अच्छी तरह से विभाजित किया जाएगा।

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Representative Results

जैविक ऊतकों में मौजूद हार्मोनोफोर की बहुत सीमित संख्या के कारण इस पद्धति के साथ प्राप्त छवियों में आंतरिक निम्न पृष्ठभूमि स्तर है, जो विधि के महत्वपूर्ण लाभों में से एक है।

जब कॉर्पस कॉलोसम के तंतुओं को चित्रित किया जाता है, तो फाइबर जैसी छोटी संरचनाएं और गोल तत्व लगातार ताइप मस्तिष्क (चित्रा 3 बी) में पाए जा सकते हैं, जबकि नियंत्रण मस्तिष्क का कॉर्पस कॉलोसम पूरे मस्तिष्क क्षेत्र में बहुत अधिक विषम और आइसोट्रोपिक संकेत दिखाता है (चित्रा 3 ए)। विभेदक संकेत की उत्पत्ति विशेष रूप से दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी की घटना में निहित है, क्योंकि संकीर्ण बैंडपास फ़िल्टर को जोड़ने से केवल नियंत्रण छवियों (चित्रा 3 सी-डी) से गैर-विशिष्ट सिग्नल तीव्रता कम हो जाती है, जबकि चुनिंदा रूप से सोमा जैसी और टाइप छवियों में छोटी, लम्बी संरचनाओं के आसपास से इस कम, फैलाने वाले संकेत को हटा दिया जाता है, जो हमेशा तीव्र एसएच प्रकाश उत्पन्न करते हैं (चित्रा 3 ई-एफ)।

विश्लेषण की गई अन्य संरचना, अनुमस्तिष्क सफेद पदार्थ, तुलनीय परिणाम देता है। विशेष रूप से, जबकि नियंत्रण ऊतक में एसएच सिग्नल (चित्रा 4 बी) की लगभग पूरी अनुपस्थिति होती है, और शॉर्ट-पास फिल्टर का उपयोग करते समय पर्किंजे कोशिकाएं मुश्किल से दिखाई देती हैं, लंबी और गोल संरचनाएं टीएईपी ऊतक (चित्रा 4 डी) से एसएच छवि में बनी रहती हैं।

