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Chemistry

Usando um espectrômetro de mobilidade de íons cíclicos para experimentos de mobilidade de íons tandem

Published: January 20, 2022 doi: 10.3791/63451
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1INRAE, UR BIA, F-44316 Nantes, France, 2INRAE, BIBS Facility, F-44316 Nantes, France

Summary

A espectrometria de mobilidade de íons (IMS) é um complemento interessante à espectrometria de massa para a caracterização de biomoléculas, notadamente por ser sensível ao isomerismo. Este protocolo descreve um experimento tandem IMS (IMS/IMS), que permite o isolamento de uma molécula e a geração dos perfis de mobilidade de seus fragmentos.

Abstract

A caracterização precisa das estruturas químicas é importante para entender seus mecanismos biológicos subjacentes e propriedades funcionais. A espectrometria de massa (MS) é uma ferramenta popular, mas nem sempre é suficiente para desvendar completamente todas as características estruturais. Por exemplo, embora os carboidratos sejam biologicamente relevantes, sua caracterização é complicada por inúmeros níveis de isomerismo. A espectrometria de mobilidade de íons (IMS) é um complemento interessante porque é sensível às conformações de íons e, portanto, ao isomerismo.

Além disso, os avanços recentes melhoraram significativamente a técnica: a última geração de instrumentos IMS cíclicos oferece recursos adicionais em comparação com instrumentos lineares de IMS, como um aumento da potência de resolução ou a possibilidade de realizar experimentos de mobilidade de íons tandem (IMS/IMS). Durante o IMS/IMS, um íon é selecionado com base em sua mobilidade de íons, fragmentado e reanalisado para obter informações sobre mobilidade de íons sobre seus fragmentos. Trabalhos recentes mostraram que os perfis de mobilidade dos fragmentos contidos em tais dados IMS/IMS podem atuar como uma impressão digital de um glicano específico e podem ser usados em uma estratégia de rede molecular para organizar conjuntos de dados glicómicos de forma estruturalmente relevante.

O objetivo deste protocolo é, portanto, descrever como gerar dados IMS/IMS, desde a preparação da amostra até a calibração final da Seção Transversal de Colisão (CCS) da dimensão de mobilidade de íons que produz espectros reprodutíveis. Tomando o exemplo de um glycan representativo, este protocolo mostrará como construir uma sequência de controle IMS/IMS em um instrumento IMS Cíclico, como explicar essa sequência de controle para traduzir o tempo de chegada do IMS em tempo de deriva (ou seja, o tempo efetivo de separação aplicado aos íons) e como extrair as informações relevantes de mobilidade dos dados brutos. Este protocolo foi projetado para explicar claramente os pontos críticos de um experimento IMS/IMS e, assim, ajudar novos usuários de IMS cíclicos a realizar aquisições simples e reprodutíveis.

Introduction

A caracterização química completa das biomoléculas é fundamental para entender suas propriedades biológicas e funcionais subjacentes. Para isso, as ciências da "omics" têm se desenvolvido nos últimos anos, visando a caracterização em larga escala de estruturas químicas em concentrações biológicas. Em proteômica e metabolômica, a MS tornou-se uma ferramenta central para desvendar a heterogeneidade estrutural encontrada na mídia biológica - notadamente graças à sua sensibilidade e capacidade de fornecer informações estruturais através de tandem MS (MS/MS). Nas estratégias de MS/MS, um íon é selecionado de acordo com sua massa, depois fragmentado, e finalmente, as massas de seus fragmentos são adquiridas para estabelecer uma impressão digital da molécula. Os espectros de MS/MS podem, em particular, ser usados para combinar bancos de dados espectrais1,2 ou reconstruir provisoriamente as estruturas-mãe3,4. Sob a suposição de que espectros semelhantes pertencem a compostos semelhantes, os dados de MS/MS também podem ser usados para construir redes moleculares (MNs) conectando espécies relacionadas através de um escore de similaridade5,6.

No entanto, devido à propriedade inerente da EM para detectar a relação massa-carga (m/z) de íons, a técnica é cega para uma série de características estruturais que se enquadram na faixa do isomerismo (estéreo). Por exemplo, os carboidratos são feitos de várias subunidades de monossacarídeos, muitas das quais são estereólogos ou mesmo epimers (por exemplo, Glc vs. Gal ou Glc vs. Man). Essas subunidades estão ligadas por ligações glicosidicas, que podem diferir pela posição da ligação (regioisomerismo) e pela configuração estérica do carbono anomérico (anomerismo). Essas características dificultam a distinção entre isômeros de carboidratos7, e apenas o regioisomerismo pode ser abordado usando métodos de ativação de alta energia8,9,10. Embora a derivatização seja uma opção para interromper a equivalência de grupos estereosméricos11, requer uma preparação extensiva da amostra. Outra opção mais simples é acoplamento de ESM com uma dimensão analítica sensível ao isômerismo, como o IMS.

Como este protocolo é projetado para usuários que já estão familiarizados com os conceitos básicos do IMS, e como avaliações detalhadas estão disponíveis em outros lugares12,13, apenas uma breve visão geral dos princípios do IMS é dada aqui. IMS é um método de separação em fase de gás que se baseia na interação de íons com um gás tampão e um campo elétrico, separando íons de acordo com suas conformações de fase gasosa. Diferentes princípios do IMS acoplados à MS podem ser encontrados em instrumentos comerciais: alguns operam em campos elétricos alternados de alta e baixa (IMS assimétricos de campo, FAIMS), enquanto a maioria opera dentro do limite de campo baixo — notavelmente o tubo de deriva IMS (DTIMS, campo elétrico decrescente linear), imS de onda itinerante (TWIMS, ondas potenciais simétricas) e IMS preso (TIMS, alto fluxo de íons de captura de gás tampão contra campos elétricos)13 . Os métodos de campo baixo permitem o acesso a um chamado CCS, uma propriedade do par de gás íon que representa a superfície (em Å2 ou nm2) do íon que interage com o gás tampão durante a separação. O CCS é teoricamente independente de instrumentos e, portanto, é útil para gerar dados que podem ser reproduzidos entre diferentes laboratórios14. As separações de mobilidade de íons podem ser impactadas por vários parâmetros e, notadamente, por flutuações da pressão do gás e da temperatura do gás na célula de mobilidade. A calibração do CCS é uma forma de remediar isso, pois tanto o calibrante quanto a espécie de interesse serão igualmente afetados13. No entanto, é obrigatório instalar o instrumento em uma sala controlada pela temperatura e ter um sistema de controle de pressão de gás confiável.

Uma evolução interessante do IMS é o IMS/IMS, que foi introduzido pela primeira vez em 2006 pelo grupo de Clemmer como um analógico de MS/MS15,16. No IMS/IMS, um íon de interesse é isolado seletivamente com base em sua mobilidade de íons; em seguida, é ativado (até possível fragmentação), e uma nova análise do IMS do íon ativado ou fragmentos é realizada. No primeiro design instrumental, duas células IMS foram colocadas em série, separadas por um funil de íons onde a ativação estava. Desde então, embora uma série de configurações IMS/IMS tenham sido propostas (para revisão, consulte Eldrid e Thalassinos17), o primeiro espectrômetro de massa comercial com capacidade IMS/IMS só ficou disponível em 201918. Este instrumento melhorou substancialmente o conceito inicial, combinando-o com outro avanço tecnológico: um design cíclico da célula IMS.

