Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

שימוש בספקטרומטר ניידות יונים מחזורי לניסויי ניידות יון דו-מושבית

Published: January 20, 2022 doi: 10.3791/63451
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1INRAE, UR BIA, F-44316 Nantes, France, 2INRAE, BIBS Facility, F-44316 Nantes, France

Summary

ספקטרומטריית ניידות יונים (IMS) היא השלמה מעניינת לספקטרומטריית מסה לאפיון ביומולקולות, בעיקר משום שהיא רגישה לאיזומריזם. פרוטוקול זה מתאר ניסוי IMS (IMS/IMS) דו-מושבי, המאפשר בידוד של מולקולה ויצירת פרופילי הניידות של שבריה.

Abstract

אפיון מדויק של מבנים כימיים חשוב להבין את המנגנונים הביולוגיים הבסיסיים שלהם ואת המאפיינים התפקודיים שלהם. ספקטרומטריית מסה (MS) היא כלי פופולרי אך לא תמיד מספיקה כדי לחשוף לחלוטין את כל התכונות המבניות. לדוגמה, למרות פחמימות רלוונטיות מבחינה ביולוגית, האפיון שלהם מסובך על ידי רמות רבות של איזומריזם. ספקטרומטריית ניידות יונים (IMS) היא השלמה מעניינת מכיוון שהיא רגישה לקונפורציות יונים, ולכן לאיזומריזם.

יתר על כן, ההתקדמות האחרונה שיפרה באופן משמעותי את הטכניקה: הדור האחרון של מכשירי IMS מחזוריים מציע יכולות נוספות בהשוואה למכשירי IMS ליניאריים, כגון כוח פתרון מוגבר או האפשרות לבצע ניסויים בניידות יונים דו-מושבית (IMS/IMS). במהלך IMS/IMS, יון נבחר בהתבסס על ניידות היונים שלו, מקוטע וניתוח מחדש כדי לקבל מידע על ניידות יונים על שבריו. עבודה שנערכה לאחרונה הראתה כי פרופילי הניידות של הקטעים הכלולים בנתוני IMS/IMS כאלה יכולים לשמש כטביעת אצבע של גליקן מסוים וניתן להשתמש בהם באסטרטגיית רשת מולקולרית כדי לארגן ערכות נתונים של גליקומוניקה באופן רלוונטי מבחינה מבנית.

מטרת פרוטוקול זה היא אפוא לתאר כיצד ליצור נתוני IMS/IMS, מהכנה מדגמית לכיול חתך הרוחב הסופי של התנגשות (CCS) של ממד ניידות היונים המניב ספקטרום ניתן לשחזור. אם ניקח את הדוגמה של גליקאן נציג אחד, פרוטוקול זה יראה כיצד לבנות רצף בקרה של IMS /IMS במכשיר IMS מחזורי, כיצד להסביר את רצף הבקרה הזה כדי לתרגם את זמן ההגעה של IMS לזמן הסחף (כלומר, זמן ההפרדה האפקטיבי החל על היונים), וכיצד לחלץ את פרטי הניידות הרלוונטיים מהנתונים הגולמיים. פרוטוקול זה נועד להסביר בבירור את הנקודות הקריטיות של ניסוי IMS/IMS ובכך לסייע למשתמשי IMS מחזוריים חדשים לבצע רכישות פשוטות וניתנות לשחזור.

Introduction

האפיון הכימי המלא של ביומולקולות הוא המפתח להבנת התכונות הביולוגיות והתפקודיות הבסיסיות שלהם. לשם כך, מדעים "omics" התפתחו בשנים האחרונות, במטרה לאפיין בקנה מידה גדול של מבנים כימיים בריכוזים ביולוגיים. בפרוטאומיקה ובמטבולומיקה, טרשת נפוצה הפכה לכלי ליבה כדי לפענח את ההטרוגניות המבנית שנמצאת במדיה הביולוגית - במיוחד הודות לרגישותה וליכולתה לספק מידע מבני באמצעות MS דו-מושבי (MS/MS). באסטרטגיות MS/MS, יון נבחר על פי המסה שלו, לאחר מכן מקוטע, ולבסוף, המסות של שבריו נרכשים כדי ליצור טביעת אצבע של המולקולה. ספקטרום MS/MS יכול לשמש, בפרט, כדי להתאים מסדי נתונים ספקטרליים 1,2, או לשחזר באופן זמני את מבני האב3,4. תחת ההנחה כי ספקטרום דומה שייך לתרכובות דומות, נתוני MS / MS יכולים לשמש גם לבניית רשתות מולקולריות (MNs) המחברות מינים קשורים באמצעות ציון דמיון 5,6.

עם זאת, בגלל המאפיין הטבוע של טרשת נפוצה כדי לזהות את יחס המסה למטען (m/z) של יונים, הטכניקה עיוורת למספר תכונות מבניות הנופלות בטווח של איזומריזם (סטריאו).. לדוגמה, פחמימות עשויות מכמה תתי-יחידות חד-יחידות חד-צדדיות, שרבות מהן סטריאואיזומרים או אפילו אפימרים (למשל, Glc לעומת Gal או Glc vs. Man). יחידות משנה אלה מקושרות על ידי קשרים גליקוסידיים, אשר יכולים להיות שונים על ידי המיקום של ההצמדה (regioisomerism) ואת התצורה הסטרית של הפחמן האנומרי (אנומריזם). מאפיינים אלה מקשים על טרשת נפוצה עצמאית להבחין בין איזומרים פחמימות7, ורק regioisomerism ניתן לטפל באמצעות שיטות הפעלה אנרגיה גבוהה8,9,10. למרות נגזרות היא אפשרות לשבש את השתוות של קבוצות סטריאוטיאוסומריות11, זה דורש הכנה מדגם נרחבת. אפשרות נוספת, פשוטה יותר, היא לשייך טרשת נפוצה עם ממד אנליטי הרגיש לאיזומריזם, כגון IMS.

מכיוון שפרוטוקול זה מיועד למשתמשים שכבר מכירים את המושגים הבסיסיים של IMS, ומכיוון שביקורות מפורטות זמינות במקומות אחרים12,13, רק סקירה קצרה של עקרונות IMS ניתנת כאן. IMS היא שיטת הפרדה של שלב הגז המסתמכת על אינטראקציה של יונים עם גז חוצץ ושדה חשמלי, ובסופו של דבר מפרידה יונים על פי הקונפורמציות של שלב הגז שלהם. עקרונות שונים של IMS בשילוב טרשת נפוצה ניתן למצוא על מכשירים מסחריים: חלקם פועלים בשדות חשמליים גבוהים ונמוכים לסירוגין (IMS אסימטריים שדה, FAIMS), בעוד שרובם פועלים בתוך מגבלת השדה הנמוך - בעיקר IMS צינור להיסחף (DTIMS, שדה חשמלי יורד באופן ליניארי), IMS גל נסיעה (TWIMS, גלים פוטנציאליים סימטריים) ו- IMS לכודים (TIMS, זרימה גבוהה של יונים לוכדים גז חוצץ נגד שדות חשמליים)13 . שיטות השדה הנמוך מאפשרות גישה למה שמכונה CCS, מאפיין של זוג היונים-גז המייצג את פני השטח (ב- Å2 או nm2) של היון המקיים אינטראקציה עם גז המאגר במהלך ההפרדה. CCS הוא תיאורטית בלתי תלוי במכשיר ולכן הוא שימושי כדי ליצור נתונים שניתן לשחזר בין מעבדות שונות14. הפרדות ניידות יונים יכולות להיות מושפעות מפרמטרים שונים, ובמיוחד מתנודות של לחץ הגז וטמפרטורת הגז בתא הניידות. כיול CCS הוא דרך לתקן זאת, שכן הן הכיול והן מינים של עניין יושפעו באופן דומה13. עם זאת, חובה להתקין את המכשיר בחדר מבוקר טמפרטורה ויש לו מערכת בקרת לחץ גז אמינה.

התפתחות מעניינת של IMS היא IMS / IMS, שהוצגה לראשונה בשנת 2006 על ידי הקבוצה של קלמר כאנלוגית של MS / MS15,16. ב- IMS / IMS, יון של עניין מבודד באופן סלקטיבי בהתבסס על ניידות היונים שלו; לאחר מכן הוא מופעל (עד לפיצול אפשרי), ומבוצע ניתוח IMS חדש של היון או הקטעים המופעלים. בעיצוב האינסטרומנטלי הראשון, שני תאי IMS הוכנסו לסדרה, מופרדים על ידי משפך יונים שבו עמדה ההפעלה. מאז, למרות שהוצעו מספר הגדרות IMS/IMS (לסקירה, ראו אלדריד ותלסינו17), ספקטרומטר המסה המסחרי הראשון עם יכולת IMS/IMS הפך לזמין רק בשנת 201918. מכשיר זה שיפר באופן משמעותי את הרעיון הראשוני על ידי שילובו עם פריצת דרך טכנולוגית נוספת: עיצוב מחזורי של תא IMS.

תא ה- IMS המחזורי מאפשר תיאורטית להגדיל כמעט לאין שיעור את אורך נתיב הסחף, ובכך את כוח הפענוח של המכשיר19. זה הושג באמצעות גיאומטריה מכשיר מסוים, שבו תא TWIMS מחזורי ממוקם אורתוגנלית לציר האופטי היונים הראשי. אזור מערך רב-תכליתי בכניסה לתא IMS מאפשר שליטה בכיוון נתיב היון: (i) שליחת יונים לצדדים להפרדת IMS, (ii) קדימה לזיהוי MS, או (iii) אחורה מתא ה- IMS לאחסון בתא סידור מראש. מתא אחסון זה מראש, ניתן להפעיל את היונים ואת הקטעים שהוכנסו מחדש בתא IMS למדידת ניידות יונים, גישה ששימשה בהצלחה לאפיון stereoisomers20. בסופו של דבר, הנתונים שנאספו מכילים ניידות יונים ומידע m/z עבור המבשר ורסיסיו.