Figure 1
चित्र 1: माइक्रोस्कोप और सेक्शनिंग( ए) प्रासंगिक घटकों पर प्रकाश डालने के साथ माइक्रोस्कोप का योजनाबद्ध। तीर: 1 = एनडीडी पोर्ट जहां एसपी 485 डिटेक्टर के करीब स्थित है; 2 = हटाने योग्य फ्रेम जहां बीपी 405 रखा गया है; 3 = उद्देश्य के तहत स्थिति जहां नियंत्रण प्रयोगों के लिए हाफ-वेव प्लेट (एचडब्ल्यूपी) रखी गई है। इनसेट उस फ्रेम को दिखाता है जहां एचडब्ल्यूपी डाला जा सकता है। (बी) विब्राटोम बफर ट्रे का शीर्ष दृश्य जिसमें चिपका हुआ मस्तिष्क ठीक-वर्गीकृत होने के लिए तैयार है। (सी) अनुभागों को स्थानांतरित करने के लिए उपयोग किया जाने वाला मूल (ऊपर) और संशोधित (नीचे) पाश्चर पिपेट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: प्रारंभिक नियंत्रण। (ए) मकई स्टार्च अनाज द्वारा उत्सर्जित एसएचजी संकेत एक प्रमुख अभिविन्यास दिखाता है जो लेजर की दोलन दिशा (इस मामले में क्षैतिज) के साथ मेल खाता है। (बी) क्षैतिज के संबंध में 45 ° पर उन्मुख अपनी तेज धुरी के साथ एक अर्ध-तरंग प्लेट डालने के बाद, संकेत को 90 ° से घुमाया जाता है। (सी) हाफ-वेव प्लेट सम्मिलन से पहले और बाद में सिग्नल का विलय। (डी) मकई स्टार्च अनाज से उत्सर्जित 485 एनएम से नीचे का संकेत। (ई) स्टार्च अनाज से एसएचजी सिग्नल 405/10 एनएम पर पाया गया। (एफ) ग्राफ डी और ई के ज़ूम किए गए इंसर्ट में दिखाए गए लाइन-स्कैन के अनुरूप दो संकेतों की तुलना दिखाता है। उपयोग किया गया एसएचजी फिल्टर नगण्य सिग्नल हानि का कारण बनता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: टीएईपी और डब्ल्यूटी कॉर्पस कॉलोसम से एसएचजी छवियां। कॉर्पस कॉलोसम से प्राप्त (ए) डब्ल्यूटी और (बी) टाइप संकेतों के प्रतिनिधि उदाहरण। (सी) एसपी 485 ने डब्ल्यूटी कॉर्पस कॉलोसम से फ़िल्टर की गई छवि को फ़िल्टर किया। (डी) बीपी 405 ने उसी नमूने से छवि को फ़िल्टर किया जैसा कि सी में है। (ई) एसपी 485 ने एक टाइप कॉर्पस कॉलोसम से फ़िल्टर की गई छवि को फ़िल्टर किया। (एफ) बीपी 405 ई में एक ही नमूने की फ़िल्टर की गई छवि कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: ताइप और डब्ल्यूटी सेरिबैलम से एसएचजी छवियां। अनुमस्तिष्क फोलिया से प्राप्त (ए-बी) डब्ल्यूटी और (सी-डी) टीईपी संकेतों के प्रतिनिधि उदाहरण। (ए) डब्ल्यूटी फोलियम से एक एसपी 485 फ़िल्टर की गई छवि; केवल कुछ पुरकिंजे कोशिकाएं दिखाई देती हैं। (बी) ए में एक ही नमूने से एक बीपी 405 फ़िल्टर की गई छवि। (सी) एक एसपी 485 एक टाइल फोलियम से फ़िल्टर की गई छवि। (डी) सी में एक ही नमूने की एक बीपी 405 फ़िल्टर की गई छवि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्र 1: कलाकृतियों के उदाहरण। (ए) नमूने के सूखने के कारण कलाकृति। (बी) अत्यधिक जोखिम के कारण कलाकृति। स्केल पट्टियाँ: 30 μm. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 1: कोहलर संरेखण। फ़ाइल कोहलर संरेखण करने के लिए चरण प्रस्तुत करती है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 2: एसएचजी छवि अधिग्रहण के लिए ZEN सॉफ्टवेयर कदम। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

एसएचजी माइक्रोस्कोपी गैर-रैखिक प्रकाशिकी तकनीकों के एक समूह का हिस्सा है, जिसमें दो-फोटॉन उत्तेजना माइक्रोस्कोपी, तीसरी हार्मोनिक पीढ़ी माइक्रोस्कोपी और सुसंगत एंटी-स्टोक्स रमन स्कैटरिंग माइक्रोस्कोपी शामिल हैं, जिन्होंने पारंपरिक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के अनुप्रयोगों की सीमा का विस्तार करने में योगदान दियाहै।

विशेष रूप से, एसएचजी माइक्रोस्कोपी की प्रमुख ताकत और कमजोरी एक ही स्थिति से संबंधित है: सिग्नल जनरेटर गैर-सेंट्रोसिमेट्रिक21 है। इस तरह की एक विशिष्ट वास्तुशिल्प स्थिति अक्सर अकार्बनिक और कार्बनिक क्रिस्टल के दायरे में पाई जाती है लेकिन जैविक वस्तुओं के बीच दुर्लभ है। कोलेजन और मांसपेशियों के मायोसिन के साथ, सूक्ष्मनलिकाएं एक दूसरा हार्मोनिक सिग्नल22 उत्पन्न करने में सक्षम हैं, जिसे समानांतर पॉलिमर के बंडलों में पर्याप्त योग होने पर माइक्रोस्कोप के साथ पता लगाया जा सकता है। कोशिकाओं के अंदर, ट्यूबुलिन अक्षतंतु (एक सेल प्रकार-विशिष्ट स्थान), माइटोटिक स्पिंडल (एक अस्थायी-विशिष्ट वितरण) के कोर में समानांतर बंडल बनाने के लिए जुड़ता है, और, जैसा कि इस काम में प्रस्तुत किया गया है, बेसल गैन्ग्लिया और सेरिबैलम के शोष के साथ हाल ही में वर्णित ट्यूबुलिनोपैथी-हाइपोमाइलिनेशन के ट्रेडमार्क माइक्रोट्यूबुल्स एसोसिएशन में, या एच-एबीसी (जो इस तरह के पहले रिपोर्ट किए गए पैथोलॉजिकल वितरण का प्रतिनिधित्व करता है) 14, 16,23.

यह संवेदी-मोटर सिंड्रोम अभी भी एक अनाथ बीमारी है, क्योंकि कई न्यूरोलॉजिस्ट अभी तक सभी लक्षणों से परिचित नहीं हैं और / या निदान की पुष्टि करने के लिए संदिग्ध रोगियों की आनुवंशिक स्क्रीनिंग का खर्च नहीं उठा सकते हैं, जो बहुत संभावना है कि कम से कम कुछ आबादी में अंडरडायग्नोसिस का कारण बनता है। इसके शीर्ष पर, आणविक और सेलुलर स्तर पर विकृति के बारे में बहुत कुछ ज्ञात नहीं है, इसलिए तकनीकें जो इस अपक्षयी प्रक्रिया के विशिष्ट तंत्र पर प्रकाश डालने में मदद कर सकती हैं, बहुत मूल्यवान हैं, बुनियादी स्तर पर भी।

इसलिए, इस माइलिन विकार से संबंधित एसएचजी माइक्रोस्कोपी के दो उपयोग प्रस्तावित हैं। लंबी अवधि में, एसएचजी माइक्रोस्कोपी को बायोप्सी स्क्रीनिंग या प्रत्यक्ष इंट्राक्रैनील विश्लेषण के लिए नैदानिक दृष्टिकोण में एकीकृत किया जा सकता है, लेकिन सबसे बड़ा प्रभाव रोग के आणविक आधार को समझने की कोशिश से जुड़ा हो सकता है।

अन्य माइक्रोस्कोपी तकनीकों पर एसएचजी माइक्रोस्कोपी के कई फायदे हैं। दरअसल, एसएचजी माइक्रोस्कोपी को ऊतक के निर्धारण की आवश्यकता नहीं होती है, जो सूक्ष्मनलिकाएं के मामले में नमूना तैयार करने का एक विशेष रूप से नाजुक कदम है, और किसी भी प्रकार के धुंधला होने की आवश्यकता नहीं है। सबसे बड़ा लाभ इसमें शामिल भौतिक घटना से संबंधित है। एक तरफ, लगभग अनुपस्थित पृष्ठभूमि के कारण, यह उत्पन्न कमजोर संकेतों के बावजूद उच्च कंट्रास्ट प्रदान करता है, और दूसरी ओर, चूंकि आवृत्ति-दोहरीकरण के लिए आवश्यक प्रकाश तीव्रता बहुत अधिक है और इन तीव्रताओं को केवल नमूने की बहुत सीमित मात्रा में पूरा किया जाता है, इसलिए तकनीक आंतरिक ऑप्टिकल सेक्शनिंग प्रदान करती है, इस प्रकार 3 डी पुनर्निर्माण की अनुमति देती है।

इस माइक्रोस्कोपी तकनीक की प्रमुख सीमाएं उपकरण की लागत से संबंधित हैं। स्पंदित अवरक्त (आईआर) लेजर के साथ एक अच्छा कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप, इस आवेदन के लिए आवश्यक है, और हालांकि कई तंत्रिका विज्ञान प्रयोगशालाओं में एक दो-फोटॉन उत्तेजना प्रणाली उपलब्ध है, जिसे आसानी से एसएचजी सेटअप में संशोधित किया जा सकता है, पारंपरिक एपिफ्लोरेसेंस सेटअप की तुलना में लागत में अंतर अभी भी महत्वपूर्ण है। इसके अतिरिक्त, विवर्तन-सीमित तकनीक के रूप में, इसका संकल्प रोशनी के लिए आईआर प्रकाश के उपयोग से प्रभावित होता है।

कई अग्रणी अनुप्रयोगों के साथ, जीवन विज्ञान पर लागू एसएचजी माइक्रोस्कोपी पर शुरुआती प्रयोगों के लिए उपयोग किए जाने वाले सेटअप पूरी तरह से अनुकूलित ऑप्टिकल सेटअप थे, जिन्हें ओपन सिस्टम 11,24,25 के रूप में बनाया गया था, जिससे प्रयोगकर्ताओं को हर एक घटक को अनुकूलित करने की संभावना मिली। चूंकि, जीवन विज्ञान प्रयोगशालाओं में, वाणिज्यिक सेटअप तक पहुंच होना अधिक आम है, हम यह परीक्षण करना चाहते थे कि क्या इनमें से एक प्रणाली टिसुलर सूक्ष्मनलिकाएं बंडलों द्वारा उत्सर्जित कमजोर संकेत का पता लगाने के लिए पर्याप्त संवेदनशील है, जिन्हें कोलेजन के रूप में मजबूत हारमोफोर नहीं माना जाता है। ज़ीस द्वारा एलएसएम 710 एनएलओ प्रणाली में ट्रांसमिशन और "एपि" मोड में गैर-डिसक्राइब्ड डिटेक्शन के लिए मॉड्यूल के साथ एक उल्टे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप और एक सुसंगत गिरगिट असमर्थ आईआर लेजर के साथ शामिल है। एसएचजी घटना की सुसंगत प्रकृति के कारण, नमूने से आवृत्ति-दोगुने प्रकाश के संग्रह को अधिकतम करने के लिए संचरण पथ का चयन करना महत्वपूर्ण है, और इसलिए, एकीकरण द्वारा 0.55 एनए कंडेनसर के माध्यम से पता लगाया गया था। एक एलसीआई प्लान-नियोफ्लुअर 25एक्स /0.8 एनए विसर्जन उद्देश्य का उपयोग नीचे से नमूने को रोशन करने और कंडेनसर एनए का अनुमान लगाने के लिए किया गया था। इस पेपर में वर्णित शर्तों के साथ, हम टीयूबीबी 4 ए उत्परिवर्तन वाले ऊतक से एक संकेत का मज़बूती से पता लगा सकते हैं, और यह संकेत हमेशा नियंत्रण में अनुपस्थित था।

रिपोर्ट किए गए प्रोटोकॉल में, सबसे अच्छी इमेजिंग स्थितियों को प्राप्त करने के लिए दो चरणों में समायोजन की आवश्यकता होती है: ऊतक अनुभाग की मोटाई और कंडेनसर डायाफ्राम का उद्घाटन। एसएच फोटॉनों के अत्यधिक अवशोषण, प्रकीर्णन और हानि को रोकने के लिए अनुभागों को यथासंभव पतला होना चाहिए, खासकर जब से लक्ष्य भौतिक घटना की सुसंगत प्रकृति के कारण संचरण में छवि बनाना है। हमारे मामले में, सीमित कारक ताइप ऊतक की स्थिरता थी, जिसने 160-180 μm से नीचे सजातीय मोटे वर्गों में विभाजन में बाधा उत्पन्न की। पारंपरिक कोहलर संरेखण के साथ, कंडेनसर डायाफ्राम आमतौर पर प्रेषित प्रकाश छवि में विपरीत उत्पन्न करने के लिए अपने क्षेत्र के लगभग 60% तक बंद हो जाता है; इसके विपरीत, इस आवेदन के लिए, उद्देश्य जितना संभव हो उतने फोटॉन एकत्र करना है, इसलिए डायाफ्राम का कुल उद्घाटन।

एसएचजी माइक्रोस्कोपी का यह अनुप्रयोग महत्वपूर्ण है क्योंकि यह ट्यूबुलिन-समृद्ध बनाम ट्यूबुलिन-सामान्य ऊतक को समझने की संभावना प्रदान करता है, जिसमें ट्यूबुलिन युक्त ऊतक एक पता लगाने योग्य संकेत उत्सर्जित करता है। यह भी संभव है कि अन्य अभी तक वर्णित ट्यूबुलिनोपैथी उत्परिवर्तन अन्य ऊतकों में साइटोस्केलेटल विकारों का कारण बनतेहैं, जिसमें ट्यूबुलिन संवर्धन भी शामिल हो सकता है।

अन्य संभावित अनुप्रयोगों के संदर्भ में, एसएचजी माइक्रोस्कोपी को कमजोर संकेतों के अध्ययन के लिए विस्तारित किया जा सकता है, जैसे ट्यूबुलिन-सामान्य ऊतक में मौजूद, ठीक, अलग अक्षतंतु में, या मिश्रित ध्रुवीयता वाले इंट्रासेल्युलर बंडलों में। ऐसा करने के लिए, सेटअप संशोधन, जैसे कि उच्च संख्यात्मक एपर्चर और / या विसर्जन के साथ एयर कंडेनसर का प्रतिस्थापन या अधिक संवेदनशील डिटेक्टर का उपयोग, एक महत्वपूर्ण अंतर बना सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं हैं।

Acknowledgments

इस कार्य को निम्नलिखित अनुदानों के माध्यम से कॉन्सेजो नेशनल डी सिएनसिया वाई टेक्नोलोजिया (CONACYT) द्वारा समर्थित किया गया था: वीपी-सीआईओ को अवसंरचनात्मक 226450, वीपी को 255277, और FORDECYT-PRONACES / 194171 / 2020 से V.H. हम वीडियो बनाने में सीआईओ में जुवेनल हर्नांडेज़ ग्वेरा के समर्थन को स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
405/10 nm BrightLine(R) single-band bandpass filter  Semrock FF01-405/10-25 32 mm diameter, with housing ring
Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric Thorlabs BK5 5' x 9' (1.5 m x 2.7 m) x 0.005" (0.12 mm) Thick 
Blades for vibratome any commercial; e.g. Wilkinson Sword  Classic stainless steel double edge razor blades
Cell culture dishes, 35 mm any commercial; e.g. Falcon 351008
Confocal microscope Zeiss LSM710NLO AxioObserver Z1 Inverted microscope, objective used is LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA 
Cooler any commercial Any insulated, polystyrene box could work, to mantain the sample at about 37 °C
Corn stach e.g. Maizena From the supermarket
Coverslips #1.5 any commercial Rectangular
Cyanoacrylate glue e.g. Loctite To glue the brain to the masking tape
Fine forceps fine science tools 11412-11 To manipulate tissue sections by handling from the meninges
Fine scissors fine science tools 14370-22 To cut the skin 
Fine scissors curved tip fine science tools 14061-09 To cut along the midline
Formaldehyde 37% Sigma-Aldrich 252549 To dilute 1:10 in PBS
Friedman Rongeur fine science tools 16000-14 To cut the bone
Gel packs any commercial Prewarmed to 37 °C, to help mantaining the temperature inside the cooler
Glass Pasteur pipette, modified any commercial To transfer the tissue section
Hanks′ Balanced Salt solution (HBSS) Gibco 14025-076 Could be prepared from powders
Kelly hemostats fine science tools 13018-14 To separate the bone 
Masking tape any commercial To protect th surface of the specimen plate
NDD module, type C Zeiss 000000-1410-101 To detect the signal, reducing light loss. Housing the 000000-1935-163 filter set with the SP485
Offset bone nippers fine science tools 16101-10 To cut the bone
Phosphate buffered saline (PBS) Gibco 10010-031 Could be prepared from powders or tabs
Pulsed laser Coherent Chameleon Vision II 680–1080 nm tunable laser
Scalpel any commercial Straight blade with sharp point
Standard pattern forceps fine science tools 11000-18
Vannas spring scissors fine science tools 15018-10 To cut meninges that remain joined to both the slice obtained from vibratome cutting and the section glued to the specimen plate.
Vibratome any commercial; e.g. Leica VT1200

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 193
सेंट्रल माइलिन में ट्यूबुलिन-निर्भर दोषों के अध्ययन के लिए लेबल-मुक्त गैर-रैखिक प्रकाशिकी
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Piazza, V., Alata, M., Hernandez, V. H., Eguibar, J. R., Cortes, C. Label-Free Non-Linear Optics for the Study of Tubulin-Dependent Defects in Central Myelin. J. Vis. Exp. (193), e63449, doi:10.3791/63449 (2023).

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