Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Tandem İyon Hareketlilik Deneyleri için Döngüsel İyon Hareketlilik Spektrometresi Kullanma

Published: January 20, 2022 doi: 10.3791/63451
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1INRAE, UR BIA, F-44316 Nantes, France, 2INRAE, BIBS Facility, F-44316 Nantes, France

Summary

İyon hareketlilik spektrometresi (IMS), biyomoleküllerin karakterizasyonu için kütle spektrometrisinin ilginç bir tamamlayıcısıdır, özellikle izomerizme duyarlı olduğu için. Bu protokol, bir molekülün izolasyonuna ve parçalarının hareketlilik profillerinin oluşturulmasına izin veren bir tandem IMS (IMS / IMS) deneyini tanımlar.

Abstract

Kimyasal yapıların doğru karakterizasyonu, altta yatan biyolojik mekanizmaları ve fonksiyonel özelliklerini anlamak için önemlidir. Kütle spektrometresi (MS) popüler bir araçtır, ancak tüm yapısal özellikleri tamamen ortaya çıkarmak için her zaman yeterli değildir. Örneğin, karbonhidratlar biyolojik olarak alakalı olmasına rağmen, karakterizasyonları sayısız izomerizm seviyesi ile karmaşıktır. İyon hareketlilik spektrometresi (IMS) ilginç bir tamamlayıcıdır çünkü iyon konformasyonlarına ve dolayısıyla izomerizme duyarlıdır.

Ayrıca, son gelişmeler tekniği önemli ölçüde geliştirmiştir: son nesil Döngüsel IMS cihazları, doğrusal IMS cihazlarına kıyasla, artan çözme gücü veya tandem iyon hareketliliği (IMS / IMS) deneyleri gerçekleştirme olasılığı gibi ek yetenekler sunmaktadır. IMS / IMS sırasında, bir iyon iyon hareketliliğine göre seçilir, parçalanır ve parçaları hakkında iyon hareketliliği bilgisi elde etmek için yeniden analiz edilir. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, bu tür IMS / IMS verilerinde bulunan parçaların hareketlilik profillerinin, belirli bir glikanın parmak izi olarak hareket edebileceğini ve glikomik veri kümelerini yapısal olarak ilgili bir şekilde düzenlemek için moleküler bir ağ stratejisinde kullanılabileceğini göstermiştir.

Bu protokolün amacı, numune hazırlamadan, tekrarlanabilir spektrumlar veren iyon hareketlilik boyutunun son Çarpışma Kesiti (CCS) kalibrasyonuna kadar IMS / IMS verilerinin nasıl üretileceğini tanımlamaktır. Bir temsili glikan örneğini alarak, bu protokol bir Döngüsel IMS cihazı üzerinde bir IMS / IMS kontrol dizisinin nasıl oluşturulacağını, IMS varış zamanını sürüklenme zamanına (yani, iyonlara uygulanan etkili ayırma süresi) çevirmek için bu kontrol dizisinin nasıl hesaplanacağını ve ham verilerden ilgili hareketlilik bilgilerinin nasıl çıkarılacağını gösterecektir. Bu protokol, bir IMS/IMS deneyinin kritik noktalarını açıkça açıklamak ve böylece yeni Döngüsel IMS kullanıcılarının basit ve tekrarlanabilir alımlar gerçekleştirmesine yardımcı olmak için tasarlanmıştır.

Introduction

Biyomoleküllerin tam kimyasal karakterizasyonu, altta yatan biyolojik ve fonksiyonel özelliklerini anlamanın anahtarıdır. Bu amaçla, son yıllarda kimyasal yapıların biyolojik konsantrasyonlarda büyük ölçekli karakterizasyonunu amaçlayan "omik" bilimleri gelişmiştir. Proteomik ve metabolomikte MS, biyolojik ortamda bulunan yapısal heterojenliği çözmek için temel bir araç haline gelmiştir - özellikle duyarlılığı ve tandem MS (MS / MS) yoluyla yapısal bilgi sağlama yeteneği sayesinde. MS / MS stratejilerinde, bir iyon kütlesine göre seçilir, daha sonra parçalanır ve son olarak, molekülün parmak izini oluşturmak için parçalarının kütleleri elde edilir. MS/MS spektrumları, özellikle, spektral veritabanlarını1,2 eşleştirmek veya üst yapıları geçici olarak yeniden yapılandırmak için kullanılabilir3,4. Benzer spektrumların benzer bileşiklere ait olduğu varsayımı altında, MS / MS verileri, ilgili türleri benzerlik skoru ile birbirine bağlayan moleküler ağlar (MN'ler) oluşturmak için de kullanılabilir5,6.

Bununla birlikte, MS'in iyonların kütle-yük oranını (m / z) tespit etme konusundaki doğal özelliği nedeniyle, teknik (stereo) izomerizm aralığına giren bir dizi yapısal özelliğe kördür. Örneğin, karbonhidratlar, çoğu stereoizomerler veya hatta epimerler olan birkaç monosakkarit alt biriminden oluşur (örneğin, Glc vs Gal veya Glc vs Man). Bu alt birimler, bağlantının konumuna (regioizomerizm) ve anomerik karbonun sterik konfigürasyonuna (anomerizm) göre farklılık gösterebilen glikosidik bağlarla bağlanır. Bu özellikler, bağımsız MS'in karbonhidrat izomerleri arasında ayrım yapmasını zorlaştırır7 ve yüksek enerjili aktivasyon yöntemleri kullanılarak yalnızca regioizomerizm ele alınabilir8,9,10. Derevcilleştirme, stereoizomerik grupların eşdeğerliğini bozmak için bir seçenek olsa da11, kapsamlı numune hazırlama gerektirir. Bir başka, daha basit seçenek, MS'i IMS gibi izomerizme duyarlı analitik bir boyutla birleştirmektir.

Bu protokol, IMS'nin temel kavramlarına zaten aşina olan kullanıcılar için tasarlandığından ve ayrıntılı incelemeler başka bir yerde mevcut olduğundan12,13, IMS ilkelerine yalnızca kısa bir genel bakış burada verilmiştir. IMS, iyonların bir tampon gaz ve bir elektrik alanı ile etkileşimine dayanan ve sonuçta iyonları gaz fazı konformasyonlarına göre ayıran bir gaz fazı ayırma yöntemidir. Ticari aletlerde MS'e bağlı farklı IMS prensipleri bulunabilir: bazıları alternatif yüksek ve düşük elektrik alanlarında (alan asimetrik IMS, FAIMS) çalışırken, çoğu düşük alan sınırı içinde çalışır - özellikle sürüklenme tüpü IMS (DTIMS, doğrusal olarak azalan elektrik alanı), hareketli dalga IMS (TWIMS, simetrik potansiyel dalgalar) ve sıkışmış IMS (TIMS, elektrik alanlarına karşı tampon gazı yakalama iyonlarının yüksek akışı)13 . Düşük alan yöntemleri, ayırma sırasında tampon gazı ile etkileşime giren iyonun yüzeyini (Å2 veya nm2 cinsinden) temsil eden iyon-gaz çiftinin bir özelliği olan CCS'ye erişime izin verir. CCS teorik olarak cihazdan bağımsızdır ve bu nedenle farklı laboratuvarlar arasında çoğaltılabilecek veriler üretmek için yararlıdır14. İyon hareketliliği ayırmaları, çeşitli parametrelerden ve özellikle hareketlilik hücresindeki gaz basıncı ve gaz sıcaklığındaki dalgalanmalardan etkilenebilir. CCS kalibrasyonu bunu düzeltmenin bir yoludur, çünkü hem kalibrant hem de ilgili türler benzer şekilde etkilenecektir13. Bununla birlikte, cihazın sıcaklık kontrollü bir odaya monte edilmesi ve güvenilir bir gaz basıncı kontrol sistemine sahip olması zorunludur.

IMS'nin ilginç bir evrimi, ilk olarak 2006 yılında Clemmer'in grubu tarafından MS / MS15,16'nın bir analoğu olarak tanıtılan IMS / IMS'dir. IMS / IMS'de, ilgilenilen bir iyon, iyon hareketliliğine bağlı olarak seçici olarak izole edilir; daha sonra aktive edilir (olası parçalanmaya kadar) ve aktive edilen iyonun veya parçaların yeni bir IMS analizi gerçekleştirilir. İlk enstrümantal tasarımda, aktivasyonun durduğu bir iyon hunisi ile ayrılan iki IMS hücresi seri olarak yerleştirildi. O zamandan beri, bir dizi IMS / IMS kurulumu önerilmiş olsa da (bir inceleme için Eldrid ve Thalassinos17'ye bakınız), IMS / IMS özelliğine sahip ilk ticari kütle spektrometresi yalnızca 201918'de kullanıma sunuldu. Bu cihaz, ilk konsepti başka bir teknolojik atılımla birleştirerek önemli ölçüde geliştirdi: IMS hücresinin döngüsel tasarımı.

Döngüsel IMS hücresi teorik olarak sürüklenme yolu uzunluğunun ve dolayısıyla cihazın çözme gücünün neredeyse sonsuz olarak artmasına izin verir19. Bu, döngüsel TWIMS hücresinin ana iyon optik eksenine ortogonal olarak yerleştirildiği belirli bir alet geometrisi ile elde edildi. IMS hücresinin girişindeki çok işlevli bir dizi bölgesi, iyon yolunun yönünü kontrol etmeyi sağlar: (i) iyonları IMS ayrımı için yana doğru göndermek, (ii) MS algılaması için ileri veya (iii) IMS hücresinden geriye doğru bir dizi öncesi hücrede saklanmak. Bu ön dizi depo hücresinden, iyonlar aktive edilebilir ve fragmanlar, stereoizomerleri20 karakterize etmek için başarıyla kullanılan bir yaklaşım olan iyon hareketliliği ölçümü için IMS hücresine yeniden enjekte edilebilir. Nihayetinde, toplanan veriler öncü ve parçaları için iyon hareketliliği ve m / z bilgilerini içerir.