A célula IMS cíclica teoricamente permite aumentar quase infinitamente o comprimento do caminho de deriva e, assim, o poder de resolução do instrumento19. Isso foi conseguido por meio de uma geometria de instrumento particular, onde a célula Cíclica TWIMS é colocada ortogonalmente ao eixo óptico de íon principal. Uma região de matriz multifuncional na entrada da célula IMS permite controlar a direção do caminho de íon: (i) enviar íons para os lados para a separação do IMS, (ii) para a frente para detecção de MS ou (iii) para trás da célula IMS a ser armazenada em uma célula de prearray. A partir desta célula de loja de prearray, os íons podem ser ativados e os fragmentos reinjetados na célula IMS para medição de mobilidade de íons, uma abordagem que tem sido usada com sucesso para caracterizar estereomers20. Em última análise, os dados coletados contêm mobilidade de íons e informações m/z para o precursor e seus fragmentos.

Em uma publicação recente que utilizou este desenho cíclico para análises glican (Ollivier et al.21), mostramos que o perfil de mobilidade dos fragmentos contidos nesses dados IMS/IMS age como uma impressão digital de uma biomolécula que pode ser usada em uma estratégia de rede molecular. A rede resultante, chamada IM-MN, levou à organização de conjuntos de dados glicômicos de forma estruturalmente relevante, enquanto a rede construída exclusivamente a partir de dados MS/MS (MS-MN) revelou poucas informações. Para complementar esta publicação e ajudar os usuários do IMS Cíclico a implementar este fluxo de trabalho, este protocolo fornece uma descrição completa do protocolo usado para coletar os dados. Este protocolo se concentra apenas na geração dos dados IMS/IMS que os usuários podem usar para criar redes IM-MN (ver21)— ou para qualquer outra aplicação de sua escolha. A construção do IM-MN não será considerada aqui, pois já existem protocolos para redes moleculares. Destacam-se os pontos cruciais que devem ser seguidos para gerar aquisições valiosas e reprodutíveis do IMS/IMS. Tomando o exemplo de um dos oligossacarídeos estudados por Ollivier et al. 21, as seguintes etapas são detalhadas: (i) preparação da amostra, (ii) ajuste do instrumento IMS Cíclico, (iii) pico automatizado de captação dos dados e (iv) calibração ccs.

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Protocol

NOTA: Uma visão geral do protocolo é fornecida na Figura 1. Os parâmetros utilizados para os experimentos descritos no presente protocolo podem ser encontrados na Tabela Suplementar S1 e Tabela Suplementar S2.

1. Preparação da solução amostral

NOTA: O protocolo é descrito usando um pentasacarídeo arabinoxylan (23-α-L-arabinofuranosyl-xylotetraose ou XA2XX; veja a Tabela dos Materiais) como exemplo.

  1. Preparação do solvente: 500 μM LiCl em 50:50 H2O:MeOH (vol./vol.).
    1. Prepare uma solução de estoque de 100 mM de cloreto de lítio (Cicv) em H2O pesando 212 mg de Cicílica e adicione 50 mL de água deionizada de alta pureza (H2O) em um tubo cônico de polipropileno de 50 mL. Agite até dissolver completamente.
      NOTA: O solvente é dopado com um sal de lítio para promover a formação de adutos [M+Li]+ na fonte de íon do espectrômetro, pois geralmente produz espectros de fragmentação de melhor qualidade em comparação com outros adutos alcalinos. O uso de LiCl é recomendado porque os ácidos orgânicos (e, portanto, seus sais) foram encontrados anteriormente para impactar os perfis do IMS23.
    2. Em uma garrafa de vidro, diluir a solução de estoque liCl 200x: a 250 μL da solução de estoque, adicione 24,75 mL de H2O. Adicione 25 mL de metanol (MeOH) para alcançar uma concentração final de LiCl de 500 μM em 50:50 H2O:MeOH (v/v). Sonicato por 2 minutos para desgas o solvente.
      NOTA: MeOH apresenta um risco à saúde (H225, H301, H311, H331, H370); manipular sob um capuz extrator usando um jaleco, luvas e proteção ocular. Uma proporção de 50:50 MeOH/H2O (v/v) parece ser o melhor solvente para a ionização de oligossacarídeos; no entanto, o MeOH pode ser substituído por acetonitrila (ACN) se necessário.
  2. Em um tubo de polipropileno de 1,5 mL, pesa 1 mg do carboidrato. Dissolva-se com um volume apropriado de 500 μM LiCl para atingir uma concentração de 1 mg/mL. Diluir para uma concentração final de 10 μg/mL em 50:50 MeOH/H2O + 500 μM LiCl. Armazenar a 4 °C.
    NOTA: A concentração de 10 μg/mL foi escolhida para otimizar o sinal sobre todos os íons fragmentados durante o IMS/IMS-MS (isto é para um composto puro; aumentar a concentração ao trabalhar em misturas). Para a aquisição de espectros de referência IMS/IMS, não dilua ainda mais a amostra: a saturação do detector de MS antes da fragmentação é esperada, embora o instrumento ofereça opções para corrigi-lo (ver passo 3.2.).

2. Ajuste do espectrômetro de massa Cíclico IMS

NOTA: As instruções relacionadas ao software (janelas, menus e comandos) são destacadas em negrito.

  1. Abra o console de instrumentos a partir do software de controle de instrumentos (página de sintonização MS , veja os detalhes do software na Tabela de Materiais) e coloque o instrumento no modo Operar . Aguarde pelo menos 3 horas para que as altas tensões se estabilizem na célula IMS.
    NOTA: Para a melhor reprodutibilidade, as tensões na célula IMS precisam ser completamente estabilizadas. Ligue as altas tensões e deixe o instrumento estabilizar durante a noite antes de qualquer análise cíclica do IMS. Além disso, a pressão e a temperatura na célula de mobilidade de íons devem ser mantidas o mais constante possível. Embora um retorno para a pressão esteja disponível na guia Vácuo , não há leitura disponível para a temperatura. Mantenha o instrumento em um laboratório termostatado. O instrumento utilizado neste trabalho opera a 1,75 mbar em um termostato de laboratório a 20 °C.
  2. Configuração do instrumento IMS cíclico
    NOTA: As soluções padrão devem ser infundidas usando o sistema fluido embutido para a configuração do instrumento.
    1. Coloque os recipientes fluidos preenchidos com as normas adequadas fornecidas pelo fabricante no sistema de fluidos: Reservatório B ('Lockmass'): 10 pg/μL leucina enkephaline (LEU ENK) em 50:50 ACN/H2O + 0,1% ácido fórmico; Reservatório C ('Calibrante'): MajorMix.
      NOTA: Neste protocolo, a solução de calibração MajorMix será usada para calibrar as dimensões m/z e CCS. Por razões práticas, será realizada uma calibração externa do CCS (ver o passo 5 do protocolo); portanto, também é possível usar uma mistura calibrante interna para o CCS e outro calibrante para o m/z (por exemplo, formatar de sódio ou iodeto de sódio).
    2. Na página Tune do console Quartz, vá para a guia Fluidics . Coloque a amostra fluidica para o reservatório C e os fluidos de referência para o reservatório B. Infundir ambas as soluções consecutivamente na fonte de íons para verificar o sinal de MS.
    3. Execute a configuração da ADC, a configuração do detector (usando LEU ENK) e a calibração de massa (consulte a tabela de materiais para a solução de calibração) a partir da página configuração do instrumento de acordo com as instruções do fabricante.
  3. Registo uma aquisição do IMS da solução de calibração com uma separação de passe único (use-a para calibração externa do IMS).
    NOTA: Os parâmetros de origem de íon e de onda itinerante (TW) (altura de onda estática e velocidade de onda) devem ser mantidos constantes durante todas as aquisições (calibração e aquisições). Se o usuário não tiver conhecimento prévio dos parâmetros ideais para sua amostra, esta etapa pode ser realizada após a etapa 3 do protocolo (para adutos [M+Li]+ de oligossacarídeos neutros, os resultados representativos utilizam uma altura TW de 16 V e velocidade TW de 350 m/s, que dão os melhores resultados).
    1. A partir da guia Fluidics , selecione a posição de defletor Amostra e infundir o calibrante (ver a tabela de materiais) na fonte de íon (usando o sistema fluido embutido) através da sonda 'Amostra' a uma taxa de fluxo de 10 μL/min.
    2. Configure uma sequência IMS de passe único. Na página Tune , coloque o instrumento no modo Mobility e abra a janela controle de sequência cíclica . Selecione o modo Avançado . Na guia Funções Cíclicas desta nova janela, selecione Adicionar pacote e, em seguida, Single/Multipass. Aguarde que uma sequência de eventos de mobilidade apareça na guia Sequência da mesma janela.
      NOTA: Para ativar o visor em tempo real, o usuário deve aplicar os parâmetros do instrumento: clique no modo Tune in TOF ou Run in Mobility . Antes de alternar o instrumento entre os modos TOF e Mobility , é necessário abortar qualquer aquisição em execução (incluindo a exibição da página Tune ). A abundância relativa de íons pode variar entre o modo TOF e o modo Mobilidade devido a alterações nos parâmetros de transmissão de íons.
    3. Adapte a sequência para que todos os íons calibrantes façam uma única passagem ao redor da pista cíclica do IMS. Não altere o tempo de injetar ou o Ejetar e adquirir tempo; no entanto, reduza o tempo separado para 1 ms (na guia Sequência ). Se alguns íons da mistura de calibração não se encaixarem na janela de tempo de chegada exibida, altere a sincronização do IMS com o empurrador do analisador TOF de aceleração ortogonal aumentando o número de Pushes Per Bin na guia Configurações ADC .
      NOTA: Os tempos na sequência de controle controlam apenas a matriz multifuncional para gating de íon. Enquanto os íons estiverem engajados em sua primeira (ou nth) passagem ao redor da pista, eles terminarão o referido passe mesmo que a direção do TW tenha mudado na matriz nesse meio tempo. Reduzir o tempo de separação para 1 ms significa que a matriz mudará para o modo de ejeção após 1 ms. Isso garante que os íons mais rápidos não terão tempo suficiente para passar pela matriz e se engajar em uma segunda passagem antes que os íons mais lentos terminem sua primeira passagem. Portanto, todos os íons serão submetidos ao mesmo número de passes (ou seja, um passe), o que é necessário para realizar a calibração do IMS.
    4. Registo uma aquisição de 2 minutos. Na janela Controle de sequência cíclica , clique em Adquirir para abrir a janela popup Configurações de aquisição . Insira o nome de arquivo, descrição e comprimento de aquisição (minutos) e clique em Salvar.
  4. Registo a aquisição de mais 2 min da solução de calibração nas mesmas condições da etapa 2.3 (use-a para verificar a qualidade da calibração do CCS). Na janela Controle de sequência cíclica , clique em Adquirir para abrir a janela popup Configurações de aquisição . Insira o nome de arquivo, descrição e comprimento de aquisição (minutos) e clique em Salvar.
  5. Lave bem o sistema fluido com 50:50 H2O/ACN para evitar a cristalização do calibrante na tubulação de espia.

3. Aquisição do IMS/IMS-MS

  1. Utilizando uma bomba de seringa, infundir a amostra (dopada de lítio) a 10 μg/mL através da sonda amostral a uma taxa de fluxo de 10 μL/min.
  2. Mude o instrumento para o modo TOF (a partir da página de sintonização MS ) para verificar a estabilidade do sinal. Registo a aquisição completa de MS (1 min) da amostra, que será útil para verificar o padrão isotópico e a presença de potenciais contaminantes.
    NOTA: Como a concentração amostral é escolhida para obter um bom sinal de íon para os fragmentos, uma saturação TOF pode ser observada nesta etapa. A saturação do TOF pode ser identificada usando os seguintes artefatos: (i) uma resolução de MS artificialmente aumentada, (ii) uma mudança nas proporções isotópicas e (iii) uma infinidade de picos de baixa abundância entre os isótopos. Use a lente DRE (aprimoramento do intervalo dinâmico, perfil quad/ms/dre da página principal de sintonia) para atenuar a transmissão de íons e descartar a saturação no modo TOF (Figura 2A,B).
  3. Coloque o instrumento no modo MSMS (aba Perfil Quad/MS da página principal de sintonia ) e selecione a massa do íon-alvo no campo de massa MSMS para isolamento no quadrúpole (no exemplo: m/z de 685,2, correspondente à espécie [M+Li]+ iônica da pentasaccarida arabinoxylan). Registo uma aquisição de 1 min para verificar o isolamento precursor ao processar os dados.
    NOTA: Os adutos de lítio têm um isótopo a -1 Da do pico monoisotópico, que precisa ser removido da janela de seleção de MS/MS para que não interfira nas etapas de processamento. Ele pode ser removido estreitando a faixa de seleção usando os parâmetros de Resolução LM e HM na guia Perfil Quad/MS (Figura 2C).
  4. Configure uma sequência IMS de "fatiamento" para executar uma seleção baseada em mobilidade do isômero de interesse.
    1. Mude o instrumento para o modo Mobilidade (ver passo 2.3.2). Na janela Controle de sequência cíclica , da guia Funções Cíclicas , selecione Adicionar pacote e, em seguida, fatiar. Aguarde que uma sequência complexa de eventos de mobilidade apareça na guia Sequência (Figura 3).
      NOTA: É possível visualizar cada etapa do processo IMS/IMS: clique no evento Ejetar e Adquirir na guia Sequência . Uma vez destacado em vermelho, mova-o para a posição apropriada dentro da sequência usando os botões Para Cima e Para Baixo .
    2. Posicione o evento Eject and Acquire logo após o primeiro evento Separado (ou seja, mova-o na linha 3 em vez da linha 8 na sequência exibida na Figura 3) e, em seguida, clique em Executar. Procure os resultados da separação inicial a ser exibida em tempo real. Aumente a duração do primeiro evento Separado para uma separação de vários passes alterando o valor de tempo para este evento na sequência até que a resolução dos picos do IMS seja satisfatória. Registo uma aquisição de 1 min para referência.
      NOTA: Anote o valor de atraso de início da ADC na guia configuração da ADC : será útil verificar a qualidade do isolamento.
    3. Clique em Pausa. Observe que os resultados da separação inicial são exibidos, embora modificações na sequência de controle não serão aplicadas até que o usuário clique em Executar novamente. Posicione o evento Eject and Acquire abaixo dos eventos Eject, Eject to Pre-Store e Hold and Eject . Ajuste a duração dos eventos de modo que o pico alvo esteja na região do Ejetar para Pré-Loja , e qualquer outro íon esteja na região de Ejetar ou Hold e Ejetar .
      NOTA: A duração desses três eventos em comparação com as distribuições de tempo de chegada (ATDs) pode ser visualizada usando a barra codificada por cores abaixo do espectro de mobilidade na guia Mobilograma (Figura 3).
    4. Posicione o evento Eject and Acquire no final da sequência, abaixo do Reinject da Pré-Loja e do segundo Eventos Separados . Clique em Executar para exibir a população selecionada.
      NOTA: Como a população selecionada deixou a célula IMS, toda a separação anterior foi perdida, e está de volta a uma separação de passe único (que é desejada).
    5. Verifique a qualidade do isolamento. Para verificar se apenas o pico de interesse foi selecionado, realize a mesma separação após a reinjeção anterior (ou seja, mesmo tempo separado ) como mostrado na Figura 4. Registo uma aquisição de 1 min para referência.
      NOTA: Os usuários são encorajados a verificar a população ejetada; a janela de tempo Eject to Pré-Store deve ser nível de linha de base (Figura 4B). Para verificar isso, coloque o ADC Start Delay no modo Manual na guia Configurações ADC e digite o tempo de atraso observado na etapa 3.4.2. Registo uma aquisição de 1 min para referência.
    6. Na aba Sequência , na coluna ao lado dos horários de evento definidos pelo usuário (a coluna Time Abs , destacada em vermelho), procure os tempos somados de todos os eventos. Tome nota do Time Abs encontrado na linha do evento Reinject from Pre-Store para realizar a calibração CCS.
  5. Fragmente o pico alvo entre as duas rodadas do IMS. Alterar as tensões da etapa de reinjeção para aumentar a energia cinética dos íons, e fragmentá-los após colidir com o gás de mobilidade de íons.
    1. Defina a duração do evento Separado diretamente precedendo o Ejeto e Adquira para 1 ms (veja explicação na etapa 2.3.3).
    2. Na linha Reinject da Pré-Loja , marque a caixa Ativar e otimize a fragmentação com o controle embutido. Se o espectro for satisfatório (por exemplo, o pico base é um fragmento), proceda diretamente à etapa 3.5.4.
      NOTA: Ao ativar a ativação, três tensões na linha ficarão cinzas: estas são as tensões que o usuário precisa alterar se for necessária a otimização manual das tensões (veja o próximo passo). Essas três tensões (Pré-Array Gradient, Pre-Array Bias e Array Offset) formam o gradiente usado para ativar os íons. A energia cinética dos íons aumentará com a inclinação entre o Viés Pré-Array e o Deslocamento de Matriz (ver Figura 5). Os valores padrão dos valores de Deslocamento de Viés → Gradiente → são: sem ativação 85 → 70 → 45 V; ativação máxima da função incorporada 185 → 170 → -5 V (+150 V). Após a fragmentação, não se esqueça de reajustar a transmissão de íons usando a lente DRE (diminuir a atenuação do sinal) (ver passo 3.2.).
    3. Se a fragmentação não for satisfatória com o controle embutido, desmarque a caixa De ativação e proceda para otimizar manualmente as tensões de reinjeção. Aumente a tensão de gradiente pré-array (a tensão de viés pré-array deve ser sempre mantida 15 V abaixo do Gradiente Pré-Array) e abaixe a tensão de deslocamento de matriz (que pode ser definida como negativa) até que os resultados sejam satisfatórios.
      NOTA: Ao ajustar manualmente as tensões da matriz multifuncional, o usuário pode mudar da exibição 'Mobilograma' para esquemas interativos das tensões aplicadas na matriz multifuncional (diagrama PE) para visualizar melhor as configurações de tensão (Figura 5A).
    4. Registo uma aquisição de 2 min. Na janela pop-up de aquisição, marque a opção Reter tempo de deriva para gerar um arquivo contendo apenas os tempos de chegada vs m/z (o tempo de aquisição usado para análises cromatográficas - o tempo de retenção - é removido do arquivo). Observe que este arquivo está rotulado de *_dt. O RAW.
      NOTA: Se o usuário esquecer de verificar a opção Reter tempo de deriva , ainda é possível extrair a dimensão IMS usando o software Driftscope 2.9 (Arquivo | Exportar para o masslynx | Mantenha o tempo de deriva).
  6. Gire o instrumento de volta para o modo TOF na página principal do Tune e enxágue completamente o sistema com 50:50 MeOH/H2O antes de prosseguir com a próxima amostra.

4. Processamento IMS/IMS-MS com MZmine 224

NOTA: MZmine 2 está disponível a partir da URL dada na Tabela de Materiais. Recomenda-se o uso de MZmine 2.51. No momento da elaboração deste manuscrito, as versões posteriores não podem abrir arquivos RAW de instrumentos IMS cíclicos devido a uma mudança na função de importação.

  1. Importe os arquivos brutos contendo apenas as dimensões IMS e m/z (*_dt. RAW) utilizando métodos de dados brutos | Importação de dados brutos.
    NOTA: Arquivos brutos aparecerão no lado esquerdo da janela principal do MZmine. Não importe o original *. Arquivos RAW que ainda contêm a dimensão do tempo de retenção. O MZmine não distingue o tempo de retenção do tempo de chegada do IMS, e os pontos de dados de ambas as dimensões se sobreporiam.
  2. Otimize os parâmetros do fluxo de trabalho em um arquivo representativo, selecionando-o no Arquivos de dados brutos lista.
    1. Avalie o nível de ruído nos dados. Clique com o botão direito do mouse no arquivo na lista de arquivos de dados Raw , selecione Mostrar TIC e exibir o pico base "cromaatograma" (BPC). Clique duas vezes no menor pico observável olho por olho para exibir seu espectro de massa. Considere o nível de ruído nos dados em torno do segundo isótopo do pico base neste espectro, e use esse mesmo valor para todos os limiares de intensidade nas etapas seguintes de processamento.
      NOTA: Os dados foram adquiridos por meio do isolamento do quadrúpole e são, portanto, considerados pela MZmine como MS/MS. Durante todo o processamento de MZmine, certifique-se de trabalhar em nível de MS = 2.
    2. Realize a detecção em massa usando métodos de dados raw | | de detecção de recursos Detecção em massa. Para dados adquiridos no modo perfil, use o algoritmo de transformação Wavelet . Para configurar os parâmetros dos algoritmos em MZmine, clique no botão [...] ao lado do algoritmo e use a opção mostrar visualização para visualizar os dados enquanto otimiza os parâmetros.
      NOTA: Nesta fase, os picos selecionados pelo algoritmo aparecerão em vermelho na janela de visualização. Ao usar o algoritmo de transformação de ondas em arquivos RAW proprietários, o MZmine às vezes confunde os pontos de dados do perfil com picos centralídeos. O software exibirá uma mensagem informando que o usuário está executando um algoritmo de perfil em espectros centralóides: ignore essa mensagem e clique em OK.
    3. Reconstrua o espectro de mobilidade de íons extraído (EIM) para cada massa de fragmento usando métodos de dados brutos | | de detecção de recursos Construtor de cromatograma ADAP na lista de massas 'massas' gerada pela etapa anterior. Como a entrada de tolerância m/z nesta fase é uma tolerância de varredura para digitalização, certifique-se de deixá-la pelo menos 3-4 vezes maior do que a precisão global esperada.
    4. Como a etapa anterior não tem uma opção de visualização, verifique a qualidade da escolha de pico diretamente usando a lista de recursos que apareceu no painel direito da janela MZmine principal. Abra a lista De recurso, selecione todas as linhas, clique com o botão direito do mouse e selecione Mostrar/XIC (diálogo). Clique em Tudo para exibir todos os íons no espectro de mobilidade. Inspecione os picos escolhidos que aparecem em cores para garantir que não haja picos perdidos óbvios.
    5. Desconvolve os EIMs para dividir o m/z que contêm diferentes picos em múltiplas características. Use métodos de lista de recursos | | de detecção de recursos Deconvolução de cromatogramas e escolha o algoritmo Wavelets (ADAP). Otimize o algoritmo para os dados usando a opção mostrar e os seguintes parâmetros-chave: limiar S/N, limite de coeficiente/área e faixa de onda RT.
      NOTA: Recomenda-se verificar o aspecto do espectro desconvolvado. Use a ferramenta de visualização de cromatograma, conforme descrito na etapa 4.2.4. Os picos desconvolvados aparecerão em cores, e picos da mesma massa devem ser divididos, como apresentado na Figura 6A.
    6. Deisótopos os EIM desconvolved usando métodos de lista de recursos | Isótopos | Garoupeiro isotópico. Use a precisão esperada do instrumento para o valor de tolerância m/z e defina a tolerância ao tempo de chegada para 0,1 ms (exibida em MZmine como tolerância ao tempo de retenção 0,1 min), pois os isótopos não são resolvidos durante a separação do IMS. Verifique a lista de recursos: se houver isótopos, aumente os valores de tolerância.
      NOTA: Embora o deisotop pode teoricamente ser realizado em qualquer momento do processamento da lista de recursos, é importante fazê-lo por último para que os valores de carga possam ser exportados (os algoritmos usados para as outras etapas às vezes removerão as informações do estado de carga).
  3. Se processar vários espectros IMS/IMS-MS, repita o processamento com esses parâmetros otimizados. Mantenha os mesmos parâmetros para todos os espectros.
  4. No caso de vários espectros, agrupa-os em uma única tabela para exportá-los; se não, pule diretamente para a etapa 4.5. Para agrupar os espectros, use métodos de lista de recursos | | de alinhamento Junte-se ao alinhador. Como o objetivo não é realmente alinhar os picos, use valores de tolerância restritivos tanto para m/z quanto para o tempo de chegada. Dê o mesmo peso para ambas as dimensões.
  5. Exporte a lista final de recursos para um arquivo *.csv . Use métodos de lista de recursos | | de exportação/importação Exportar para o arquivo CSV e exportar os seguintes valores: Linha de exportação m/z, tempo de retenção da linha de exportação (o tempo real de chegada do IMS), pico m/z e altura do pico. Use uma círgula como separador de campo.

5. TWCCSN2 do espectro IMS/IMS centralado

NOTA: Neste protocolo, será utilizada uma calibração de ajuste logarítmico25,26, que tende a dar melhores resultados do que a calibração linear e é fácil de implementar em uma planilha ou em um script de processamento interno. Um script interno (escrito em R) está disponível na URL dada na Tabela de Materiais.

  1. Escolha os valores de tempo de chegada de referência da aquisição calibrante (ver passo 2.3). Faça isso manualmente usando o software de construção (veja a Tabela de Materiais) para verificar o aspecto de todos os picos calibradores do IMS.
    1. Na janela cromatograma , abra o _dt. Arquivo RAW correspondente ao calibrante.
    2. Para cada ponto de calibração, gere o EIM usando o Display | Opção de massa .
    3. Verifique o perfil dos EIMs. Se alguns estiverem mal definidos, suavize-os usando o Processo | Opção suave (como os melhores resultados são tipicamente obtidos com o algoritmo Savitzky-Golay, suave 2 vezes mais de 3 caixas). Denuncie os valores do ápice em uma planilha.
      NOTA: Como os pontos de referência são geralmente adquiridos usando dispositivos DTIMS de baixa resolução, algumas distribuições multimodais podem aparecer no IMS Cíclico, dependendo dos calibrantes. Remova qualquer pico apresentando tal distribuição da lista de calibração.
  2. Calcule os parâmetros de ajuste logarítmicos dos calibrantes.
    1. Para todos os pontos de calibração, calcule o seguinte.
      1. Calcule o tempo de deriva usando Eq (1):
        Equation 1 (1)
        com td o tempo de deriva, tA o tempo de chegada medido, e tinj o tempo de injeção na célula IMS (tudo em ms).
        NOTA: Para moléculas pequenas, como fragmentos de oligossacarídeos, a hora de voo (tempo de voo entre a saída da célula IMS e o detector) varia entre diferentes massas está dentro da faixa de erro da calibração do CCS e pode ser ignorada.
      2. Calcular a massa neutra dos íons usando Eq (2):
        Equation 2 (2)
        com z o estado de carga do íon, e mion a massa do contra-íon (em Da). Use massas exatas para evitar a introdução da incerteza. Se houver perda de átomo em vez de um contra-íon, use valores de mion negativos (por exemplo, para [M-H]-mneutral = (m/z) * |z| - (- 1,007276) = (m/z) * |z| + 1,007276). 
      3. Calcular o parâmetro ccs usando Eq (3):
        Equation 3 (3)
        com CCS o tubo de deriva de referência valor DTCCSN2 (em nm2), e mgas a massa do gás de deriva (em Da; ex. para nitrogênio: mgas = 28,01 Da).
      4. Calcule o parâmetro td' usando Eq (4):
        Equation 4 (4)
        com d o detector start delay usado experimentalmente para corrigir para o tempo morto (tipicamente ~1,5 ms).
      5. Calcular logaritmo dos parâmetros acima:
        In (CCS') e in (t'd)
    2. Realize uma regressão linear para determinar o coeficiente R2 e os parâmetros x e y do ajuste logarítmico (com x a inclinação e in(y) a interceptação) usando Eq (5):
      Equation 5 (5)
      NOTA: O usuário pode traçar os valores ln(CCS) vs(td') para verificar visualmente os resultados da calibração, embora isso seja opcional.
  3. Aplique a calibração aos dados experimentais para calibrar os picos escolhidos pelo MZmine para cada espectro IMS/IMS exportado para o arquivo *.csv. Para cada ponto, calcule o seguinte.
    1. Calcule o tempo de deriva usando Eq (6):
      Equation 6 (6)
      com tseq o tempo anterior à separação final do IMS (o valor 'Time Abs' observado na etapa 3.4.6).
      NOTA: Se calibrar vários espectros IMS/IMS adquiridos com diferentes sequências, verifique cuidadosamente os valores do tseq .
    2. Calcular a massa neutra dos íons usando Eq (7):
      Equation 7 (7)
    3. Calcule os parâmetros td' e td'' utilizando Eq (8) e Eq (9):
      Equation 8 (8)
      Equation 9 (9)
    4. Calcule os valores ccs calibrados finais (TWCCSN2 em nm2) usando Eq (10):
      Equation 10 (10)
      NOTA: Apesar do passo 5.2.2. dá ln(y) como a interceptação, y deve ser usado para obter o valor ccs final. Não se esqueça de aplicar uma função exponencial.
  4. Verifique a precisão da calibração aplicando a calibração à segunda aquisição da solução de calibração adquirida na etapa 2.4.
    NOTA: A calibração deve produzir resultados com um erro de ~1-2%.

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Representative Results

Um pentasacarídeo arabinoxylan, XA2XX, foi escolhido como exemplo para ilustrar este protocolo. Este composto está comercialmente disponível, mas apenas como uma mistura com outra pentasacarida arabinoxylan, XA3XX (XA3XX puro também está disponível comercialmente). As estruturas de XA2XX e XA3XX são dadas em Figura Suplementar S1. Como a razão de XA2XX e XA3XX na mistura comercial é ~50:50, uma solução a 20 μg/mL da mistura foi preparada para atingir uma concentração XA2XX de ~10 μg/mL em 50:50 MeOH/H2O + 500 μM LiCl.

Primeiro, foi realizada uma análise ms da mistura XA2XX + XA3XX utilizando-se ms de alta resolução. Como os dois compostos são isômeros, observou-se um único pico em [M+Li]+m/z 685,24. Este pico de MS foi selecionado com o quadrúpede e a janela de seleção ajustada para remover o isótopo de lítio -1 Da, o que poderia ser confundido como o pico monoisotópico por algoritmos de processamento (Figura 2).

Os adutos [M+Li]+ das pentasacarídeos foram então submetidos ao primeiro estágio da separação do IMS: após 3 passagens ao redor da célula IMS cíclica, 3 picos foram separados com tempos de chegada de 83, 90 e 94 ms. Este perfil foi comparado ao de XA3XX puro (infundido a 10 μg/mL), mostrando que os picos de 83 e 90 ms correspondiam ao XA3XX, enquanto o pico de 94 ms correspondia a XA2XX (Figura 4A). O pico de 94 ms foi selecionado para análise do IMS/IMS: os íons pertencentes ao XA3XX foram ejetados (Figura 4B), e o pico de interesse foi enviado para a célula da loja prearray. Uma separação de 3 passes foi realizada após reinjeção do íon sem ativação para garantir que apenas o pico XA2XX permaneceu após a seleção (chegando a 199 ms na Figura 4C).

Em seguida, o íon foi fragmentado após a reinjeção da área pré-loja, e uma separação de IMS de passe único foi realizada em todos os fragmentos. Duas ativações diferentes foram testadas: a configuração máxima da função de ativação pré-loja incorporada foi testada pela primeira vez (Figura 5B,C); no entanto, o precursor permaneceu o pico base do espectro. Isso não é desejado porque, para espectros de referência, fragmentos abaixo de um certo limiar de intensidade normalmente seriam removidos. Assim, foi escolhido um gradiente de prearray definido manualmente → viés pré-array → gradiente de tensão de matriz (Figura 5D,E).

Os dados gerados do IMS/IMS-MS foram desconvolvados com o MZmine 2.51, utilizando o tempo de chegada e as dimensões m/z (Figura 6A), para dar espectros IMS/IMS contendo apenas as informações de mobilidade dos fragmentos. Os picos acima de 0,2% de intensidade relativa foram exportados para calibração do CCS (os parâmetros detalhados de MZmine são dados na Tabela Suplementar S1). A calibração do CCS foi realizada utilizando-se a solução de calibração (R2 = 0,995, desvio absoluto médio de controle = 1,63%, ver Tabela Suplementar S3). Esse processamento finalmente proporcionou um espectro central, calibrado por CCS, IMS/IMS (Figura 6B).

Figure 1
Figura 1: Visão geral do processo de geração de dados IMS/IMS. Abreviaturas: IMS = espectrometria de mobilidade de íons; IMS/IMS = tandem IMS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Padrão isotópico de uma mistura de pentasacarídeo XA3XX + XA2XX arabinoxylan. (A) Sinal saturado sem DRE; (B) sinal corrigido utilizando DRE com transmissão de íons de 5% (ou seja, atenuação de 95%); e (C) perfil após a seleção do quadrúpole para remover o pico -1 Da correspondente a um isótopo de lítio. Em roxo: a região onde os picos de artefatos podem aparecer devido à saturação é ampliada 6 vezes. Abreviaturas: DRE = aprimoramento dinâmico do alcance; MS = espectrometria de massa; MSMS = tandem MS; LM Res = resolução de baixa massa; HM Res = resolução de alta massa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Visão geral da janela de controle IMS Cíclica, na qual o usuário define a sequência IMS/IMS. A sequência exibida mostra como verificar a qualidade do isolamento no IMS/IMS, com uma seleção de XA2XX após 3 passes (o espectro exibido corresponde à configuração dos eventos de seleção após a separação da primeira fase). A sequência consiste em executar uma primeira separação IMS de 3 passes ao longo de 58 ms, em seguida, ejetando os dois isoformos mais rápidos da célula IMS (segmento 3), ejetando a isoforma mais lenta (ATD entre 92 e 96 ms) na pré-loja (segmento 4), reinjetando-a na célula IMS sem ativação (segmento 6), permitindo que os íons se submetam a uma separação adicional de 3 passes (58-ms) (segmento 7), em seguida, ejetar íons da célula IMS e adquirir dados (segmento 8). Abreviaturas: IMS = espectrometria de mobilidade de íons; cIMS = IMS cíclico; IMS/IMS = tandem IMS; ADC = conversor analógico-digital; TW = onda de viagem; PE = energia potencial; ATD = distribuição de tempo de chegada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Seleção de XA2XX a partir da mistura de XA2XX e XA3XX. (A) Separação das pentasacarídeos arabinoxilanas, XA3XX e XA2XX, após 3 passes (correspondente a um tempo de separação definido em 58 ms) em torno da célula IMS Cíclica. (B) Fração ejetada logo após a primeira fase da separação do IMS. (C) Fração selecionada para IMS/IMS na qual outra separação de 3 passes foi realizada após reinjeção. O pico de interesse XA2XX é destacado em cinza. Os espectros de mobilidade de íons são mostrados em caixas de dados e anotados com seu tempo de chegada (ms). Abreviaturas: IMS = espectrometria de mobilidade de íons; IMS/IMS = tandem IMS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Princípios de dissociação induzida por colisão utilizando a área da loja de prearray. (A) Esquemas da região do array multifuncional detalhando as tensões de teclas (em vermelho) utilizadas para a seleção, a reinjeção e a ativação durante os experimentos IMS/IMS. As setas azuis mostram a direção da onda itinerante na matriz multifuncional. (B, C) Espectros IMS/IMS e MS/MS obtidos para XA2XX usando a função de ativação pré-loja incorporada (+150 V). A barra de cor representa a escala de intensidade de íon (azul = baixo; vermelho = alto). (D, E) Espectros IMS/IMS e MS/MS obtidos para XA2XX com otimização manual das tensões (gradiente de pré-array 195 V, viés prearray 180 V, deslocamento de matriz -10 V). Íons precursores são indicados por asteriscos nos espectros. Os espectros de mobilidade de íons são mostrados em caixas de dados e anotados com seu tempo de chegada (ms). Abreviaturas: IMS = espectrometria de mobilidade de íons; IMS/IMS = tandem IMS; TOF = tempo de voo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Ilustração das etapas de processamento. Resultados de (A) a captação de pico mzmine e (B) a calibração CCS da pentasacarida arabinoxylan XA2XX. A mostra a deconvolução em massa do espectro IMS/IMS através de um código de cor. B mostra o espectro IMS/IMS final após a centralidade e calibração ccs. Abreviaturas: IMS = espectrometria de mobilidade de íons; IMS/IMS = tandem IMS; CCS = seção transversal de colisão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Uma comparação de dois espectros IMS/IMS de XA2XX ilustra a reprodutibilidade do método. O espectro calibrado final deste papel (topo) é comparado com o espectro do trabalho de Ollivier et al. 21 (inferior, invertido). Abreviaturas: IMS = espectrometria de mobilidade de íons; IMS/IMS = tandem IMS; CCS = seção transversal de colisão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura Suplementar S1: Estruturas do XA2XX e XA3XX arabinoxylan pentasacarídeos. Por favor clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura Suplementar S2: Avaliação da repetibilidade do interday utilizando XA2XX. As aquisições do IMS/IMS foram repetidas nos dias 1 (superior) e dia 95 (inferior). Abreviaturas: IMS = espectrometria de mobilidade de íons; IMS/IMS = tandem IMS. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Tabela Suplementar S1: Parâmetros detalhados de MZmine. Clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela Suplementar S2: Parâmetros de instrumento alterados para avaliar a reprodutibilidade. Abreviação: ESI = ionização eletrospray. Clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela Suplementar S3: Controle da calibração ccs utilizando uma segunda aquisição de solução de calibração. Clique aqui para baixar esta Tabela.

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Discussion

O SELECT SERIES Cyclic IMS é uma ferramenta poderosa que permite selecionar uma população de íons definida — de uma determinada mobilidade m/z e íon — sem a necessidade de separação cromatográfica a montante. O instrumento oferece a possibilidade de gerar um mapa de fragmentação bidimensional dessa população de íons, a partir do qual podem ser extraídos espectros de MS/MS e IMS/IMS. No entanto, o usuário deve observar vários pontos críticos que requerem atenção durante o processo experimental.

Primeiro, o usuário deve verificar cuidadosamente a janela de isolamento de MS para a presença de possíveis contaminantes isobáricos. De fato, a janela de isolamento de um quadrupole é relativamente ampla, e conhecer íons de um m/z ligeiramente diferente que pode ser coselecionado no quadrupole ajudará o usuário a atribuir adequadamente o pico de interesse na mobilidade de íons.

Em segundo lugar, ao realizar a separação inicial, o usuário deve garantir que todos os íons sejam submetidos ao mesmo número de passagens ao redor da célula de mobilidade de íons cíclicos. Este é um aspecto importante e complicado da separação da mobilidade de íons em um dispositivo cíclico. Uma avaliação errônea do número de passes para um determinado íon pode levar a uma identificação e interpretação inadequadas dos picos. Controlar o número de passagens de diferentes populações de íons pode ser complicado devido ao comprimento relativamente curto de passe único (~1 m), e espécies com mobilidades muito diferentes podem se sobrepor rapidamente.

Em particular, um pico pode se dividir entre duas passagens diferentes se a matriz mudar de direção quando essa população de íons passar (isso é relativamente fácil de identificar: o pico dividido aparecerá mais nítido com uma população logo no início do evento Ejet e Acquire ). Para definir corretamente o número de passes, o usuário deve começar com um curto tempo de separação (1-5 ms) que dará o perfil de 1 passe. Em seguida, o usuário deve aumentar gradualmente o tempo de separação até que toda a população tenha se mudado para horários de chegada mais altos, o que dará o perfil de 2 passes. O perfil de 2 passes deve ser semelhante ao perfil de 1 passe, mas com picos mais bem resolvidos. O tempo que uma determinada população de íons leva para fazer uma passagem ao redor da célula cíclica é uma constante que o usuário pode usar para calcular o número de passes em função do tempo de separação. Por exemplo, se houver uma diferença de 10 ms entre a primeira e a segunda passagem, também haverá uma diferença de 10 ms entre a segunda e a terceira.

Em terceiro lugar, durante a fase de seleção do IMS, o usuário deve verificar cuidadosamente a qualidade do isolamento, conforme demonstrado na Figura 4. É especialmente importante verificar o perfil reinjetado porque se as configurações de altura e velocidade de TW são muito baixas, a ejeção das outras populações pode não estar completa. Usuários avançados podem corrigir isso ajustando a tensão de radiofrequência Driftcell RF na guia RF da página Tune .

Em quarto lugar, o usuário deve ter cuidado na geração do espectro de fragmentação e, notadamente, na seleção da energia de colisão adequada, especialmente se as tensões estiverem sintonizadas manualmente. De fato, a redução excessiva da tensão de deslocamento de matriz pode impactar negativamente a intensidade geral do íon, dificultando a reinjeção. Além disso, o precursor e fragmentos podem se estender por uma ampla gama de mobilidades. Assim, eles passarão rapidamente por um número diferente de passes se o tempo final de separação for alto, por isso é importante manter um evento separado de 1 ms, conforme explicado na etapa de protocolo 2.3.3. Esta é uma grande limitação, uma vez que o comprimento de passe único é relativamente curto, limitando o poder de resolução de passe único a ~100 para oligossacarídeos27. A este respeito, um maior comprimento de caminho em uma única passagem seria benéfico (ou seja, as Estruturas baseadas em TWIMS para manipulação de íons sem perdas ou SLIM, com um comprimento de caminho de 13 m28). A configuração SLIM foi lançada comercialmente muito recentemente29.

Finalmente, o usuário deve ter cuidado na definição da faixa final de mobilidade de aquisição usando o comando Pushes per bin , especialmente se trabalhar em íons carregados multiplicadores. A mobilidade de íons é de fato uma função da carga12, e, por exemplo, fragmentos carregados de singly gerados a partir de um precursor duplamente carregado provavelmente serão mais lentos do que o precursor (embora sejam compostos menores).

Uma grande limitação de usar apenas separações de MS e IMS para selecionar o precursor (e não, por exemplo, um passo upstream da cromatografia) é que um determinado m/z pode produzir vários picos no IMS e que vários picos podem vir do mesmo composto. Isso é ilustrado pelas distribuições de m/z 685.2, tanto para a mistura XA2XX+XA3XX quanto para xa3XX puro, na Figura 4A. As distribuições multimodais de IMS de um único m/z resultam de diferentes conformações de fase de gás. Para as espécies analisadas como adutos de ação de cation (em modo positivo), as diferentes conformações possivelmente decorrem de diferenças de coordenação com o contra-íon30,31,32.

Para oligossacarídeos, eles também podem surgir da separação de anomers de extremidade redutora, embora separar anomers de extremidade redutora normalmente requer maior poder de resolução de IMS do que o usado aqui33,34,35. No presente caso, a distribuição multimodal de IMS na Figura 4A resulta, em parte, das contribuições individuais de XA2XX e XA3XX. É, no entanto, notável que o XA3XX produz dois picos, que são provavelmente conformadores de coordenação de cation. Foi fácil identificar qual pico correspondia ao XA2XX (ou seja, a espécie de interesse) porque o XA3XX puro está disponível comercialmente, e seu perfil de mobilidade poderia ser registrado separadamente. Para trabalhar em misturas complexas, como mídias biológicas, pode ser importante considerar a adição de um estágio de separação cromatográfica.

Devem ser observados dois pontos em relação ao fluxo de trabalho de processamento utilizado para obter espectros IMS/IMS desconvolved em massa. Primeiro, neste protocolo, propõe-se usar o MZmine 224 para desconvolver o espectro IMS/IMS usando a dimensão MS e, notavelmente, usar o algoritmo ADAP36 para dividir os EIMs em diferentes picos. Embora dê resultados razoavelmente bons, como ilustrado na Figura 6, o algoritmo ADAP foi projetado para análises cromatográficas e, portanto, explica fatores de assimetria inerentes à cromatografia de fase líquida, como o pico de rejeito. Portanto, o algoritmo ADAP pode resultar em não identificar alguns dos recursos quando aplicados aos picos do IMS (por exemplo, ombros). Em essência, os dados do IMS são mais simples do que os dados cromatógrafos: como não há interação química dos compostos com uma coluna, espera-se que os dados do IMS adquiridos em condições adequadas (ou seja, sem saturar a célula IMS) sigam as distribuições gaussianas37,38. Idealmente, a etapa de desconvolução da ADAP seria melhor substituída por uma função de montagem gaussiana, como a usada por software destinado ao IMS como o CUISuite 239. No entanto, do jeito que está, a desconvolução gaussiana não foi diretamente adaptada à cadeia completa de tratamento descrita neste protocolo. Portanto, o uso do software gratuito de código aberto MZmine parecia ser um bom compromisso para os usuários finais.

A segunda parte do processamento que justifica a discussão é a calibração do CCS. Este protocolo propõe o uso de uma calibração de ajuste logarítmico25,26 e uma mistura comercial calibrante do mesmo provedor do espectrômetro (ver a Tabela de Materiais). Este procedimento é o mais simples de implementar no laboratório. Quanto à escolha da mistura calibrante, o usuário deve considerar que, como mencionado em vários estudos, a precisão da calibração do CCS é melhorada ao utilizar calibrantes da mesma classe molecular e estado de carga como o analito26,40,41. O erro introduzido ao calibrar com tipos relativamente semelhantes de compostos (por exemplo, carboidratos vs. peptídeos) é moderado. No entanto, recomenda-se não usar íons muito diferentes, como, por exemplo, usar aglomerados de sal como calibrantes ao medir carboidratos41. Em relação à escolha do método de calibração, Richardson et al.42 relataram recentemente um novo método de calibração que leva em conta a física do TWIMS para melhorar a precisão da calibração (com um software fornecido). No entanto, a abordagem requer a avaliação de parâmetros altamente específicos através da análise de vários tipos de compostos — que vão desde metabólitos até proteínas nativas. Como nenhuma mistura de tal variedade de compostos pode ser encontrada comercialmente, este método não foi implementado no presente protocolo.

Por fim, para avaliar a reprodutibilidade do método, avaliamos a reprodutibilidade interdiária repetindo a aquisição do IMS/IMS-MS no dia 1º e dia 95 (Figura Suplementar S2). O experimento mostrou que os dados do IMS/IMS-MS são altamente reprodutíveis, sem pico de IMS mudando em mais de 0,2 ms durante este período prolongado. O espectro IMS/IMS gerado neste trabalho foi ainda mais comparado a outro espectro de XA2XX adquirido em diferentes condições para trabalhos anteriores em rede molecular de mobilidade de íons21. Alguns parâmetros instrumentais que podem impactar a estrutura de íons e o perfil de mobilidade de íons13 foram deliberadamente alterados — os parâmetros de origem e o gradiente de tensão de ativação (uma comparação das diferentes condições instrumentais é dada na Tabela Suplementar S2). Em seguida, os dois espectros foram comparados usando o escore de similaridade de cosseno — que é popular para a comparação de espectros de MS/MS em metabolômicas — na plataforma GNPS5 (tolerância ccs para fragmentos correspondentes = 0,015 nm2).

A comparação mostrou um escore de similaridade cosseno de 0,87 (Figura 7), que pode ser considerado elevado em relação às importantes variações instrumentais aplicadas. Isso leva à ideia de que as bibliotecas espectrais IMS/IMS poderiam ser usadas para desreplicar glicocanos em misturas complexas com alto nível de confiança, o que não seria o caso dos espectros de MS/MS. Observe que, embora a abordagem atual utilize apenas a dimensão CCS do espectro de fragmentação, os dados IMS/IMS-MS também contêm informações de MS, o que não é redundante com o CCS. Para otimizar o poder dereplicativo do IMS/IMS, um sistema de pontuação bidimensional deve ser desenvolvido.

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Disclosures

Os autores não têm conflito de interesses para divulgar.

Acknowledgments

S.O. agradece à Agência Nacional de Pesquisa francesa por financiar seu Doutorado (conceder ANR-18-CE29-0006).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
33-α-L- plus 23-α-L-Arabinofuranosyl-xylotetraose (XA3XX/XA2XX) mixture Megazyme Ltd., Wicklow, Ireland O-XAXXMIX XA2XX + XA3XX mixture
33-α-L-Arabinofuranosyl-xylotetraose (XA3XX) Megazyme Ltd., Wicklow, Ireland O-XA3XX Pure XA3XX standard
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, Eppendorf Quality, colorless, 1,000 tubes Eppendorf, Hamburg, Germany 0030120086 Used to prepare the carbohydrate stock solution and dilution
FALCON 50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm Corning Science México S.A. de C.V., Reynosa, Tamaulipas, Mexico 352070 Used to prepare the aqueous stock solution of 100 mM LiCl
Lithium Chloride (ACS reagent, ≥99 %) Sigma-Aldrich Inc., Saint Quentin Fallavier, France 310468 Used to dope the sample with lithium
Major Mix IMS/Tof Calibration Kit Waters Corp., Wilmslow, UK 186008113 Calibration solution for MS and IMS
MassLynx 4.2 SCN1016 Release 6 (Waters Embedded Analyser Platform for Cyclic IMS 2.9.1 Release 9) Waters Corp., Wilmslow, UK 721022377 Cyclic IMS vendor software for instrument control and data processing
Methanol for HPLC PLUS Gradient grade Carlo-Erba Reagents, Val de Reuil, France 412383 High-purity solvent
MS Leucine Enkephaline Kit Waters Corp., Wilmslow, UK 700002456 Reference compound used for tuning of the mass spectrometer
SCHOTT DURAN 100 mL borosilicate glass bottle VWR INTERNATIONAL, Radnor, Pennsylvania, US 218012458 Used to prepare the solution of 500 µM LiCl in 50:50 MeOH/Water
SELECT SERIES Cyclic IMS Waters Corp., Wilmslow, UK 186009432 Ion mobility-mass spectrometer equipped with a cylic IMS cell
Website: http://mzmine.github.io/ MZmine Development Team - Link to download the MZmine software
Website: https://github.com/siollivier/IM-MN INRAE, UR BIA, BIBS Facility, Nantes, France - Link to an in-house R script containing a CCS calibration function

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Química Edição 179
Usando um espectrômetro de mobilidade de íons cíclicos para experimentos de mobilidade de íons tandem
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Ollivier, S., Fanuel, M., Rogniaux, H., Ropartz, D. Using a Cyclic Ion Mobility Spectrometer for Tandem Ion Mobility Experiments. J. Vis. Exp. (179), e63451, doi:10.3791/63451 (2022).

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