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Chemistry

Utilisation d’un spectromètre de mobilité ionique cyclique pour les expériences de mobilité ionique en tandem

Published: January 20, 2022 doi: 10.3791/63451
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1INRAE, UR BIA, F-44316 Nantes, France, 2INRAE, BIBS Facility, F-44316 Nantes, France

Summary

La spectrométrie de mobilité ionique (IMS) est un complément intéressant à la spectrométrie de masse pour la caractérisation des biomolécules, notamment parce qu’elle est sensible à l’isomérisme. Ce protocole décrit une expérience IMS en tandem (IMS/IMS), qui permet l’isolement d’une molécule et la génération des profils de mobilité de ses fragments.

Abstract

Une caractérisation précise des structures chimiques est importante pour comprendre leurs mécanismes biologiques sous-jacents et leurs propriétés fonctionnelles. La spectrométrie de masse (SEP) est un outil populaire mais n’est pas toujours suffisante pour dévoiler complètement toutes les caractéristiques structurelles. Par exemple, bien que les glucides soient biologiquement pertinents, leur caractérisation est compliquée par de nombreux niveaux d’isomérisme. La spectrométrie de mobilité ionique (IMS) est un complément intéressant car elle est sensible aux conformations ioniques et, par conséquent, à l’isomérisme.

En outre, les progrès récents ont considérablement amélioré la technique : la dernière génération d’instruments IMS cycliques offre des capacités supplémentaires par rapport aux instruments IMS linéaires, telles qu’un pouvoir de résolution accru ou la possibilité d’effectuer des expériences de mobilité ionique en tandem (IMS/IMS). Au cours de l’IMS/IMS, un ion est sélectionné en fonction de sa mobilité ionique, fragmenté et réanalysé pour obtenir des informations sur la mobilité ionique de ses fragments. Des travaux récents ont montré que les profils de mobilité des fragments contenus dans ces données IMS/IMS peuvent agir comme une empreinte digitale d’un glycane particulier et peuvent être utilisés dans une stratégie de réseau moléculaire pour organiser les ensembles de données glycomiques d’une manière structurellement pertinente.

L’objectif de ce protocole est donc de décrire comment générer des données IMS/IMS, de la préparation de l’échantillon à l’étalonnage final de la section transversale de collision (CCS) de la dimension de mobilité ionique qui donne des spectres reproductibles. En prenant l’exemple d’un glycane représentatif, ce protocole montrera comment construire une séquence de contrôle IMS/IMS sur un instrument IMS cyclique, comment tenir compte de cette séquence de contrôle pour traduire le temps d’arrivée IMS en temps de dérive (c’est-à-dire le temps de séparation efficace appliqué aux ions) et comment extraire les informations de mobilité pertinentes des données brutes. Ce protocole est conçu pour expliquer clairement les points critiques d’une expérience IMS/IMS et ainsi aider les nouveaux utilisateurs d’IMS cycliques à effectuer des acquisitions simples et reproductibles.

Introduction

La caractérisation chimique complète des biomolécules est essentielle pour comprendre leurs propriétés biologiques et fonctionnelles sous-jacentes. À cette fin, les sciences « omiques » se sont développées ces dernières années, visant la caractérisation à grande échelle des structures chimiques à des concentrations biologiques. En protéomique et en métabolomique, la SEP est devenue un outil essentiel pour démêler l’hétérogénéité structurelle des milieux biologiques, notamment grâce à sa sensibilité et à sa capacité à fournir des informations structurelles par le biais de la SEP tandem (MS/MS). Dans les stratégies MS/MS, un ion est sélectionné en fonction de sa masse, puis fragmenté, et enfin, les masses de ses fragments sont acquises pour établir une empreinte digitale de la molécule. Les spectres MS/MS peuvent, en particulier, être utilisés pour faire correspondre les bases de données spectrales1,2, ou reconstruire provisoirement les structures parentes3,4. En supposant que des spectres similaires appartiennent à des composés similaires, les données MS/MS peuvent également être utilisées pour construire des réseaux moléculaires (MN) reliant des espèces apparentées grâce à un score de similitude5,6.

Cependant, en raison de la propriété inhérente de la SEP de détecter le rapport masse/charge (m/z) des ions, la technique est aveugle à un certain nombre de caractéristiques structurelles qui entrent dans la gamme de l’isomérisme (stéréo). Par exemple, les glucides sont constitués de plusieurs sous-unités monosaccharidiques, dont beaucoup sont des stéréoisomères ou même des épimères (par exemple, Glc vs Gal ou Glc vs Man). Ces sous-unités sont liées par des liaisons glycosidiques, qui peuvent différer par la position de la liaison (régioisomérisme) et la configuration stérique du carbone anomérique (anomérisme). Ces caractéristiques font qu’il est difficile pour la SEP autonome de faire la distinction entre les isomères glucidiques7, et seul le régioisomérisme peut être traité à l’aide de méthodes d’activation à haute énergie8,9,10. Bien que la dérivatisation soit une option pour perturber l’équivalence des groupes stéréoisomériques11, elle nécessite une préparation approfondie des échantillons. Une autre option, plus simple, consiste à coupler la SEP avec une dimension analytique sensible à l’isomérisme, telle que l’IMS.

Étant donné que ce protocole est conçu pour les utilisateurs qui connaissent déjà les concepts de base du SGI et que des examens détaillés sont disponibles ailleurs12,13, seul un bref aperçu des principes du SGI est donné ici. IMS est une méthode de séparation en phase gazeuse qui repose sur l’interaction des ions avec un gaz tampon et un champ électrique, séparant finalement les ions en fonction de leurs conformations en phase gazeuse. Différents principes d’IMS couplés à MS peuvent être trouvés sur les instruments commerciaux: certains fonctionnent à des champs électriques alternés élevés et faibles (IMS asymétriques de champ, FAIMS), tandis que la plupart fonctionnent dans la limite de champ bas, notamment IMS à tube de dérive (DTIMS, champ électrique décroissant linéaire), IMS à ondes mobiles (TWIMS, ondes de potentiel symétriques) et IMS piégés (TIMS, flux élevé d’ions piégeant les gaz tampons contre les champs électriques)13 . Les méthodes à faible champ permettent d’accéder à ce que l’on appelle un CCS, une propriété de la paire ion-gaz qui représente la surface (en Å2 ou nm2) de l’ion qui interagit avec le gaz tampon pendant la séparation. Le CSC est théoriquement indépendant de l’instrument et est donc utile pour générer des données qui peuvent être reproduites entre différents laboratoires14. Les séparations de mobilité ionique peuvent être influencées par divers paramètres et, notamment, par les fluctuations de la pression et de la température du gaz dans la cellule de mobilité. L’étalonnage CCS est un moyen d’y remédier, car le calibrant et l’espèce d’intérêt seront affectés de la même manière13. Cependant, il est obligatoire d’installer l’instrument dans une pièce à température contrôlée et de disposer d’un système de contrôle de la pression de gaz fiable.

Une évolution intéressante de l’IMS est IMS/IMS, qui a été introduit pour la première fois en 2006 par le groupe de Clemmer en tant qu’analogue de MS/MS15,16. Dans IMS/IMS, un ion d’intérêt est isolé de manière sélective en fonction de sa mobilité ionique; il est ensuite activé (jusqu’à fragmentation possible), et une nouvelle analyse IMS de l’ion ou des fragments activés est effectuée. Dans la première conception instrumentale, deux cellules IMS ont été placées en série, séparées par un entonnoir ionique où se trouvait l’activation. Depuis lors, bien qu’un certain nombre de configurations IMS / IMS aient été proposées (pour un examen, voir Eldrid et Thalassinos17), le premier spectromètre de masse commercial doté de la capacité IMS / IMS n’est devenu disponible qu’en 201918. Cet instrument a considérablement amélioré le concept initial en le combinant avec une autre percée technologique : une conception cyclique de la cellule IMS.

La cellule IMS cyclique permet théoriquement d’augmenter presque à l’infini la longueur du trajet de dérive et, par conséquent, le pouvoir de résolution de l’instrument19. Ceci a été réalisé au moyen d’une géométrie d’instrument particulière, où la cellule TWIMS cyclique est placée orthogonalement à l’axe optique ionique principal. Une région de réseau multifonction à l’entrée de la cellule IMS permet de contrôler la direction du trajet ionique: (i) envoyer des ions latéralement pour la séparation IMS, (ii) vers l’avant pour la détection MS, ou (iii) vers l’arrière de la cellule IMS pour être stockés dans une cellule de préréseau. À partir de cette cellule de stockage prérésistante, les ions peuvent être activés et les fragments réinjectés dans la cellule IMS pour la mesure de la mobilité ionique, une approche qui a été utilisée avec succès pour caractériser les stéréoisomères20. En fin de compte, les données collectées contiennent des informations sur la mobilité ionique et m/z pour le précurseur et ses fragments.

Dans une publication récente qui a utilisé cette conception cyclique pour les analyses de glycanes (Ollivier et al.21), nous avons montré que le profil de mobilité des fragments contenus dans ces données IMS / IMS agit comme une empreinte digitale d’une biomolécule qui peut être utilisée dans une stratégie de réseau moléculaire. Le réseau qui en a résulté, appelé IM-MN, a conduit à l’organisation des ensembles de données glycomiques d’une manière structurellement pertinente, tandis que le réseau construit uniquement à partir de données MS / MS (MS-MN) a révélé peu d’informations. Pour compléter cette publication et aider les utilisateurs de Cyclic IMS à implémenter ce flux de travail, ce protocole fournit une description complète du protocole utilisé pour collecter les données. Ce protocole se concentre uniquement sur la génération des données IMS/IMS que les utilisateurs peuvent ensuite utiliser pour créer des réseaux IM-MN (voir 21), ou pour toute autre application de leur choix. La construction de l’IM-MN ne sera pas envisagée ici, car des protocoles de mise en réseau moléculaire sont déjà disponibles22. Les points cruciaux qui doivent être suivis pour générer des acquisitions IMS/IMS précieuses et reproductibles sont mis en évidence. Prenant l’exemple d’un des oligosaccharides étudiés par Ollivier et al. 21, les étapes suivantes sont détaillées : (i) préparation de l’échantillon, (ii) réglage de l’instrument IMS cyclique, (iii) prélèvement automatisé des pics des données et (iv) étalonnage CCS.

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Protocol

REMARQUE : Une vue d’ensemble du protocole est fournie à la figure 1. Les paramètres utilisés pour les expériences décrites dans le présent protocole se trouvent dans le tableau supplémentaire S1 et le tableau supplémentaire S2.

1. Préparation de la solution d’échantillon

NOTE: Le protocole est décrit en utilisant un pentasaccharide arabinoxylane (23-α-L-arabinofuranosyl-xylotétraose ou XA2XX; voir la Table des matériaux) à titre d’exemple.

  1. Préparation du solvant : 500 μM LiCl en 50:50 H2O:MeOH (vol./vol.).
    1. Préparer une solution mère de 100 mM de chlorure de lithium (LiCl) dans H2O en pesant 212 mg de LiCl et ajouter 50 mL d’eau désionisée de haute pureté (H2O) dans un tube conique en polypropylène de 50 mL. Agiter jusqu’à dissolution complète.
      REMARQUE: Le solvant est dopé avec un sel de lithium pour favoriser la formation d’adduits [M + Li] + dans la source ionique du spectromètre, car il donne généralement des spectres de fragmentation de meilleure qualité par rapport à d’autres adduits alcalins. L’utilisation de LiCl est recommandée car il a déjà été constaté que les acides organiques (et donc leurs sels) avaient un impact sur les profils IMS23.
    2. Dans une bouteille en verre, diluer la solution mère liCl 200x: à 250 μL de la solution mère, ajouter 24,75 mL de H2O. Ajouter 25 mL de méthanol (MeOH) pour atteindre une concentration finale de LiCl de 500 μM dans 50:50 H2O:MeOH (v/v). Sonicate pendant 2 min pour dégazer le solvant.
      REMARQUE: MeOH présente un danger pour la santé (H225, H301, H311, H331, H370); manipuler sous une hotte aspirante en portant une blouse de laboratoire, des gants et une protection oculaire. Une proportion de 50:50 MeOH/H2O (v/v) semble être le meilleur solvant pour l’ionisation des oligosaccharides; cependant, meOH peut être remplacé par l’acétonitrile (ACN) si nécessaire.
  2. Dans un tube en polypropylène de 1,5 mL, peser 1 mg de glucides. Dissoudre avec un volume approprié de 500 μM LiCl pour atteindre une concentration de 1 mg/mL. Diluer à une concentration finale de 10 μg/mL dans 50:50 MeOH/H2O + 500 μM LiCl. Conserver à 4 °C.
    REMARQUE: La concentration de 10 μg / mL a été choisie pour optimiser le signal sur tous les ions de fragment pendant IMS / IMS-MS (c’est pour un composé pur; augmenter la concentration lors du travail sur des mélanges). Pour l’acquisition des spectres IMS/IMS de référence, ne diluez pas davantage l’échantillon : une saturation du détecteur MS avant fragmentation est attendue, bien que l’instrument offre des options pour la corriger (voir étape 3.2.).

2. Réglage du spectromètre de masse IMS cyclique

REMARQUE: Les instructions relatives aux logiciels (fenêtres, menus et commandes) sont mises en surbrillance en gras.

  1. Ouvrez la console de l’instrument à partir du logiciel de contrôle de l’instrument (page MS tune , voir les détails du logiciel dans la table des matériaux) et mettez l’instrument en mode fonctionnement. Attendez au moins 3 h pour que les hautes tensions se stabilisent dans la cellule IMS.
    REMARQUE: Pour une reproductibilité optimale, les tensions dans la cellule IMS doivent être complètement stabilisées. Allumez les hautes tensions et laissez l’instrument se stabiliser pendant la nuit avant toute analyse IMS cyclique. En outre, la pression et la température dans la cellule de mobilité ionique doivent être maintenues aussi constantes que possible. Bien qu’une lecture de la pression soit disponible dans l’onglet Vide , aucune lecture n’est disponible pour la température. Conservez l’instrument dans un laboratoire thermostaté. L’instrument utilisé dans ce travail fonctionne à 1,75 mbar dans un laboratoire thermostaté à 20 °C.
  2. Configuration de l’instrument IMS cyclique
    REMARQUE: Les solutions standard doivent être infusées à l’aide du système fluidique intégré pour la configuration de l’instrument.
    1. Placer les récipients fluidiques remplis des normes appropriées fournies par le fabricant sur le système fluidique: Réservoir B (« Lockmass »): 10 pg / μL de leucine enképhaline (LEU ENK) dans 50:50 ACN / H2O + 0,1% d’acide formique; Réservoir C (« Calibrant »): MajorMix.
      REMARQUE: Dans ce protocole, la solution d’étalonnage MajorMix sera utilisée pour calibrer les dimensions m /z et CCS. Pour des raisons pratiques, un étalonnage CCS externe sera effectué (voir l’étape 5 du protocole); par conséquent, il est également possible d’utiliser un mélange interne de calibrant pour le CCS et un autre calibrant pour le m/z (par exemple, le formiate de sodium ou l’iodure de sodium).
    2. Sur la page Tune de la console Quartz, accédez à l’onglet Fluidics . Réglez la fluidique de l’échantillon sur le réservoir C et la fluidique de référence sur le réservoir B. Infusez les deux solutions consécutivement dans la source d’ions pour vérifier le signal MS.
    3. Effectuez la configuration de l’ADC, la configuration du détecteur (à l’aide de LEU ENK) et l’étalonnage de masse (voir la table des matériaux pour la solution d’étalonnage) à partir de la page Configuration de l’instrument conformément aux instructions du fabricant.
  3. Enregistrez une acquisition IMS de la solution d’étalonnage avec une séparation en un seul passage (utilisez-la pour l’étalonnage IMS externe).
    REMARQUE: La source d’ions et les paramètres de l’onde mobile (TW) (hauteur et vitesse de l’onde statique) doivent être maintenus constants pendant toutes les acquisitions (étalonnage et acquisitions). Si l’utilisateur n’a pas connaissance préalable des paramètres optimaux pour son échantillon, cette étape peut être effectuée après l’étape 3 du protocole (pour les adduits [M+Li]+ d’oligosaccharides neutres, les résultats représentatifs utilisent une hauteur TW de 16 V et une vitesse TW de 350 m/s, ce qui donne les meilleurs résultats).
    1. Dans l’onglet Fluidique , sélectionnez la position du déflecteur Échantillon et infusez l’étrier (voir le tableau des matériaux) dans la source d’ions (à l’aide du système fluidique intégré) à travers la sonde « Échantillon » à un débit de 10 μL / min.
    2. Configurez une séquence IMS à passage unique. Dans la page Tune , mettez l’instrument en mode Mobilité et ouvrez la fenêtre Contrôle de séquence cyclique . Sélectionnez Mode avancé . Dans l’onglet Fonctions cycliques de cette nouvelle fenêtre, sélectionnez Ajouter un bundle, puis Single/Multipass. Attendez qu’une séquence d’événements de mobilité apparaisse dans l’onglet Séquence de la même fenêtre.
      REMARQUE: Pour activer l’affichage en temps réel, l’utilisateur doit appliquer les paramètres de l’instrument: cliquez sur Tune en mode TOF ou Exécuter en mode Mobilité . Avant de basculer l’instrument entre les modes TOF et Mobilité , il est nécessaire d’abandonner toute acquisition en cours d’exécution (y compris l’affichage de la page Tune ). L’abondance relative des ions peut varier entre le mode TOF et le mode Mobilité en raison des changements dans les paramètres de transmission des ions.
    3. Adaptez la séquence pour que tous les ions calibrants fassent un seul passage autour de la piste de course IMS cyclique. Ne modifiez pas le temps d’injection ou l’éjection et n’acquérez pas de temps; toutefois, abaissez le temps de séparation à 1 ms (dans l’onglet Séquence ). Si certains ions du mélange d’étalonnage ne rentrent pas dans la fenêtre d’heure d’arrivée affichée, modifiez la synchronisation de l’IMS avec le poussoir de l’analyseur TOF d’accélération orthogonale en augmentant le nombre de poussées par bac dans l’onglet Paramètres ADC .
      REMARQUE: Les temps dans la séquence de contrôle contrôle contrôlent uniquement le réseau multifonction pour la fermeture d’ions. Tant que les ions sont engagés dans leur premier (ou nième) passage autour de la piste, ils termineront ledit passage même si la direction du TW a changé dans le tableau entre-temps. L’abaissement du temps de séparation à 1 ms signifie que la matrice passera en mode d’éjection après 1 ms. Cela garantit que les ions les plus rapides n’auront pas assez de temps pour traverser le réseau et s’engager dans un deuxième passage avant que les ions les plus lents ne terminent leur premier passage. Par conséquent, tous les ions seront soumis au même nombre de passes (c’est-à-dire une passe), ce qui est nécessaire pour effectuer l’étalonnage IMS.
    4. Enregistrez une acquisition de 2 minutes. Dans la fenêtre Contrôle de séquence cyclique , cliquez sur Acquérir pour ouvrir la fenêtre contextuelle Paramètres d’acquisition . Entrez le nom de fichier, la description et la durée d’acquisition (mins) et cliquez sur Enregistrer.
  4. Enregistrez une autre acquisition de 2 minutes de la solution d’étalonnage dans les mêmes conditions que l’étape 2.3 (utilisez-la pour vérifier la qualité de l’étalonnage CCS). Dans la fenêtre Contrôle de séquence cyclique , cliquez sur Acquérir pour ouvrir la fenêtre contextuelle Paramètres d’acquisition . Entrez le nom de fichier, la description et la durée d’acquisition (mins) et cliquez sur Enregistrer.
  5. Lavez soigneusement le système fluidique avec 50:50 H2O/ACN pour éviter la cristallisation de l’étrier dans le tube d’observation.

3. Acquisition d’IMS/IMS-MS

  1. À l’aide d’une pompe à seringue, infuser l’échantillon (dopé au lithium) à 10 μg/mL à travers la sonde d’échantillonnage à un débit de 10 μL/min.
  2. Basculez l’instrument en mode TOF (à partir de la page d’accord MS ) pour vérifier la stabilité du signal. Enregistrez une acquisition complète de SEP (1 min) de l’échantillon, ce qui sera utile pour vérifier le profil isotopique et la présence de contaminants potentiels.
    REMARQUE: Étant donné que la concentration de l’échantillon est choisie pour obtenir un bon signal ionique pour les fragments, une saturation TOF peut être observée à cette étape. La saturation du TOF peut être identifiée à l’aide des artefacts suivants : (i) une résolution MS artificiellement augmentée, (ii) un changement dans les rapports isotopiques et (iii) une multitude de pics de faible abondance entre les isotopes. Utilisez l’objectif DRE (Dynamic Range enhancement, onglet Quad/MS Profile/DRE de la page tune principale) pour atténuer la transmission des ions et éliminer la saturation en mode TOF (Figure 2A,B).
  3. Mettez l’instrument en mode MSMS (onglet Quad/MS Profile de la page principale Tune ) et sélectionnez la masse de l’ion ciblé dans le champ MSMS Mass pour l’isolement dans le quadripôle (dans l’exemple : m/z de 685,2, correspondant aux espèces ioniques [M+Li]+ du pentasaccharide arabinoxylane). Enregistrez une acquisition de 1 min pour vérifier l’isolement du précurseur lors du traitement des données.
    REMARQUE: Les adduits de lithium ont un isotope à -1 Da du pic monoisotopique, qui doit être retiré de la fenêtre de sélection MS / MS afin qu’il n’interfère pas avec les étapes de traitement. Il peut être supprimé en réduisant la plage de sélection à l’aide des paramètres Résolution LM et Résolution HM dans l’onglet Profil Quad/MS (Figure 2C).
  4. Mettez en place une séquence IMS de « tranchage » pour effectuer une sélection basée sur la mobilité de l’isomère d’intérêt.
    1. Basculez l’instrument en mode Mobilité (voir étape 2.3.2). Dans la fenêtre Contrôle de séquence cyclique , dans l’onglet Fonctions cycliques , sélectionnez Ajouter un bundle , puis Découpage. Attendez qu’une séquence complexe d’événements de mobilité apparaisse dans l’onglet Séquence (Figure 3).
      REMARQUE: Il est possible de visualiser chaque étape du processus IMS/IMS: cliquez sur l’événement Éjecter et acquérir dans l’onglet Séquence . Une fois surligné en rouge, déplacez-le à la position appropriée dans la séquence à l’aide des boutons Haut et Bas .
    2. Positionnez l’événement Eject and Acquire juste après le premier événement Separate (c’est-à-dire déplacez-le à la ligne 3 au lieu de la ligne 8 dans la séquence comme illustré à la figure 3), puis cliquez sur Exécuter. Recherchez les résultats de la séparation initiale à afficher en temps réel. Augmentez la durée du premier événement Separate pour une séparation multipasse en modifiant la valeur temporelle de cet événement dans la séquence jusqu’à ce que la résolution des pics IMS soit satisfaisante. Enregistrez une acquisition de 1 min pour référence.
      REMARQUE: Prenez note de la valeur ADC Start Delay dans l’onglet ADC Setup : il sera utile de vérifier la qualité de l’isolation.
    3. Cliquez sur Pause. Notez que les résultats de la séparation initiale sont affichés, bien que les modifications apportées à la séquence de contrôle ne soient pas appliquées tant que l’utilisateur n’aura pas cliqué à nouveau sur Exécuter . Placez l’événement Éjecter et acquérir sous les événements Éjecter, Éjecter vers le pré-magasin et Conserver et éjecter . Ajustez la durée des événements de sorte que le pic ciblé se trouve dans la région Éjecter vers le pré-stockage et que tout autre ion se trouve dans la région Éjecter ou Tenir et éjecter .
      REMARQUE : La durée de ces trois événements par rapport aux distributions d’heure d’arrivée (ATD) peut être visualisée à l’aide de la barre codée par couleur sous le spectre de mobilité dans l’onglet Mobilogramme (Figure 3).
    4. Positionnez l’événement Eject and Acquire à la fin de la séquence, sous les événements Reinject from Pre-Store et les deuxièmes événements Separate . Cliquez sur Exécuter pour afficher la population sélectionnée.
      REMARQUE: Étant donné que la population sélectionnée a quitté la cellule IMS, toutes les séparations précédentes ont été perdues et elle est revenue à une séparation en un seul passage (ce qui est souhaité).
    5. Vérifiez la qualité de l’isolement. Pour vérifier que seul le pic d’intérêt a été sélectionné, effectuez la même séparation après réinjection qu’avant la réinjection (c.-à-d. même heure séparée ) comme illustré à la figure 4. Enregistrez une acquisition de 1 min pour référence.
      REMARQUE: Les utilisateurs sont encouragés à vérifier la population éjectée; la fenêtre de temps Éjecter vers le préstockage doit être au niveau de référence (Figure 4B). Pour vérifier cela, placez le délai de démarrage ADC en mode manuel dans l’onglet Paramètres ADC et entrez le délai indiqué à l’étape 3.4.2. Enregistrez une acquisition de 1 min pour référence.
    6. Dans l’onglet Séquence , dans la colonne en regard des heures d’événement définies par l’utilisateur (la colonne Abs de temps , surlignée en rouge), recherchez les heures additionnées de tous les événements. Prenez note de l’abs temporel trouvé sur la ligne de l’événement Reinject from Pre-Store pour effectuer l’étalonnage CCS.
  5. Fragmenter le pic ciblé entre les deux cycles d’IMS. Modifiez les tensions de l’étape de réinjection pour augmenter l’énergie cinétique des ions et fragmentez-les lors de la collision avec le gaz de mobilité ionique.
    1. Définissez la durée de l’événement Separate précédant directement l’éjection et l’acquisition sur 1 ms (voir l’explication à l’étape 2.3.3).
    2. Sur la ligne Réinjecter à partir du pré-magasin , cochez la case Activer l’activation et optimisez la fragmentation avec le contrôle intégré. Si le spectre est satisfaisant (p. ex., le pic de base est un fragment), passez directement à l’étape 3.5.4.
      REMARQUE: Lors de l’activation, trois tensions sur la ligne deviennent grises: ce sont les tensions que l’utilisateur doit changer si une optimisation manuelle des tensions est nécessaire (voir l’étape suivante). Ces trois tensions (Pre-Array Gradient, Pre-Array Bias et Array Offset) forment le gradient utilisé pour activer les ions. L’énergie cinétique des ions augmentera avec la pente entre le biais de pré-réseau et le décalage de réseau (voir la figure 5). Les valeurs par défaut des valeurs Gradient → Bias → Offset sont les suivantes : sans activation 85 → 70 → 45 V ; activation maximale de la fonction intégrée 185 → 170 → -5 V (+150 V). Après fragmentation, n’oubliez pas de réajuster la transmission ionique à l’aide de la lentille DRE (diminuer l’atténuation du signal) (voir étape 3.2.).
    3. Si la fragmentation n’est pas satisfaisante avec le contrôle intégré, décochez la case Activer l’activation et procédez à l’optimisation manuelle des tensions de réinjection. Augmentez la tension du gradient de pré-réseau (la tension de polarisation de pré-réseau doit toujours être maintenue à 15 V en dessous du gradient de pré-réseau) et abaissez la tension de décalage de réseau (qui peut être définie comme négative) jusqu’à ce que les résultats soient satisfaisants.
      REMARQUE: Lors du réglage manuel des tensions du réseau multifonction, l’utilisateur peut passer de la vue « Mobilogram » à des schémas interactifs des tensions appliquées dans le réseau multifonction (diagramme PE) pour mieux visualiser les paramètres de tension (Figure 5A).
    4. Enregistrez une acquisition de 2 min. Dans la fenêtre contextuelle d’acquisition, cochez l’option Conserver le temps de dérive pour générer un fichier contenant uniquement les heures d’arrivée vs m/z (le temps d’acquisition utilisé pour les analyses chromatographiques - le temps de rétention - est supprimé du fichier). Notez que ce fichier est intitulé *_dt. RAW.
      REMARQUE: Si l’utilisateur oublie de cocher l’option Conserver le temps de dérive , il est toujours possible d’extraire la dimension IMS à l’aide du logiciel Driftscope 2.9 (File | Exporter vers MassLynx | Conserver le temps de dérive).
  6. Remettez l’instrument en mode TOF dans la page principale Tune et rincez soigneusement le système avec 50:50 MeOH/H2O avant de passer à l’échantillon suivant.

4. Traitement IMS/IMS-MS avec MZmine 224

REMARQUE: MZmine 2 est disponible à partir de l’URL indiquée dans le tableau des matériaux. L’utilisation de MZmine 2.51 est recommandée. Au moment de la préparation de ce manuscrit, les versions ultérieures ne peuvent pas ouvrir les fichiers RAW à partir d’instruments IMS cycliques en raison d’une modification de la fonction d’importation.

  1. Importez le(s) fichier(s) brut(s) contenant uniquement les dimensions IMS et m/z (*_dt. RAW) à l’aide de méthodes de données brutes | Importation de données brutes.
    REMARQUE: Les fichiers bruts apparaîtront sur le côté gauche de la fenêtre principale de MZmine. N’importez pas l’original *. Fichiers RAW qui contiennent toujours la dimension de temps de rétention. MZmine ne distingue pas le temps de rétention de l’heure d’arrivée IMS, et les points de données des deux dimensions se chevaucheraient.
  2. Optimisez les paramètres de flux de travail sur un fichier représentatif en le sélectionnant dans le Fichiers de données brutes liste.
    1. Évaluez le niveau de bruit dans les données. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur le fichier dans la liste Fichiers de données raw , sélectionnez Afficher TIC et affichez le pic de base « chromatogramme » (BPC). Double-cliquez sur le plus petit pic observable à l’œil nu pour afficher son spectre de masse. Considérez que le niveau de bruit dans les données est proche de celui du deuxième isotope du pic de base dans ce spectre, et utilisez cette même valeur pour tous les seuils d’intensité dans les étapes de traitement suivantes.
      REMARQUE: Les données ont été acquises à l’aide de l’isolement quadripolaire et sont donc considérées par MZmine comme MS / MS. Tout au long du traitement MZmine, assurez-vous de travailler à un niveau MS = 2.
    2. Effectuez la détection de masse à l’aide des méthodes de données brutes | | de détection de fonctionnalités Détection de masse. Pour les données acquises en mode profil, utilisez l’algorithme de transformation Wavelet . Pour configurer les paramètres des algorithmes dans MZmine, cliquez sur le bouton [...] à côté de l’algorithme et utilisez l’option Afficher l’aperçu pour visualiser les données tout en optimisant les paramètres.
      REMARQUE: À ce stade, les pics sélectionnés par l’algorithme apparaîtront en rouge dans la fenêtre d’aperçu. Lors de l’utilisation de l’algorithme de transformation d’ondelettes sur des fichiers RAW propriétaires, MZmine confond parfois les points de données de profil avec des pics centroïdes. Le logiciel affichera un message indiquant que l’utilisateur exécute un algorithme de profil sur des spectres centrifiés: ignorez ce message et cliquez sur OK.
    3. Reconstruire les spectres de mobilité ionique (EIM) extraits pour chaque masse de fragment à l’aide de méthodes de données brutes | | de détection de fonctionnalités Constructeur de chromatogrammes ADAP sur la liste de masse des « masses » générée par l’étape précédente. Comme l’entrée de tolérance m/z à ce stade est une tolérance de balayage à balayage, assurez-vous de la laisser au moins 3 à 4 fois supérieure à la précision globale attendue.
    4. Comme l’étape précédente n’a pas d’option d’aperçu, vérifiez la qualité de la sélection de pic directement à l’aide de la liste des fonctionnalités qui apparaît sur le panneau de droite de la fenêtre principale de MZmine. Ouvrez la liste Fonctionnalité, sélectionnez toutes les lignes, cliquez avec le bouton droit de la souris, puis sélectionnez Afficher/XIC (boîte de dialogue). Cliquez sur Tout pour afficher tous les ions du spectre de mobilité. Inspectez les pics choisis qui apparaissent en couleur pour vous assurer qu’il n’y a pas de pics manqués évidents.
    5. Déconvolez les EIM pour diviser les m/z qui contiennent différents pics en plusieurs entités. Utiliser les méthodes de liste de fonctionnalités | | de détection de fonctionnalités Déconvolution du chromatogramme et choisissez l’algorithme Wavelets (ADAP). Optimisez l’algorithme pour les données à l’aide de l’option Afficher l’aperçu et des paramètres clés suivants : seuil S/N, seuil de coefficient/zone et plage d’ondelettes RT.
      REMARQUE: Il est recommandé de vérifier l’aspect du spectre déconcentré. Utilisez l’outil de visualisation du chromatogramme, comme décrit à l’étape 4.2.4. Les pics déconcentrés apparaîtront en couleur et les pics de même masse devront être divisés, comme illustré à la figure 6A.
    6. Désisotope les EIM déconcentrés à l’aide des méthodes de liste de fonctionnalités | Isotopes | Pics isotopiques mérou. Utilisez la précision attendue de l’instrument pour la valeur de tolérance m/z et réglez la tolérance de temps d’arrivée à 0,1 ms (affichée dans MZmine comme Tolérance de temps de rétention 0,1 min), car les isotopes ne sont pas résolus lors de la séparation IMS. Vérifiez la liste des caractéristiques : s’il reste des isotopes, augmentez les valeurs de tolérance.
      REMARQUE: Bien que le désisotopage puisse théoriquement être effectué à tout moment du traitement de la liste des fonctionnalités, il est important de le faire en dernier afin que les valeurs de charge puissent être exportées (les algorithmes utilisés pour les autres étapes supprimeront parfois les informations d’état de charge).
  3. Si vous traitez plusieurs spectres IMS/IMS-MS, répétez le traitement avec ces paramètres optimisés. Conservez les mêmes paramètres pour tous les spectres.
  4. Dans le cas de plusieurs spectres, regroupez-les dans une seule table pour les exporter; si ce n’est pas le cas, passez directement à l’étape 4.5. Pour regrouper les spectres, utilisez les méthodes de liste de fonctions | | d’alignement Joindre l’aligneur. Étant donné que l’objectif n’est pas d’aligner réellement les pics, utilisez des valeurs de tolérance restrictives pour m/z et l’heure d’arrivée. Donnez le même poids aux deux dimensions.
  5. Exportez la liste finale des fonctionnalités dans un fichier *.csv . Utiliser les méthodes de liste de fonctionnalités | | d’exportation/importation Exportez vers un fichier CSV et exportez les valeurs suivantes : Exportez la ligne m/z, Exportez le temps de rétention de la ligne (l’heure d’arrivée IMS réelle), Peak m/z et Peak height. Utilisez une virgule comme séparateur de champ.

5. TWCCSN2 des spectres IMS/IMS centroïdes

REMARQUE: Dans ce protocole, un étalonnage d’ajustement logarithmique25,26 sera utilisé, ce qui tend à donner de meilleurs résultats que l’étalonnage linéaire et est facile à implémenter dans une feuille de calcul ou un script de traitement interne. Un script interne (écrit en R) est disponible à l’URL indiquée dans la Table des matériaux.

  1. Choisissez les valeurs d’heure d’arrivée de référence dans l’acquisition de l’étrier (voir étape 2.3). Faites-le manuellement à l’aide du logiciel constructeur (voir la table des matériaux) pour vérifier l’aspect de tous les pics d’étalonnage IMS.
    1. Dans la fenêtre Chromatogramme , ouvrez le *_dt. RAW correspondant au calibrant.
    2. Pour chaque point d’étalonnage, générez l’EIM à l’aide de l'| d’affichage Option de masse .
    3. Vérifiez le profil des EIM. Si certains sont mal définis, lissez-les à l’aide du process | Option lisse (car les meilleurs résultats sont généralement obtenus avec l’algorithme Savitzky-Golay, lisse 2 fois sur 3 bacs). Signalez les valeurs de sommet dans une feuille de calcul.
      REMARQUE : Étant donné que les points de référence sont généralement acquis à l’aide de périphériques DTIMS basse résolution, certaines distributions multimodales peuvent apparaître dans Cyclic IMS en fonction des calibrants. Supprimez tout pic présentant une telle distribution de la liste d’étalonnage.
  2. Calculez les paramètres d’ajustement logarithmique à partir des calibrants.
    1. Pour tous les points d’étalonnage, calculez ce qui suit.
      1. Calculez le temps de dérive à l’aide de Eq (1) :
        Equation 1 (1)
        avec td le temps de dérive, tA le temps d’arrivée mesuré, et tinj le temps d’injection dans la cellule IMS (tout en ms).
        REMARQUE: Pour les petites molécules, telles que les fragments d’oligosaccharides, la variation du temps mort (temps de vol entre la sortie de la cellule IMS et le détecteur) entre les différentes masses se situe dans la plage d’erreur de l’étalonnage CCS et peut être ignorée.
      2. Calculer la masse neutre des ions en utilisant Eq (2):
        Equation 2 (2)
        avec z l’état de charge de l’ion, et mion la masse du contre-ion (en Da). Utilisez des masses exactes pour éviter d’introduire de l’incertitude. S’il y a une perte d’atome au lieu d’un contre-ion, utilisez des valeurs de mions négatives (par exemple, pour [M-H]-mneutral = (m/z) * |z| - (- 1,007276) = (m/z) * |z| + 1,007276). 
      3. Calculez le paramètre du CCS à l’aide de Eq (3) :
        Equation 3 (3)
        avec CCS la valeur DTCCSN2 du tube de dérive de référence (en nm2), et mgas la masse du gaz de dérive (en Da; ex. pour l’azote: mgas = 28,01 Da).
      4. Calculez le paramètre td' à l’aide de Eq (4) :
        Equation 4 (4)
        avec d le délai de démarrage du détecteur utilisé expérimentalement pour corriger le temps mort (généralement ~ 1,5 ms).
      5. Calculer le logarithme des paramètres ci-dessus :
        ln (CCS') et ln (t’d)
    2. Effectuer une régression linéaire pour déterminer le coefficient R2 et les paramètres x et y de l’ajustement logarithmique (avec x la pente et ln(y) l’interception) en utilisant Eq (5) :
      Equation 5 (5)
      REMARQUE: L’utilisateur peut tracer les valeurs ln (CCS') vs ln (td') pour vérifier visuellement les résultats de l’étalonnage, bien que cela soit facultatif.
  3. Appliquez l’étalonnage aux données expérimentales pour calibrer les pics choisis par MZmine pour chaque spectre IMS/IMS exporté vers le fichier *.csv. Pour chaque point, calculez ce qui suit.
    1. Calculez le temps de dérive à l’aide de Eq (6) :
      Equation 6 (6)
      avec tseq le temps précédant la séparation IMS finale (la valeur 'Time Abs' notée à l’étape 3.4.6).
      REMARQUE: Si vous étalonnez plusieurs spectres IMS / IMS acquis avec différentes séquences, vérifiez soigneusement les valeurs tseq.
    2. Calculer la masse neutre des ions en utilisant Eq (7):
      Equation 7 (7)
    3. Calculez les paramètres td' et td'' en utilisant Eq (8) et Eq (9) :
      Equation 8 (8)
      Equation 9 (9)
    4. Calculer les valeurs CCS étalonnées finales (TWCCSN2 en nm2) à l’aide de Eq (10) :
      Equation 10 (10)
      REMARQUE: Bien que l’étape 5.2.2. donne ln(y) comme interception, y doit être utilisé pour obtenir la valeur CCS finale. N’oubliez pas d’appliquer une fonction exponentielle.
  4. Vérifiez la précision de l’étalonnage en appliquant l’étalonnage à la deuxième acquisition de la solution d’étalonnage acquise à l’étape 2.4.
    REMARQUE: L’étalonnage devrait donner des résultats avec une erreur d’environ 1-2%.

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Representative Results

Un pentasaccharide arabinoxylane, XA2XX, a été choisi comme exemple pour illustrer ce protocole. Ce composé est disponible dans le commerce, mais uniquement sous forme de mélange avec un autre pentasaccharide arabinoxylane, XA3XX (le XA3XX pur est également disponible dans le commerce). Les structures de XA2XX et XA3XX sont données dans la figure supplémentaire S1. Comme le rapport entre XA2XX et XA3XX dans le mélange commercial est d’environ 50:50, une solution à 20 μg/mL du mélange a été préparée pour atteindre une concentration de XA2XX d’environ 10 μg/mL dans 50:50 MeOH/H2O + 500 μM LiCl.

Tout d’abord, une analyse MS du mélange XA2XX + XA3XX a été réalisée à l’aide de MS haute résolution. Comme les deux composés sont des isomères, un seul pic a été observé à [M+Li]+m/z 685,24. Ce pic de SEP a été sélectionné avec le quadripôle et la fenêtre de sélection ajustée pour éliminer l’isotope de lithium -1 Da, qui pourrait être confondu avec le pic monoisotopique par des algorithmes de traitement (Figure 2).

Les adduits [M+Li]+ des pentasaccharides ont ensuite été soumis à la première étape de séparation IMS : après 3 passages autour de la cellule IMS cyclique, 3 pics ont été séparés avec des temps d’arrivée de 83, 90 et 94 ms. Ce profil a été comparé à celui du XA3XX pur (infusé à 10 μg/mL), montrant que les pics à 83 et 90 ms correspondaient au XA3XX, tandis que le pic à 94 ms correspondait au XA2XX (Figure 4A). Le pic à 94 ms a été sélectionné pour l’analyse IMS/IMS : les ions appartenant à XA3XX ont été éjectés (Figure 4B), et le pic d’intérêt a été envoyé à la cellule de stockage de préréseau. Une séparation à 3 passes a été effectuée après réinjection de l’ion sans activation pour s’assurer que seul le pic XA2XX restait après la sélection (arrivant à 199 ms dans la figure 4C).

Ensuite, l’ion a été fragmenté lors de la réinjection de la zone de pré-magasin, et une séparation IMS en un seul passage a été effectuée sur tous les fragments. Deux activations différentes ont été essayées : le réglage maximal de la fonction d’activation de pré-magasin intégrée a d’abord été essayé (Figure 5B,C) ; cependant, le précurseur est resté le pic de base du spectre. Cela n’est pas souhaitable car, pour les spectres de référence, les fragments en dessous d’un certain seuil d’intensité seraient généralement supprimés. Ainsi, un gradient de préréseau défini manuellement → biais de pré-réseau → gradient de tension décalé du réseau a été choisi (Figure 5D,E).

Les données IMS/IMS-MS générées ont été déconcentrées avec MZmine 2.51, en utilisant l’heure d’arrivée et les dimensions m/z (Figure 6A), pour donner des spectres IMS/IMS contenant uniquement les informations de mobilité des fragments. Les pics supérieurs à 0,2 % d’intensité relative ont été exportés pour l’étalonnage du CSC (les paramètres détaillés de MZmine sont donnés dans le tableau supplémentaire S1). L’étalonnage du CSC a été effectué à l’aide de la solution d’étalonnage (R2 = 0,995, écart absolu moyen du contrôle = 1,63 %, voir le tableau supplémentaire S3). Ce traitement a finalement permis d’obtenir un spectre IMS/IMS centroïde, étalonné par CCS (figure 6B).

Figure 1
Figure 1 : Vue d’ensemble du processus de génération de données IMS/IMS. Abréviations : IMS = spectrométrie de mobilité ionique; IMS/IMS = IMS tandem. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Motif isotopique d’un mélange de pentasaccharides arabinoxylanes XA3XX + XA2XX. (A) Signal saturé sans DRE ; (B) signal corrigé à l’aide d’ERD avec une transmission ionique à 5 % (c.-à-d. une atténuation de 95 %); et (C) profil après sélection quadripolaire pour éliminer le pic -1 Da correspondant à un isotope du lithium. En violet : la région où des pics d’artefacts peuvent apparaître en raison de la saturation est agrandie 6 fois. Abréviations : DRE = dynamic range enhancement; MS = spectrométrie de masse; MSMS = MS tandem; LM Res = résolution de faible masse; HM Res = résolution de masse élevée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Vue d’ensemble de la fenêtre de contrôle IMS cyclique, dans laquelle l’utilisateur définit la séquence IMS/IMS. La séquence affichée montre comment vérifier la qualité de l’isolement dans IMS/IMS, avec une sélection de XA2XX après 3 passages (le spectre affiché correspond au réglage des événements de sélection après la séparation de la première étape). La séquence consiste à exécuter une première séparation IMS à 3 passes sur 58 ms, puis à éjecter les deux isoformes les plus rapides de la cellule IMS (segment 3), à éjecter l’isoforme plus lente (ATD entre 92 et 96 ms) dans le préstockeur (segment 4), à la réinjecter dans la cellule IMS sans activation (segment 6), permettant aux ions de subir une autre séparation à 3 passes (58 ms) (segment 7), puis éjecter des ions de la cellule IMS et acquérir des données (segment 8). Abréviations : IMS = spectrométrie de mobilité ionique; cIMS = IMS cyclique; IMS/IMS = tandem IMS; ADC = convertisseur analogique-numérique; TW = onde mobile; PE = énergie potentielle; ATD = répartition de l’heure d’arrivée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Sélection de XA2XX à partir du mélange de XA2XX et XA3XX. (A) Séparation des pentasaccharides arabinoxylanes, XA3XX et XA2XX, après 3 passages (correspondant à un temps de séparation fixé à 58 ms) autour de la cellule IMS cyclique. (B) Fraction éjectée directement après la première étape de la séparation IMS. (C) Fraction sélectionnée pour IMS/IMS sur laquelle une autre séparation à 3 passages a été effectuée après réinjection. Le pic d’intérêt XA2XX est surligné en gris. Les spectres de mobilité ionique sont affichés dans des bacs de données et annotés avec leur heure d’arrivée (ms). Abréviations : IMS = spectrométrie de mobilité ionique; IMS/IMS = IMS tandem. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Principes de dissociation induite par collision à l’aide de la zone de stockage de préarray. (A) Schémas de la région du réseau multifonction détaillant les tensions clés (en rouge) utilisées pour la sélection, la réinjection et l’activation lors des expériences IMS/IMS. Les flèches bleues indiquent la direction de l’onde mobile dans le réseau multifonction. (B, C) Spectres IMS/IMS et MS/MS obtenus pour XA2XX à l’aide de la fonction d’activation de pré-magasin intégrée (+150 V). La barre de couleur représente l’échelle d’intensité ionique (bleu = faible; rouge = élevé). (D, E) Spectres IMS/IMS et MS/MS obtenus pour XA2XX avec optimisation manuelle des tensions (gradient de préréseau 195 V, biais de préréseau 180 V, décalage de réseau -10 V). Les ions précurseurs sont indiqués par des astérisques sur les spectres. Les spectres de mobilité ionique sont affichés dans des bacs de données et annotés avec leur heure d’arrivée (ms). Abréviations : IMS = spectrométrie de mobilité ionique; IMS/IMS = tandem IMS; TOF = temps de vol. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Illustration des étapes de traitement. Résultats de (A) la cueillette du pic MZmine et (B) l’étalonnage CCS de l’arabinoxylan pentasaccharide XA2XX. A montre la déconvolution de masse du spectre IMS/IMS à travers un code couleur. B montre le spectre IMS/IMS final après centroïde et étalonnage CCS. Abréviations : IMS = spectrométrie de mobilité ionique; IMS/IMS = tandem IMS; CCS = section transversale de collision. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Une comparaison de deux spectres IMS/IMS de XA2XX illustre la reproductibilité de la méthode. Le spectre étalonné final de cet article (en haut) est comparé au spectre des travaux d’Ollivier et al. 21 (en bas, retourné). Abréviations : IMS = spectrométrie de mobilité ionique; IMS/IMS = tandem IMS; CCS = section transversale de collision. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire S1: Structures des pentasaccharides arabinoxylane XA2XX et XA3XX. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S2 : Évaluation de la répétabilité interjournalière à l’aide de XA2XX. Les acquisitions d’IMS/IMS ont été répétées au jour 1 (en haut) et au jour 95 (en bas). Abréviations : IMS = spectrométrie de mobilité ionique; IMS/IMS = IMS tandem. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire S1 : Paramètres détaillés de MZmine. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau supplémentaire S2 : Modification des paramètres de l’instrument pour évaluer la reproductibilité. Abréviation : ESI = ionisation par électropulvérisation. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau supplémentaire S3 : Contrôle de l’étalonnage CCS à l’aide d’une deuxième acquisition de solution d’étalonnage. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

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Discussion

L’IMS cyclique SELECT SERIES est un outil puissant qui permet de sélectionner une population d’ions définie , d’une mobilité m/z et ionique donnée , sans avoir besoin d’une séparation chromatographique en amont. L’instrument offre la possibilité de générer une carte de fragmentation bidimensionnelle de cette population d’ions, à partir de laquelle les spectres MS/MS et IMS/IMS peuvent être extraits. Cependant, l’utilisateur doit noter plusieurs points critiques qui nécessitent une attention particulière au cours du processus expérimental.

Tout d’abord, l’utilisateur doit vérifier attentivement la fenêtre d’isolation MS pour la présence de contaminants isobares possibles. En effet, la fenêtre d’isolement d’un quadripôle est relativement large, et connaître des ions d’un m/z légèrement différent qui peuvent être cosélectionnés dans le quadripôle aidera l’utilisateur à attribuer correctement le pic d’intérêt pour la mobilité ionique.

Deuxièmement, lors de la séparation initiale, l’utilisateur doit s’assurer que tous les ions subissent le même nombre de passages autour de la cellule de mobilité ionique cyclique. Il s’agit d’un aspect important et délicat de la séparation de la mobilité ionique dans un dispositif cyclique. Une évaluation erronée du nombre de passages pour un ion donné peut conduire à une identification et une interprétation incorrectes des pics. Le contrôle du nombre de passages de différentes populations d’ions peut être délicat en raison de la longueur relativement courte d’un seul passage (~ 1 m), et les espèces ayant des mobilités très différentes peuvent rapidement se chevaucher.

En particulier, un pic peut se diviser entre deux passes différentes si le réseau change de direction lorsque cette population d’ions passe (ceci est relativement facile à identifier: le pic divisé apparaîtra plus net avec une population juste au début de l’événement Eject and Acquire ). Pour régler correctement le nombre de passes, l’utilisateur doit commencer par un temps de séparation court (1-5 ms) qui donnera le profil 1-pass. Ensuite, l’utilisateur doit augmenter progressivement le temps de séparation jusqu’à ce que toute la population soit passée à des heures d’arrivée plus élevées, ce qui donnera le profil à 2 passes. Le profil à 2 passes doit ressembler au profil à 1 passe, mais avec des pics mieux résolus. Le temps qu’une population d’ions donnée prend pour faire un passage autour de la cellule cyclique est une constante que l’utilisateur peut utiliser pour calculer le nombre de passes en fonction du temps de séparation. Par exemple, s’il y a une différence de 10 ms entre le premier et le deuxième passage, il y aura également une différence de 10 ms entre le deuxième et le troisième.

Troisièmement, au cours de l’étape de sélection du SGI, l’utilisateur doit vérifier soigneusement la qualité de l’isolement, comme le montre la figure 4. Il est particulièrement important de vérifier le profil réinjecté car si les réglages de hauteur et de vitesse TW sont trop bas, l’éjection des autres populations pourrait ne pas être complète. Les utilisateurs avancés peuvent corriger cela en ajustant la tension de radiofréquence RF Driftcell dans l’onglet RF de la page Tune .

Quatrièmement, l’utilisateur doit être prudent dans la génération du spectre de fragmentation et, notamment, dans le choix de l’énergie de collision appropriée, en particulier si les tensions sont réglées manuellement. En effet, une baisse excessive de la tension Array Offset peut avoir un impact négatif sur l’intensité ionique globale en entravant la réinjection. En outre, le précurseur et les fragments peuvent s’étendre sur un large éventail de mobilités. Ainsi, ils subiront rapidement un nombre différent de passes si le temps de séparation final est élevé, il est donc important de conserver un événement séparé de 1 ms comme expliqué à l’étape de protocole 2.3.3. Il s’agit d’une limitation majeure puisque la longueur en un seul passage est relativement courte, ce qui limite le pouvoir de résolution en un seul passage à environ 100 pour les oligosaccharides27. À cet égard, une longueur de chemin accrue en un seul passage serait bénéfique (c’est-à-dire les structures TWIMS pour la manipulation d’ions sans perte ou SLIM, avec une longueur de chemin de 13 m28). La configuration SLIM a été lancée commercialement très récemment29.

Enfin, l’utilisateur doit être prudent dans la définition de la plage de mobilité d’acquisition finale à l’aide de la commande Pushes per bin , en particulier s’il travaille sur des ions chargés multipliés. La mobilité ionique est en effet fonction de la charge12 et, par exemple, les fragments chargés individuellement générés à partir d’un précurseur doublement chargé sont susceptibles d’être plus lents que le précurseur (bien qu’il s’agisse de composés plus petits).

Une limitation majeure de l’utilisation uniquement des séparations MS et IMS pour sélectionner le précurseur (et non, par exemple, une étape en amont de la chromatographie) est qu’un m/z donné peut produire plusieurs pics dans IMS et que plusieurs pics peuvent provenir du même composé. Ceci est illustré par les distributions de m/z 685.2, à la fois pour le mélange XA2XX+XA3XX et pour le XA3XX pur, à la figure 4A. Les distributions IMS multimodales d’un seul m/z résultent de différentes conformations en phase gazeuse. Pour les espèces analysées comme des adduits cationiques (en mode positif), les différentes conformations peuvent résulter de différences de coordination avec le contre-ion30,31,32.

Pour les oligosaccharides, ils peuvent également résulter de la séparation des anomères à extrémité réductrice, bien que la séparation des anomères à extrémité réductrice nécessite généralement un pouvoir de résolution IMS plus élevé que celui utilisé ici33,34,35. En l’espèce, la distribution imS multimodale de la figure 4A résulte en partie des contributions individuelles de XA2XX et de XA3XX. Il est toutefois à noter que XA3XX donne deux pics, qui sont probablement des conformeurs de coordination cationique. Il était facile d’identifier quel pic correspondait à XA2XX (c’est-à-dire l’espèce d’intérêt) parce que le XA3XX pur est disponible dans le commerce et que son profil de mobilité pouvait être enregistré séparément. Pour travailler sur des mélanges complexes tels que des milieux biologiques, il peut être important d’envisager l’ajout d’une étape de séparation chromatographique.

Deux points doivent être notés concernant le flux de travail de traitement utilisé pour obtenir des spectres IMS/IMS déconcentrés en masse. Tout d’abord, dans ce protocole, il est proposé d’utiliser MZmine 224 pour déconvoluer le spectre IMS/IMS en utilisant la dimension MS et, notamment, d’utiliser l’algorithme ADAP36 pour diviser les EIM en différents pics. Bien qu’il donne de très bons résultats, comme l’illustre la figure 6, l’algorithme ADAP a été conçu pour les analyses chromatographiques et tient donc compte des facteurs d’asymétrie inhérents à la chromatographie en phase liquide, tels que le pic de résidus. Par conséquent, l’algorithme ADAP peut avoir pour conséquence de ne pas identifier certaines des caractéristiques lorsqu’il est appliqué aux pics IMS (par exemple, les épaules). Essentiellement, les données IMS sont plus simples que les données chromatographiques : comme il n’y a pas d’interaction chimique des composés avec une colonne, les données IMS acquises dans des conditions appropriées (c.-à-d. sans saturer la cellule IMS) devraient suivre les distributions gaussiennes37,38. Idéalement, l’étape de déconvolution ADAP serait mieux remplacée par une fonction d’ajustement gaussien, telle que celle utilisée par les logiciels destinés à IMS comme CUISuite 239. Cependant, en l’état, la déconvolution gaussienne n’a pas été directement adaptée à la chaîne complète de traitement décrite dans ce protocole. Par conséquent, l’utilisation du logiciel gratuit et open source MZmine semblait être un bon compromis pour les utilisateurs finaux.

La deuxième partie du traitement qui mérite d’être discutée est l’étalonnage du CSC. Ce protocole propose d’utiliser un étalonnage d’ajustement logarithmique25,26 et un mélange d’étriquant commercial du même fournisseur que celui du spectromètre (voir la Table des matériaux). Cette procédure est la plus simple à mettre en œuvre en laboratoire. En ce qui concerne le choix du mélange d’étriquants, l’utilisateur doit considérer que, comme mentionné dans plusieurs études, la précision de l’étalonnage CCS est améliorée lors de l’utilisation d’étriquants de la même classe moléculaire et du même état de charge que l’analyte26,40,41. L’erreur introduite lors de l’étalonnage avec des types de composés relativement similaires (par exemple, glucides vs peptides) est modérée. Cependant, il est recommandé de ne pas utiliser d’ions très différents tels que, par exemple, l’utilisation de grappes de sel comme calibrants lors de la mesure des glucides41. En ce qui concerne le choix de la méthode d’étalonnage, Richardson et al.42 ont récemment rapporté une nouvelle méthode d’étalonnage qui prend en compte la physique de TWIMS pour améliorer la précision de l’étalonnage (avec un logiciel fourni). Cependant, l’approche nécessite l’évaluation de paramètres très spécifiques grâce à l’analyse de divers types de composés, allant des métabolites aux protéines natives. Étant donné qu’aucun mélange d’une telle variété de composés ne peut être trouvé commercialement, cette méthode n’a pas été mise en œuvre dans le présent protocole.

Enfin, pour évaluer la reproductibilité de la méthode, nous avons évalué la reproductibilité entre les jours en répétant l’acquisition IMS/IMS-MS au jour 1 et au jour 95 (figure supplémentaire S2). L’expérience a montré que les données IMS/IMS-MS sont hautement reproductibles, sans qu’aucun pic IMS ne se déplace de plus de 0,2 ms au cours de cette période prolongée. Le spectre IMS/IMS généré dans ce travail a été comparé à un autre spectre de XA2XX acquis dans des conditions différentes pour des travaux antérieurs sur la mobilité ionique-mise en réseau moléculaire21. Certains paramètres instrumentaux qui peuvent avoir une incidence sur la structure ionique et le profil de mobilité ionique13 ont été délibérément modifiés – les paramètres de la source et le gradient de tension d’activation (une comparaison des différentes conditions instrumentales est donnée dans le tableau supplémentaire S2). Ensuite, les deux spectres ont été comparés en utilisant le score de similitude du cosinus – qui est populaire pour la comparaison des spectres MS / MS en métabolomique – sur la plate-forme GNPS5 (tolérance CCS pour les fragments correspondants = 0,015 nm2).

La comparaison a montré un score de similitude cosinus de 0,87 (Figure 7), ce qui peut être considéré comme élevé en ce qui concerne les variations instrumentales importantes appliquées. Cela conduit à l’idée que les bibliothèques spectrales IMS/IMS pourraient être utilisées pour dérepliquer les glycanes dans des mélanges complexes avec un niveau de confiance élevé, ce qui ne serait pas le cas avec les spectres MS/MS. Il convient de noter que, bien que l’approche actuelle n’utilise que la dimension CSC du spectre de fragmentation, les données IMS/IMS-MS contiennent également des informations sur les EM, qui ne sont pas redondantes avec le CSC. Pour optimiser le pouvoir de réplication d’IMS/IMS, un système de notation bidimensionnel doit être développé.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgments

S.O. est reconnaissant à l’Agence nationale de la recherche Français pour le financement de son doctorat (subvention ANR-18-CE29-0006).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
33-α-L- plus 23-α-L-Arabinofuranosyl-xylotetraose (XA3XX/XA2XX) mixture Megazyme Ltd., Wicklow, Ireland O-XAXXMIX XA2XX + XA3XX mixture
33-α-L-Arabinofuranosyl-xylotetraose (XA3XX) Megazyme Ltd., Wicklow, Ireland O-XA3XX Pure XA3XX standard
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, Eppendorf Quality, colorless, 1,000 tubes Eppendorf, Hamburg, Germany 0030120086 Used to prepare the carbohydrate stock solution and dilution
FALCON 50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm Corning Science México S.A. de C.V., Reynosa, Tamaulipas, Mexico 352070 Used to prepare the aqueous stock solution of 100 mM LiCl
Lithium Chloride (ACS reagent, ≥99 %) Sigma-Aldrich Inc., Saint Quentin Fallavier, France 310468 Used to dope the sample with lithium
Major Mix IMS/Tof Calibration Kit Waters Corp., Wilmslow, UK 186008113 Calibration solution for MS and IMS
MassLynx 4.2 SCN1016 Release 6 (Waters Embedded Analyser Platform for Cyclic IMS 2.9.1 Release 9) Waters Corp., Wilmslow, UK 721022377 Cyclic IMS vendor software for instrument control and data processing
Methanol for HPLC PLUS Gradient grade Carlo-Erba Reagents, Val de Reuil, France 412383 High-purity solvent
MS Leucine Enkephaline Kit Waters Corp., Wilmslow, UK 700002456 Reference compound used for tuning of the mass spectrometer
SCHOTT DURAN 100 mL borosilicate glass bottle VWR INTERNATIONAL, Radnor, Pennsylvania, US 218012458 Used to prepare the solution of 500 µM LiCl in 50:50 MeOH/Water
SELECT SERIES Cyclic IMS Waters Corp., Wilmslow, UK 186009432 Ion mobility-mass spectrometer equipped with a cylic IMS cell
Website: http://mzmine.github.io/ MZmine Development Team - Link to download the MZmine software
Website: https://github.com/siollivier/IM-MN INRAE, UR BIA, BIBS Facility, Nantes, France - Link to an in-house R script containing a CCS calibration function

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Chimie numéro 179
Utilisation d’un spectromètre de mobilité ionique cyclique pour les expériences de mobilité ionique en tandem
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Ollivier, S., Fanuel, M., Rogniaux, H., Ropartz, D. Using a Cyclic Ion Mobility Spectrometer for Tandem Ion Mobility Experiments. J. Vis. Exp. (179), e63451, doi:10.3791/63451 (2022).

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