Bu döngüsel tasarımı glikan analizleri için kullanan yakın tarihli bir yayında (Ollivier ve ark.21), bu tür IMS / IMS verilerinde bulunan parçaların hareketlilik profilinin, moleküler bir ağ stratejisinde kullanılabilecek bir biyomolekülün parmak izi gibi davrandığını gösterdik. IM-MN adı verilen ortaya çıkan ağ, glikomik veri kümelerinin yapısal olarak ilgili bir şekilde düzenlenmesine yol açarken, yalnızca MS / MS verilerinden (MS-MN) oluşturulan ağ çok az bilgi ortaya çıkardı. Bu yayını tamamlamak ve Döngüsel IMS kullanıcılarının bu iş akışını uygulamasına yardımcı olmak için bu protokol, verileri toplamak için kullanılan protokolün tam bir açıklamasını sağlar. Bu protokol yalnızca kullanıcıların IM-MN ağları oluşturmak için kullanabilecekleri IMS/IMS verilerinin oluşturulmasına odaklanır (bkz. 21) veya seçtikleri başka bir uygulama için. IM-MN'nin oluşturulması burada dikkate alınmayacaktır, çünkü moleküler ağ protokolleri zaten mevcuttur22. Değerli ve tekrarlanabilir IMS/IMS satın alımları oluşturmak için uyulması gereken önemli noktalar vurgulanmaktadır. Ollivier ve ark. tarafından incelenen oligosakkaritlerden birinin örneğini ele alalım. 21, aşağıdaki adımlar detaylandırılmıştır: (i) numune hazırlama, (ii) Döngüsel IMS cihazının ayarı, (iii) verilerin otomatik pik toplama ve (iv) CCS kalibrasyonu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOT: Protokole genel bir bakış Şekil 1'de verilmiştir. Bu protokolde açıklanan deneyler için kullanılan parametreler Ek Tablo S1 ve Ek Tablo S2'de bulunabilir.

1. Numune çözeltisinin hazırlanması

NOT: Protokol, örnek olarak bir arabinoksilan pentasakkarit (23-α-L-arabinofuranosil-ksilotetraoz veya XA2XX; Malzeme Tablosuna bakınız) kullanılarak tanımlanmıştır.

  1. Çözücünün hazırlanması: 50:50 H2O:MeOH'da 500 μM LiCl (cilt/hacim.).
    1. 212 mg LiCl ağırlığında H2O'da 100 mM'lik bir lityum klorür (LiCl) stok çözeltisi hazırlayın ve 50 mL'lik bir polipropilen konik tüpe 50 mL yüksek saflıkta deiyonize su (H2O) ekleyin. Tamamen eriyene kadar çalkalayın.
      NOT: Çözücü, spektrometrenin iyon kaynağında [M + Li] + addüktörlerinin oluşumunu teşvik etmek için bir lityum tuzu ile katkılıdır, çünkü genellikle diğer alkali addüktörlere kıyasla daha kaliteli parçalanma spektrumları verir. LiCl kullanımı tavsiye edilir, çünkü organik asitlerin (ve dolayısıyla tuzlarının) daha önce IMS profillerini etkilediği bulunmuştur23.
    2. Bir cam şişede, LiCl stok çözeltisini 200x seyreltin: stok çözeltisinin 250 μL'sine kadar, 24.75 mL H2O ekleyin. 50:50 H2O: MeOH (v / v) içinde 500 μM'lik son LiCl konsantrasyonuna ulaşmak için 25 mL metanol (MeOH) ekleyin. Çözücüyü gazdan arındırmak için 2 dakika boyunca sonikat.
      NOT: MeOH sağlık açısından tehlike arz eder (H225, H301, H311, H331, H370); laboratuvar önlüğü, eldiven ve göz koruması giyen bir çıkarıcı başlığın altında manipüle edin. 50:50 MeOH / H2O (v / v) oranı, oligosakaritlerin iyonlaşması için en iyi çözücü gibi görünmektedir; Bununla birlikte, MeOH gerekirse asetonitril (ACN) ile değiştirilebilir.
  2. 1.5 mL'lik bir polipropilen tüpte, 1 mg karbonhidrat ağırlığındadır. 1 mg / mL'lik bir konsantrasyona ulaşmak için uygun bir hacim olan 500 μM LiCl ile çözün. 50:50 MeOH/H2O + 500 μM LiCl'de 10 μg/mL'lik son konsantrasyona kadar seyreltin. 4 °C'de saklayın.
    NOT: 10 μg/mL konsantrasyonu, IMS/IMS-MS sırasında tüm fragman iyonları üzerindeki sinyali optimize etmek için seçilmiştir (bu saf bir bileşik içindir; karışımlar üzerinde çalışırken konsantrasyonu arttırın). Referans IMS/IMS spektrumlarının elde edilmesi için numuneyi daha fazla seyreltmeyin: Cihaz düzeltmek için seçenekler sunsa da, parçalanmadan önce MS dedektörünün doygunluğu beklenmektedir (bkz. adım 3.2.).

2. Döngüsel IMS kütle spektrometresinin ayarlanması

NOT: Yazılımla ilgili talimatlar (pencereler, menüler ve komutlar) kalın harflerle vurgulanır.

  1. Cihaz kontrol yazılımından enstrüman konsolunu açın (MS tune sayfası, Malzeme Tablosundaki yazılım ayrıntılarına bakın) ve cihazı Çalıştırma moduna getirin. IMS hücresinde yüksek voltajların dengelenmesi için en az 3 saat bekleyin.
    NOT: En iyi tekrarlanabilirlik için, IMS hücresindeki voltajların tamamen stabilize edilmesi gerekir. Yüksek voltajları açın ve herhangi bir döngüsel IMS analizinden önce cihazın gece boyunca dengelenmesine izin verin. Ayrıca, iyon hareketlilik hücresindeki basınç ve sıcaklık mümkün olduğunca sabit tutulmalıdır. Vakum sekmesinde basınç için bir geri okuma bulunsa da, sıcaklık için geri okuma yoktur. Cihazı termostatif bir laboratuvarda saklayın. Bu çalışmada kullanılan cihaz, 20 ° C'de termostatize edilmiş bir laboratuvarda 1.75 mbar'da çalışır.
  2. Döngüsel IMS cihazı kurulumu
    NOT: Standart çözümler, cihaz kurulumu için dahili akışkan sistemi kullanılarak aşılanmalıdır.
    1. Üretici tarafından sağlanan uygun standartlarla doldurulmuş akışkan kapları akışkan sistemine yerleştirin: Rezervuar B ('Kilit kütlesi'): 10 pg/μL lösin enkephaline (LEU ENK) 50:50 ACN/H2O + %0,1 formik asit içinde; C Rezervuarı ('Calibrant'): MajorMix.
      NOT: Bu protokolde, hem m/z hem de CCS boyutlarını kalibre etmek için MajorMix kalibrasyon çözeltisi kullanılacaktır. Pratik nedenlerden dolayı, harici bir CCS kalibrasyonu gerçekleştirilecektir (protokolün 5. adımına bakınız); Bu nedenle, CCS için şirket içi bir kalibrant karışımı ve m / z için başka bir kalibrant (örneğin, sodyum format veya sodyum iyodür) kullanmak da mümkündür.
    2. Kuvars konsolunun Ayar sayfasında, Fluidics sekmesine gidin. Numune akışkanlarını C rezervuarına ve referans akışkanlarını B rezervuarına ayarlayın. MS sinyalini kontrol etmek için her iki çözeltiyi de iyon kaynağında art arda infüze edin.
    3. ADC kurulumunu, dedektör kurulumunu (LEU ENK kullanarak) ve kütle kalibrasyonunu (kalibrasyon çözeltisi için Malzeme Tablosuna bakın) üreticinin talimatlarına göre Cihaz Kurulumu sayfasından gerçekleştirin.
  3. Tek geçişli ayırma ile kalibrasyon çözeltisinin IMS alımını kaydedin (harici IMS kalibrasyonu için bunu kullanın).
    NOT: İyon kaynağı ve hareketli dalga (TW) parametreleri (statik dalga yüksekliği ve dalga hızı) tüm kazanımlar (kalibrasyon ve edinimler) sırasında sabit tutulmalıdır. Kullanıcının numunesi için en uygun parametreler hakkında önceden bilgisi yoksa, bu adım protokolün 3. adımından sonra gerçekleştirilebilir ([M + Li] + nötr oligosakkaritlerin katkıları için, temsili sonuçlar 16 V'luk bir TW yüksekliği ve en iyi sonuçları veren 350 m / s'lik bir TW hızı kullanır).
    1. Akışkanlar sekmesinden, saptırma konumu Numune'yi seçin ve kalibrantı (dahili akışkanlar sistemini kullanarak) iyon kaynağında (dahili akışkanlar sistemini kullanarak) 10 μL/dak akış hızında 'Numune' probu aracılığıyla infüze edin.
    2. Tek geçişli bir IMS dizisi ayarlayın. Ayar sayfasından, aleti Mobilite moduna getirin ve Döngüsel Sıra Denetimi penceresini açın. Gelişmiş mod'u seçin. Bu yeni pencerenin Döngüsel İşlevler sekmesinden Paket Ekle'yi ve ardından Tekli/Çok Geçişli'yi seçin. Aynı pencerenin Sıra sekmesinde bir dizi mobilite olayının görünmesini bekleyin.
      NOT: Gerçek zamanlı ekranı etkinleştirmek için kullanıcının cihaz parametrelerini uygulaması gerekir: TOF modunda ayarla veya Mobilite modunda çalıştır'a tıklayın. Cihazı TOF ve Mobilite modları arasında değiştirmeden önce, çalışan herhangi bir alımı (Ayar sayfası ekranı dahil) iptal etmek gerekir. İyonların göreceli bolluğu, iyon iletim parametrelerindeki değişiklikler nedeniyle TOF modu ve Mobilite modu arasında değişebilir.
    3. Sekansı, tüm kalibrant iyonlarının döngüsel IMS yarış pistinin etrafında tek bir geçiş yapması için uyarlayın. Enjekte etme süresini veya Çıkarma ve zaman kazanma süresini değiştirmeyin; ancak, Ayrı süreyi 1 ms'ye düşürün (Sıra sekmesinde). Kalibrasyon karışımının bazı iyonları görüntülenen varış zamanı penceresine sığmazsa, ADC Ayarları sekmesindeki Kutu Başına İtme sayısını artırarak IMS'nin ortogonal ivmeli TOF analizörünün iticisiyle senkronizasyonunu değiştirin.
      NOT: Kontrol dizisindeki süreler yalnızca iyon geçidi için çok işlevli diziyi kontrol eder. İyonlar, yarış pistinin etrafındaki ilk (veya n'inci) geçişlerine girdikleri sürece, bu arada dizide TW'nin yönü değişmiş olsa bile, söz konusu geçişi bitireceklerdir. Ayırma süresini 1 ms'ye düşürmek, dizinin 1 ms sonra ejeksiyon moduna geçeceği anlamına gelir. Bu, daha hızlı iyonların diziden geçmek için yeterli zamana sahip olmamasını ve daha yavaş iyonlar ilk geçişlerini bitirmeden önce ikinci bir geçişe girmesini sağlar. Bu nedenle, tüm iyonlar, IMS kalibrasyonunu gerçekleştirmek için gerekli olan aynı sayıda geçişe (yani bir geçiş) tabi tutulacaktır.
    4. 2 dakikalık bir satın alma kaydedin. Döngüsel Sıra Kontrolü penceresinde, Edinme Ayarları açılır penceresini açmak için Al'a tıklayın. Dosya Adı, Açıklama ve Edinme Uzunluğu'nu (dakika) girin ve Kaydet'i tıklatın.
  4. Adım 2.3 ile aynı koşullar altında kalibrasyon çözeltisinin 2 dakikalık bir alımını daha kaydedin (CCS kalibrasyonunun kalitesini kontrol etmek için bunu kullanın). Döngüsel Sıra Kontrolü penceresinde, Edinme Ayarları açılır penceresini açmak için Al'a tıklayın. Dosya Adı, Açıklama ve Edinme Uzunluğu'nu (dakika) girin ve Kaydet'i tıklatın.
  5. Göz atma borusundaki kalibrantın kristalleşmesini önlemek için akışkan sistemini 50:50 H2O/ACN ile iyice yıkayın.

3. IMS/IMS-MS satın alınması

  1. Bir şırınga pompası kullanarak, (lityum katkılı) numuneyi 10 μg / mL'de numune probundan 10 μL / dak akış hızında infüze edin.
  2. Sinyalin kararlılığını kontrol etmek için cihazı TOF moduna ( MS ayar sayfasından) geçirin. İzotopik paterni ve potansiyel kirleticilerin varlığını kontrol etmek için yararlı olacak numunenin tam bir MS alımını (1 dakika) kaydedin.
    NOT: Numune konsantrasyonu, parçalar için iyi bir iyon sinyali elde etmek üzere seçildiğinden, bu adımda bir TOF doygunluğu gözlemlenebilir. TOF doygunluğu, aşağıdaki eserler kullanılarak tanımlanabilir: (i) yapay olarak artmış bir MS çözünürlüğü, (ii) izotopik oranlarda bir değişiklik ve (iii) izotoplar arasında çok sayıda düşük bolluk zirvesi. İyonların iletimini azaltmak ve TOF modunda doygunluğu atmak için DRE Lensini (Dinamik Aralık geliştirmesi, ana Ayar sayfasının Dörtlü/MS Profili/DRE sekmesi) kullanın (Şekil 2A,B).
  3. Cihazı MSMS moduna geçirin (ana Ayar sayfasının Quad/MS Profile sekmesi) ve quadrupole izolasyon için MSMS Mass alanında hedeflenen iyonun kütlesini seçin (örnekte: arabinoksilan pentasakkaritin [M+Li]+ iyonik türlerine karşılık gelen 685.2'nin m/z'si). Verileri işlerken öncü yalıtımı kontrol etmek için 1 dakikalık bir alım kaydedin.
    NOT: Lityum katkıları, monoizotopik tepenin -1 Da'sında bir izotopa sahiptir, bu da işleme adımlarına müdahale etmemesi için MS / MS seçim penceresinden çıkarılması gerekir. Quad/MS Profile sekmesindeki LM Resolution ve HM Resolution parametreleri kullanılarak seçim aralığı daraltılarak kaldırılabilir (Şekil 2C).
  4. İlgilenilen izomerin mobilite tabanlı seçimini gerçekleştirmek için bir "dilimleme" IMS dizisi ayarlayın.
    1. Cihazı Mobilite moduna geçirin (bkz. adım 2.3.2). Döngüsel Sıra Denetimi penceresinde, Döngüsel İşlevler sekmesinden Paket ekle'yi ve ardından Dilimleme'yi seçin. Dizi sekmesinde karmaşık bir mobilite olayları dizisinin görünmesini bekleyin (Şekil 3).
      NOT: IMS/IMS işleminin her adımını görselleştirmek mümkündür: Sıra sekmesindeki Çıkar ve Al olayına tıklayın. Kırmızı renkle vurgulandıktan sonra, Yukarı ve Aşağı düğmelerini kullanarak dizi içinde uygun konuma getirin.
    2. Eject and Acquire olayını ilk Ayrı olaydan hemen sonra konumlandırın (yani, Şekil 3'te gösterildiği gibi sıradaki satır 8 yerine 3. satırda taşıyın) ve ardından Çalıştır'ı tıklatın. Gerçek zamanlı olarak görüntülenecek ilk ayrımın sonuçlarını arayın. IMS tepe noktalarının çözünürlüğü tatmin edici olana kadar dizideki bu olayın zaman değerini değiştirerek çok geçişli bir ayırma için ilk Ayrı olayın süresini artırın. Referans için 1 dakikalık bir alım kaydedin.
      NOT: ADC Kurulumu sekmesindeki ADC Başlangıç Gecikmesi değerini not alın: yalıtımın kalitesini denetlemek yararlı olacaktır.
    3. Duraklat'ı tıklayın. İlk ayırmanın sonuçlarının görüntülendiğini, ancak kullanıcı Çalıştır'ı yeniden tıklatana kadar denetim sırasındaki değişikliklerin uygulanmayacağını unutmayın. Eject and Acquire olayını Eject, Eject to Pre-Store ve Hold and Eject olaylarının altına yerleştirin. Olayların süresini, hedeflenen tepe noktası Ön Depoya Çıkar bölgesinde ve diğer iyonlar Çıkar veya Beklet ve Çıkar bölgesinde olacak şekilde ayarlayın.
      NOT: Bu üç olayın varış zamanı dağılımlarına (ATD'ler) kıyasla süresi, Mobilogram sekmesindeki hareketlilik spektrumunun altındaki renk kodlu çubuk kullanılarak görselleştirilebilir (Şekil 3).
    4. Eject and Acquire olayını dizinin sonunda, Ön Mağazadan Yeniden Enjekte Et ve ikinci Ayrı olaylarının altına yerleştirin. Seçili popülasyonu görüntülemek için Çalıştır'ı tıklatın.
      NOT: Seçilen popülasyon IMS hücresinden ayrıldığından, önceki tüm ayrımlar kaybolmuştur ve tek geçişli bir ayrıma (istenen şekilde) geri dönmüştür.
    5. İzolasyonun kalitesini kontrol edin. Yalnızca ilgilenilen zirvenin seçildiğini doğrulamak için, Şekil 4'te gösterildiği gibi reenjeksiyondan önce olduğu gibi reenjeksiyondan sonra aynı ayrımı (yani, aynı Ayrı zaman) gerçekleştirin. Referans için 1 dakikalık bir alım kaydedin.
      NOT: Kullanıcıların atılan popülasyonu kontrol etmeleri önerilir; Depo Öncesi Çıkarma zaman penceresi taban çizgisi düzeyinde olmalıdır (Şekil 4B). Bunu denetlemek için, ADC Ayarları sekmesine ADC Başlat Gecikmesi'ni El ile moduna getirin ve adım 3.4.2'de belirtilen gecikme süresini girin. Referans için 1 dakikalık bir alım kaydedin.
    6. Sıra sekmesinde, kullanıcı tanımlı olay zamanlarının yanındaki sütunda (kırmızıyla vurgulanmış Time Abs sütunu), tüm olayların toplam zamanlarını arayın. CCS kalibrasyonunu gerçekleştirmek için Pre-Store'dan Reinject etkinliğinin hattında bulunan Time Abs'yi not alın.
  5. Hedeflenen zirveyi iki IMS turu arasında parçalayın. İyonların kinetik enerjisini arttırmak için reenjeksiyon adımının voltajlarını değiştirin ve iyon hareketlilik gazı ile çarpıştığında bunları parçalayın.
    1. Eject and Acquire olayından hemen önceki Ayrı olayının süresini 1 ms'ye ayarlayın (bkz. adım 2.3.3'teki açıklama).
    2. Mağaza Öncesinden Yeniden Enjekte Et satırında, Etkinleştirmeyi Etkinleştir kutusunu işaretleyin ve yerleşik denetimle parçalanmayı en iyi duruma getirin. Spektrum tatmin ediciyse (örneğin, taban tepe noktası bir parçadır), doğrudan adım 3.5.4'e geçin.
      NOT: Etkinleştirmeyi etkinleştirirken, hat üzerindeki üç voltaj griye döner: voltajların manuel olarak optimize edilmesi gerekiyorsa kullanıcının değiştirmesi gereken voltajlar bunlardır (bir sonraki adıma bakın). Bu üç voltaj (Pre-Array Degrade, Pre-Array Bias, ve Array Ofset), iyonları aktive etmek için kullanılan gradyanı oluşturur. İyonların kinetik enerjisi, Dizi Öncesi Önyargı ve Dizi Ofseti arasındaki eğimle artacaktır (bkz. Şekil 5). Degrade → Önyargı → Ofset değerlerinin varsayılan değerleri şunlardır: etkinleştirme olmadan 85 → 70 → 45 V; dahili fonksiyonun maksimum aktivasyonu 185 → 170 → -5 V (+150 V). Parçalanmadan sonra, DRE lensini kullanarak iyon iletimini yeniden ayarlamayı unutmayın (sinyalin zayıflamasını azaltın) (bkz. adım 3.2.).
    3. Parçalanma yerleşik kontrol ile tatmin edici değilse, Etkinleştirmeyi Etkinleştir kutusunun işaretini kaldırın ve reenjeksiyon voltajlarını manuel olarak optimize etmeye devam edin. Pre-Array Degrade voltajını artırın (Pre-Array Bias voltajı her zaman Pre-Array Degradesinin 15 V altında tutulmalıdır) ve sonuçlar tatmin edici olana kadar Array Offset voltajını (negatif olarak ayarlanabilir) düşürün.
      NOT: Çok fonksiyonlu dizinin voltajlarını manuel olarak ayarlarken, kullanıcı voltaj ayarlarını daha iyi görselleştirmek için 'Mobilogram' görünümünden çok fonksiyonlu dizide (PE diyagramı) uygulanan voltajların etkileşimli şemalarına geçebilir (Şekil 5A).
    4. 2 dakikalık bir satın alma kaydedin. Edinme açılır penceresinde, yalnızca varış zamanlarını ve m/z'yi (kromatografik analizler için kullanılan edinme süresi (saklama süresi) içeren bir dosya oluşturmak için Sapma Süresini Koru seçeneğini işaretleyin. Bu dosyanın *_dt etiketli olduğunu unutmayın. RAW.
      NOT: Kullanıcı Sapma Süresini Koru seçeneğini işaretlemeyi unutursa, Driftscope 2.9 yazılımını kullanarak IMS boyutunu ayıklamak hala mümkündür (Dosya | MassLynx |'e dışa aktarma Sürüklenme Süresini Koru).
  6. Cihazı ana Ayar sayfasında TOF moduna geri döndürün ve bir sonraki numuneye geçmeden önce sistemi 50:50 MeOH/H2O ile iyice durulayın.

4. MZmine 224 ile IMS/IMS-MS işleme

NOT: MZmine 2, Malzeme Tablosunda verilen URL'den edinilebilir. MZmine 2.51 kullanımı önerilir. Bu makalenin hazırlanması sırasında, sonraki sürümler içe aktarma işlevindeki bir değişiklik nedeniyle Döngüsel IMS araçlarından RAW dosyalarını açamaz.

  1. Yalnızca IMS ve m/z boyutlarını (*_dt içeren ham dosyaları içe aktarın. RAW) Raw veri yöntemlerini kullanarak | Ham veri içe aktarma.
    NOT: Ham dosyalar ana MZmine penceresinin sol tarafında görünecektir. Orijinal * dosyasını içe aktarmayın. Hala bekletme süresi boyutunu içeren RAW dosyaları. MZmine, bekletme süresini IMS varış zamanından ayırmaz ve her iki boyutun veri noktaları çakışacaktır.
  2. Temsili bir dosyadaki iş akışı parametrelerini, Ham veri dosyaları liste.
    1. Verilerdeki gürültü düzeyini değerlendirin. Ham veri dosyaları listesinde dosyaya sağ tıklayın, TIC'yi Göster'i seçin ve temel tepe noktası "kromatogram" (BPC) 'yi görüntüleyin. Kütle spektrumunu görüntülemek için gözle gözlemlenebilen en küçük zirveye çift tıklayın. Verilerdeki gürültü seviyesinin, bu spektrumdaki taban zirvesinin ikinci izotopunun etrafında olduğunu düşünün ve aşağıdaki işleme adımlarında tüm yoğunluk eşikleri için aynı değeri kullanın.
      NOT: Veriler quadrupole izolasyonu kullanılarak elde edilmiştir ve bu nedenle MZmine tarafından MS / MS olarak kabul edilir.
    2. Ham veri yöntemlerini kullanarak toplu algılamayı gerçekleştirin | Özellik algılama | Kütle algılama. Profil modunda alınan veriler için Wavelet dönüştürme algoritmasını kullanın. MZmine'daki algoritmaların parametrelerini ayarlamak için, algoritmanın yanındaki [...] düğmesine tıklayın ve parametreleri optimize ederken verileri görselleştirmek için Önizlemeyi göster seçeneğini kullanın.
      NOT: Bu aşamada, algoritma tarafından seçilen tepe noktaları önizleme penceresinde kırmızı renkte görünecektir. Özel RAW dosyalarında dalgacık dönüştürme algoritmasını kullanırken, MZmine bazen profil veri noktalarını merkezlenmiş zirvelerle karıştırır. Yazılım, kullanıcının merkezlenmiş spektrumlarda bir profil algoritması çalıştırdığını belirten bir mesaj görüntüler: bu mesajı görmezden gelin ve Tamam'a tıklayın.
    3. Ham veri yöntemlerini kullanarak her parça kütlesi için çıkarılan iyon hareketlilik spektrumlarını (EIM) yeniden yapılandırın | Özellik algılama | ADAP Kromatogram oluşturucu önceki adımda oluşturulan 'kütleler' kütle listesinde. Bu aşamadaki m/z tolerans girişi taramadan taramaya tolerans olduğundan, beklenen genel doğruluktan en az 3-4 kat daha yüksek bıraktığınızdan emin olun.
    4. Önceki adımda önizleme seçeneği olmadığından, ana MZmine penceresinin sağ panelinde görünen Özellik listesini kullanarak tepe noktası çekme işleminin kalitesini doğrudan kontrol edin. Özellik listesini açın, tüm satırları seçin, sağ tıklayın ve Göster/XIC (iletişim kutusu) seçeneğini belirleyin. Mobilite spektrumundaki tüm iyonları görüntülemek için Tümü'nü tıklatın. Belirgin bir şekilde kaçırılmış tepe noktası olmadığından emin olmak için renkli görünen seçilmiş tepe noktalarını inceleyin.
    5. Birden fazla özellikte farklı pikler içeren m/z'yi bölmek için EIM'leri deconvolve edin. Özellik listesi yöntemlerini | kullanma Özellik algılama | Chromatogram deconvolution, ve Wavelets (ADAP) algoritmasını seçin. Önizlemeyi göster seçeneğini ve aşağıdaki anahtar parametreleri kullanarak veriler için algoritmayı optimize edin: S/N eşiği , katsayı/alan eşiği ve RT dalgacık aralığı.
      NOT: Çözülmüş spektrumun yönünün kontrol edilmesi önerilir. Adım 4.2.4'te açıklandığı gibi kromatogram görselleştirme aracını kullanın. Ayrışmış tepe noktaları renkli olarak görünecek ve Şekil 6A'da gösterildiği gibi aynı kütlenin zirveleri bölünmelidir.
    6. Özellik listesi yöntemlerini kullanarak dekonvolved EIM'leri deizotop | İzotoplar | İzotopik zirveler orfoz. IMS ayrımı sırasında izotoplar çözümlenmediğinden, m/z tolerans değeri için cihazın beklenen doğruluğunu kullanın ve varış zamanı toleransını 0,1 ms'ye (MZmine'da Tutma süresi toleransı 0,1 dakika olarak görüntülenir) ayarlayın. Özellik listesini kontrol edin: herhangi bir izotop kalırsa, tolerans değerlerini artırın.
      NOT: İzotopu kaldırma teorik olarak özellik listesi işlemenin herhangi bir anında gerçekleştirilebilse de, şarj değerlerinin dışa aktarılabilmesi için bunu en son yapmak önemlidir (diğer adımlar için kullanılan algoritmalar bazen şarj durumu bilgilerini kaldırır).
  3. Birden fazla IMS/IMS-MS spektrumu işliyorsanız, işlemeyi bu optimize edilmiş parametrelerle tekrarlayın. Tüm spektrumlar için aynı parametreleri saklayın.
  4. Birden çok spektrum söz konusu olduğunda, bunları dışa aktarmak için tek bir tabloda gruplandırın; değilse, doğrudan adım 4.5'e atlayın. Spektrumları gruplandırmak için, Özellik listesi yöntemlerini | Hizalama | Hizalayıcıya katılın. Amaç aslında pikleri hizalamak olmadığından, hem m / z hem de varış zamanı için kısıtlayıcı tolerans değerleri kullanın. Her iki boyuta da aynı ağırlığı verin.
  5. Son özellik listesini *.csv dosyasına dışa aktarın. Özellik listesi yöntemlerini | kullanma İhracat/İthalat | CSV dosyasına dışa aktarma ve şu değerleri dışa aktarma: Satır m/ z'yi dışa aktarma, Satır saklama süresini dışa aktarma (gerçek IMS varış süresi), En yüksek m/z ve Tepe yüksekliği. Alan ayırıcı olarak virgül kullanın.

5. Merkezlenmiş IMS/IMS spektrumlarının TWCCSN2'si

NOT: Bu protokolde, doğrusal kalibrasyondan daha iyi sonuçlar verme eğiliminde olan ve bir elektronik tabloda veya şirket içi bir işleme komut dosyasında uygulanması kolay olan logaritmik bir uyum kalibrasyonu25,26 kullanılacaktır. Şirket içi bir senaryo (R ile yazılmış), Malzeme Tablosunda verilen URL'de mevcuttur.

  1. Kalibrant alımından referans varış zamanı değerlerini seçin (bkz. adım 2.3). Tüm IMS kalibrant piklerinin yönünü kontrol etmek için oluşturucu yazılımını kullanarak bunu manuel olarak yapın ( Malzeme Tablosuna bakın).
    1. Chromatogram penceresinde *_dt açın. Kalibrana karşılık gelen RAW dosyası.
    2. Her kalibrasyon noktası için, Display | kullanarak EIM'yi oluşturun Kütle seçeneği.
    3. EIM'lerin profilini kontrol edin. Bazıları kötü tanımlanmışsa, İşlem | kullanarak bunları düzeltin Pürüzsüz seçenek (en iyi sonuçlar tipik olarak Savitzky-Golay algoritması ile elde edildiğinden, 3 kutu üzerinde 2 kez pürüzsüz). Bir e-tablodaki tepe değerlerini bildirin.
      NOT: Referans noktaları genellikle düşük çözünürlüklü DTIMS cihazları kullanılarak elde edildiğinden, kalibrantlara bağlı olarak Döngüsel IMS'de bazı multimodal dağılımlar görünebilir. Böyle bir dağılımı gösteren tepe noktalarını kalibrasyon listesinden kaldırın.
  2. Kalibrantlardan logaritmik uyum parametrelerini hesaplayın.
    1. Tüm kalibrasyon noktaları için aşağıdakileri hesaplayın.
      1. Eq (1) kullanarak sürüklenme süresini hesaplayın:
        Equation 1 (1)
        td ile sürüklenme süresi, tA ölçülen varış zamanı ve IMS hücresindeki enjeksiyon zamanını tinj (hepsi ms cinsinden).
        NOT: Oligosakkarit parçaları gibi küçük moleküller için, farklı kütleler arasındaki ölü zaman (IMS hücresinden çıkış ile dedektör arasındaki uçuş süresi) varyasyonu, CCS kalibrasyonunun hata aralığındadır ve göz ardı edilebilir.
      2. Eq (2) kullanarak iyonların nötr kütlesini hesaplayın:
        Equation 2 (2)
        z ile iyonun yük durumu ve karşı iyonun kütlesi (Da'da) mion. Belirsizlik yaratmamak için tam kütleler kullanın. Karşı iyon yerine atom kaybı varsa, negatif miyon değerleri kullanın (örneğin, [M-H]-mnötr = (m/z) * |z| - (- 1.007276) = (m/z) * |z| + 1.007276 için). 
      3. Eq (3) kullanarak CCS parametresini hesaplayın:
        Equation 3 (3)
        CCS ile referans sürüklenme tüpü DTCCSN2 değeri (nm2 cinsinden) ve sürüklenme gazının kütlesi mgas (Da'da; örneğin azot için: mgas = 28.01 Da).
      4. Eq (4) kullanarak td' parametresini hesaplayın:
        Equation 4 (4)
        d ile dedektör başlangıç gecikmesi, ölü zamanı düzeltmek için deneysel olarak kullanılır (tipik olarak ~ 1,5 ms).
      5. Yukarıdaki parametrelerin logaritmasını hesaplayın:
        ln (CCS') ve ln (t'd)
    2. Eq (5) kullanarak R2 katsayısını ve logaritmik uyumun x ve y parametrelerini (x eğim ve ln (y) kesişme ile) belirlemek için doğrusal bir regresyon gerçekleştirin:
      Equation 5 (5)
      NOT: Kullanıcı, kalibrasyon sonuçlarını görsel olarak kontrol etmek için ln(CCS') ve ln(td') değerlerini grafiklendirebilir, ancak bu isteğe bağlıdır.
  3. *.csv dosyasına dışa aktarılan her IMS/IMS spektrumu için MZmine tarafından seçilen tepe noktalarını kalibre etmek üzere kalibrasyonu deneysel verilere uygulayın. Her nokta için aşağıdakileri hesaplayın.
    1. Eq (6) kullanarak sürüklenme süresini hesaplayın:
      Equation 6 (6)
      tseq ile son IMS ayrımından önceki zaman (adım 3.4.6'da belirtilen 'Time Abs' değeri).
      NOT: Farklı dizilerle elde edilen birden fazla IMS/IMS spektrumunu kalibre ediyorsanız, tseq değerlerini dikkatlice kontrol edin.
    2. Eq (7) kullanarak iyonların nötr kütlesini hesaplayın:
      Equation 7 (7)
    3. Eq (8) ve Eq (9) kullanarak td' ve td'' parametrelerini hesaplayın:
      Equation 8 (8)
      Equation 9 (9)
    4. Eq (10) kullanarak son kalibre edilmiş CCS değerlerini (nm2'de TWCCSN2) hesaplayın:
      Equation 10 (10)
      NOT: Adım 5.2.2 olmasına rağmen. kesişme olarak ln(y) verir, son CCS değerini elde etmek için y kullanılmalıdır. Üstel bir fonksiyon uygulamayı unutmayın.
  4. Kalibrasyonu, adım 2.4'te elde edilen kalibrasyon çözeltisinin ikinci edinimine uygulayarak kalibrasyonun doğruluğunu kontrol edin.
    NOT: Kalibrasyon ~%1-2 hata ile sonuç vermelidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu protokolü göstermek için örnek olarak bir arabinoksilan pentasakkarit, XA2XX seçildi. Bu bileşik ticari olarak temin edilebilir, ancak yalnızca başka bir arabinoksilan pentasakkarit, XA3XX (saf XA3XX de ticari olarak temin edilebilir) ile bir karışım olarak temin edilebilir. XA2XX ve XA3XX'in yapıları Ek Şekil S1'de verilmiştir. Ticari karışımdaki XA2XX ve XA3XX oranı ~ 50:50 olduğundan, karışımın 20 μg / mL'sinde bir çözelti, 50:50 MeOH / H2O + 500 μM LiCl'de ~10 μg / mL'lik bir XA2XX konsantrasyonuna ulaşmak için hazırlandı.

İlk olarak, XA2XX + XA3XX karışımının MS analizi, yüksek çözünürlüklü MS kullanılarak gerçekleştirildi. İki bileşik izomer olduğundan, [M + Li] + m / z 685.24'te tek bir tepe noktası gözlendi. Bu MS zirvesi, kuadrupol ve seçim penceresi, algoritmaları işleyerek monoizotopik tepe noktası olarak karıştırılabilecek -1 Da lityum izotopunu çıkarmak için ayarlanarak seçildi (Şekil 2).

Pentasakkaritlerin [M + Li] + addüktörleri daha sonra IMS ayrımının ilk aşamasına sunuldu: döngüsel IMS hücresinin etrafında 3 geçişten sonra, 3 tepe noktası 83, 90 ve 94 ms'lik varış zamanlarıyla ayrıldı. Bu profil, saf XA3XX'inkiyle karşılaştırıldı (10 μg / mL'de aşılanmış), 83 ve 90 ms'deki zirvelerin XA3XX'e karşılık geldiğini, 94 ms'deki zirvenin XA2XX'e karşılık geldiğini gösterdi (Şekil 4A). IMS / IMS analizi için 94 ms'deki tepe noktası seçildi: XA3XX'e ait iyonlar dışarı atıldı (Şekil 4B) ve ilgilenilen zirve prearray depo hücresine gönderildi. Seçimden sonra sadece XA2XX zirvesinin kalmasını sağlamak için iyonun aktivasyon olmadan yeniden enjekte edilmesinden sonra 3 geçişli bir ayırma gerçekleştirildi (Şekil 4C'de 199 ms'ye ulaştı).

Daha sonra, prestore alanından reenjeksiyon üzerine iyon parçalandı ve tüm parçalar üzerinde tek geçişli bir IMS ayrımı yapıldı. İki farklı aktivasyon denendi: yerleşik prestore aktivasyon fonksiyonunun maksimum ayarı ilk kez denendi (Şekil 5B, C); ancak, öncül spektrumun temel zirvesi olarak kaldı. Bu istenmez, çünkü referans spektrumları için, belirli bir yoğunluk eşiğinin altındaki parçalar tipik olarak kaldırılır. Böylece, dizi öncesi sapma → dizi ofset voltaj gradyanı → manuel olarak tanımlanmış bir ön dizi gradyanı seçilmiştir (Şekil 5D, E).

Oluşturulan IMS/IMS-MS verileri, sadece parçaların hareketlilik bilgilerini içeren IMS/IMS spektrumlarını vermek için varış zamanı ve m/z boyutları (Şekil 6A) kullanılarak MZmine 2.51 ile ayrıştırıldı. CCS kalibrasyonu için %0,2'lik bağıl yoğunluğun üzerindeki pikler dışa aktarılmıştır (ayrıntılı MZmine parametreleri Ek Tablo S1'de verilmiştir). CCS kalibrasyonu, kalibrasyon çözeltisi kullanılarak gerçekleştirilmiştir (R2 = 0,995, kontrolün ortalama mutlak sapması = %1,63, bakınız Ek Tablo S3). Bu işlem sonunda merkezli, CCS kalibre edilmiş, IMS / IMS spektrumu sağladı (Şekil 6B).

Figure 1
Şekil 1: IMS/IMS veri oluşturma işlemine genel bakış. Kısaltmalar: IMS = iyon hareketlilik spektrometrisi; IMS/IMS = tandem IMS. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: XA3XX + XA2XX arabinoksilan pentasakkarit karışımının izotopik paterni. (A) DRE olmadan doymuş sinyal; (B) %5 iyon iletimi ile DRE kullanılarak düzeltilen sinyal (yani, %95 zayıflama); ve (C) bir lityum izotopuna karşılık gelen -1 Da zirvesini çıkarmak için kuadrupol seçiminden sonraki profil. Mor renkte: Doygunluk nedeniyle eser zirvelerinin görünebileceği bölge 6 kat büyütülür. Kısaltmalar: DRE = dinamik aralık geliştirme; MS = kütle spektrometrisi; MSMS = tandem MS; LM Res = düşük kütleli çözünürlük; HM Res = yüksek kütleli çözünürlük. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Kullanıcının IMS/IMS sırasını tanımladığı Döngüsel IMS denetim penceresine genel bakış. Görüntülenen dizi, IMS/IMS'deki izolasyonun kalitesinin, 3 geçişten sonra XA2XX seçimiyle nasıl kontrol edileceğini gösterir (görüntülenen spektrum, ilk aşama ayrımından sonra seçim olaylarının ayarına karşılık gelir). Dizi, 58 ms'nin üzerinde ilk 3 geçişli IMS ayrımını çalıştırmaktan, daha sonra iki daha hızlı izoformun IMS hücresinden (segment 3) çıkarılmasından, prestore'daki daha yavaş izoformun (92 ila 96 ms arasında ATD) çıkarılmasından, aktivasyon olmadan IMS hücresine yeniden enjekte edilmesinden (segment 6), iyonların daha fazla 3 geçişli (58-ms) ayrılmaya maruz kalmasına izin vermekten (segment 7) oluşur. daha sonra IMS hücresinden iyonları dışarı atmak ve veri almak (segment 8). Kısaltmalar: IMS = iyon hareketlilik spektrometrisi; cIMS = döngüsel IMS; IMS/IMS = tandem IMS; ADC = analogdan dijitale dönüştürücü; TW = hareket eden dalga; PE = potansiyel enerji; ATD = varış zamanı dağılımı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Resim 4: XA2XX ve XA3XX karışımından XA2XX seçimi. (A) Arabinoksilan pentasakaritlerin, XA3XX ve XA2XX'in, Döngüsel IMS hücresi etrafında 3 geçişten sonra (58 ms'de ayarlanmış bir ayırma süresine karşılık gelen) ayrılması. (B) IMS ayrımının ilk aşamasından hemen sonra atılan kesir. (C) IMS/IMS için seçilen ve reenjeksiyondan sonra başka bir 3 geçişli ayırmanın yapıldığı fraksiyon. İlgilenilen XA2XX zirvesi gri renkle vurgulanır. İyon hareketlilik spektrumları veri kutularında gösterilir ve varış zamanları (ms) ile birlikte ek açıklama eklenir. Kısaltmalar: IMS = iyon hareketlilik spektrometrisi; IMS/IMS = tandem IMS. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Ön dizi deposu alanını kullanarak çarpışma kaynaklı ayrışma ilkeleri. (A) IMS/IMS deneyleri sırasında seçim, yeniden enjeksiyon ve aktivasyon için kullanılan anahtar voltajlarını (kırmızı renkte) detaylandıran çok fonksiyonlu dizi bölgesinin şemaları. Mavi oklar, çok işlevli dizideki hareket eden dalganın yönünü gösterir. (B, C) Dahili prestore aktivasyon işlevi (+150 V) kullanılarak XA2XX için elde edilen IMS/IMS ve MS/MS spektrumları. Renk çubuğu, iyon yoğunluğu ölçeğini temsil eder (mavi = düşük; kırmızı = yüksek). (D, E) Gerilimlerin manuel optimizasyonu ile XA2XX için elde edilen IMS/IMS ve MS/MS spektrumları (ön dizi gradyanı 195 V, ön dizi yanlılığı 180 V, dizi ofseti -10 V). Öncü iyonlar spektrumdaki yıldız işaretleriyle gösterilir. İyon hareketlilik spektrumları veri kutularında gösterilir ve varış zamanları (ms) ile birlikte ek açıklama eklenir. Kısaltmalar: IMS = iyon hareketlilik spektrometrisi; IMS/IMS = tandem IMS; TOF = uçuş zamanı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: İşleme adımlarının gösterimi. (A) MZmine tepe toplama ve (B) arabinoksilan pentasakkarit XA2XX'in CCS kalibrasyonunun sonuçları. A, IMS/IMS spektrumunun kütlesel dekonvolüsyonunu bir renk kodu aracılığıyla gösterir. B, merkezleme ve CCS kalibrasyonundan sonraki son IMS/IMS spektrumunu gösterir. Kısaltmalar: IMS = iyon hareketlilik spektrometrisi; IMS/IMS = tandem IMS; CCS = çarpışma kesiti. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7: XA2XX'in iki IMS/IMS spektrumunun karşılaştırılması, yöntemin tekrarlanabilirliğini göstermektedir. Bu makaleden (üstte) son kalibre edilmiş spektrum, Ollivier ve ark. tarafından yapılan çalışmadan elde edilen spektrumla karşılaştırılmıştır. 21 (altta, çevrilmiş). Kısaltmalar: IMS = iyon hareketlilik spektrometrisi; IMS/IMS = tandem IMS; CCS = çarpışma kesiti. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S1: XA2XX ve XA3XX arabinoksilan pentasakaritlerin yapıları. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S2: XA2XX kullanarak günler arası tekrarlanabilirliğin değerlendirilmesi. IMS/IMS alımları 1. Gün (üstte) ve 95. günde (altta) tekrarlandı. Kısaltmalar: IMS = iyon hareketlilik spektrometrisi; IMS/IMS = tandem IMS. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Tablo S1: Ayrıntılı MZmine parametreleri. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Tablo S2: Tekrarlanabilirliği değerlendirmek için cihaz parametreleri değiştirildi. Kısaltma: ESI = elektrosprey iyonizasyonu. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Tablo S3: Kalibrasyon çözeltisinin ikinci bir alımını kullanarak CCS kalibrasyonunun kontrolü. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

SELECT SERİSİ Döngüsel IMS, yukarı akış kromatografik ayrımına gerek kalmadan belirli bir m/z ve iyon hareketliliğinin tanımlanmış bir iyon popülasyonunun seçilmesini sağlayan güçlü bir araçtır. Cihaz, hem MS / MS hem de IMS / IMS spektrumlarının çıkarılabileceği bu iyon popülasyonunun iki boyutlu parçalanma haritasını oluşturma imkanı sunar. Bununla birlikte, kullanıcı deneysel süreç sırasında dikkat edilmesi gereken birkaç kritik noktaya dikkat etmelidir.

İlk olarak, kullanıcı MS izolasyon penceresini olası izobarik kirleticilerin varlığı açısından dikkatlice kontrol etmelidir. Gerçekten de, bir dörtgenin izolasyon penceresi nispeten geniştir ve dörtlü kutupta birlikte seçilebilecek biraz farklı bir m / z iyonunu bilmek, kullanıcının iyon hareketliliğine olan ilgisinin zirvesini doğru bir şekilde atamasına yardımcı olacaktır.

İkincisi, ilk ayırmayı gerçekleştirirken, kullanıcı tüm iyonların Döngüsel iyon hareketlilik hücresi etrafında aynı sayıda geçişe maruz kalmasını sağlamalıdır. Bu, döngüsel bir cihazda iyon hareketliliği ayrımının önemli ve zor bir yönüdür. Belirli bir iyon için geçiş sayısının hatalı bir şekilde değerlendirilmesi, zirvelerin yanlış tanımlanmasına ve yorumlanmasına yol açabilir. Farklı iyon popülasyonlarının geçiş sayısını kontrol etmek, nispeten kısa tek geçişli uzunluk (~ 1 m) nedeniyle zor olabilir ve çok farklı hareketliliğe sahip türler hızla üst üste binebilir.

Özellikle, eğer dizi bu iyon popülasyonu geçtiğinde yön değiştirirse, bir tepe noktası iki farklı geçiş arasında bölünebilir (bunun tanımlanması nispeten kolaydır: bölünmüş zirve, Ejekte Et ve Al olayının hemen başında bir popülasyonla daha keskin görünecektir). Geçiş sayısını doğru bir şekilde ayarlamak için, kullanıcı 1 geçişli profili verecek kısa bir ayırma süresiyle (1-5 ms) başlamalıdır. Daha sonra, kullanıcı tüm nüfus daha yüksek varış zamanlarına geçene kadar ayrılma süresini kademeli olarak artırmalıdır, bu da 2 geçişli profili verecektir. 2 geçişli profil, 1 geçişli profile benzemeli, ancak daha iyi çözülmüş zirvelere sahip olmalıdır. Belirli bir iyon popülasyonunun döngüsel hücrenin etrafında bir geçiş yapmak için harcadığı süre, kullanıcının geçiş sayısını ayırma zamanının bir fonksiyonu olarak hesaplamak için kullanabileceği bir sabittir. Örneğin, birinci ve ikinci geçiş arasında 10 ms'lik bir fark varsa, ikinci ve üçüncü geçiş arasında da 10 ms'lik bir fark olacaktır.

Üçüncü olarak, IMS seçim aşamasında, kullanıcı Şekil 4'te gösterildiği gibi izolasyonun kalitesini dikkatlice kontrol etmelidir. Yeniden enjekte edilen profili kontrol etmek özellikle önemlidir, çünkü TW yükseklik ve hız ayarları çok düşükse, diğer popülasyonların atılması tamamlanmayabilir. İleri düzey kullanıcılar, Tune sayfasının RF sekmesindeki Driftcell RF radyo frekansı voltajını ayarlayarak bunu düzeltebilir.

Dördüncüsü, kullanıcı parçalanma spektrumunu oluştururken ve özellikle voltajlar manuel olarak ayarlanmışsa, uygun çarpışma enerjisini seçerken dikkatli olmalıdır. Gerçekten de, Array Offset voltajını aşırı derecede düşürmek, reenjeksiyonu engelleyerek genel iyon yoğunluğunu olumsuz yönde etkileyebilir. Ek olarak, öncü ve parçalar çok çeşitli hareketliliklere yayılabilir. Bu nedenle, son ayırma süresi yüksekse, hızlı bir şekilde farklı sayıda geçişe maruz kalacaklardır, bu nedenle protokol adımı 2.3.3'te açıklandığı gibi 1 ms'lik ayrı bir olay tutmak önemlidir. Tek geçişli uzunluk nispeten kısa olduğu için bu büyük bir sınırlamadır ve oligosakaritler için tek geçişli çözme gücünü ~ 100 ile sınırlar27. Bu bakımdan, tek bir geçişte artan bir yol uzunluğu faydalı olacaktır (yani, yol uzunluğu 13 m28 olan TWIMS tabanlı Kayıpsız İyon Manipülasyonu için Yapılar veya SLIM). SLIM kurulumu çok yakın zamanda ticari olarak piyasaya sürüldü29.

Son olarak, kullanıcı, özellikle çarpma yüklü iyonlar üzerinde çalışırken, Pushes per bin komutunu kullanarak nihai edinme hareketlilik aralığını tanımlarken dikkatli olmalıdır. İyon hareketliliği gerçekten de yükün bir fonksiyonudur12 ve örneğin, iki kat yüklü bir öncülden üretilen tek başına yüklü parçaların öncülden daha yavaş olması muhtemeldir (daha küçük bileşikler olmalarına rağmen).

Öncülü seçmek için yalnızca MS ve IMS ayrımlarını kullanmanın önemli bir sınırlaması (ve örneğin, kromatografinin yukarı akış adımı değil), belirli bir m / z'nin IMS'de birden fazla tepe noktası üretebilmesi ve birden fazla pikin aynı bileşikten gelebilmesidir. Bu, Şekil 4A'da hem XA2XX+XA3XX karışımı hem de saf XA3XX için m/z 685.2 dağılımları ile gösterilmiştir. Tek bir m/z'nin multimodal IMS dağılımları farklı gaz fazı konformasyonlarından kaynaklanır. Katyon katkıları olarak analiz edilen türler için (pozitif modda), farklı konformasyonlar muhtemelen karşı iyon ile koordineli farklılıklardan kaynaklanmaktadır30,31,32.

Oligosakaritler için, indirgeyici uç anomerlerinin ayrılmasından da kaynaklanabilirler, ancak indirgeyici uç anomerlerini ayırmak tipik olarak burada kullanılandan daha yüksek IMS çözme gücü gerektirir33,34,35. Bu durumda, Şekil 4A'daki multimodal IMS dağılımı kısmen XA2XX ve XA3XX'in bireysel katkılarından kaynaklanmaktadır. Bununla birlikte, XA3XX'in muhtemelen katyon-koordinasyon uygunlaştırıcıları olan iki tepe noktası vermesi dikkat çekicidir. Hangi zirvenin XA2XX'e (yani ilgilenilen türe) karşılık geldiğini belirlemek kolaydı, çünkü saf XA3XX ticari olarak temin edilebilir ve hareketlilik profili ayrı ayrı kaydedilebilir. Biyolojik ortam gibi karmaşık karışımlar üzerinde çalışmak için, bir kromatografik ayırma aşaması eklemeyi düşünmek önemli olabilir.

Kütleden arındırılmış IMS/IMS spektrumlarını elde etmek için kullanılan işleme iş akışıyla ilgili iki noktaya dikkat edilmelidir. İlk olarak, bu protokolde, MS boyutunu kullanarak IMS / IMS spektrumunu çözmek için MZmine 224'ün kullanılması ve özellikle EIM'leri farklı zirvelere bölmek için ADAP algoritmasının36 kullanılması önerilmektedir. Şekil 6'da gösterildiği gibi oldukça iyi sonuçlar vermesine rağmen, ADAP algoritması kromatografik analizler için tasarlanmıştır ve bu nedenle pik kuyruklama gibi sıvı faz kromatografisine özgü asimetri faktörlerini hesaba katar. Bu nedenle, ADAP algoritması IMS tepe noktalarına (örneğin, omuzlar) uygulandığında bazı özelliklerin tanımlanmamasına neden olabilir. Temel olarak, IMS verileri kromatografik verilerden daha basittir: bileşiklerin bir sütunla kimyasal etkileşimi olmadığından, uygun koşullar altında (yani, IMS hücresini doyurmadan) elde edilen IMS verilerinin gauss dağılımlarını izlemesi beklenir37,38. İdeal olarak, ADAP dekonvolüsyon adımı, CUISuite 239 gibi IMS'ye yönelik yazılımlar tarafından kullanılanlar gibi bir gaussian montaj işlevi ile en iyi şekilde değiştirilecektir. Bununla birlikte, mevcut haliyle, gaussian dekonvolüsyonu, bu protokolde açıklanan tüm tedavi zincirine doğrudan uyarlanmamıştır. Bu nedenle, ücretsiz, açık kaynaklı yazılım MZmine'ı kullanmak, son kullanıcılar için iyi bir uzlaşma gibi görünüyordu.

İşlemenin tartışmayı gerektiren ikinci kısmı CCS kalibrasyonudur. Bu protokol, logaritmik bir uyum kalibrasyonunu25,26 ve spektrometreninkiyle aynı sağlayıcıdan ticari bir kalibrant karışımı kullanılmasını önermektedir (bkz. Bu yordam, laboratuvarda uygulanması en kolay olanıdır. Kalibrant karışımının seçimi ile ilgili olarak, kullanıcı, çeşitli çalışmalarda belirtildiği gibi, analit26,40,41 ile aynı moleküler sınıftaki ve yük durumundaki kalibrantlar kullanıldığında CCS kalibrasyonunun doğruluğunun arttırıldığını düşünmelidir. Nispeten benzer bileşik türleriyle (örneğin, karbonhidratlar ve peptitler) kalibre edilirken ortaya çıkan hata ortadır. Bununla birlikte, karbonhidratları ölçerken kalibrant olarak tuz kümelerinin kullanılması gibi çok farklı iyonların kullanılmaması önerilir41. Kalibrasyon yönteminin seçimi ile ilgili olarak, Richardson ve ark.42 yakın zamanda kalibrasyonun doğruluğunu artırmak için TWIMS fiziğini dikkate alan yeni bir kalibrasyon yöntemi bildirmiştir (sağlanan bir yazılımla). Bununla birlikte, yaklaşım, metabolitlerden doğal proteinlere kadar çeşitli bileşik türlerinin analizi yoluyla oldukça spesifik parametrelerin değerlendirilmesini gerektirir. Bu kadar çeşitli bileşiklerin hiçbir karışımı ticari olarak bulunamadığından, bu yöntem mevcut protokolde uygulanmamıştır.

Son olarak, yöntemin tekrarlanabilirliğini değerlendirmek için, IMS / IMS-MS edinimini 1. gün ve 95. günde tekrarlayarak günler arası tekrarlanabilirliği değerlendirdik (Ek Şekil S2). Deney, IMS / IMS-MS verilerinin yüksek oranda tekrarlanabilir olduğunu ve bu uzun süre boyunca IMS tepe noktasının 0,2 ms'den fazla kaymadığını gösterdi. Bu çalışmada üretilen IMS / IMS spektrumu, iyon hareketliliği-moleküler ağ üzerindeki önceki çalışmalar için farklı koşullar altında elde edilen başka bir XA2XX spektrumuna karşılaştırılmıştır21. İyon yapısını ve iyon hareketlilik profilini13 etkileyebilecek bazı enstrümantal parametreler kasıtlı olarak değiştirilmiştir – kaynak parametreleri ve aktivasyon voltajı gradyanı (değişen enstrümantal koşulların bir karşılaştırması Ek Tablo S2'de verilmiştir). Daha sonra, iki spektrum, GNPS platformunda5 (eşleşen parçalar için CCS toleransı = 0.015 nm2) metabolomiklerde MS / MS spektrumlarının karşılaştırılması için popüler olan kosinüs benzerlik skoru kullanılarak karşılaştırıldı.

Karşılaştırma, uygulanan önemli enstrümantal varyasyonlar açısından yüksek kabul edilebilecek 0.87'lik bir kosinüs benzerlik skoru göstermiştir (Şekil 7). Bu, IMS / IMS spektral kütüphanelerinin, karmaşık karışımlardaki glikanları yüksek bir güven seviyesiyle çoğaltmak için kullanılabileceği fikrine yol açar; bu, MS / MS spektrumlarında geçerli değildir. Mevcut yaklaşım yalnızca parçalanma spektrumunun CCS boyutunu kullansa da, IMS/IMS-MS verilerinin CCS ile gereksiz olmayan MS bilgilerini de içerdiğini unutmayın. IMS/IMS'nin replikasyon kaldırma gücünü optimize etmek için, iki boyutlu bir puanlama sistemi geliştirilmelidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgments

S.O., doktorasını finanse ettiği için Fransız Ulusal Araştırma Ajansı'na müteşekkirdir (hibe ANR-18-CE29-0006).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
33-α-L- plus 23-α-L-Arabinofuranosyl-xylotetraose (XA3XX/XA2XX) mixture Megazyme Ltd., Wicklow, Ireland O-XAXXMIX XA2XX + XA3XX mixture
33-α-L-Arabinofuranosyl-xylotetraose (XA3XX) Megazyme Ltd., Wicklow, Ireland O-XA3XX Pure XA3XX standard
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, Eppendorf Quality, colorless, 1,000 tubes Eppendorf, Hamburg, Germany 0030120086 Used to prepare the carbohydrate stock solution and dilution
FALCON 50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm Corning Science México S.A. de C.V., Reynosa, Tamaulipas, Mexico 352070 Used to prepare the aqueous stock solution of 100 mM LiCl
Lithium Chloride (ACS reagent, ≥99 %) Sigma-Aldrich Inc., Saint Quentin Fallavier, France 310468 Used to dope the sample with lithium
Major Mix IMS/Tof Calibration Kit Waters Corp., Wilmslow, UK 186008113 Calibration solution for MS and IMS
MassLynx 4.2 SCN1016 Release 6 (Waters Embedded Analyser Platform for Cyclic IMS 2.9.1 Release 9) Waters Corp., Wilmslow, UK 721022377 Cyclic IMS vendor software for instrument control and data processing
Methanol for HPLC PLUS Gradient grade Carlo-Erba Reagents, Val de Reuil, France 412383 High-purity solvent
MS Leucine Enkephaline Kit Waters Corp., Wilmslow, UK 700002456 Reference compound used for tuning of the mass spectrometer
SCHOTT DURAN 100 mL borosilicate glass bottle VWR INTERNATIONAL, Radnor, Pennsylvania, US 218012458 Used to prepare the solution of 500 µM LiCl in 50:50 MeOH/Water
SELECT SERIES Cyclic IMS Waters Corp., Wilmslow, UK 186009432 Ion mobility-mass spectrometer equipped with a cylic IMS cell
Website: http://mzmine.github.io/ MZmine Development Team - Link to download the MZmine software
Website: https://github.com/siollivier/IM-MN INRAE, UR BIA, BIBS Facility, Nantes, France - Link to an in-house R script containing a CCS calibration function

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Allard, P. -M., et al. Integration of molecular networking and in-silico MS/MS fragmentation for natural products dereplication. Analytical Chemistry. 88 (6), 3317-3323 (2016).
  2. Wang, M., et al. Mass spectrometry searches using MASST. Nature Biotechnology. 38 (1), 23-26 (2020).
  3. David, M., Fertin, G., Rogniaux, H., Tessier, D. SpecOMS: a full open modification search method performing all-to-all spectra comparisons within minutes. Journal of Proteome Research. 16 (8), 3030-3038 (2017).
  4. Dührkop, K., et al. SIRIUS 4: a rapid tool for turning tandem mass spectra into metabolite structure information. Nature Methods. 16 (4), 299-302 (2019).
  5. Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).
  6. Nothias, L. -F., et al. Feature-based molecular networking in the GNPS analysis environment. Nature Methods. 17 (9), 905-908 (2020).
  7. Gray, C. J., et al. Advancing solutions to the Carbohydrate Sequencing Challenge. Journal of the American Chemical Society. 141 (37), 14463-14479 (2019).
  8. Ropartz, D., et al. Online coupling of high-resolution chromatography with extreme UV photon activation tandem mass spectrometry: Application to the structural investigation of complex glycans by dissociative photoionization. Analytica Chimica Acta. 933, 1-9 (2016).
  9. Wolff, J. J., et al. Negative electron transfer dissociation of glycosaminoglycans. Analytical Chemistry. 82 (9), 3460-3466 (2010).
  10. Ropartz, D., et al. Charge transfer dissociation of complex oligosaccharides: comparison with collision-induced dissociation and extreme ultraviolet dissociative photoionization. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (10), 1614-1619 (2016).
  11. Morelle, W., et al. Fragmentation characteristics of permethylated oligosaccharides using a matrix-assisted laser desorption/ionization two-stage time-of-flight (TOF/TOF) tandem mass spectrometer. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 18 (22), 2637-2649 (2004).
  12. Gabelica, V., Marklund, E. Fundamentals of ion mobility spectrometry. Current Opinion in Chemical Biology. 42, 51-59 (2018).
  13. Gabelica, V., et al. Recommendations for reporting ion mobility mass spectrometry measurements. Mass Spectrometry Reviews. 38 (3), 291-320 (2019).
  14. Hernandez-Mesa, M., et al. Interlaboratory and interplatform study of steroids collision cross section by traveling wave ion mobility spectrometry. Analytical Chemistry. 92 (7), 5013-5022 (2020).
  15. Koeniger, S. L., et al. An IMS-IMS analogue of MS-MS. Analytical Chemistry. 78 (12), 4161-4174 (2006).
  16. Merenbloom, S. I., Koeniger, S. L., Valentine, S. J., Plasencia, M. D., Clemmer, D. E. IMS−IMS and IMS−IMS−IMS/MS for separating peptide and protein fragment ions. Analytical Chemistry. 78 (8), 2802-2809 (2006).
  17. Eldrid, C., Thalassinos, K. Developments in tandem ion mobility mass spectrometry. Biochemical Society Transactions. 48 (6), 2457-2466 (2020).
  18. Giles, K., et al. A cyclic ion mobility-mass spectrometry system. Analytical Chemistry. 91 (13), 8564-8573 (2019).
  19. Merenbloom, S. I., Glaskin, R. S., Henson, Z. B., Clemmer, D. E. High-resolution ion cyclotron mobility spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (4), 1482-1487 (2009).
  20. Ollivier, S., et al. Anomeric retention of carbohydrates in multistage cyclic ion mobility (IMSn): de novo structural elucidation of enzymatically produced mannosides. Analytical Chemistry. 93 (15), 6254-6261 (2021).
  21. Ollivier, S., Fanuel, M., Rogniaux, H., Ropartz, D. Molecular networking of high-resolution tandem ion mobility spectra: a structurally relevant way of organizing data in glycomics. Analytical Chemistry. 93 (31), 10871-10878 (2021).
  22. Aron, A. T., et al. Reproducible molecular networking of untargeted mass spectrometry data using GNPS. Nature Protocols. 15 (6), 1954-1991 (2020).
  23. McKenna, K. R., Li, L., Krishnamurthy, R., Liotta, C. L., Fernández, F. M. Organic acid shift reagents for the discrimination of carbohydrate isobars by ion mobility-mass spectrometry. The Analyst. 145 (24), 8008-8015 (2021).
  24. Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Orešič, M. MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11, 395 (2010).
  25. Ruotolo, B. T., Benesch, J. L. P., Sandercock, A. M., Hyung, S. -J., Robinson, C. V. Ion mobility-mass spectrometry analysis of large protein complexes. Nature Protocols. 3 (7), 1139-1152 (2008).
  26. Bush, M. F., Hall, Z., Giles, K., Hoyes, J., Robinson, C. V., Ruotolo, B. T. Collision cross sections of proteins and their complexes: a calibration framework and database for gas-phase structural biology. Analytical Chemistry. 82 (22), 9557-9565 (2010).
  27. Ropartz, D., et al. Structure determination of large isomeric oligosaccharides of natural origin through multipass and multistage cyclic traveling-wave ion mobility mass spectrometry. Analytical Chemistry. 91 (18), 12030-12037 (2019).
  28. Tolmachev, A. V., et al. Characterization of ion dynamics in structures for lossless ion manipulations. Analytical Chemistry. 86 (18), 9162-9168 (2014).
  29. Arndt, J. R., et al. High-resolution ion-mobility-enabled peptide mapping for high-throughput critical quality attribute monitoring. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (8), 2019-2032 (2021).
  30. Le Fèvre, A., Dugourd, P., Chirot, F. Exploring conformational landscapes using trap and release tandem ion mobility spectrometry. Analytical Chemistry. 93 (9), 4183-4190 (2021).
  31. Ohshimo, K., He, X., Ito, R., Misaizu, F. Conformer separation of dibenzo-crown-ether complexes with Na+ and K+ ions studied by cryogenic ion mobility-mass spectrometry. The Journal of Physical Chemistry A. 125 (17), 3718-3725 (2021).
  32. Purves, R. W., Barnett, D. A., Ells, B., Guevremont, R. Gas-phase conformers of the [M + 2H]2+ ion of bradykinin investigated by combining high-field asymmetric waveform ion mobility spectrometry, hydrogen/deuterium exchange, and energy-loss measurements. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 15 (16), 1453-1456 (2001).
  33. Ujma, J., et al. Cyclic ion mobility mass spectrometry distinguishes anomers and open-ring forms of pentasaccharides. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (6), 1028-1037 (2019).
  34. Warnke, S., Faleh, A. B., Scutelnic, V., Rizzo, T. R. Separation and identification of glycan anomers using ultrahigh-resolution ion-mobility spectrometry and cryogenic ion spectroscopy. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 30 (11), 2204-2211 (2019).
  35. Williamson, D. L., Bergman, A. E., Nagy, G. Investigating the structure of α/β carbohydrate linkage isomers as a function of group I metal adduction and degree of polymerization as revealed by cyclic ion mobility separations. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (10), 2573-2582 (2021).
  36. Myers, O. D., Sumner, S. J., Li, S., Barnes, S., Du, X. One step forward for reducing false positive and false negative compound identifications from mass spectrometry metabolomics data: new algorithms for constructing extracted ion chromatograms and detecting chromatographic peaks. Analytical Chemistry. 89 (17), 8696-8703 (2017).
  37. Marchand, A., Livet, S., Rosu, F., Gabelica, V. Drift tube ion mobility: how to reconstruct collision cross section distributions from arrival time distributions. Analytical Chemistry. 89 (23), 12674-12681 (2017).
  38. Davis, D. M., et al. Analysis of ion mobility spectra for mixed vapors using Gaussian deconvolution. Analytica Chimica Acta. 289 (3), 263-272 (1994).
  39. Polasky, D. A., Dixit, S. M., Fantin, S. M., Ruotolo, B. T. CIUSuite 2: next-generation software for the analysis of gas-phase protein unfolding data. Analytical Chemistry. 91 (4), 3147-3155 (2019).
  40. Salbo, R., et al. Traveling-wave ion mobility mass spectrometry of protein complexes: accurate calibrated collision cross-sections of human insulin oligomers. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 26 (10), 1181-1193 (2012).
  41. Gelb, A. S., Jarratt, R. E., Huang, Y., Dodds, E. D. A study of calibrant selection in measurement of carbohydrate and peptide ion-neutral collision cross sections by traveling wave ion mobility spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (22), 11396-11402 (2014).
  42. Richardson, K., Langridge, D., Dixit, S. M., Ruotolo, B. T. An improved calibration approach for traveling wave ion mobility spectrometry: robust, high-precision collision cross sections. Analytical Chemistry. 93 (7), 3542-3550 (2021).

Tags

Kimya Sayı 179
Tandem İyon Hareketlilik Deneyleri için Döngüsel İyon Hareketlilik Spektrometresi Kullanma
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ollivier, S., Fanuel, M., Rogniaux,… More

Ollivier, S., Fanuel, M., Rogniaux, H., Ropartz, D. Using a Cyclic Ion Mobility Spectrometer for Tandem Ion Mobility Experiments. J. Vis. Exp. (179), e63451, doi:10.3791/63451 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter