Summary
I denne artikkelen presenterer vi en protokoll for å oppdage mikrotubulibelastede oligodendrocytter i en modell av tubulinopati gjennom en enkel, innovativ andre harmonisk generasjons mikroskopi tilnærming.
Abstract
Tilfredsstillende visualisering av cytoskjelettkomponenter i hjernen er utfordrende. Den allestedsnærværende fordelingen av nettverkene av mikrotubuli, mikrofilamenter og mellomliggende filamenter i alle nevrale vev, sammen med variasjonen i resultatene av fluorescerende proteinfusjonsstrategier og deres begrensede anvendelighet til dynamiske studier av antistoffer og legemidler som kromoforbiler, gjør klassiske optiske tilnærminger ikke like effektive som for andre proteiner. Når tubulin må studeres, er den etikettfrie generasjonen av andre harmoniske en meget egnet alternativ på grunn av den ikke-sentrosymmetriske organisasjonen av molekylet. Denne teknikken, når den konjugeres til mikroskopi, kan kvalitativt beskrive den volumetriske fordelingen av parallelle bunter av mikrotubuli i biologiske prøver, med den ekstra fordelen av å arbeide med friske vev som er ufikserte og ugjennomtrengelige. Dette arbeidet beskriver hvordan man avbilder tubulin med et kommersielt andre harmonisk generasjonsmikroskopioppsett for å markere mikrotubuli i de tubulinberikede strukturer av oligodendrocytter, som i hypomyelinisering med atrofi av basalganglia og cerebellum (H-ABC) tubulinopati, en nylig beskrevet myelinforstyrrelse.
Introduction
Den optiske avbildningen av cytoskeletale strukturer i vev og organpreparater er ikke en lett oppgave. Cytoskeletale filamenter er allestedsnærværende, så hvis generisk farging utføres, for eksempel mot alfa-tubulin eller beta-aktin eller potensielt keratin i en epitelprøve, vil signalet sannsynligvis bli fordelt ganske homogent over hele prøven. For å begrense fargingen til en mer meningsfull delmengde av cellulære komponenter, kan man enten bruke transgene mus med målrettet uttrykk1 eller planlegge å bruke isoformspesifikke antistoffer. Mens svært få av de sistnevnte er på markedet (og svært få eksisterer i det hele tatt 2,3,4), kan en transgen dyremodell være tilgjengelig. Det må imidlertid anskaffes av laboratoriet og plasseres riktig, med alle utgifter involvert i prosessen. Visse antistoffer eller kjemikalier, for eksempel fluoroforkonjugerte legemidler som phalloidin eller paklitaksel, kan være delvis eller helt uforenlige med bruk i levende celler eller vev, og dermed begrense deres anvendelighet til bare studier av faste prøver.
Når det gjelder tubulin, må det tas hensyn til et ekstra aspekt, som er polymerens følsomhet for fiksering. Konvensjonell kjemisk fiksering med formaldehyd er kjent for ikke å være tilstrekkelig for optimal bevaring av integriteten til mikrotubuli5. I tillegg bekrefter en nylig rapport at formaldehyd tverrbinding induserer subtile endringer i mikrotubuliens ultrastruktur, som ligner på hva som skjer med bindingen av noen stoffer eller fysiologiske molekyler som GTP6.
Den direkte visualiseringen av mikrotubuli i ufargede, ufikserte prøver er derfor ofte ønskelig. For å oppnå dette er en teknisk løsning andre harmoniske generasjons (SHG) mikroskopi7, som er basert på evnen til bunter av parallelle mikrotubuli til å fungere som harmonoforer og å avgi frekvensdoblet lys når det er riktig opplyst med en intens, pulserende infrarød laser. Selv om et sterkere og mer stabilt andre harmonisk signal kan genereres fra kollagen og myosin, som er de eneste to andre biologiske materialene som er kjent for å være i stand til frekvensdobling, har signalet fra tubulin hittil blitt brukt mest til å studere mitotiske spindelomorganiseringer 8,9,10 og aksonal mikrotubulimorfologi11,12,13.
I dette arbeidet introduserer vi en ny bruk av SHG-mikroskopi som et diagnostisk verktøy for å skille sentralnervesystemet (CNS) vev påvirket av tubulin beta 4 A (TUBB4A) tubulinopati fra deres friske kolleger14. Noen av mutasjonene som forekommer i denne overveiende nevrale isoformen av tubulin, som de som forårsaker hypomyelinisering og atrofi av basalganglia og cerebellum (H-ABC), induserer overfylling av mikrotubuli i oligodendrocytter15,16; De cytoskeletale endringene er i sin tur forbundet med nedstrøms effekter som dysmyelinisering, med dyp svekkelse av motoriske og sensoriske veier16,17,18,19. Taiep-murinmodellen som brukes i dette arbeidet, viser unormalt mikrotubuliinnhold i oligodendrocytter og rekapitulerer de fleste sensorisk-motoriske symptomene hos H-ABC-pasienter17. Protokollen forklarer hvordan man avbilder strukturer som corpus callosum og cerebellum, som vanligvis er svært myeliniserte og som er sterkt påvirket hos menneskelige pasienter, så vel som i taiep-rotte 19, for å markere forskjellene i SH-signaler mellom sunt og mutant vev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer som er beskrevet ble gjort i samsvar med lovene og kodene som er godkjent i den syvende tittelen i forskriften om generell helselov om helseforskning av den meksikanske regjeringen (NOM-062-ZOO-1999) og i samsvar med anbefalingene fra National Institutes of Health Guide for omsorg og bruk av eksperimentelle dyr og ble godkjent av den institusjonelle komiteen for bioetikk i forskning fra Universidad de Guanajuato og Benemérita Universidad Autónoma de Puebla.
1. Innstillinger for mikroskop
- Slå på mikroskopisystemet.
- Slå på den pulserende laseren for å garantere at den vil være klar til å lase på et optimalt og jevnt effektnivå etter prøveutvinning og klargjøring.
- Still laseren til 810 nm. For å studere tissulære mikrotubuli brukes 10% -20% av den tilgjengelige lasereffekten, som i det beskrevne systemet tilsvarer 13-26 mW målt på objektivets bakfokalplan.
- Forsikre deg om at mikroskopet er Köhler-justert (tilleggsfil 1), med målet som skal brukes til SHG-bildebehandling.
MERK: Dette er viktig siden i det kommersielle oppsettet som brukes i dette arbeidet, utføres deteksjonen i overføringsmodus og gjennom kondensatoren. - Fjern uønskede filtre fra den optiske deteksjonsbanen (figur 1A).
- Forsikre deg om at kondensatormembranen er helt åpen for å sikre at ikke noe lys stoppes unødvendig på dette nivået.
- Forbered et 25x / 0,8 numerisk blenderåpning (NA) olje-nedsenkningsmål med en liten dråpe nedsenkningsolje i linsen.
MERK: Dette målet ble brukt for å passe best til kondensatoren NA, som var 0,55 (ideelt sett NAcond≥ NAobj).
2. Mikroskop foreløpige kontroller
MERK: Utfør de foreløpige mikroskopkontrollene én gang, med mindre oppsettet er endret.
- Bilde tørr maisstivelse klemt mellom glassglass med SHG-parametere for å generere SHG-bilder som avslører laserpolarisasjonsretningen. Følg trinnene som er rapportert i tilleggsfil 2, bortsett fra lasereffekten, som er mindre enn 5 % for maisstivelse.
- Ta ett bilde av sparsomme maisstivelseskorn, og merk orienteringen til SHG-lobulene i x-y-planet. Denne retningen tilsvarer laserretningen (figur 2A).
- Som en kontroll, ta et annet bilde av den samme prøven, sett inn i den optiske banen en halvbølgeplate (posisjon vist i figur 1A) for å endre oscillasjonsretningen til laseren. Det resulterende bildet viser roterte SHG-signalkuler (figur 2B, C).
- Hvis du bruker en annen type båndpassfilter for SHG, må du sørge for at det har optimale overføringsegenskaper ved å sammenligne bildene (figur 2D, E) og signalintensiteten piksel for piksel langs en linjeskanning (figur 2F).
3. Vev ekstraksjon
MERK: Bruk alltid rene verktøy for å utføre de kirurgiske prosedyrene.
- Bruk 6-12 måneder gamle taiep-rotter og aldersmatchede Sprague-Dawley-kontroller (WT).
- Bedøv dyrene med en i.p. injeksjon av en blanding av ketamin-xylazin (0,125 mg/kg og 5 mg/kg) fortynnet i en 0,9% steril NaCl-løsning.
- Kontroller smerterefleksene, og fortsett bare hvis de er fraværende.
- Ofre dyret via halshugging.
- Når hodet er isolert, åpner du beinene i kranialhvelvet forsiktig langs midtlinjen, fra det mest kaudale punktet øverst mot nesen, fra banehulene mot midtlinjen, og deretter fra det mest kaudale punktet til under hjernen og lillehjernen.
MERK: Bone cutters og Rongeurs tillate riktig fjerning av hodet bein uten å skade hjernestrukturene. - Frigjør hjernen og lillehjernen fra beinet. De to halvkulene kunne skilles. Hvis halvkulene er delt, bruk den ene halvdelen til SHG-avbildning, og fest den andre halvdelen i 3,7% paraformaldehyd i fosfatbufret saltvann (PBS) i 20 minutter inne i en kjemisk hette for etterfølgende seksjonering og farging.
4. Vibratome seksjonering
- Klargjør et vibratome bufferbrett fylt med varm (37 °C) Hank's Balanced Salt Solution (HBSS).
- Fest hjernen til prøveplaten ved hjelp av cyanoakrylatlim via et stykke maskeringstape. Den mest kaudale delen / regionen kommer i kontakt med limet slik at de brukbare koronale seksjonene fra den motsatte, rostrale delen kan kuttes.
- Tillat ~ 10 s for limet å polymerisere for å oppnå effektiv festing av prøven.
MERK: De beste resultatene oppnås når hjernen er orientert slik at bladet skjærer "fra topp til bunn" i stedet for "fra side til side" (figur 1B).
- Tillat ~ 10 s for limet å polymerisere for å oppnå effektiv festing av prøven.
- Overfør prøveplaten til den magnetiske støtten inne i bufferbrettet.
- Begynn å kutte 300-500 μm seksjoner til skivene som produseres omfatter hele overflaten av hjernen.
- På dette tidspunktet reduserer du tykkelsen på seksjonen til 160 μm.
- Når en komplett 160 μm seksjon er kuttet på nivået av corpus callosum, gjenopprett den med en modifisert glass Pasteur pipette med en stor, flammet åpning (figur 1C).
- Overfør den til en ren petriskål med ny varm HBSS eller direkte på glassstøtten for mikroskopi (deksel eller glassbunnskål).
MERK: For de beskrevne eksperimentelle forholdene er det skadelig for bildet å legge til et deksel over prøven.
5. Overfør til mikroskopet
- Hvis mikroskopet er i et annet rom, må du lage en isolert boks med oppvarmede gelpakker for å overføre vevsseksjonene samtidig som temperaturen opprettholdes. Boksen tjener også til å holde seksjonene varme til de er avbildet.
- Sett prøven under mikroskopet, og sørg for at den er plassert riktig under målet ved direkte observasjon gjennom okularene med overført lys.
MERK: Målet er å justere de forutsagte emitterende strukturene med oscillasjonsretningen til laseren for å maksimere det utstrålede (og derfor oppdagede) SHG-signalet. - Fjern overflødig HBSS slik at en tynn flytende film dekker hele prøven. Kontroller væskefilmen visuelt hvert par minutter for å unngå overdreven fordampning og tørking av prøven.
MERK: Under de beskrevne forholdene brukes en seksjon i ikke mer enn 20 minutter. Tørking av prøven gir drastiske artefaktiske effekter (supplerende figur 1A). I stedet for å legge til mer HBSS, anbefales periodisk bløtlegging av seksjonen i varmt, friskt medium hvis det er behov for lengre bildebehandlingstider. Bruk av perfusjonskamre og lim eller lavsmeltende agarose for å immobilisere vevet anbefales også når lengre eksperimenter skal gjøres. - Forbered mikroskopstadiet for ikke-descanned bildebehandling, som kan omfatte å lukke alle dørene til det mørke inkubasjonskammeret eller dekke inkubasjonskammeret med et svart nylonpolyuretanbelagt stoff.
6. Bildebehandling
- Velg "ikke-descanned" bildemodus langs overføringsbanen. På denne måten vil fangsten av det svake SH-signalet til tubulin bli optimalisert.
- Velg målsettingen LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA.
- Sett en lasereffekt mellom 13 mW og 26 mW, med en pikseloppholdstid på 12,6 μs. Ta bilder som ikke er større enn 512 piksler x 512 piksler, med hastighet 5 og gjennomsnittlig 2, for en gjennomsnittlig anskaffelsestid på omtrent 15 s.
MERK: Bruk av høyere laserkrefter og/eller lengre oppholdstider kan skade prøven (supplerende figur 1B). - Ta bilder først med et 485 nm kortpassfilter (SP485), og legg til et skarpt 405 nm båndpassfilter (BP405; Figur 3). Følg trinnene som er rapportert i Tilleggsfil 2.
MERK: Pseudo-brightfield-bilder kan tas gjennom samme detektor ved hjelp av gjenværende laserlys på en synlig linje (405 nm eller 488 nm lasere fungerer best).
7. Behandling av lillehjernen
- Skjær først lillehjernen med en skalpell i to halvkuler, og lim dem deretter til vibratomestøtten ved den midterste delen (den flate delen oppnådd etter kutting).
- Seksjon og bilde lillehjernen på samme måte som ble beskrevet for hjernen (160 μm seksjoner, samme vibratome innstillinger, samme blad, samme mikroskopinnstillinger, etc.).
MERK: På grunn av cerebellumets anatomi er orienteringen i øyeblikket av seksjonering ikke kritisk; I de fleste skivene som genereres vekk fra overflaten, vil det være folia snittet godt inn i den hvite substansen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bildene oppnådd med denne metoden har et iboende lavt bakgrunnsnivå på grunn av det svært begrensede antallet harmoniforer som er tilstede i biologiske vev, noe som er en av de betydelige fordelene ved metoden.
Når fibrene i corpus callosum er avbildet, kan fiberlignende korte strukturer og avrundede elementer konsekvent finnes i taiep-hjernen (figur 3B), mens corpus callosum i kontrollhjernen viser et mye mer heterogent og isotropisk signal i hele hjerneområdet (figur 3A). Opprinnelsen til differensialsignalet ligger spesielt i det andre harmoniske generasjonsfenomenet, siden tilsetning av det smale båndpassfilteret bare reduserer den ikke-spesifikke signalintensiteten fra kontrollbildene (figur 3C-D) mens du selektivt fjerner dette lave, diffuse signalet fra rundt det soma-lignende og de korte, langstrakte strukturer i taiep-bildene, som alltid genererer intenst SH-lys (figur 3E-F).
Den andre strukturen som analyseres, den cerebellære hvite substansen, gir sammenlignbare resultater. Nærmere bestemt, mens det i kontrollvev er et nesten fullstendig fravær av SH-signal (figur 4B), og Purkinje-cellene knapt er synlige ved bruk av kortpassfilteret, fortsetter de langstrakte og avrundede strukturene i SH-bildet fra taiep-vevet (figur 4D).