בפרסום שפורסם לאחרונה שהשתמש בעיצוב מחזורי זה לניתוחי גליקנים (Ollivier et al.21), הראינו כי פרופיל הניידות של השברים הכלולים בנתוני IMS / IMS כאלה פועל כטביעת אצבע של ביומולקולה שניתן להשתמש בה באסטרטגיית רשת מולקולרית. הרשת שנוצרה, הנקראת IM-MN, הובילה לארגון ערכות נתונים של גליקומוניקה באופן רלוונטי מבחינה מבנית, ואילו הרשת שנבנתה אך ורק מנתוני MS/MS (MS-MN) חשפה מידע מועט. כדי להשלים פרסום זה ולסייע למשתמשי IMS מחזוריים ליישם זרימת עבודה זו, פרוטוקול זה מספק תיאור מלא של הפרוטוקול המשמש לאיסוף הנתונים. פרוטוקול זה מתמקד רק ביצירת נתוני IMS/IMS שבהם משתמשים יכולים להשתמש כדי לבנות רשתות IM-MN (ראה21) - או עבור כל יישום אחר לפי בחירתם. בניית IM-MN לא תיחשב כאן, שכן פרוטוקולים עבור רשת מולקולרית כבר זמינים22. הנקודות המכריעות שיש לעקוב אחריהן כדי ליצור רכישות IMS/IMS יקרות ערך הניתנות לשחזור מודגשות. לוקח את הדוגמה של אחד oligosaccharides נחקר על ידי אוליבייה ואח '. 21, השלבים הבאים מפורטים: (i) הכנת מדגם, (ii) כוונון של מכשיר IMS מחזורי, (iii) איסוף שיא אוטומטי של הנתונים, ו - (iv) כיול CCS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: מבט כולל על הפרוטוקול מסופק באיור 1. הפרמטרים המשמשים לניסויים המתוארים בפרוטוקול הנוכחי ניתן למצוא בטבלה משלימה S1 ובטבלה משלימה S2.

1. הכנת הפתרון לדוגמה

הערה: הפרוטוקול מתואר באמצעות פנטסכריד arabinoxylan (23-α-L-arabinofuranosyl-xylotetraose או XA2XXX; ראה את טבלת החומרים) כדוגמה.

  1. הכנת הממס: 500 μM LiCl ב 50:50 H2O:MeOH (vol./vol.).
    1. הכן פתרון מלאי של 100 מ"מ של ליתיום כלוריד (LiCl) ב- H2O על ידי שקילה של 212 מ"ג LiCl והוסף 50 מ"ל של מים דה-יוניים בטוהר גבוה (H2O) בצינור חרוטי פוליפרופילן 50 מ"ל. יש לנער עד להמסה מלאה.
      הערה: הממס מסומם עם מלח ליתיום כדי לקדם את היווצרות [M +Li]+ תוספות במקור היון של הספקטרומטר, כפי שהוא בדרך כלל מניב ספקטרום פיצול באיכות טובה יותר לעומת תוספים אלקליים אחרים. השימוש LiCl מומלץ כי חומצות אורגניות (ולכן המלחים שלהם) נמצאו בעבר להשפיע על פרופילי IMS23.
    2. בבקבוק זכוכית, לדלל את פתרון מלאי LiCl 200x: ל 250 μL של פתרון המניה, להוסיף 24.75 מ"ל של H2O. להוסיף 25 מ"ל של מתנול (MeOH) כדי להגיע לריכוז סופי של LiCl של 500 מיקרומטר ב 50:50 H2O:MeOH (v /v). Sonicate במשך 2 דקות כדי degas הממס.
      הערה: MeOH מהווה סכנה בריאותית (H225, H301, H311, H331, H370); לתפעל מתחת למכסה המנוע המחלץ לובש חלוק מעבדה, כפפות, והגנה על העיניים. שיעור של 50:50 MeOH / H2O (v / v) נראה הממס הטוב ביותר עבור יינון של oligosaccharides; עם זאת, MeOH יכול להיות מוחלף על ידי אצטוניטריל (ACN) במידת הצורך.
  2. בצינור פוליפרופילן 1.5 מ"ל, לשקול 1 מ"ג של פחמימות. יש להתמוסס בנפח מתאים של 500 מיקרומטר LiCl כדי להגיע לריכוז של 1 מ"ג/מ"ל. לדלל לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מ"ל ב 50:50 MeOH / H2O + 500 μM LiCl. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 °C (65 °F).
    הערה: הריכוז של 10 מיקרוגרם / מ"ל נבחר כדי לייעל את האות על כל יוני שבר במהלך IMS / IMS-MS (זה עבור תרכובת טהורה; להגדיל את הריכוז בעת עבודה על תערובות). לרכישת ספקטרום IMS/IMS הפניה, אין לדלל עוד יותר את המדגם: רוויה של גלאי MS לפני הפיצול צפויה, אם כי המכשיר מציע אפשרויות לתקן אותו (ראה שלב 3.2.).

2. כוונון של ספקטרומטר המסה של IMS המחזורי

הערה: הוראות הקשורות לתוכנה (חלונות, תפריטים ופקודות) מסומנות באותיות מודגשות.

  1. פתח את מסוף המכשירים מתוכנת בקרת המכשירים (דף כוונון MS , עיין בפרטי התוכנה בטבלת החומרים) והצב את המכשיר במצב הפעלה . המתן לפחות 3 שעות עד שהמתחים הגבוהים יתייצבו בתא ה- IMS.
    הערה: לקבלת השחזור הטוב ביותר, המתחים בתא IMS צריכים להיות מיוצבים לחלוטין. הפעל את המתחים הגבוהים ותן למכשיר להתייצב בן לילה לפני כל ניתוח IMS מחזורי. יתר על כן, הלחץ והטמפרטורה בתא ניידות היונים חייבים להישמר קבועים ככל האפשר. למרות קריאה חוזרת ללחץ זמין בכרטיסייה ואקום , אין readback זמין עבור הטמפרטורה. שמור את המכשיר במעבדה תרמוסטט. המכשיר המשמש בעבודה זו פועל ב 1.75 mbar במעבדה תרמוסטט ב 20 °C (60 °F).
  2. הגדרת מכשיר IMS מחזורי
    הערה: יש להחדיר פתרונות סטנדרטיים באמצעות מערכת הנוזלים המובנית עבור התקנת המכשיר.
    1. מניחים את מיכלי הנוזלים המלאים בתקנים המתאימים המסופקים על ידי היצרן במערכת הנוזלים: מאגר B ('Lockmass'): 10 pg/μL לאוצין אנקפלין (LEU ENK) ב 50:50 ACN / H2O + 0.1% חומצה פורמית; מאגר C ('קליברנט'): MajorMix.
      הערה: בפרוטוקול זה, פתרון הכיול של MajorMix ישמש לכיול ממדי m/z ו- CCS. מסיבות מעשיות, יבוצע כיול CCS חיצוני (ראה שלב 5 של הפרוטוקול); לפיכך, ניתן גם להשתמש בתערובת קליברנט בתוך הבית עבור CCS ועוד calibrant עבור m / z (למשל, נתרן formate או נתרן יודיד).
    2. בדף הכוונון של מסוף הקוורץ, עבור לכרטיסיה Fluidics . הגדר את נוזלים מדגם למאגר C ואת נוזל הייחוס למאגר B. החדיר את שני הפתרונות ברציפות במקור היון כדי לבדוק את אות MS.
    3. בצע את הגדרת ADC, הגדרת גלאי (באמצעות LEU ENK) וכיול המוני (עיין בטבלת החומרים עבור פתרון הכיול) מהדף הגדרת מכשירים בהתאם להוראות היצרן.
  3. הקלט רכישת IMS של פתרון הכיול באמצעות הפרדת מעבר יחידה (השתמש בה עבור כיול IMS חיצוני).
    הערה: מקור היונים ופרמטרי הגל הנודד (TW) (גובה הגל הסטטי ומהירות הגל) חייבים להישמר קבועים במהלך כל הרכישות (כיול ורכישות). אם למשתמש אין ידע מוקדם על הפרמטרים האופטימליים עבור המדגם שלו, שלב זה יכול להתבצע לאחר שלב 3 של הפרוטוקול (עבור [M+Li]+ תוספות של אוליגוסכרידים ניטרליים, התוצאות הייצוגיות משתמשות בגובה TW של 16 V ומהירות TW של 350 מ'/ש', המעניקות את התוצאות הטובות ביותר).
    1. מהכרטיסיה Fluidics , בחר מדגם מיקום מבולבל והטמיע את הקליברנט (ראה טבלת החומרים) במקור היונים (באמצעות מערכת הנוזלים המובנית) באמצעות הבדיקה 'מדגם' בקצב זרימה של 10 μL / min.
    2. הגדר רצף IMS של מעבר יחיד. מהדף 'כוונון' , מקם את הכלי במצב ניידות ופתח את החלון בקרת רצף מחזורי . בחר מצב מתקדם . בכרטיסיה פונקציות מחזוריות של חלון חדש זה, בחר הוסף חבילה ולאחר מכן מעבר יחיד/מרובה. המתן עד שרצף של אירועי ניידות יופיע בכרטיסיה רצף של אותו חלון.
      הערה: כדי להפעיל את התצוגה בזמן אמת, על המשתמש להחיל את פרמטרי המכשיר: לחץ על הכוונון במצב TOF או על הפעל במצב ניידות. לפני העברת המכשיר בין מצבי TOF למצבי ניידות, יש צורך לבטל כל רכישה פועלת (כולל תצוגת הדף Tune). השפע היחסי של יונים עשוי להשתנות בין מצב TOF למצב ניידות עקב שינויים בפרמטרי העברת היונים.
    3. התאם את הרצף כך שכל היונים הקליברנטיים יבצעו מעבר יחיד סביב מסלול המרוצים המחזורי של IMS. אין לשנות את זמן ההזרקה או את ההוצאה ולרכוש זמן; עם זאת, צמצם את הזמן הנפרד ל- 1 אלפיות השנייה (בכרטיסיה רצף ). אם יונים מסוימים של תערובת הכיול אינם מתאימים בחלון זמן ההגעה המוצג, שנה את הסינכרון של ה- IMS עם הדוחף של מנתח TOF התאוצה האורתוגונלית על-ידי הגדלת מספר הדחפים לסל בכרטיסיה הגדרות ADC .
      הערה: הזמנים ברצף הבקרה שולטים רק במערך הרב-תכליתי עבור גוון gating. כל עוד היונים עוסקים במעבר הראשון שלהם (או nth) סביב מסלול המרוצים, הם יסיימו את המעבר האמור גם אם הכיוון של TW השתנה במערך בינתיים. הפחתת זמן ההפרדה ל- 1 אלפיות השנייה פירושה שהמערך יעבור למצב פליטה לאחר 1 אלפיות השנייה. זה מבטיח כי היונים מהר יותר לא יהיה מספיק זמן לעבור את המערך ולעסוק במעבר שני לפני היונים איטיים יותר לסיים את המעבר הראשון שלהם. לכן, כל היונים יהיו כפופים לאותו מספר של מעברים (כלומר, מעבר אחד), אשר יש צורך לבצע כיול IMS.
    4. תרשום רכישה של 2 דקות. בחלון בקרת רצף מחזורי , לחץ על רכישה כדי לפתוח את החלון המוקפץ הגדרות רכישה . הזן את שם הקובץ, התיאור ואורך הרכישה (דקות) ולחץ על שמור.
  4. רשום רכישה נוספת של 2 דקות של פתרון הכיול באותם תנאים כמו שלב 2.3 (השתמש בזה כדי לבדוק את איכות הכיול של CCS). בחלון בקרת רצף מחזורי , לחץ על רכישה כדי לפתוח את החלון המוקפץ הגדרות רכישה . הזן את שם הקובץ, התיאור ואורך הרכישה (דקות) ולחץ על שמור.
  5. לשטוף ביסודיות את מערכת fluidics עם 50:50 H2O / ACN כדי למנוע התגבשות של calibrant בצנרת הצצה.

3. רכישת IMS/IMS-MS

  1. באמצעות משאבת מזרק, להחדיר את המדגם (מסומם ליתיום) ב 10 מיקרוגרם / מ"ל דרך הבדיקה מדגם בקצב זרימה של 10 μL / min.
  2. העבר את הכלי למצב TOF (מדף כוונון MS ) כדי לבדוק את יציבות האות. רשום רכישת טרשת נפוצה מלאה (1 דקות) של המדגם, אשר יהיה שימושי כדי לבדוק את התבנית האיזוטופית ואת נוכחותם של מזהמים פוטנציאליים.
    הערה: מכיוון שריכוז המדגם נבחר כדי לקבל אות יון טוב עבור השברים, ניתן לצפות ברוויה של TOF בשלב זה. ניתן לזהות רוויית TOF באמצעות הממצאים הבאים: (i) רזולוציית טרשת נפוצה מוגברת באופן מלאכותי, (ii) שינוי ביחסים איזוטופיים, ו- (iii) שפע של פסגות בשפע נמוך בין איזוטופים. השתמש בעדשת DRE (שיפור טווח דינמי, הכרטיסיה פרופיל Quad/MS/DRE של דף הכוונון הראשי) כדי להחליש את העברת היונים ולמחוק את הרוויה במצב TOF (איור 2A,B).
  3. שים את המכשיר במצב MSMS (הכרטיסיה פרופיל Quad/MS של דף המנגינה הראשי) ובחר את המסה של היון הממוקד בשדה מסה MSMS לבידוד ברביעייה (בדוגמה: m/z של 685.2, המתאים למין היוני [M+Li]+ של הפנטסכריד הארבינוקסילן). רשום רכישה של דקה אחת כדי לבדוק את בידוד המבשר בעת עיבוד הנתונים.
    הערה: תוספות ליתיום יש איזוטופ ב--1 Da של הפסגה המונואיזוטופית, אשר יש להסיר מחלון הבחירה של MS / MS, כך שזה לא יפריע לשלבי העיבוד. ניתן להסיר אותו על-ידי צמצום טווח הבחירה באמצעות הפרמטרים רזולוציית LM ורזולוציית HM בכרטיסיה פרופיל Quad/MS (איור 2C).
  4. הגדר רצף IMS "חיתוך" כדי לבצע בחירה מבוססת ניידות של איזומר העניין.
    1. העבר את המכשיר למצב ניידות (ראה שלב 2.3.2). בחלון בקרת רצף מחזורי , מהכרטיסיה פונקציות מחזוריות , בחר הוסף חבילה ולאחר מכן חתך. המתן להופעת רצף מורכב של אירועי ניידות בכרטיסיה רצף (איור 3).
      הערה: ניתן לדמיין כל שלב בתהליך IMS/IMS: לחץ על האירוע 'הוצא ורכוש' בכרטיסיה 'רצף'. לאחר סימון באדום, העבר אותו למיקום המתאים בתוך הרצף באמצעות הלחצנים למעלה ולמטה.
    2. מקם את האירוע 'הוצא ורכוש ' מיד לאחר האירוע הנפרד הראשון (כלומר, הזז אותו בשורה 3 במקום בשורה 8 ברצף כפי שמוצג באיור 3) ולאחר מכן לחץ על הפעל. חפש את תוצאות ההפרדה הראשונית שיוצגו בזמן אמת. הגדל את משך הזמן של האירוע הנפרד הראשון עבור הפרדה מרובת מעברים על-ידי שינוי ערך הזמן עבור אירוע זה ברצף עד שהרזולוציה של פסגות IMS תהיה משביעת רצון. הקלט רכישה של דקה אחת לעיון.
      הערה: שים לב לערך השהיית ההתחלה של ADC בכרטיסיה הגדרת ADC : יהיה שימושי לבדוק את איכות הבידוד.
    3. לחץ על השהה. שים לב שתוצאות ההפרדה הראשונית מוצגות, אם כי שינויים ברצף הפקדים לא יוחלו עד שהמשתמש ילחץ שוב על הפעל . מקם את האירוע 'הוצא ורכוש' מתחת לאירועי 'הוצא', 'הוצא' ל'חנות מקדימה' ו'חסימה והוצאה' . התאם את משך האירועים כך שהשיא הממוקד יהיה באזור 'הוצא אל טרום-חנות' , וכל יון אחר נמצא באזור 'הוצא ' או 'החזק' ו'הוצא' .
      הערה: ניתן לדמיין את משך הזמן של שלושת האירועים הללו בהשוואה להפצות זמן ההגעה (ATDs) באמצעות סרגל מקודד בצבע מתחת לספקטרום הניידות בכרטיסיה Mobilogram (איור 3).
    4. מקם את האירוע 'הוצאה ורכישה' בסוף הרצף, מתחת להוצאה מחדש מקדם-חנות והאירועים הנפרדים השניים. לחץ על הפעל כדי להציג את האוכלוסיה שנבחרה.
      הערה: מאחר שהאוכלוסייה שנבחרה עזבה את תא ה- IMS, כל ההפרדות הקודמות אבדו והיא חוזרת להפרדה של מעבר יחיד (הרצויה).
    5. בדוק את איכות הבידוד. כדי לוודא שרק שיא העניין נבחר, בצע את אותה הפרדה לאחר החזרה למצב הקודם (כלומר, אותו זמן נפרד ) כפי שמוצג באיור 4. הקלט רכישה של דקה אחת לעיון.
      הערה: המשתמשים מוזמנים לבדוק את האוכלוסייה שנפלטה; חלון הזמן 'הוצא לקדם-חנות' צריך להיות ברמה בסיסית (איור 4B). כדי לבדוק זאת, מקם את השהיית ההתחלה של ADC במצב ידני בכרטיסיה הגדרות ADC והזן את זמן ההשהיה שצוין בשלב 3.4.2. הקלט רכישה של דקה אחת לעיון.
    6. בכרטיסיה רצף , בעמודה לצד זמני האירוע המוגדרים על-ידי המשתמש (העמודה Time Abs , המסומנת באדום), חפש את הזמנים המסוכמים של כל האירועים. שימו לב לשרירי הבטן של הזמן שנמצאו על קו האירוע Reinject מקדם-חנות לביצוע כיול CCS.
  5. לפצל את הפסגה הממוקדת בין שני הסיבובים של IMS. שנה את המתחים של שלב החזרה כדי להגדיל את האנרגיה הקינטית של היונים, ושבר אותם עם התנגשות עם גז ניידות היונים.
    1. הגדר את משך האירוע Separate ישירות לפני ההוצאה והרכישה ל- 1 אלפיות השנייה (ראה הסבר בשלב 2.3.3).
    2. בשורה הוצא מחדש מקדם-חנות , סמן את התיבה אפשר הפעלה ומטב את הפיצול עם הפקד המוכלל. אם הספקטרום משביע רצון (לדוגמה, שיא הבסיס הוא שבר), המשך ישירות לשלב 3.5.4.
      הערה: בעת הפעלת הפעלה, שלושה מתחים על הקו יהפכו לאפורים: אלה המתחים שהמשתמש צריך לשנות אם נדרש אופטימיזציה ידנית של המתחים (ראה את השלב הבא). שלושת המתחים הללו (מעבר צבע קדם-מערך, הטיית קדם-מערך והיסט מערך) יוצרים את מעבר הצבע המשמש להפעלת היונים. האנרגיה הקינטית של היונים תגדל עם השיפוע בין ההטיה טרום-מערך להיסט המערך (ראו איור 5). ערכי ברירת המחדל של ערכי היסט → הטיית מעבר צבע → הם: ללא הפעלה 85 → 70 → 45 V; הפעלה מרבית של הפונקציה המובנית 185 → 170 → -5 V (+150 V). לאחר הפיצול, אל תשכח להתאים מחדש את שידור היונים באמצעות עדשת DRE (להקטין את ההנחתה של האות) (ראה שלב 3.2.).
    3. אם הפיצול אינו משביע רצון עם הפקד המובנה, בטל את הסימון בתיבה אפשר הפעלה והמשך לייעל באופן ידני את מתחי ההחזרה. הגדל את מתח מעבר הצבע לפני המערך (מתח ההטיה טרום-מערך חייב תמיד להישמר 15 V מתחת למעבר הצבע טרום-מערך), והורד את מתח היסט המערך (שניתן להגדירו כשלילי) עד שהתוצאות יהיו משביעות רצון.
      הערה: בעת כוונון ידני של המתחים של המערך הרב-תכליתי, המשתמש יכול לעבור מהתצוגה 'Mobilogram' לשרטוטים אינטראקטיביים של המתחים המוחלים במערך הרב-תכליתי (תרשים PE) כדי להמחיש טוב יותר את הגדרות המתח (איור 5A).
    4. רשום רכישה של 2 דקות. בחלון המוקפץ של הרכישה, סמן את האפשרות שמור על זמן דריפט כדי ליצור קובץ המכיל רק את זמני ההגעה לעומת m/z (זמן הרכישה המשמש לניתוחים כרומטוגרפיים - זמן השמירה -מוסר מהקובץ). שים לב שקובץ זה מסומן בשם *_dt. RAW.
      הערה: אם המשתמש שוכח לבדוק את האפשרות שמור על זמן דריפט , עדיין ניתן לחלץ את ממד IMS באמצעות תוכנת Driftscope 2.9 (קובץ | ייצוא ל- MassLynx | שמור על זמן דריפט).
  6. סובבו את המכשיר בחזרה למצב TOF בעמוד הכוונון הראשי, ושטפו את המערכת ביסודיות עם 50:50 MeOH/H2O לפני שתמשיכו במדגם הבא.

4. עיבוד IMS/IMS-MS עם MZmine 224

הערה: MZmine 2 זמין מכתובת ה- URL שניתנה בטבלת החומרים. מומלץ להשתמש ב- MZmine 2.51. בעת הכנת כתב יד זה, הגירסאות המאוחרות יותר אינן יכולות לפתוח קבצי RAW ממכשירי IMS מחזוריים עקב שינוי בפונקציית הייבוא.

  1. יבא את הקבצים הגולמיים המכילים רק את ממדי IMS ו- m/z (*_dt. RAW) באמצעות שיטות נתונים גולמיות | ייבוא נתונים גולמי.
    הערה: קבצים גולמיים יופיעו בצד שמאל של החלון הראשי של MZmine. אל תייבא את *המקורי . קבצי RAW שעדיין מכילים את ממד זמן השמירה. MZmine אינו מבחין בין זמן שמירה לזמן ההגעה של IMS, ונקודות הנתונים של שני הממדים יחפפו.
  2. מטב את פרמטרי זרימת העבודה בקובץ מייצג על-ידי בחירתו במקטע קבצי נתונים גולמיים רשימה.
    1. הערך את רמת הרעש בנתונים. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הקובץ ברשימה קבצי נתונים גולמיים , בחר הצג TIC והצג את שיא הבסיס "כרומטוגרמה" (BPC). לחץ פעמיים על הפסגה הקטנה ביותר הנצפית בעין כדי להציג את ספקטרום המסה שלה. שקול את רמת הרעש בנתונים להיות סביב זה של האיזוטופ השני של שיא הבסיס בספקטרום זה, ולהשתמש באותו ערך עבור כל סף העוצמה בשלבי העיבוד הבאים.
      הערה: הנתונים נרכשו באמצעות בידוד מרובע ולכן נחשבים על ידי MZmine כמו MS / MS. לאורך כל עיבוד MZmine, הקפד לעבוד ברמת MS = 2.
    2. בצע את זיהוי ההמונים באמצעות שיטות נתונים גולמיות | | לזיהוי תכונות גילוי המוני. לקבלת נתונים שנרכשו במצב פרופיל, השתמש באלגוריתם התמרת Wavelet . כדי להגדיר את הפרמטרים של האלגוריתמים ב- MZmine, לחץ על לחצן [...] לצד האלגוריתם והשתמש באפשרות הצג תצוגה מקדימה כדי לדמיין את הנתונים תוך מיטוב הפרמטרים.
      הערה: בשלב זה, הפסגות שנבחרו על ידי האלגוריתם יופיעו באדום בחלון התצוגה המקדימה. בעת שימוש באלגוריתם המרת גל על קבצי RAW קנייניים, MZmine לפעמים יטעה בנקודות נתוני הפרופיל עבור פסגות ממוקדות. התוכנה תציג הודעה המציינת כי המשתמש מפעיל אלגוריתם פרופיל על ספקטרום centroided: התעלם מהודעה זו ולחץ על אישור.
    3. לשחזר את ספקטרום ניידות היונים שחולץ (EIM) עבור כל מסה שבר באמצעות שיטות נתונים Raw | | לזיהוי תכונות בונה הכרומטוגרמה של ADAP ברשימת ההמונים 'ההמונים' שנוצרה על ידי השלב הקודם. מכיוון שקלט העמידות ל- m/z בשלב זה הוא עמידות לסריקה לסריקה, הקפד להשאיר אותו גבוה לפחות פי 3-4 מהדיוק הכולל הצפוי.
    4. מכיוון שהשלב הקודם אינו כולל אפשרות תצוגה מקדימה, בדוק את איכות בחירת השיא ישירות באמצעות רשימת התכונות שהופיעה בחלונית הימנית של חלון MZmine הראשי. פתח את הרשימה תכונות, בחר את כל השורות, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר הצג/XIC (דו-שיח). לחץ על הכל כדי להציג את כל היונים בספקטרום הניידות. בדוק את הפסגות שנבחרו המופיעות בצבע כדי לוודא שאין פסגות שהוחמצו בבירור.
    5. נתק את ה- EIMs כדי לפצל את ה - m/z המכילים פסגות שונות בתכונות מרובות. השתמש בשיטות של רשימת תכונות | | לזיהוי תכונות פירוק כרומטוגרמה, ובחר את אלגוריתם Wavelets (ADAP). מטב את האלגוריתם עבור הנתונים באמצעות האפשרות הצג תצוגה מקדימה ופרמטרי המפתח הבאים: סף S/N, סף מקדם/אזור וטווח גל RT.
      הערה: מומלץ לבדוק את ההיבט של הספקטרום המבולבל. השתמש בכלי הפריט החזותי כרומטוגרמה, כמתואר בשלב 4.2.4. הפסגות המפותקות יופיעו בצבע, ויש לפצל פסגות של אותה מסה, כפי שמוצג באיור 6A.
    6. Deisotope EIMs מנותק באמצעות שיטות רשימת תכונות | איזוטופים | לוקוס פסגות איזוטופיות. השתמש בדיוק הצפוי של המכשיר עבור ערך העמידות m/z , והגדר את עמידות זמן ההגעה ל- 0.1 אלפיות השנייה (מוצגת ב- MZmine כסובלנות זמן שמירה 0.1 דקות), מכיוון שאיזוטופים אינם נפתרים במהלך הפרדת IMS. בדוק את רשימת התכונות: אם נותרו איזוטופים כלשהם, הגדל את ערכי הסבילות.
      הערה: למרות deisotoping יכול להתבצע באופן תיאורטי בכל רגע של עיבוד רשימת התכונות, חשוב לעשות את זה אחרון, כך ערכי החיוב ניתן לייצא (האלגוריתמים המשמשים עבור השלבים האחרים לפעמים להסיר את פרטי מצב החיוב).
  3. אם מעבדים ספקטרום IMS/IMS-MS מרובים, חזור על העיבוד עם פרמטרים ממוטבים אלה. שמור את אותם פרמטרים לכל הספקטרום.
  4. במקרה של ספקטרום מרובה, קבץ אותם בטבלה אחת כדי לייצא אותם; אם לא, דלג ישירות לשלב 4.5. כדי לקבץ את הספקטרום, השתמש בשיטות של רשימת תכונות | יישור | הצטרף ליישור. מכיוון שהמטרה היא לא ליישר את הפסגות, השתמש בערכי עמידות מגבילים הן עבור m /z והן עבור זמן ההגעה. תן את אותו משקל לשני הממדים.
  5. יצא את רשימת התכונות הסופית לקובץ *.csv . שימוש בשיטות של רשימת תכונות | | ייצוא/ייבוא יצא לקובץ CSV וייצא את הערכים הבאים: יצא שורה m/z, יצא זמן שמירה של שורה (זמן ההגעה בפועל של IMS), שיא m/z וגובה שיא. השתמש בפסיק כמפריד שדות.

5. TWCCSN2 של ספקטרום IMS/IMS ממוקד

הערה: בפרוטוקול זה, ייעשה שימוש בכיול התאמה לוגריתמית25,26, אשר נוטה לתת תוצאות טובות יותר מאשר כיול ליניארי וקל ליישום בגיליון אלקטרוני או סקריפט עיבוד בתוך הבית. סקריפט פנימי (שנכתב ב- R) זמין בכתובת ה- URL שניתנה בטבלת החומרים.

  1. בחר את ערכי זמן ההגעה של ההפניה מהרכישה הקליברית (ראה שלב 2.3). בצע זאת באופן ידני באמצעות תוכנת הבנאי (עיין בטבלת החומרים) כדי לבדוק את ההיבט של כל פסגות הכיול של IMS.
    1. בחלון כרומטוגרמה , פתח את *_dt. קובץ RAW המתאים לכיול.
    2. עבור כל נקודת כיול, צור את ה- EIM באמצעות | תצוגה אפשרות המונית .
    3. בדוק את הפרופיל של EIMs. אם חלקם מוגדרים בצורה גרועה, החליקו אותם באמצעות התהליך | אפשרות חלקה (מכיוון שהתוצאות הטובות ביותר מתקבלות בדרך כלל עם האלגוריתם Savitzky-Golay, חלק פי 2 על פני 3 סלים). דווח על ערכי השיא בגיליון אלקטרוני.
      הערה: מכיוון שנקודות ההתייחסות נרכשות בדרך כלל באמצעות התקני DTIMS ברזולוציה נמוכה, חלק מההפצות הרב-מודאליות עשויות להופיע ב- IMS מחזורי בהתאם לכיולים. הסר כל שיא המציג התפלגות כזו מרשימת הכיול.
  2. חשב את פרמטרי ההתאמה הלוגריתמית מהכיולים.
    1. עבור כל נקודות הכיול, חשב את הנקודות הבאות.
      1. חשב את זמן הסחף באמצעות Eq (1):
        Equation 1 (1)
        עם td זמן הסחף, tA זמן ההגעה הנמדד, ו tinj זמן ההזרקה בתא IMS (הכל בטרשת נפוצה).
        הערה: עבור מולקולות קטנות, כגון שברי אוליגוסכריד, זמן הטיסה (זמן הטיסה בין היציאה מתא IMS לבין הגלאי) וריאציה בין מסות שונות נמצא בטווח השגיאות של כיול CCS וניתן להתעלם ממנו.
      2. חישוב המסה הניטרלית של היונים באמצעות Eq (2):
        Equation 2 (2)
        עם z מצב הטעינה של היון, ו יון המסה של יון הנגד (ב Da). השתמש במסות מדויקות כדי למנוע החדרת אי ודאות. אם קיים אובדן אטום במקום יון נגדי, השתמש בערכי יון שליליים (לדוגמה, עבור [M-H]-mneutral = (m/z) * |z| - (- 1.007276) = (m/z) * |z| + 1.007276). 
      3. חשב את הפרמטר של CCS באמצעות Eq (3):
        Equation 3 (3)
        עם CCS ערך צינור נדידת הייחוס DTCCSN2 (ב- nm2), ו- mgas המסה של גז הסחף (ב- Da; ex. עבור חנקן: mgas = 28.01 Da).
      4. חשב את הפרמטר td' באמצעות Eq (4):
        Equation 4 (4)
        עם d עיכוב התחלת הגלאי המשמש באופן ניסיוני לתיקון לזמן מת (בדרך כלל ~ 1.5 אלפיות השנייה).
      5. חשב לוגריתם של הפרמטרים לעיל:
        ln (CCS') ו- ln (t'd)
    2. בצע רגרסיה ליניארית כדי לקבוע את מקדם R2 ואת הפרמטרים x ו - y של ההתאמה הלוגריתמית (עם x השיפוע ו - ln(y) היירוט) באמצעות Eq (5):
      Equation 5 (5)
      הערה: המשתמש יכול להתוות את ערכי ln(CCS') לעומת ln(td') כדי לבדוק באופן חזותי את תוצאות הכיול, אם כי זה אופציונלי.
  3. החל את הכיול על הנתונים הניסיוניים כדי לכייל את הפסגות שנבחרו על-ידי MZmine עבור כל ספקטרום IMS/IMS המיוצא לקובץ *.csv. עבור כל נקודה, חשב את הנקודות הבאות.
    1. חשב את זמן הסחף באמצעות Eq (6):
      Equation 6 (6)
      עם tseq הזמן שקדם להפרדת IMS הסופית (הערך 'Time Abs' שצוין בשלב 3.4.6).
      הערה: אם כיול ספקטרום IMS/IMS מרובים שנרכשו עם רצפים שונים, בדוק בקפידה את ערכי tseq.
    2. חשב את המסה הניטרלית של היונים באמצעות Eq (7):
      Equation 7 (7)
    3. חשב את הפרמטרים td' ו- td'' באמצעות Eq (8) ו- Eq (9):
      Equation 8 (8)
      Equation 9 (9)
    4. חשב את ערכי ה- CCS המכוילים הסופיים (TWCCSN2 ב- nm2) באמצעות Eq (10):
      Equation 10 (10)
      הערה: למרות שלב 5.2.2. נותן ln(y) כמו היירוט, y חייב לשמש כדי להשיג את הערך הסופי CCS. אל תשכח ליישם פונקציה מעריכית.
  4. בדוק את דיוק הכיול על-ידי החלת הכיול לרכישה השנייה של פתרון הכיול שנרכש בשלב 2.4.
    הערה: הכיול אמור להניב תוצאות עם שגיאה של ~1-2%.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פנטסכריד arabinoxylan, XA2XX, נבחר כדוגמה כדי להמחיש פרוטוקול זה. תרכובת זו זמינה מסחרית, אך רק כתערובת עם פנטסכריד ערבינוקסילן אחר, XA3XX (XA3XXX טהור זמין גם מסחרית). המבנים של XA2XX ו- XA3XX ניתנים באיור S1 משלים. כמו היחס של XA2XXX ו XA3XXX בתערובת המסחרית הוא ~ 50:50, פתרון ב 20 מיקרוגרם / מ"ל של התערובת היה מוכן להגיע לריכוז XA2XX של ~ 10 מיקרוגרם / מ"ל ב 50:50 MeOH / H2O + 500 μM LiCl.

ראשית, ניתוח MS של תערובת XA2XX + XA3XX בוצע באמצעות טרשת נפוצה ברזולוציה גבוהה. כמו שתי תרכובות הם isomers, שיא אחד נצפתה ב [M +Li]+m/z 685.24. פסגת טרשת נפוצה זו נבחרה עם המרובע וחלון הבחירה שהותאם להסרת איזוטופ הליתיום -1 Da, שניתן לטעות בו כשיא מונואיזוטופי על ידי עיבוד אלגוריתמים (איור 2).

[M+Li]+ תוספות של pentasaccharides הוגשו לאחר מכן לשלב הראשון של הפרדת IMS: לאחר 3 עובר סביב תא IMS מחזורי, 3 פסגות הופרדו עם זמני הגעה של 83, 90, ו 94 אלפיות השנייה. פרופיל זה הושווה לזה של XA3XXX טהור (חדורים ב-10 מיקרוגרם/מ"ל), והראה שהפסגות ב-83 ו-90 אלפיות השנייה תואמות ל-XA3XX, בעוד שהשיא ב-94 אלפיות השנייה תואם ל-XA2XX (איור 4A). השיא ב-94 אלפיות השנייה נבחר לניתוח IMS/IMS: היונים השייכים ל-XA3XX נפלטו (איור 4B), ושיא העניין נשלח לתא החנות שנקבע מראש. הפרדה של 3 מעברים בוצעה לאחר החזרת היון ללא הפעלה כדי להבטיח שרק שיא ה-XA2XX יישאר לאחר הבחירה (הגעה של 199 אלפיות השנייה באיור 4C).

לאחר מכן, היון היה מקוטע עם החזרה מאזור prestore, והפרדת IMS במעבר יחיד בוצעה על כל הקטעים. נוסו שתי הפעלות שונות: נוסתה לראשונה ההגדרה המרבית של פונקציית ההפעלה המובנית prestore (איור 5B,C); עם זאת, המבשר נשאר פסגת הבסיס של הספקטרום. זה לא רצוי כי, עבור ספקטרום התייחסות, קטעים מתחת לסף עוצמה מסוימת בדרך כלל יוסרו. כך, נבחר שיפוע קדם-סידורי המוגדר ידנית → הטיית טרום-מערך → מעבר צבע מתח היסט של מערך (איור 5D,E).

נתוני IMS/IMS-MS שנוצרו נותקו עם MZmine 2.51, תוך שימוש בזמן ההגעה ובממדי m/z (איור 6A), כדי לספק ספקטרום IMS/IMS המכיל רק את פרטי הניידות של הקטעים. הפסגות מעל 0.2% עוצמה יחסית יוצאו לכיול CCS (הפרמטרים המפורטים של MZmine ניתנים בטבלה משלימה S1). כיול CCS בוצע באמצעות פתרון הכיול (R2 = 0.995, כלומר סטייה מוחלטת של פקד = 1.63%, ראה טבלה משלימה S3). עיבוד זה העניק לבסוף ספקטרום IMS/IMS (איור 6B) מכויל, מכויל ב-CCS.

Figure 1
איור 1: מבט כולל על תהליך יצירת הנתונים של IMS/IMS. קיצורים: IMS = ספקטרומטריית ניידות יונים; IMS/IMS = IMS דו-מושבי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: תבנית איזוטופית של תערובת פנטסכריד XA3XX + XA2XX Arabinoxylan pentasaccharide. (A) אות רווי ללא DRE; (B) אות מתוקן באמצעות DRE עם שידור 5% יונים (כלומר, 95% הנחתה); וכן (C) פרופיל לאחר בחירת מרובע כדי להסיר את שיא ה- -1 Da המתאים לאיזוטופ ליתיום. בסגול: האזור שבו פסגות חפצים יכולות להופיע עקב רוויה מוגדל 6 פעמים. קיצורים: DRE = שיפור טווח דינמי; MS = ספקטרומטריית מסה; MSMS = טנדם MS; LM Res = רזולוציה במסה נמוכה; HM Res = רזולוציה המונית גבוהה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: מבט כולל על חלון בקרת IMS מחזורי, שבו המשתמש מגדיר את רצף IMS/IMS. הרצף המוצג מראה כיצד לבדוק את איכות הבידוד ב- IMS / IMS, עם מבחר של XA2XX לאחר 3 מעברים (הספקטרום המוצג מתאים להגדרת אירועי הבחירה לאחר ההפרדה בשלב הראשון). הרצף מורכב מהפעלת הפרדת IMS ראשונה של 3 מעברים על פני 58 אלפיות השנייה, ולאחר מכן הוצאת שני האיזופורמים המהירים יותר מתא ה- IMS (מקטע 3), הוצאת האיזופורם האיטי יותר (ATD בין 92 ל- 96 אלפיות השנייה) בחנות המוקדמת (מקטע 4), הוצאתו מחדש בתא ה- IMS ללא הפעלה (קטע 6), ומאפשרת ליונים לעבור הפרדה נוספת של 3 מעבר (58-ms) (מקטע 7), לאחר מכן הוצאת יונים מתא IMS ורכישת נתונים (מקטע 8). קיצורים: IMS = ספקטרומטריית ניידות יונים; cIMS = IMS מחזורי; IMS/IMS = IMS דו-מושבי; ADC = ממיר אנלוגי לדיגיטלי; TW = גל נודד; PE = אנרגיה פוטנציאלית; ATD = התפלגות זמן הגעה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: בחירת XA2XXX מהתערובת של XA2XX ו-XA3XX. (A) הפרדה של פנטסכרידים arabinoxylan, XA3XXX ו- XA2XX, לאחר 3 מעברים (המקביל לזמן הפרדה שנקבע על 58 אלפיות השנייה) סביב תא IMS מחזורי. (B) שבר נפלט ישירות לאחר השלב הראשון של הפרדת IMS. (ג) שבר שנבחר עבור IMS/IMS שבו בוצעה הפרדה נוספת של 3 מעברים לאחר החזרה. שיא העניין של XA2XXX מודגש באפור. ספקטרום ניידות היונים מוצג בפחי נתונים ומפורט עם זמן ההגעה שלהם (אלפיות השנייה). קיצורים: IMS = ספקטרומטריית ניידות יונים; IMS/IMS = IMS דו-מושבי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: עקרונות של ניתוק שנגרם מהתנגשות באמצעות אזור החנות הטרום-ערעורית. (A) שרטוטים של אזור המערך הרב-תכליתי המפרט את מתחי המקשים (באדום) המשמשים לבחירה, להפעלה מחדש ולהפעלה במהלך ניסויי IMS/IMS. החצים הכחולים מראים את כיוון הגל הנודד במערך הרב תכליתי. (ב, ג) IMS/IMS וספקטרום MS/MS שהושג עבור XA2XX באמצעות פונקציית ההפעלה המובנית prestore (+150 V). סרגל הצבע מייצג את סולם עוצמת היונים (כחול = נמוך; אדום = גבוה). (ד, ה) IMS/IMS וספקטרום MS/MS שהושג עבור XA2XXX עם אופטימיזציה ידנית של המתחים (שיפוע טרנדיטורי 195 V, הטיה טרום-סידורית 180 V, היסט מערך -10 V). יונים מבשרים מסומנים על ידי כוכביות על הספקטרום. ספקטרום ניידות היונים מוצג בפחי נתונים ומפורט עם זמן ההגעה שלהם (אלפיות השנייה). קיצורים: IMS = ספקטרומטריית ניידות יונים; IMS/IMS = IMS דו-מושבי; TOF = זמן טיסה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: איור של שלבי העיבוד. תוצאות של (A) קטיף שיא MZmine ו -(B) כיול CCS של arabinoxylan pentasaccharide XA2XX. A מציג את הפירוק ההמוני של ספקטרום IMS/IMS באמצעות קוד צבע. B מציג את ספקטרום IMS/IMS הסופי לאחר צנטרואיד וכיול CCS. קיצורים: IMS = ספקטרומטריית ניידות יונים; IMS/IMS = IMS דו-מושבי; CCS = חתך רוחב התנגשות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: השוואה בין שני ספקטרום IMS/IMS של XA2XX ממחישה את יכולת השחזור של השיטה. הספקטרום המכויל הסופי מנייר זה (למעלה) מושווה לספקטרום מהעבודה של אוליבייה ואח '. 21 (למטה, הפוך). קיצורים: IMS = ספקטרומטריית ניידות יונים; IMS/IMS = IMS דו-מושבי; CCS = חתך רוחב התנגשות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור S1 משלים: מבנים של הפנטסכרידים XA2XXX ו- XA3XX arabinoxylan. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור S2 משלים: הערכת יכולת החזרה בין-יומית באמצעות XA2XX. רכישות IMS/IMS חזרו על עצמן ביום הראשון (למעלה) וביום 95 (למטה). קיצורים: IMS = ספקטרומטריית ניידות יונים; IMS/IMS = IMS דו-מושבי. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה S1: פרמטרי MZmine מפורטים. לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה משלימה S2: פרמטרי המכשיר השתנו כדי להעריך את יכולת השכפול. קיצור: ESI = יינון אלקטרוספריי. לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה משלימה S3: שליטה בכיול CCS באמצעות רכישה שנייה של פתרון כיול. לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ה- SELECT SERIES Cyclic IMS הוא כלי רב עוצמה המאפשר בחירת אוכלוסיית יונים מוגדרת - של ניידות m/z ויונים נתונה - ללא צורך בהפרדה כרומטוגרפית במעלה הזרם. המכשיר מאפשר ליצור מפת פיצול דו-שנתית של אוכלוסיית יונים זו, שממנה ניתן לחלץ הן MS / MS והן ספקטרום IMS / IMS / IMS. עם זאת, המשתמש חייב לציין מספר נקודות קריטיות הדורשות תשומת לב במהלך התהליך הניסיוני.

ראשית, המשתמש צריך לבדוק בזהירות את חלון הבידוד של טרשת נפוצה לנוכחות של מזהמים איזובריים אפשריים. אכן, חלון הבידוד של מרובע הוא רחב יחסית, ויודע יונים של m / z שונה במקצת שעשוי להיבחר ב quadrupole יעזור למשתמש כראוי להקצות את שיא העניין בניידות יונים.

שנית, בעת ביצוע ההפרדה הראשונית, על המשתמש לוודא שכל היונים עוברים את אותו מספר של מעברים סביב תא הניידות של היונים המחזוריים. זהו היבט חשוב ומסובך של הפרדת ניידות יונים במכשיר מחזורי. הערכה שגויה של מספר המעברים ליון נתון עלולה להוביל לזיהוי ופרשנות לא נאותים של הפסגות. שליטה במספר המעברים של אוכלוסיות יונים שונות יכולה להיות מסובכת בשל אורך המעבר הבודד הקצר יחסית (~ 1 מ '), ומינים עם יכולות שונות מאוד יכולים לחפוף במהירות.

בפרט, שיא יכול להתפצל בין שני מעברים שונים אם המערך מחליף כיוון כאשר אוכלוסיית היונים הזו עוברת (קל יחסית לזהות זאת: הפסגה המפוצלת תיראה חדה יותר עם אוכלוסייה ממש בתחילת אירוע הפליטה והרכישה ). כדי להגדיר כראוי את מספר המעברים, המשתמש צריך להתחיל עם זמן הפרדה קצר (1-5 אלפיות השנייה) שייתן את פרופיל המעבר הראשון. לאחר מכן, המשתמש צריך להגדיל בהדרגה את זמן ההפרדה עד שהאוכלוסייה כולה עברה לזמני הגעה גבוהים יותר, מה שייתן את פרופיל 2 המעברים. פרופיל 2-pass אמור להיראות דומה לפרופיל המעבר הראשון, אך עם פסגות שנפתרו טוב יותר. הזמן שלוקח לאוכלוסיית יונים נתונה לבצע מעבר אחד סביב התא המחזורי הוא קבוע שהמשתמש יכול להשתמש בו כדי לחשב את מספר המעברים כפונקציה של זמן ההפרדה. לדוגמה, אם יש הבדל של 10 אלפיות השנייה בין המעבר הראשון לשני, יהיה גם הבדל של 10 מילישניות בין השני לשלישי.

שלישית, בשלב הבחירה של IMS, על המשתמש לבדוק בקפידה את איכות הבידוד, כפי שמוצג באיור 4. חשוב במיוחד לבדוק את הפרופיל שהוחזר מכיוון שאם הגדרות הגובה והמהירות של TW נמוכות מדי, ייתכן שהפליטה של האוכלוסיות האחרות לא תהיה שלמה. משתמשים מתקדמים יכולים לתקן זאת על-ידי התאמת מתח גלי הרדיו של Driftcell RF בכרטיסיה RF של הדף 'כוונון' .

רביעית, המשתמש צריך להיות זהיר ביצירת ספקטרום הפיצול, ובמיוחד, בבחירת אנרגיית ההתנגשות המתאימה, במיוחד אם המתחים מכוונים באופן ידני. אכן, הנמכה מוגזמת של מתח היסט המערך עלולה להשפיע לרעה על עוצמת היונים הכוללת על-ידי הפרעה לחזרה. בנוסף, הקדמה ורסיסים עשויים להתפרש על פני מגוון רחב של mobilities. לכן, הם יעברו במהירות מספר שונה של מעברים אם זמן ההפרדה הסופי הוא גבוה, ולכן חשוב לשמור על אירוע נפרד של 1 אלפיות השנייה כפי שמוסבר בפרוטוקול שלב 2.3.3. זוהי מגבלה גדולה מכיוון שאורך המעבר הבודד קצר יחסית, מה שמגביל את כוח פתרון המעבר הבודד ל- ~ 100 עבור oligosaccharides27. מבחינה זו, אורך נתיב מוגבר במעבר יחיד יהיה מועיל (כלומר, מבנים מבוססי TWIMS עבור מניפולציה יון ללא אובדן אובדן נתונים או SLIM, עם אורך נתיב של 13 m28). ההתקנה SLIM הושקה מסחרית ממש לאחרונה29.

לבסוף, המשתמש צריך להיות זהיר בהגדרת טווח ניידות הרכישה הסופי באמצעות הפקודה Pushes לכל סל , במיוחד אם עובד על יונים טעונים כפולים. ניידות יונים היא אכן פונקציה של המטען12,, למשל, שברים טעונים ביחידה הנוצרים מבשר טעון כפליים עשויים להיות איטיים יותר מאשר הקדמה (אם כי הם תרכובות קטנות יותר).

מגבלה מרכזית של שימוש בהפרדות MS ו- IMS בלבד כדי לבחור את המבשר (ולא, למשל, שלב במעלה הזרם של כרומטוגרפיה) היא ש- m/z נתון יכול להניב פסגות מרובות ב- IMS וכי פסגות מרובות יכולות להגיע מאותה תרכובת. הדבר בא לידי ביטוי בהפצות של m/z 685.2, הן עבור תערובת XA2XX+XA3XXXX והן עבור XA3XXXX טהור, באיור 4A. התפלגות IMS רב-מודלית של m/z יחיד נובעת מקונפורמציות שונות של שלב הגז. עבור מינים המנותחים כתוספי קטיון (במצב חיובי), הקונפורמציות השונות עשויות לנבוע מהבדלים בתיאום עם הנגד 30,31,32.

עבור oligosaccharides, הם יכולים גם לנבוע מהפרדה של אנומים קצה הפחתת, אם כי הפרדת anomers הפחתת סוף בדרך כלל דורש כוח פתרון IMS גבוה יותר ממה המשמש כאן33,34,35. במקרה הנוכחי, התפלגות IMS רב-מודלית באיור 4A נובעת בחלקה מהתרומות הבודדות של XA2XX ו-XA3XX. עם זאת, ראוי לציין כי XA3XXX מניב שתי פסגות, שהן ככל הנראה קונפורמי תיאום-קטיון. היה קל לזהות איזה שיא מתאים ל- XA2XX (כלומר, מין העניין) מכיוון ש- XA3XXXX טהור זמין מסחרית, ופרופיל הניידות שלו יכול להיות מוקלט בנפרד. כדי לעבוד על תערובות מורכבות כגון מדיה ביולוגית, ייתכן שיהיה חשוב לשקול הוספת שלב הפרדה כרומטוגרפית.

יש לציין שתי נקודות בנוגע לזרימת העבודה של העיבוד המשמשת להשגת ספקטרום IMS/IMS שעבר פירוק המוני. ראשית, בפרוטוקול זה, מוצע להשתמש ב- MZmine 224 כדי לנתק את ספקטרום IMS/ IMS באמצעות ממד MS, ובמיוחד להשתמש באלגוריתם ADAP36 כדי לפצל את ה- EIMs לפסגות שונות. למרות שהוא נותן תוצאות טובות למדי, כפי שמודגם באיור 6, אלגוריתם ADAP תוכנן לניתוחים כרומטוגרפיים ובכך מסביר גורמים אסימטריים הטמונים בכרומטוגרפיה של שלב נוזלי, כגון זנב שיא. לכן, אלגוריתם ADAP עלול לגרום לא לזהות חלק מהתכונות כאשר מוחל על פסגות IMS (למשל, כתפיים). בעיקרו של דבר, נתוני IMS הם פשוטים יותר מאשר נתונים כרומטוגרפיים: מכיוון שאין אינטראקציה כימית של התרכובות עם עמודה, נתוני IMS שנרכשו בתנאים המתאימים (כלומר, מבלי להרוות את תא ה- IMS) צפויים לעקוב אחר הפצות גאוסיות37,38. באופן אידיאלי, שלב הפירוק של ADAP יוחלף בצורה הטובה ביותר בפונקציית התאמה גאוסית, כגון זו המשמשת תוכנה המיועדת ל- IMS כגון CUISuite 239. עם זאת, כפי שהוא עומד, deconvolution גאוס לא הותאם ישירות לשרשרת המלאה של טיפול המתואר בפרוטוקול זה. לכן, באמצעות חינם, תוכנת קוד פתוח MZmine נראה פשרה טובה עבור משתמשי קצה.

החלק השני של העיבוד המצדיק דיון הוא כיול CCS. פרוטוקול זה מציע להשתמש בכיול התאמה לוגריתמית25,26 ותערובת כיול מסחרי מאותו ספק כמו זה של הספקטרומטר (ראה טבלת החומרים). הליך זה הוא הפשוט ביותר ליישום במעבדה. לגבי הבחירה של תערובת כיול, המשתמש צריך לשקול כי, כאמור במספר מחקרים, הדיוק של כיול CCS משופר בעת שימוש כיול של אותה מחלקה מולקולרית ומצב מטען כמו analyte26,40,41. השגיאה שהוצגה בעת כיול עם סוגים דומים יחסית של תרכובות (למשל, פחמימות לעומת פפטידים) היא מתונה. עם זאת, מומלץ לא להשתמש ביונים שונים מאוד כגון, למשל, באמצעות אשכולות מלח כמו כיול בעת מדידת פחמימות41. לגבי הבחירה של שיטת הכיול, Richardson et al.42 דיווח לאחרונה על שיטת כיול חדשה שלוקחת בחשבון את הפיזיקה של TWIMS כדי לשפר את הדיוק של הכיול (עם תוכנה שסופקה). עם זאת, הגישה דורשת הערכה של פרמטרים ספציפיים מאוד באמצעות ניתוח של סוגים שונים של תרכובות – החל מטבוליטים לחלבונים מקומיים. מכיוון שלא ניתן למצוא תערובת של מגוון כזה של תרכובות באופן מסחרי, שיטה זו לא יושמה בפרוטוקול הנוכחי.

לבסוף, כדי להעריך את יכולת הרבייה של השיטה, הערכנו את יכולת הרבייה בין-יומית על-ידי חזרה על רכישת IMS/IMS-MS ביום הראשון וביום 95 (איור S2 משלים). הניסוי הראה כי נתוני IMS/IMS-MS ניתנים לשחזור באופן גבוה, ללא שינוי שיא IMS ביותר מ- 0.2 אלפיות השנייה במהלך תקופה ממושכת זו. ספקטרום IMS/IMS שנוצר בעבודה זו הושווה עוד יותר לספקטרום אחר של XA2XX שנרכש בתנאים שונים לעבודה קודמת על רשת מולקולרית-ניידות יונים21. כמה פרמטרים אינסטרומנטליים שיכולים להשפיע על מבנה היונים ופרופיל ניידות היונים13 שונו במכוון - פרמטרי המקור ושיפוע מתח ההפעלה (השוואה של התנאים האינסטרומנטליים המשתנים ניתנת בטבלה משלימה S2). לאחר מכן, שני הספקטרום הושוו באמצעות ציון הדמיון הקוסינוס - הפופולרי בהשוואה של ספקטרום MS/MS במטבולומיקה - בפלטפורמת GNPS5 (עמידות CCS לקטעים תואמים = 0.015 nm2).

ההשוואה הראתה ציון דמיון קוסינוס של 0.87 (איור 7), אשר יכול להיחשב גבוה לגבי הווריאציות האינסטרומנטליות החשובות שהוחלו. זה מוביל לרעיון כי ספריות ספקטרליות IMS / IMS יכול לשמש כדי dereplicate גליקנים בתערובות מורכבות עם רמה גבוהה של ביטחון, אשר לא יהיה המקרה עם ספקטרום MS / MS. שים לב שלמרות שהגישה הנוכחית משתמשת רק בממד CCS של ספקטרום הפיצול, נתוני IMS/IMS-MS מכילים גם מידע MS, שאינו מיותר עם CCS. כדי למטב את העוצמה של IMS/IMS, יש לפתח מערכת ניקוד דו-משמעית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגוד אינטרסים לחשוף.

Acknowledgments

S.O. מודה לסוכנות המחקר הלאומית הצרפתית על מימון הדוקטורט שלו (הענק ANR-18-CE29-0006).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
33-α-L- plus 23-α-L-Arabinofuranosyl-xylotetraose (XA3XX/XA2XX) mixture Megazyme Ltd., Wicklow, Ireland O-XAXXMIX XA2XX + XA3XX mixture
33-α-L-Arabinofuranosyl-xylotetraose (XA3XX) Megazyme Ltd., Wicklow, Ireland O-XA3XX Pure XA3XX standard
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, Eppendorf Quality, colorless, 1,000 tubes Eppendorf, Hamburg, Germany 0030120086 Used to prepare the carbohydrate stock solution and dilution
FALCON 50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm Corning Science México S.A. de C.V., Reynosa, Tamaulipas, Mexico 352070 Used to prepare the aqueous stock solution of 100 mM LiCl
Lithium Chloride (ACS reagent, ≥99 %) Sigma-Aldrich Inc., Saint Quentin Fallavier, France 310468 Used to dope the sample with lithium
Major Mix IMS/Tof Calibration Kit Waters Corp., Wilmslow, UK 186008113 Calibration solution for MS and IMS
MassLynx 4.2 SCN1016 Release 6 (Waters Embedded Analyser Platform for Cyclic IMS 2.9.1 Release 9) Waters Corp., Wilmslow, UK 721022377 Cyclic IMS vendor software for instrument control and data processing
Methanol for HPLC PLUS Gradient grade Carlo-Erba Reagents, Val de Reuil, France 412383 High-purity solvent
MS Leucine Enkephaline Kit Waters Corp., Wilmslow, UK 700002456 Reference compound used for tuning of the mass spectrometer
SCHOTT DURAN 100 mL borosilicate glass bottle VWR INTERNATIONAL, Radnor, Pennsylvania, US 218012458 Used to prepare the solution of 500 µM LiCl in 50:50 MeOH/Water
SELECT SERIES Cyclic IMS Waters Corp., Wilmslow, UK 186009432 Ion mobility-mass spectrometer equipped with a cylic IMS cell
Website: http://mzmine.github.io/ MZmine Development Team - Link to download the MZmine software
Website: https://github.com/siollivier/IM-MN INRAE, UR BIA, BIBS Facility, Nantes, France - Link to an in-house R script containing a CCS calibration function

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Allard, P. -M., et al. Integration of molecular networking and in-silico MS/MS fragmentation for natural products dereplication. Analytical Chemistry. 88 (6), 3317-3323 (2016).
  2. Wang, M., et al. Mass spectrometry searches using MASST. Nature Biotechnology. 38 (1), 23-26 (2020).
  3. David, M., Fertin, G., Rogniaux, H., Tessier, D. SpecOMS: a full open modification search method performing all-to-all spectra comparisons within minutes. Journal of Proteome Research. 16 (8), 3030-3038 (2017).
  4. Dührkop, K., et al. SIRIUS 4: a rapid tool for turning tandem mass spectra into metabolite structure information. Nature Methods. 16 (4), 299-302 (2019).
  5. Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).
  6. Nothias, L. -F., et al. Feature-based molecular networking in the GNPS analysis environment. Nature Methods. 17 (9), 905-908 (2020).
  7. Gray, C. J., et al. Advancing solutions to the Carbohydrate Sequencing Challenge. Journal of the American Chemical Society. 141 (37), 14463-14479 (2019).
  8. Ropartz, D., et al. Online coupling of high-resolution chromatography with extreme UV photon activation tandem mass spectrometry: Application to the structural investigation of complex glycans by dissociative photoionization. Analytica Chimica Acta. 933, 1-9 (2016).
  9. Wolff, J. J., et al. Negative electron transfer dissociation of glycosaminoglycans. Analytical Chemistry. 82 (9), 3460-3466 (2010).
  10. Ropartz, D., et al. Charge transfer dissociation of complex oligosaccharides: comparison with collision-induced dissociation and extreme ultraviolet dissociative photoionization. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (10), 1614-1619 (2016).
  11. Morelle, W., et al. Fragmentation characteristics of permethylated oligosaccharides using a matrix-assisted laser desorption/ionization two-stage time-of-flight (TOF/TOF) tandem mass spectrometer. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 18 (22), 2637-2649 (2004).
  12. Gabelica, V., Marklund, E. Fundamentals of ion mobility spectrometry. Current Opinion in Chemical Biology. 42, 51-59 (2018).
  13. Gabelica, V., et al. Recommendations for reporting ion mobility mass spectrometry measurements. Mass Spectrometry Reviews. 38 (3), 291-320 (2019).
  14. Hernandez-Mesa, M., et al. Interlaboratory and interplatform study of steroids collision cross section by traveling wave ion mobility spectrometry. Analytical Chemistry. 92 (7), 5013-5022 (2020).
  15. Koeniger, S. L., et al. An IMS-IMS analogue of MS-MS. Analytical Chemistry. 78 (12), 4161-4174 (2006).
  16. Merenbloom, S. I., Koeniger, S. L., Valentine, S. J., Plasencia, M. D., Clemmer, D. E. IMS−IMS and IMS−IMS−IMS/MS for separating peptide and protein fragment ions. Analytical Chemistry. 78 (8), 2802-2809 (2006).
  17. Eldrid, C., Thalassinos, K. Developments in tandem ion mobility mass spectrometry. Biochemical Society Transactions. 48 (6), 2457-2466 (2020).
  18. Giles, K., et al. A cyclic ion mobility-mass spectrometry system. Analytical Chemistry. 91 (13), 8564-8573 (2019).
  19. Merenbloom, S. I., Glaskin, R. S., Henson, Z. B., Clemmer, D. E. High-resolution ion cyclotron mobility spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (4), 1482-1487 (2009).
  20. Ollivier, S., et al. Anomeric retention of carbohydrates in multistage cyclic ion mobility (IMSn): de novo structural elucidation of enzymatically produced mannosides. Analytical Chemistry. 93 (15), 6254-6261 (2021).
  21. Ollivier, S., Fanuel, M., Rogniaux, H., Ropartz, D. Molecular networking of high-resolution tandem ion mobility spectra: a structurally relevant way of organizing data in glycomics. Analytical Chemistry. 93 (31), 10871-10878 (2021).
  22. Aron, A. T., et al. Reproducible molecular networking of untargeted mass spectrometry data using GNPS. Nature Protocols. 15 (6), 1954-1991 (2020).
  23. McKenna, K. R., Li, L., Krishnamurthy, R., Liotta, C. L., Fernández, F. M. Organic acid shift reagents for the discrimination of carbohydrate isobars by ion mobility-mass spectrometry. The Analyst. 145 (24), 8008-8015 (2021).
  24. Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Orešič, M. MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11, 395 (2010).
  25. Ruotolo, B. T., Benesch, J. L. P., Sandercock, A. M., Hyung, S. -J., Robinson, C. V. Ion mobility-mass spectrometry analysis of large protein complexes. Nature Protocols. 3 (7), 1139-1152 (2008).
  26. Bush, M. F., Hall, Z., Giles, K., Hoyes, J., Robinson, C. V., Ruotolo, B. T. Collision cross sections of proteins and their complexes: a calibration framework and database for gas-phase structural biology. Analytical Chemistry. 82 (22), 9557-9565 (2010).
  27. Ropartz, D., et al. Structure determination of large isomeric oligosaccharides of natural origin through multipass and multistage cyclic traveling-wave ion mobility mass spectrometry. Analytical Chemistry. 91 (18), 12030-12037 (2019).
  28. Tolmachev, A. V., et al. Characterization of ion dynamics in structures for lossless ion manipulations. Analytical Chemistry. 86 (18), 9162-9168 (2014).
  29. Arndt, J. R., et al. High-resolution ion-mobility-enabled peptide mapping for high-throughput critical quality attribute monitoring. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (8), 2019-2032 (2021).
  30. Le Fèvre, A., Dugourd, P., Chirot, F. Exploring conformational landscapes using trap and release tandem ion mobility spectrometry. Analytical Chemistry. 93 (9), 4183-4190 (2021).
  31. Ohshimo, K., He, X., Ito, R., Misaizu, F. Conformer separation of dibenzo-crown-ether complexes with Na+ and K+ ions studied by cryogenic ion mobility-mass spectrometry. The Journal of Physical Chemistry A. 125 (17), 3718-3725 (2021).
  32. Purves, R. W., Barnett, D. A., Ells, B., Guevremont, R. Gas-phase conformers of the [M + 2H]2+ ion of bradykinin investigated by combining high-field asymmetric waveform ion mobility spectrometry, hydrogen/deuterium exchange, and energy-loss measurements. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 15 (16), 1453-1456 (2001).
  33. Ujma, J., et al. Cyclic ion mobility mass spectrometry distinguishes anomers and open-ring forms of pentasaccharides. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (6), 1028-1037 (2019).
  34. Warnke, S., Faleh, A. B., Scutelnic, V., Rizzo, T. R. Separation and identification of glycan anomers using ultrahigh-resolution ion-mobility spectrometry and cryogenic ion spectroscopy. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 30 (11), 2204-2211 (2019).
  35. Williamson, D. L., Bergman, A. E., Nagy, G. Investigating the structure of α/β carbohydrate linkage isomers as a function of group I metal adduction and degree of polymerization as revealed by cyclic ion mobility separations. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (10), 2573-2582 (2021).
  36. Myers, O. D., Sumner, S. J., Li, S., Barnes, S., Du, X. One step forward for reducing false positive and false negative compound identifications from mass spectrometry metabolomics data: new algorithms for constructing extracted ion chromatograms and detecting chromatographic peaks. Analytical Chemistry. 89 (17), 8696-8703 (2017).
  37. Marchand, A., Livet, S., Rosu, F., Gabelica, V. Drift tube ion mobility: how to reconstruct collision cross section distributions from arrival time distributions. Analytical Chemistry. 89 (23), 12674-12681 (2017).
  38. Davis, D. M., et al. Analysis of ion mobility spectra for mixed vapors using Gaussian deconvolution. Analytica Chimica Acta. 289 (3), 263-272 (1994).
  39. Polasky, D. A., Dixit, S. M., Fantin, S. M., Ruotolo, B. T. CIUSuite 2: next-generation software for the analysis of gas-phase protein unfolding data. Analytical Chemistry. 91 (4), 3147-3155 (2019).
  40. Salbo, R., et al. Traveling-wave ion mobility mass spectrometry of protein complexes: accurate calibrated collision cross-sections of human insulin oligomers. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 26 (10), 1181-1193 (2012).
  41. Gelb, A. S., Jarratt, R. E., Huang, Y., Dodds, E. D. A study of calibrant selection in measurement of carbohydrate and peptide ion-neutral collision cross sections by traveling wave ion mobility spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (22), 11396-11402 (2014).
  42. Richardson, K., Langridge, D., Dixit, S. M., Ruotolo, B. T. An improved calibration approach for traveling wave ion mobility spectrometry: robust, high-precision collision cross sections. Analytical Chemistry. 93 (7), 3542-3550 (2021).

Tags

כימיה גיליון 179
שימוש בספקטרומטר ניידות יונים מחזורי לניסויי ניידות יון דו-מושבית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ollivier, S., Fanuel, M., Rogniaux,… More

Ollivier, S., Fanuel, M., Rogniaux, H., Ropartz, D. Using a Cyclic Ion Mobility Spectrometer for Tandem Ion Mobility Experiments. J. Vis. Exp. (179), e63451, doi:10.3791/63451 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter