Summary
In dit artikel presenteren we een protocol om microtubule-geladen oligodendrocyten te detecteren in een model van tubulinopathie door middel van een eenvoudige, innovatieve tweede harmonische generatie microscopiebenadering.
Abstract
De bevredigende visualisatie van cytoskeletale componenten in de hersenen is een uitdaging. De alomtegenwoordige verdeling van de netwerken van microtubuli, microfilamenten en intermediaire filamenten in alle neurale weefsels, samen met de variabiliteit in de uitkomsten van fluorescente eiwitfusiestrategieën en hun beperkte toepasbaarheid op dynamische studies van antilichamen en geneesmiddelen als chromofoorvoertuigen, maken klassieke optische benaderingen niet zo effectief als voor andere eiwitten. Wanneer tubuline moet worden bestudeerd, is de labelvrije generatie van tweede harmonischen een zeer geschikte optie vanwege de niet-centrosymmetrische organisatie van het molecuul. Deze techniek, wanneer geconjugeerd aan microscopie, kan kwalitatief de volumetrische verdeling van parallelle bundels microtubuli in biologische monsters beschrijven, met als bijkomend voordeel dat het werkt met verse weefsels die niet-gefixeerd en niet-gepermeabiliseerd zijn. Dit werk beschrijft hoe tubuline kan worden afgebeeld met een commerciële tweede harmonische generatie microscopie-opstelling om microtubuli in de met tubuline verrijkte structuren van de oligodendrocyten te markeren, zoals bij hypomyelinisatie met atrofie van de basale ganglia en cerebellum (H-ABC) tubulinopathie, een recent beschreven myelinestoornis.
Introduction
De optische beeldvorming van cytoskeletale structuren in weefsels en orgaanpreparaten is geen gemakkelijke taak. Cytoskeletale filamenten zijn alomtegenwoordig, dus als generieke kleuring wordt uitgevoerd, bijvoorbeeld tegen alfa-tubuline of bèta-actine of mogelijk keratine in een epitheelmonster, zal het signaal waarschijnlijk vrij homogeen over het monster worden verdeeld. Om de kleuring te beperken tot een meer betekenisvolle subset van cellulaire componenten, kan men transgene muizen gebruiken met gerichte expressie1 of van plan zijn om isovormspecifieke antilichamen te gebruiken. Hoewel er maar heel weinig van deze laatste op de markt zijn (en er maar heel weinig bestaan 2,3,4), kan een transgeen diermodel beschikbaar zijn. Het moet echter door het laboratorium worden verworven en op de juiste manier worden gehuisvest, met alle kosten die met het proces gemoeid zijn. Bepaalde antilichamen of chemicaliën, bijvoorbeeld fluorofoor-geconjugeerde geneesmiddelen zoals falloïdine of paclitaxel, kunnen gedeeltelijk of volledig onverenigbaar zijn met gebruik in levende cellen of weefsels, waardoor hun toepasbaarheid beperkt blijft tot alleen studies van vaste monsters.
In het geval van tubuline moet rekening worden gehouden met een bijkomend aspect, namelijk de gevoeligheid van het polymeer voor fixatie. Conventionele chemische fixatie met formaldehyde staat erom bekend dat het niet geschikt is om de integriteit van microtubuli optimaal te behouden5. Bovendien bevestigt een recent rapport dat formaldehyde-crosslinking subtiele veranderingen in de ultrastructuur van de microtubule induceert, vergelijkbaar met wat er gebeurt met de binding van sommige geneesmiddelen of fysiologische moleculen zoals GTP6.
De directe visualisatie van microtubuli in niet-gekleurde, niet-gefixeerde monsters is daarom vaak wenselijk. Om dit te bereiken, is een technische oplossing tweede harmonische generatie (SHG) microscopie7, die is gebaseerd op het vermogen van bundels parallelle microtubuli om als harmonoforen te fungeren en om frequentieverdubbeld licht uit te zenden wanneer het goed wordt verlicht met een intense, gepulseerde infraroodlaser. Hoewel een sterker en stabieler tweede harmonisch signaal kan worden gegenereerd uit collageen en myosine, de enige andere twee biologische materialen waarvan bekend is dat ze in staat zijn tot frequentieverdubbeling, is het signaal van tubuline tot nu toe vooral gebruikt om mitotische spindelherschikkingen 8,9,10 en axonale microtubulimorfologie 11,12,13 te bestuderen.
In dit werk introduceren we een nieuw gebruik van SHG-microscopie als een diagnostisch hulpmiddel om weefsels van het centrale zenuwstelsel (CZS) die zijn aangetast door tubuline bèta 4 A (TUBB4A) tubulinopathie te onderscheiden van hun gezonde tegenhangers14. Sommige van de mutaties die optreden in deze overwegend neurale isovorm van tubuline, zoals die welke hypomyelinisatie en atrofie van de basale ganglia en het cerebellum (H-ABC) veroorzaken, induceren microtubuli-overvulling in de oligodendrocyten15,16; de cytoskeletale veranderingen zijn op hun beurt geassocieerd met stroomafwaartse effecten zoals dysmyelinisatie, met diepgaande aantasting van de motorische en sensorische paden 16,17,18,19. Het taiep murine-model dat in dit werk wordt gebruikt, toont abnormaal microtubuligehalte in de oligodendrocyten en recapituuleert de meeste sensorisch-motorische symptomen van H-ABC-patiënten17. Het protocol legt uit hoe structuren kunnen worden afgebeeld als het corpus callosum en het cerebellum, die meestal sterk gemyeliniseerd zijn en die ernstig zijn aangetast bij menselijke patiënten en bij de taiep rat19, om de verschillen in SH-signalen tussen gezonde en mutante weefsels te benadrukken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle beschreven procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de wetten en codes die zijn goedgekeurd in de zevende titel van de verordening van de algemene gezondheidswet met betrekking tot gezondheidsonderzoek van de Mexicaanse regering (NOM-062-ZOO-1999) en in overeenstemming met de aanbevelingen van de National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Experimental Animals en werden goedgekeurd door het institutionele comité voor bio-ethiek in onderzoek van de Universidad de Guanajuato en Benemérita Universidad Autónoma de Puebla.
1. Microscoop instellingen
- Schakel het microscopiesysteem in.
- Schakel de gepulseerde laser in om te garanderen dat deze klaar is om te lassen op een optimaal en stabiel vermogensniveau na de extractie en bereiding van het monster.
- Stem de laser af op 810 nm. Om tissulaire microtubuli te bestuderen, wordt 10% -20% van het beschikbare laservermogen gebruikt, wat in het beschreven systeem overeenkomt met 13-26 mW gemeten op het achterste brandpuntsvlak van het objectief.
- Zorg ervoor dat de microscoop is uitgelijnd (aanvullend bestand 1), met het doel dat zal worden gebruikt voor de SHG-beeldvorming.
OPMERKING: Dit is belangrijk omdat, in de commerciële opstelling die in dit werk wordt gebruikt, de detectie wordt uitgevoerd in de transmissiemodus en via de condensor. - Verwijder ongewenste filters uit het optische detectiepad (figuur 1A).
- Zorg ervoor dat het membraan van de condensor volledig is geopend om ervoor te zorgen dat er op dit niveau geen licht onnodig wordt gestopt.
- Bereid een 25x/0.8 numeriek diafragma (NA) olie-onderdompelingsobject voor met een kleine druppel dompelolie in de lens.
OPMERKING: Dit doel werd gebruikt om het beste overeen te komen met de condensor NA, die 0,55 was (idealiter NAcond≥ NAobj).
2. Microscoop voorcontroles
OPMERKING: Voer de voorlopige microscoopcontroles eenmaal uit, tenzij de instelling wordt gewijzigd.
- Afbeelding droog maïszetmeel ingeklemd tussen glazen dia's met SHG-parameters om SHG-afbeeldingen te genereren die de laserpolarisatierichting onthullen. Volg de stappen die worden gerapporteerd in aanvullend bestand 2, met uitzondering van het laservermogen, dat minder dan 5% is voor maïszetmeel.
- Maak een afbeelding van schaarse maïszetmeelkorrels en markeer de oriëntatie van de SHG-lobben in het x-y-vlak. Deze oriëntatie komt overeen met de laseroriëntatie (figuur 2A).
- Neem als controle een andere afbeelding van hetzelfde monster en steek in het optische pad een halve golfplaat (positie weergegeven in figuur 1A) om de oscillatierichting van de laser te wijzigen. Het resulterende beeld toont gedraaide SHG-signaallobben (figuur 2B, C).
- Als u een ander type bandpassfilter voor de SHG gebruikt, moet u ervoor zorgen dat deze optimale transmissie-eigenschappen heeft door de afbeeldingen (figuur 2D, E) en de signaalintensiteiten pixel voor pixel te vergelijken langs een lijnscan (figuur 2F).
3. Weefselextractie
OPMERKING: Gebruik altijd schoon gereedschap om de chirurgische ingrepen uit te voeren.
- Gebruik taiepratten van 6-12 maanden oud en Sprague-Dawley-controles (WT) die overeenkomen met de leeftijd.
- Verdoof de dieren met een i.p. injectie van een mengsel van ketamine-xylazine (0,125 mg/Kg en 5 mg/Kg) verdund in een 0,9% steriele NaCl oplossing.
- Controleer de pijnreflexen en ga alleen verder als ze afwezig zijn.
- Offer het dier via onthoofding.
- Zodra het hoofd is geïsoleerd, opent u de botten van het schedelgewelf voorzichtig langs de middellijn, beginnend bij het meest caudale punt bovenaan naar de neus, van de orbitale holtes naar de middellijn en vervolgens van het meest caudale punt tot onder de hersenen en het cerebellum.
OPMERKING: Botsnijders en Rongeurs zorgen voor een goede verwijdering van de hoofdbotten zonder de hersenstructuren te beschadigen. - Laat de hersenen en het cerebellum los uit het bot. De twee hemisferen konden worden gescheiden. Als de hemisferen zijn verdeeld, gebruik dan de ene helft voor SHG-beeldvorming en fixeer de andere helft in 3,7% paraformaldehyde in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 20 minuten in een chemische kap voor daaropvolgende sectie en kleuring.
4. Vibratome sectie
- Bereid een vibratome bufferbak gevuld met warme (37 °C) Hank's Balanced Salt Solution (HBSS).
- Bevestig de hersenen aan de monsterplaat met behulp van cyanoacrylaatlijm via een stuk afplaktape. Het meest caudale deel /gebied komt in contact met de lijm, zodat de bruikbare coronale secties uit het tegenovergestelde, rostrale gedeelte kunnen worden gesneden.
- Laat ~ 10 s voor de lijm polymeriseren om een effectieve bevestiging van het monster te verkrijgen.
OPMERKING: De beste resultaten worden verkregen wanneer de hersenen zo zijn georiënteerd dat het mes "van boven naar beneden" snijdt in plaats van "van links naar rechts" (figuur 1B).
- Laat ~ 10 s voor de lijm polymeriseren om een effectieve bevestiging van het monster te verkrijgen.
- Breng de monsterplaat over op de magnetische steun in de bufferlade.
- Begin met het snijden van secties van 300-500 μm totdat de geproduceerde plakjes het hele oppervlak van de hersenen omvatten.
- Verminder op dit punt de dikte van de sectie tot 160 μm.
- Zodra een volledige sectie van 160 μm is gesneden ter hoogte van het corpus callosum, herstelt u deze met een gemodificeerde glazen Pasteur-pipet met een grote, gevlamde opening (figuur 1C).
- Breng het over in een schone petrischaal met nieuwe warme HBSS of rechtstreeks op de glazen ondersteuning voor microscopie (coverslip of glasbodemschaal).
OPMERKING: Voor de beschreven experimentele omstandigheden is het toevoegen van een coverslip boven het monster schadelijk voor de beeldvorming.
5. Breng over naar de microscoop
- Als de microscoop zich in een andere kamer bevindt, bereid dan een geïsoleerde doos voor met verwarmde gelpakketten om de weefselsecties over te brengen met behoud van de temperatuur. De doos dient ook om de secties warm te houden totdat ze worden afgebeeld.
- Leg het monster onder de microscoop en zorg ervoor dat het goed onder het doel wordt geplaatst door directe observatie door de oculairen met doorgelaten licht.
OPMERKING: Het doel is om de voorspelde emitterende structuren uit te lijnen met de oscillatierichting van de laser om het uitgezonden (en dus gedetecteerde) SHG-signaal te maximaliseren. - Verwijder de overtollige HBSS zodat een dunne vloeibare film het hele monster bedekt. Controleer de vloeistoffilm om de paar minuten visueel om overmatige verdamping en droging van het monster te voorkomen.
OPMERKING: In de beschreven omstandigheden wordt een sectie niet langer dan 20 minuten gebruikt. Het drogen van het monster veroorzaakt drastische artefactuele effecten (aanvullende figuur 1A). In plaats van meer HBSS toe te voegen, wordt periodiek weken van de sectie in warm, vers medium aanbevolen als langere beeldvormingstijden nodig zijn. Het gebruik van perfusiekamers en lijm of laagsmeltende agarose om het weefsel te immobiliseren wordt ook aanbevolen wanneer langere experimenten moeten worden uitgevoerd. - Bereid de microscoopfase voor op niet-gescande beeldvorming, waaronder het sluiten van alle deuren van de donkere incubatiekamer of het bedekken van de incubatiekamer met een zwarte nylon polyurethaan-gecoate stof.
6. Beeldvorming
- Selecteer de beeldmodus "niet-gedescand" langs het transmissiepad. Op deze manier wordt de opvang van het zwakke SH-signaal van tubuline geoptimaliseerd.
- Selecteer de doelstelling LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA.
- Stel een laservermogen in tussen 13 mW en 26 mW, met een pixel dwell-tijd van 12,6 μs. Maak afbeeldingen die niet groter zijn dan 512 pixels x 512 pixels, met snelheid 5 en gemiddeld 2, voor een gemiddelde acquisitietijd van ongeveer 15 s.
OPMERKING: Het gebruik van hogere laservermogens en/of langere verblijftijden kan het monster beschadigen (aanvullende figuur 1B). - Maak eerst foto's met een 485 nm short-pass filter (SP485) en voeg in een tweede stap een scherp 405 nm bandpass filter (BP405; Figuur 3). Volg de stappen die worden beschreven in Aanvullend dossier 2.
OPMERKING: Pseudo-brightfield-beelden kunnen door dezelfde detector worden gemaakt met behulp van het resterende laserlicht van een zichtbare lijn (405 nm of 488 nm lasers werken het beste).
7. Verwerking van het cerebellum
- Snijd eerst het cerebellum met een scalpel in twee hemisferen en lijm ze vervolgens op de vibratomondersteuning door het middelste gedeelte (het platte deel verkregen na het snijden).
- Sectie en afbeelding van het cerebellum op dezelfde manier als werd beschreven voor de hersenen (160 μm secties, dezelfde vibratome instellingen, hetzelfde blad, dezelfde microscoop instellingen, enz.).
OPMERKING: Vanwege de anatomie van het cerebellum is de oriëntatie op het moment van sectie niet kritisch; in de meeste plakjes die buiten het oppervlak worden gegenereerd, zal er folia tot ver in de witte stof worden gesneden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De beelden die met deze methodologie worden verkregen, hebben een intrinsiek laag achtergrondniveau vanwege het zeer beperkte aantal harmonoforen in biologische weefsels, wat een van de belangrijke voordelen van de methode is.
Wanneer de vezels van het corpus callosum in beeld worden gebracht, zijn vezelachtige korte structuren en afgeronde elementen consistent te vinden in het taiepbrein (figuur 3B), terwijl het corpus callosum van het controlebrein een veel heterogener en isotroop signaal vertoont in het hele hersengebied (figuur 3A). De oorsprong van het differentiële signaal ligt specifiek in het fenomeen van de tweede harmonische generatie, aangezien het toevoegen van het smalle bandpass-filter alleen de niet-specifieke signaalintensiteit van de controlebeelden vermindert (figuur 3C-D) terwijl dit lage, diffuse signaal selectief wordt verwijderd rond de soma-achtige en de korte, langwerpige structuren in de taiepbeelden, die altijd intens SH-licht genereren (figuur 3E-F).
De andere geanalyseerde structuur, de cerebellaire witte stof, geeft vergelijkbare resultaten. In het bijzonder, terwijl er in controleweefsel een bijna volledige afwezigheid van SH-signaal is (figuur 4B) en de Purkinje-cellen nauwelijks zichtbaar zijn bij gebruik van het short-pass filter, blijven de langwerpige en afgeronde structuren bestaan in het SH-beeld van het taiepweefsel (figuur 4D).
Figuur 1: Microscoop en sectie. (A) Schema van de gebruikte microscoop, met relevante componenten gemarkeerd. Pijlen: 1 = NDD-poort waar de SP485 zich dicht bij de detector bevindt; 2 = afneembare frames waar de BP405 is geplaatst; 3 = positie onder het objectief waar de halfgolfplaat (HWP) wordt geplaatst voor besturingsexperimenten. De inzet toont het frame waar de HWP kan worden ingevoegd. (B) Bovenaanzicht van de trilbratombufferbak met de gelijmde hersenen klaar om te worden doorsneden. (C) De originele (boven) en gemodificeerde (onderste) Pasteur pipet die wordt gebruikt om de secties over te brengen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Voorlopige controles. (A) Het SHG-signaal dat door maïszetmeelkorrels wordt uitgezonden, vertoont een overheersende oriëntatie die samenvalt met de oscillatierichting van de laser (horizontaal in dit geval). (B) Na het plaatsen van een halfgolfplaat met zijn snelle as gericht op 45° ten opzichte van het horizontale vlak, wordt het signaal 90° gedraaid. (C) Samenvoegen van het signaal voor en na het inbrengen van de halfgolfplaat. (D) Het signaal van minder dan 485 nm dat door de maïszetmeelkorrels wordt uitgezonden. (E) Het SHG-signaal van de zetmeelkorrels gedetecteerd bij 405/10 nm. (F) Grafiek met een vergelijking van de twee signalen die overeenkomen met de lijnscans die worden weergegeven in de ingezoomde inserts van D en E. Het gebruikte SHG-filter veroorzaakt verwaarloosbaar signaalverlies. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: SHG beelden van taiep en WT corpus callosum. Representatieve voorbeelden van (A) WT en (B) taiep signalen verkregen uit het corpus callosum. (C) SP485 gefilterde afbeelding van een WT corpus callosum. (D) BP405 gefilterde afbeelding uit hetzelfde monster als in C. (E) SP485 gefilterde afbeelding van een taiep corpus callosum. (F) BP405 gefilterde afbeelding van hetzelfde monster als in E. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: SHG-beelden van taiep- en WT-cerebellums. Representatieve voorbeelden van (A-B) WT en (C-D) taiepsignalen verkregen uit cerebellaire folia. (A) Een SP485 gefilterde afbeelding van een WT folium; slechts enkele Purkinje-cellen zijn zichtbaar. (B) Een bp405 gefilterde afbeelding van hetzelfde monster als in A. (C) Een SP485 gefilterde afbeelding van een taiep folium. (D) Een bp405 gefilterd beeld van hetzelfde monster als in C. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Voorbeelden van artefacten. (A) Artefact als gevolg van het drogen van het monster. (B) Artefact als gevolg van overmatige blootstelling. Schaalbalken: 30 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend dossier 1: Köhler-uitlijning. Het bestand bevat de stappen voor het uitvoeren van de Köhler-uitlijning. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 2: ZEN-softwarestappen voor SHG-beeldacquisitie. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SHG-microscopie maakt deel uit van een groep niet-lineaire optische technieken, waaronder twee-foton excitatiemicroscopie, derde harmonische generatie microscopie en coherente anti-Stokes Raman verstrooiingsmicroscopie, die hebben bijgedragen aan het uitbreiden van het scala aan toepassingen van conventionele optische microscopie naar de levenswetenschappen20.
In het bijzonder hebben de belangrijkste sterkte en zwakte van SHG-microscopie betrekking op dezelfde toestand: de signaalgenerator is niet-centrosymmetrisch21. Een dergelijke specifieke architecturale toestand wordt vaak gevonden in het rijk van anorganische en organische kristallen, maar is zeldzaam onder biologische objecten. Samen met collageen en spiermyosine zijn microtubuli in staat om een tweede harmonisch signaal22 te genereren, dat met een microscoop kan worden gedetecteerd als er voldoende summatie optreedt in de bundels parallelle polymeren. In de cellen associeert tubuline om parallelle bundels te vormen in de kernen van axonen (een celtypespecifieke locatie), in mitotische spindels (een temporele-specifieke verdeling) en, zoals gepresenteerd in dit werk, in de handelsmerk microtubule associatie van een recent beschreven tubulinopathie-hypomyelinisatie met atrofie van de basale ganglia en het cerebellum, of H-ABC (die de eerste gerapporteerde pathologische distributie van deze soort vertegenwoordigt)14, 16,23.
Dit sensorisch-motorisch syndroom is nog steeds een weesziekte, omdat veel neurologen nog niet bekend zijn met alle symptomen en / of zich de genetische screening van verdachte patiënten niet kunnen veroorloven om de diagnose te bevestigen, wat zeer waarschijnlijk onderdiagnose veroorzaakt, althans in sommige populaties. Bovendien is er niet veel bekend over de pathologie op moleculair en cellulair niveau, dus de technieken die kunnen helpen licht te werpen op de specifieke mechanismen van dit degeneratieve proces zijn zeer waardevol, ook op basisniveau.
Daarom worden twee toepassingen van SHG-microscopie met betrekking tot deze myelinestoornis voorgesteld. Op de lange termijn zou SHG-microscopie kunnen worden geïntegreerd in diagnostische benaderingen voor biopsiescreening of directe intracraniale analyse, maar de grootste impact kan worden geassocieerd met het proberen te ontcijferen van de moleculaire basis van de ziekte.
Er zijn veel voordelen van SHG-microscopie ten opzichte van andere microscopietechnieken. Shg-microscopie vereist inderdaad geen fixatie van het weefsel, wat een bijzonder delicate stap is van monstervoorbereiding in het geval van microtubuli, en vereist geen kleuring van welke aard dan ook. Het grootste voordeel hangt samen met het betrokken fysische fenomeen. Aan de ene kant, vanwege de vrijwel afwezige achtergrond, biedt het een hoog contrast ondanks de zwakke gegenereerde signalen, en aan de andere kant, omdat de lichtintensiteiten die nodig zijn voor frequentieverdubbeling erg hoog zijn en deze intensiteiten alleen in een zeer beperkt volume van het monster worden bereikt, biedt de techniek intrinsieke optische sectioning, waardoor 3D-reconstructies mogelijk zijn.
De belangrijkste beperkingen van deze microscopietechniek zijn gerelateerd aan de kosten van de apparatuur. Een goede confocale microscoop, samen met een gepulseerde infrarood (IR) laser, is noodzakelijk voor deze toepassing, en hoewel een excitatiesysteem met twee fotonen beschikbaar is in veel neurowetenschappelijke laboratoria, dat gemakkelijk kan worden gewijzigd in een SHG-opstelling, is het verschil in kosten in vergelijking met een conventionele epifluorescentie-opstelling nog steeds aanzienlijk. Bovendien, als een diffractie-beperkte techniek, wordt de resolutie beïnvloed door het gebruik van IR-licht voor verlichting.
Zoals met veel baanbrekende toepassingen, waren de opstellingen die werden gebruikt voor de vroege experimenten met SHG-microscopie toegepast op de levenswetenschappen volledig aangepaste optische opstellingen gebouwd als open systemen 11,24,25, waardoor de experimentatoren de mogelijkheid hadden om elk afzonderlijk onderdeel te optimaliseren. Omdat het in life science-laboratoria gebruikelijker is om toegang te hebben tot een commerciële opstelling, wilden we testen of een van deze systemen gevoelig genoeg is om het zwakke signaal te detecteren dat wordt uitgezonden door tissulaire microtubulesbundels, waarvan bekend is dat ze niet zo sterk zijn als collageen. Het LSM710 NLO-systeem van Zeiss bestaat uit een omgekeerde confocale microscoop met modules voor niet-gedescande detectie in transmissie- en "epi" -modus en met een Coherent Chameleon afstembare IR-laser. Vanwege de coherente aard van het SHG-fenomeen is het cruciaal om het transmissiepad te selecteren om de verzameling van frequentieverdubbeld licht uit het monster te maximaliseren, en daarom werd de detectie uitgevoerd via de 0,55 NA-condensor door integratie. Een LCI Plan-Neofluar 25X/0.8 NA-dompelobjectief werd gebruikt om het monster vanaf de bodem te verlichten en de condensor NA te benaderen. Met de voorwaarden die in dit artikel worden beschreven, konden we op betrouwbare wijze een signaal detecteren van het weefsel met de TUBB4A-mutatie, en dit signaal was altijd afwezig in de controles.
In het gerapporteerde protocol vereisten twee stappen aanpassingen om de beste beeldvormingsomstandigheden te bereiken: de dikte van het weefselgedeelte en de opening van het condensormembraan. De secties moeten zo dun mogelijk zijn om overmatige absorptie, verstrooiing en verlies van SH-fotonen te voorkomen, vooral omdat het doel is om in transmissie te beelden vanwege de coherente aard van het fysieke fenomeen. In ons geval was de beperkende factor de consistentie van het taiepweefsel , wat de sectie in homogeen dikke secties onder 160-180 μm belemmerde. Met de conventionele Köhler-uitlijning wordt het condensormembraan meestal gesloten tot ongeveer 60% van zijn gebied om contrast te genereren in het doorgelaten lichtbeeld; omgekeerd is het voor deze toepassing de bedoeling om zoveel mogelijk fotonen te verzamelen, vandaar de totale opening van het diafragma.
Deze toepassing van SHG-microscopie is belangrijk omdat het de mogelijkheid biedt om tubulinerijk versus tubuline-normaal weefsel te onderscheiden, waarbij het tubulinerijke weefsel een detecteerbaar signaal uitzendt. Het is ook mogelijk dat andere nog te beschrijven tubulinopathiemutaties cytoskeletale aandoeningen in andere weefsels veroorzaken26, die ook tubulineverrijking kunnen inhouden.
In termen van andere mogelijke toepassingen zou SHG-microscopie kunnen worden uitgebreid naar de studie van zwakkere signalen, zoals die aanwezig zijn in tubuline-normaal weefsel, in fijne, gedissocieerde axonen of in intracellulaire bundels met gemengde polariteit. Om dit te doen, kunnen aanpassingen aan de installatie, zoals het vervangen van de luchtcondensor door een met een hoger numeriek diafragma en / of met onderdompeling of het gebruik van een gevoeligere detector, een belangrijk verschil maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) door middel van de volgende subsidies: infrastructuren 226450 tot VP-CIO, infrastructuren 255277 tot V.P. en FORDECYT-PRONACES/194171/2020 tot V.H. We erkennen de steun van Juvenal Hernández Guevara bij CIO bij het maken van video's.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 405/10 nm BrightLine(R) single-band bandpass filter | Semrock | FF01-405/10-25 | 32 mm diameter, with housing ring |
| Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric | Thorlabs | BK5 | 5' x 9' (1.5 m x 2.7 m) x 0.005" (0.12 mm) Thick |
| Blades for vibratome | any commercial; e.g. Wilkinson Sword | Classic stainless steel double edge razor blades | |
| Cell culture dishes, 35 mm | any commercial; e.g. Falcon | 351008 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM710NLO AxioObserver Z1 | Inverted microscope, objective used is LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA |
| Cooler | any commercial | Any insulated, polystyrene box could work, to mantain the sample at about 37 °C | |
| Corn stach | e.g. Maizena | From the supermarket | |
| Coverslips #1.5 | any commercial | Rectangular | |
| Cyanoacrylate glue | e.g. Loctite | To glue the brain to the masking tape | |
| Fine forceps | fine science tools | 11412-11 | To manipulate tissue sections by handling from the meninges |
| Fine scissors | fine science tools | 14370-22 | To cut the skin |
| Fine scissors curved tip | fine science tools | 14061-09 | To cut along the midline |
| Formaldehyde 37% | Sigma-Aldrich | 252549 | To dilute 1:10 in PBS |
| Friedman Rongeur | fine science tools | 16000-14 | To cut the bone |
| Gel packs | any commercial | Prewarmed to 37 °C, to help mantaining the temperature inside the cooler | |
| Glass Pasteur pipette, modified | any commercial | To transfer the tissue section | |
| Hanks′ Balanced Salt solution (HBSS) | Gibco | 14025-076 | Could be prepared from powders |
| Kelly hemostats | fine science tools | 13018-14 | To separate the bone |
| Masking tape | any commercial | To protect th surface of the specimen plate | |
| NDD module, type C | Zeiss | 000000-1410-101 | To detect the signal, reducing light loss. Housing the 000000-1935-163 filter set with the SP485 |
| Offset bone nippers | fine science tools | 16101-10 | To cut the bone |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-031 | Could be prepared from powders or tabs |
| Pulsed laser | Coherent | Chameleon Vision II | 680–1080 nm tunable laser |
| Scalpel | any commercial | Straight blade with sharp point | |
| Standard pattern forceps | fine science tools | 11000-18 | |
| Vannas spring scissors | fine science tools | 15018-10 | To cut meninges that remain joined to both the slice obtained from vibratome cutting and the section glued to the specimen plate. |
| Vibratome | any commercial; e.g. Leica | VT1200 |
References
- Palmiter, R. D., et al. Cell lineage ablation in transgenic mice by cell-specific expression of a toxin gene. Cell. 50 (3), 435-443 (1987).
- Banerjee, A., et al. A monoclonal antibody against the type II isotype of beta-tubulin. Preparation of isotypically altered tubulin. The Journal of Biological Chemistry. 263 (6), 3029-3034 (1988).
- Banerjee, A., Roach, M. C., Trcka, P., Luduena, R. F. Preparation of a monoclonal antibody specific for the class IV isotype of beta-tubulin. Purification and assembly of alpha beta II, alpha beta III, and alpha beta IV tubulin dimers from bovine brain. The Journal of Biological Chemistry. 267 (8), 5625-5630 (1992).
- Banerjee, A., et al. Localization of βv tubulin in the cochlea and cultured cells with a novel monoclonal antibody. Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 505-514 (2008).
- Cross, A. R., Williams, R. C. Kinky microtubules: Bending and breaking induced by fixation in vitro with glutaraldehyde and formaldehyde. Cell Motility and the Cytoskeleton. 20 (4), 272-278 (1991).
- Van Steenbergen, V., et al. Molecular understanding of label-free second harmonic imaging of microtubules. Nature Communications. 10 (1), 3530 (2019).
- Campagnola, P. J., Clark, H. A., Mohler, W. A., Lewis, A., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy of living cells. Journal of Biomedical Optics. 6 (3), 277 (2001).
- Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
- Yu, C. -H., et al. Measuring microtubule polarity in spindles with second-harmonic generation. Biophysical Journal. 106 (8), 1578-1587 (2014).
- Bancelin, S., et al. Probing microtubules polarity in mitotic spindles in situ using Interferometric Second Harmonic Generation Microscopy. Scientific Reports. 7, 6758 (2017).
- Dombeck, D. A., et al. Uniform polarity microtubule assemblies imaged in native brain tissue by second-harmonic generation microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7081-7086 (2003).
- Psilodimitrakopoulos, S., et al. Estimation of the effective orientation of the SHG source in primary cortical neurons. Optics Express. 17 (16), 14418 (2009).
- Sharoukhov, D., Bucinca-Cupallari, F., Lim, H. Microtubule imaging reveals cytoskeletal deficit predisposing the retinal ganglion cell axons to atrophy in DBA/2J. Investigative Opthalmology & Visual Science. 59 (13), 5292 (2018).
- Alata, M., Piazza, V., Eguibar, J. R., Cortes, C., Hernandez, V. H. H-ABC tubulinopathy revealed by label-free second harmonic generation microscopy. Scientific Reports. 12, 14417 (2022).
- Duncan, I. D., Lunn, K. F., Holmgren, B., Urba-Holmgren, R., Brignolo-Holmes, L. The taiep rat: A myelin mutant with an associated oligodendrocyte microtubular defect. Journal of Neurocytology. 21 (12), 870-884 (1992).
- Duncan, I. D., et al. A mutation in the Tubb4a gene leads to microtubule accumulation with hypomyelination and demyelination: Tubb4a Mutation. Annals of Neurology. 81 (5), 690-702 (2017).
- Garduno-Robles, A., et al. MRI features in a rat model of H-ABC tubulinopathy. Frontiers in Neuroscience. 14, 555 (2020).
- Lopez-Juarez, A., et al.
- Alata, M., et al. Longitudinal evaluation of cerebellar signs of H-ABC tubulinopathy in a patient and in the taiep model. Frontiers in Neurology. 12, 702039 (2021).
- Parodi, V., et al. Nonlinear optical microscopy: From fundamentals to applications in live bioimaging. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 585363 (2020).
- Lefort, C. A review of biomedical multiphoton microscopy and its laser sources. Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (42), 423001 (2017).
- Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nature Biotechnology. 21 (11), 1356-1360 (2003).
- vander Knaap, M. S., et al. New syndrome characterized by hypomyelination with atrophy of the basal ganglia and cerebellum. American Journal of Neuroradiology. 23 (9), 1466 (2002).
- Stoller, P., Kim, B. -M., Rubenchik, A. M., Reiser, K. M., Da Silva, L. B. Polarization-dependent optical second-harmonic imaging of a rat-tail tendon. Journal of Biomedical Optics. 7 (2), 205 (2002).
- Brown, E. B., et al. In vivo measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy. Nature Medicine. 7 (7), 864-868 (2001).
- Chakraborti, S., Natarajan, K., Curiel, J., Janke, C., Liu, J. The emerging role of the tubulin code: From the tubulin molecule to neuronal function and disease. Cytoskeleton. 73 (10), 521-550 (2016).