Figur 1: Mikroskop og snitt. (A) Skjematisk av mikroskopet som brukes, med relevante komponenter uthevet. Piler: 1 = NDD-port der SP485 er plassert nær detektoren; 2 = flyttbare rammer der BP405 er plassert; 3 = posisjon under målet der halvbølgeplaten (HWP) er plassert for kontrolleksperimenter. Innfellingen viser rammen der HWP kan settes inn. (B) Toppvisning av vibratomebufferbrettet med den limte hjernen klar til å bli finseksjonert. (C) Den originale (øverste) og modifiserte (nederste) Pasteur-pipetten som ble brukt til å overføre seksjonene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Foreløpige kontroller. (A) SHG-signalet som sendes ut av maisstivelseskorn, viser en dominerende orientering som sammenfaller med oscillasjonsretningen til laseren (horisontal i dette tilfellet). (B) Etter å ha satt inn en halvbølgeplate med sin raske akse orientert ved 45 ° i forhold til horisontal, roteres signalet med 90 °. (C) Sammenslåing av signalet før og etter innsetting av halvbølgeplaten. (D) Signalet under 485 nm som sendes ut fra maisstivelseskornene. (E) SHG-signalet fra stivelseskornene oppdaget ved 405/10 nm. (F) Graf som viser en sammenligning av de to signalene som tilsvarer linjeskanningene som vises i de zoomede innsatsene til D og E. SHG-filteret som brukes forårsaker ubetydelig signaltap. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: SHG-bilder fra taiep og WT corpus callosum. Representative eksempler på (A) WT- og (B) taiep-signaler hentet fra corpus callosum. (C) SP485 filtrert bilde fra en WT corpus callosum. (D) BP405 filtrert bilde fra samme prøve som i C. (E) SP485 filtrert bilde fra en taiep corpus callosum. (F) BP405-filtrert bilde av samme prøve som i E. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: SHG-bilder fra taiep- og WT-cerebellum. Representative eksempler på (A-B) WT og (C-D) taiep signaler oppnådd fra cerebellar folia. (A) Et SP485-filtrert bilde fra et WT-folium; bare noen Purkinje-celler er synlige. (B) Et BP405-filtrert bilde fra samme prøve som i A. (C) Et SP485-filtrert bilde fra et taiep-folium. (D) Et BP405-filtrert bilde av samme prøve som i C. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur 1: Eksempler på artefakter. (A) Artefakt på grunn av tørking av prøven. (B) Artefakt på grunn av overdreven eksponering. Skala barer: 30 μm. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 1: Köhler-justering. Filen presenterer trinnene for å utføre Köhler-justeringen. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 2: ZEN-programvaretrinn for SHG-bildeopptak. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SHG-mikroskopi er en del av en gruppe ikke-lineære optikkteknikker, som inkluderer to-foton eksitasjonsmikroskopi, tredje harmoniske generasjonsmikroskopi og sammenhengende anti-Stokes Raman spredningsmikroskopi, som har bidratt til å utvide anvendelsesområdet for konvensjonell optisk mikroskopi til biovitenskap20.
Spesielt er den største styrken og svakheten ved SHG-mikroskopi knyttet til samme tilstand: signalgeneratoren er ikke-sentrosymmetrisk21. En slik spesifikk arkitektonisk tilstand finnes ofte i riket av uorganiske og organiske krystaller, men er sjelden blant biologiske gjenstander. Sammen med kollagen og muskulær myosin er mikrotubuli i stand til å generere et andre harmonisk signal22, som kan detekteres med et mikroskop hvis det oppstår nok summering i buntene av parallelle polymerer. Inne i cellene assosierer tubulin seg til å danne parallelle bunter i kjernene til aksoner (en celletypespesifikk plassering), i mitotiske spindler (en temporalspesifikk fordeling), og, som presentert i dette arbeidet, i varemerket mikrotubuli forening av en nylig beskrevet tubulinopati-hypomyelinisering med atrofi av basalganglia og cerebellum, eller H-ABC (som representerer den første rapporterte patologiske fordelingen av denne typen)14, 16,23.
Dette sensorisk-motoriske syndromet er fortsatt en foreldreløs sykdom, da mange nevrologer ennå ikke er kjent med alle symptomene og / eller ikke har råd til genetisk screening av mistenkte pasienter for å bekrefte diagnosen, noe som sannsynligvis forårsaker underdiagnose, i hvert fall i enkelte populasjoner. På toppen av det er det ikke mye kjent om patologien på molekylært og cellulært nivå, så teknikkene som kan bidra til å kaste lys over de spesifikke mekanismene i denne degenerative prosessen er svært verdifulle, også på et grunnleggende nivå.
Derfor foreslås to bruk av SHG-mikroskopi angående denne myelinforstyrrelsen. På lang sikt kan SHG-mikroskopi integreres i diagnostiske tilnærminger for biopsiscreening eller direkte intrakraniell analyse, men den største effekten kan være forbundet med å forsøke å dechiffrere det molekylære grunnlaget for sykdommen.
Det er mange fordeler med SHG-mikroskopi fremfor andre mikroskopiteknikker. Faktisk krever SHG-mikroskopi ikke fiksering av vevet, noe som er et spesielt delikat trinn for prøvepreparering når det gjelder mikrotubuli, og krever ikke farging av noe slag. Den største fordelen er knyttet til det fysiske fenomenet som er involvert. På den ene siden, på grunn av den nesten fraværende bakgrunnen, gir den høy kontrast til tross for de svake signalene som genereres, og på den annen side, siden lysintensitetene som trengs for frekvensdobling er svært høye og disse intensitetene bare oppfylles i et svært begrenset volum av prøven, gir teknikken egen optisk seksjonering, og tillater dermed 3D-rekonstruksjoner.
De store begrensningene i denne mikroskopiteknikken er relatert til kostnadene for utstyret. Et godt konfokalmikroskop, sammen med en pulserende infrarød (IR) laser, er nødvendig for denne applikasjonen, og selv om et to-foton eksitasjonssystem er tilgjengelig i mange nevrovitenskapslaboratorier, som enkelt kan modifiseres til et SHG-oppsett, er forskjellen i kostnad sammenlignet med et konvensjonelt epifluorescensoppsett fortsatt betydelig. I tillegg, som en diffraksjonsbegrenset teknikk, påvirkes oppløsningen av bruken av IR-lys for belysning.
Som med mange banebrytende applikasjoner, var oppsettene som ble brukt til de tidlige eksperimentene på SHG-mikroskopi anvendt på biovitenskap, helt tilpassede optiske oppsett bygget som åpne systemer 11,24,25, noe som ga eksperimentene muligheten til å optimalisere hver eneste komponent. Siden det i biovitenskapslaboratorier er mer vanlig å ha tilgang til et kommersielt oppsett, ønsket vi å teste om et av disse systemene er følsomt nok til å oppdage det svake signalet som sendes ut av tissulære mikrotubulibunter, som er kjent for ikke å være like sterke harmonoforer som kollagen. LSM710 NLO-systemet fra Zeiss består av et invertert konfokalmikroskop med moduler for ikke-descanned deteksjon i overførings- og "epi"-modus og med en Coherent Chameleon-justerbar IR-laser. På grunn av SHG-fenomenets sammenhengende natur er det avgjørende å velge overføringsbane for å maksimere samlingen av frekvensdoblet lys fra prøven, og derfor ble deteksjonen utført gjennom 0,55 NA-kondensatoren ved integrasjon. Et LCI Plan-Neofluar 25X/0.8 NA nedsenkningsmål ble brukt til å belyse prøven fra bunnen og tilnærme kondensatoren NA. Med forholdene som er beskrevet i denne artikkelen, kunne vi pålitelig oppdage et signal fra vevet som bærer TUBB4A-mutasjonen, og dette signalet var alltid fraværende i kontrollene.
I den rapporterte protokollen krevde to trinn justeringer for å oppnå de beste bildeforholdene: tykkelsen på vevsseksjonen og åpningen av kondensatormembranen. Seksjonene skal være så tynne som mulig for å forhindre overdreven absorbans, spredning og tap av SH-fotoner, spesielt siden målet er å avbilde i overføring på grunn av det fysiske fenomenets sammenhengende natur. I vårt tilfelle var den begrensende faktoren konsistensen av taiep-vevet , noe som hindret snitting i homogent tykke seksjoner under 160-180 μm. Med den konvensjonelle Köhler-justeringen er kondensatormembranen vanligvis stengt til omtrent 60% av arealet for å generere kontrast i det overførte lysbildet; Omvendt, for denne applikasjonen, er målet å samle så mange fotoner som mulig, derav den totale åpningen av membranen.
Denne anvendelsen av SHG-mikroskopi er viktig da den gir mulighet for kresne tubulinrikt versus tubulin-normalt vev, med det tubulinrike vevet som sender ut et detekterbart signal. Det er også mulig at andre ennå ikke beskrevne tubulinopatimutasjoner forårsaker cytoskeletale lidelser i andre vev26, som også kan innebære tubulinberikelse.
Når det gjelder andre mulige anvendelser, kan SHG-mikroskopi utvides til studiet av svakere signaler, som de som er tilstede i tubulin-normalt vev, i fine, dissosierte aksoner eller i intracellulære bunter med blandet polaritet. For å gjøre dette kan oppsettendringer, for eksempel bytte av luftkondensatoren med en med høyere numerisk blenderåpning og / eller med nedsenking eller bruk av en mer følsom detektor, gjøre en viktig forskjell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) gjennom følgende tilskudd: infraestructura 226450 til VP-CIO, infraestructura 255277 til V.P., og FORDECYT-PRONACES/194171/2020 til V.H. Vi anerkjenner støtten fra Juvenal Hernández Guevara hos CIO i videoproduksjonen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 405/10 nm BrightLine(R) single-band bandpass filter | Semrock | FF01-405/10-25 | 32 mm diameter, with housing ring |
| Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric | Thorlabs | BK5 | 5' x 9' (1.5 m x 2.7 m) x 0.005" (0.12 mm) Thick |
| Blades for vibratome | any commercial; e.g. Wilkinson Sword | Classic stainless steel double edge razor blades | |
| Cell culture dishes, 35 mm | any commercial; e.g. Falcon | 351008 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM710NLO AxioObserver Z1 | Inverted microscope, objective used is LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA |
| Cooler | any commercial | Any insulated, polystyrene box could work, to mantain the sample at about 37 °C | |
| Corn stach | e.g. Maizena | From the supermarket | |
| Coverslips #1.5 | any commercial | Rectangular | |
| Cyanoacrylate glue | e.g. Loctite | To glue the brain to the masking tape | |
| Fine forceps | fine science tools | 11412-11 | To manipulate tissue sections by handling from the meninges |
| Fine scissors | fine science tools | 14370-22 | To cut the skin |
| Fine scissors curved tip | fine science tools | 14061-09 | To cut along the midline |
| Formaldehyde 37% | Sigma-Aldrich | 252549 | To dilute 1:10 in PBS |
| Friedman Rongeur | fine science tools | 16000-14 | To cut the bone |
| Gel packs | any commercial | Prewarmed to 37 °C, to help mantaining the temperature inside the cooler | |
| Glass Pasteur pipette, modified | any commercial | To transfer the tissue section | |
| Hanks′ Balanced Salt solution (HBSS) | Gibco | 14025-076 | Could be prepared from powders |
| Kelly hemostats | fine science tools | 13018-14 | To separate the bone |
| Masking tape | any commercial | To protect th surface of the specimen plate | |
| NDD module, type C | Zeiss | 000000-1410-101 | To detect the signal, reducing light loss. Housing the 000000-1935-163 filter set with the SP485 |
| Offset bone nippers | fine science tools | 16101-10 | To cut the bone |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-031 | Could be prepared from powders or tabs |
| Pulsed laser | Coherent | Chameleon Vision II | 680–1080 nm tunable laser |
| Scalpel | any commercial | Straight blade with sharp point | |
| Standard pattern forceps | fine science tools | 11000-18 | |
| Vannas spring scissors | fine science tools | 15018-10 | To cut meninges that remain joined to both the slice obtained from vibratome cutting and the section glued to the specimen plate. |
| Vibratome | any commercial; e.g. Leica | VT1200 |
References
- Palmiter, R. D., et al. Cell lineage ablation in transgenic mice by cell-specific expression of a toxin gene. Cell. 50 (3), 435-443 (1987).
- Banerjee, A., et al. A monoclonal antibody against the type II isotype of beta-tubulin. Preparation of isotypically altered tubulin. The Journal of Biological Chemistry. 263 (6), 3029-3034 (1988).
- Banerjee, A., Roach, M. C., Trcka, P., Luduena, R. F. Preparation of a monoclonal antibody specific for the class IV isotype of beta-tubulin. Purification and assembly of alpha beta II, alpha beta III, and alpha beta IV tubulin dimers from bovine brain. The Journal of Biological Chemistry. 267 (8), 5625-5630 (1992).
- Banerjee, A., et al. Localization of βv tubulin in the cochlea and cultured cells with a novel monoclonal antibody. Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 505-514 (2008).
- Cross, A. R., Williams, R. C. Kinky microtubules: Bending and breaking induced by fixation in vitro with glutaraldehyde and formaldehyde. Cell Motility and the Cytoskeleton. 20 (4), 272-278 (1991).
- Van Steenbergen, V., et al. Molecular understanding of label-free second harmonic imaging of microtubules. Nature Communications. 10 (1), 3530 (2019).
- Campagnola, P. J., Clark, H. A., Mohler, W. A., Lewis, A., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy of living cells. Journal of Biomedical Optics. 6 (3), 277 (2001).
- Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
- Yu, C. -H., et al. Measuring microtubule polarity in spindles with second-harmonic generation. Biophysical Journal. 106 (8), 1578-1587 (2014).
- Bancelin, S., et al. Probing microtubules polarity in mitotic spindles in situ using Interferometric Second Harmonic Generation Microscopy. Scientific Reports. 7, 6758 (2017).
- Dombeck, D. A., et al. Uniform polarity microtubule assemblies imaged in native brain tissue by second-harmonic generation microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7081-7086 (2003).
- Psilodimitrakopoulos, S., et al. Estimation of the effective orientation of the SHG source in primary cortical neurons. Optics Express. 17 (16), 14418 (2009).
- Sharoukhov, D., Bucinca-Cupallari, F., Lim, H. Microtubule imaging reveals cytoskeletal deficit predisposing the retinal ganglion cell axons to atrophy in DBA/2J. Investigative Opthalmology & Visual Science. 59 (13), 5292 (2018).
- Alata, M., Piazza, V., Eguibar, J. R., Cortes, C., Hernandez, V. H. H-ABC tubulinopathy revealed by label-free second harmonic generation microscopy. Scientific Reports. 12, 14417 (2022).
- Duncan, I. D., Lunn, K. F., Holmgren, B., Urba-Holmgren, R., Brignolo-Holmes, L. The taiep rat: A myelin mutant with an associated oligodendrocyte microtubular defect. Journal of Neurocytology. 21 (12), 870-884 (1992).
- Duncan, I. D., et al. A mutation in the Tubb4a gene leads to microtubule accumulation with hypomyelination and demyelination: Tubb4a Mutation. Annals of Neurology. 81 (5), 690-702 (2017).
- Garduno-Robles, A., et al. MRI features in a rat model of H-ABC tubulinopathy. Frontiers in Neuroscience. 14, 555 (2020).
- Lopez-Juarez, A., et al.
- Alata, M., et al. Longitudinal evaluation of cerebellar signs of H-ABC tubulinopathy in a patient and in the taiep model. Frontiers in Neurology. 12, 702039 (2021).
- Parodi, V., et al. Nonlinear optical microscopy: From fundamentals to applications in live bioimaging. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 585363 (2020).
- Lefort, C. A review of biomedical multiphoton microscopy and its laser sources. Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (42), 423001 (2017).
- Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nature Biotechnology. 21 (11), 1356-1360 (2003).
- vander Knaap, M. S., et al. New syndrome characterized by hypomyelination with atrophy of the basal ganglia and cerebellum. American Journal of Neuroradiology. 23 (9), 1466 (2002).
- Stoller, P., Kim, B. -M., Rubenchik, A. M., Reiser, K. M., Da Silva, L. B. Polarization-dependent optical second-harmonic imaging of a rat-tail tendon. Journal of Biomedical Optics. 7 (2), 205 (2002).
- Brown, E. B., et al. In vivo measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy. Nature Medicine. 7 (7), 864-868 (2001).
- Chakraborti, S., Natarajan, K., Curiel, J., Janke, C., Liu, J. The emerging role of the tubulin code: From the tubulin molecule to neuronal function and disease. Cytoskeleton. 73 (10), 521-550 (2016).
