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Chemistry

タンデムイオン移動度実験のための周期的イオン移動度分光計の使用

Published: January 20, 2022 doi: 10.3791/63451
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1INRAE, UR BIA, F-44316 Nantes, France, 2INRAE, BIBS Facility, F-44316 Nantes, France

Summary

イオン移動度分析(IMS)は、生体分子の特性評価のための質量分析を補完する興味深いものであり、特に異性化に敏感であるためです。このプロトコルは、分子の単離とその断片の移動度プロファイルの生成を可能にするタンデムIMS(IMS/IMS)実験を記述します。

Abstract

化学構造の正確な特性評価は、その根底にある生物学的メカニズムと機能的特性を理解するために重要です。質量分析(MS)は一般的なツールですが、すべての構造的特徴を完全に明らかにするには必ずしも十分ではありません。例えば、炭水化物は生物学的に関連性があるが、それらの特性評価は多数のレベルの異性化によって複雑である。イオン移動度分光法(IMS)は、イオン立体構造に敏感であり、したがって異性性に敏感であるため、興味深い補完物です。

さらに、最近の進歩により、この技術が大幅に改善されました:前世代のサイクリックIMS計測器は、分解能の向上やタンデムイオンモビリティ(IMS/IMS)実験の実行可能性など、リニアIMS計測器と比較して追加の機能を提供します。IMS/IMS では、イオンの移動度に基づいてイオンが選択され、断片化され、再分析されて、その断片に関するイオン移動度情報を取得します。最近の研究は、このようなIMS/IMSデータに含まれる断片の移動度プロファイルが、特定のグリカンのフィンガープリントとして機能し、構造的に関連する方法でグリコミクスデータセットを編成するための分子ネットワーキング戦略に使用できることを示した。

したがって、このプロトコルの目的は、サンプル調製から再現可能なスペクトルを生成するイオン移動度寸法の最終的な衝突断面(CCS)較正まで、IMS/IMSデータを生成する方法を記述することです。1つの代表的なグリカンの例を挙げると、このプロトコルは、サイクリックIMS機器上にIMS/IMS制御シーケンスを構築する方法、IMS到着時間をドリフト時間(すなわち、イオンに適用される有効な分離時間)に変換するためにこの制御シーケンスを考慮する方法、および生データから関連するモビリティ情報を抽出する方法を示す。このプロトコルは、IMS/IMS 実験の重要なポイントを明確に説明し、新しいサイクリック IMS ユーザーが簡単で再現可能な集録を実行するのに役立つように設計されています。

Introduction

生体分子の完全な化学的特性評価は、その根底にある生物学的および機能的特性を理解するための鍵です。この目的のために、近年、「オミックス」科学が発展し、生物学的濃度での化学構造の大規模な特徴付けを目指している。プロテオミクスおよびメタボロミクスにおいて、MSは、特にタンデムMS(MS/MS)を介して構造情報を提供する感度と能力のおかげで、生物学的媒体に見られる構造的不均一性を解明するためのコアツールとなっている。MS/MS戦略では、イオンはその質量に応じて選択され、次いで断片化され、そして最後に、その断片の質量が分子のフィンガープリントを確立するために獲得される。MS/MSスペクトルは、特に、スペクトルデータベース1,2を一致させるために、または親構造3,4を暫定的に再構築するために使用することができる。類似のスペクトルが類似の化合物に属するという仮定の下で、MS/MSデータは、類似性スコア5,6を介して近縁種をつなぐ分子ネットワーク(MN)を構築するためにも使用することができる5,6。

しかし、イオンの質量電荷比(m / z)を検出するMSの固有の特性のために、この技術は(立体)異性性の範囲内にある多くの構造的特徴に盲目的である。例えば、炭水化物はいくつかの単糖サブユニットからなり、その多くは立体異性体またはエピマー(例えば、Glc対GalまたはGlc対Man)である。これらのサブユニットはグリコシド結合によって連結されており、これは結合の位置(位置異性)およびアノマー炭素の立体配置(アノマー性)によって異なる可能性がある。これらの特性により、スタンドアロンMSが炭水化物異性体を区別することは困難であり7、高エネルギー活性化法を使用して位置異性のみに対処することができます8,9,10。誘導体化は立体異性体基の等価性を破壊するための選択肢ですが11、広範なサンプル調製が必要です。もう1つのより簡単な選択肢は、MSをIMSなどの異性化に敏感な分析次元と組み合わせることです。

このプロトコルは、IMS の基本概念に既に精通しているユーザー向けに設計されており、詳細なレビューは他の場所で入手できるため12,13 ここでは、IMS の原則の簡単な概要のみを示します。IMSは、イオンとバッファーガスおよび電場との相互作用に依存し、最終的に気相立体構造に従ってイオンを分離する気相分離法である。MSに結合されたIMSのさまざまな原理は、商用機器で見つけることができます:いくつかは交互の高電界と低電界(電界非対称IMS、FAIMS)で動作しますが、ほとんどは低磁界限界内で動作します - 特にドリフトチューブIMS(DTIMS、直線的に減少する電界)、進行波IMS(TWIMS、対称電位波)、およびトラップされたIMS(TIMS、電界に対してイオンをトラップするバッファガスの高流量)13.低磁場法は、分離中にバッファーガスと相互作用するイオンの表面(Å2またはnm2)を表すイオン - ガス対の特性である、いわゆるCCSへのアクセスを可能にする。CCSは理論的には機器に依存しないため、異なるラボ間で再現できるデータを生成するのに役立ちます14。イオン移動度分離は、様々なパラメータによって、特に移動度セル内のガス圧力およびガス温度の変動によって影響を受ける可能性がある。CCSキャリブレーションは、キャリブラントと対象種の両方が同様に影響を受けるため、これを改善する方法です13。ただし、温度制御された部屋に機器を設置し、信頼性の高いガス圧力制御システムを持つことが必須です。

IMSの興味深い進化はIMS/IMSであり、これは2006年にクレマーのグループによってMS/MS15,16のアナログとして初めて導入された。IMS/IMSでは、目的のイオンは、そのイオン移動度に基づいて選択的に単離される。その後、(フラグメンテーションが可能になるまで) 活動化され、活動化されたイオンまたはフラグメントの新しい IMS 分析が実行されます。最初の機器設計では、2つのIMSセルを直列に配置し、活性化が立っていたイオン漏斗によって分離した。それ以来、多くのIMS/IMSセットアップが提案されましたが(レビューについては、EldridとThalassinos17を参照)、IMS/IMS機能を備えた最初の商用質量分析計は201918年に利用可能になりました。この装置は、IMSセルの循環設計という別の技術的ブレークスルーと組み合わせることで、初期の概念を大幅に改善しました。

周期的なIMSセルは、理論的には、ドリフトパスの長さをほぼ無限に増加させ、したがって、計測器19の分解能を増加させることを可能にする。これは、環状TWIMSセルが主イオン光軸に対して直交して配置される特定の機器形状によって達成された。IMS セルの入り口にある多機能アレイ領域は、(i) IMS 分離のためにイオンを横向きに送る、(ii) MS 検出のために前方に送る、または (iii) IMS セルから後方にプリアレイ・セルに格納する、イオン経路の方向を制御することができます。このプレアレイストアセルから、イオンを活性化し、フラグメントをイオン移動度測定のためにIMSセルに再注入することができ、このアプローチは立体異性体20を特徴付けるために首尾よく使用されている。最終的に、収集されたデータには、前駆体とその断片のイオン移動度と m / z 情報が含まれています。

グリカン分析にこの環状設計を使用した最近の出版物(Ollivier et al.21)では、このようなIMS/IMSデータに含まれるフラグメントの移動度プロファイルが、分子ネットワーク戦略に使用できる生体分子のフィンガープリントとして機能することを示した。その結果、IM-MNと呼ばれるネットワークは、構造的に関連する方法でグリコミクスデータセットの組織化につながったが、MS / MSデータ(MS-MN)のみから構築されたネットワークはほとんど情報を明らかにしなかった。本書を補完し、Cyclic IMS ユーザーがこのワークフローを実装できるように、このプロトコルには、データの収集に使用されるプロトコルの完全な説明が記載されています。このプロトコルは、ユーザーが IM-MN ネットワークの構築に使用できる IMS/IMS データの生成 (21 を参照) のみに焦点を合わせています (または、ユーザーが選択したその他のアプリケーションに対して)。IM-MNの構築は、分子ネットワークのためのプロトコルがすでに利用可能であるため、ここでは考慮されません22。貴重で再現可能な IMS/IMS 集録を生成するために従わなければならない重要なポイントが強調表示されます。Ollivierらによって研究されたオリゴ糖の1つを例 にとる。図21では、(i)サンプル調製、(ii)サイクリックIMS機器のチューニング、(iii)データの自動ピークピッキング、および(iv)CCSキャリブレーションのステップが詳述されています。

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Protocol

メモ: プロトコルの概要を図 1 に示します。本プロトコールに記載される実験に使用されるパラメータは、補足表S1および補足表S2に見出すことができる。

試料溶液の調製

注:このプロトコルは、例としてアラビノキシラン五糖(23-α-L-アラビノフラノシル-キシロテトラオースまたはXA2XX; 材料表を参照)を用いて記載されている。

  1. 溶媒の調製:50:50 H2O:MeOH中の500μM LiCl(体積/体積)。
    1. 212mgのLiClを秤量してH2O中の塩化リチウム(LiCl)の100mM原液を調製し、50mLポリプロピレン製円錐管に50mLの高純度脱イオン水(H2O)を加える。完全に溶解するまで振る。
      注:溶媒にはリチウム塩がドープされており、分光計のイオン源における[M + Li]+ 付加物の形成を促進し、通常は他のアルカリ付加物と比較してより高品質のフラグメンテーションスペクトルが得られる。LiClの使用が推奨されるのは、有機酸(およびその塩)がIMSプロファイルに影響を与えることが以前に判明しているためです23。
    2. ガラス瓶に、LiCl ストック溶液を 200x: 250 μL のストック溶液に希釈し、24.75 mL の H2O を加えます。25 mL のメタノール (MeOH) を加えて、50:50 H2O:MeOH (v/v) で 500 μM の LiCl の最終濃度に達します。溶媒を脱気するために2分間超音波処理する。
      注:MeOHは健康上の危険(H225、H301、H311、H331、H370)を提示します。ラボコート、手袋、および目の保護具を着用した抽出フードの下で操作します。50:50 MeOH/H2O(v/v)の割合は、オリゴ糖のイオン化に最適な溶媒であると思われる。しかしながら、MeOHは、必要に応じてアセトニトリル(ACN)で置換することができる。
  2. 1.5mLポリプロピレンチューブに、1mgの炭水化物の重量を量る。500 μM LiClの適切な容量で溶解し、1 mg/mLの濃度に達する。50:50 MeOH/H2O + 500 μM LiCl で終濃度 10 μg/mL に希釈します。4°Cで保存してください。
    注:10μg/mLの濃度は、IMS/IMS-MS中のすべてのフラグメントイオンにわたってシグナルを最適化するために選択されました(これは純粋な化合物用であり、混合物で作業する場合は濃度を上げてください)。基準IMS/IMSスペクトルを取得するには、サンプルをさらに希釈しないでください:フラグメンテーションの前にMS検出器の飽和が予想されますが、装置には補正オプションが用意されています(ステップ3.2を参照)。

2. サイクリックIMS質量分析計のチューニング

メモ: ソフトウェア関連の指示 (ウィンドウ、メニュー、およびコマンド) は 太字で強調表示されています。

  1. 計器制御ソフトウェアから計器コンソールを開き(MSチューニング ページ、 材料表のソフトウェアの詳細を参照)、計器を 操作 モードにします。IMS セル内で高電圧が安定するまで、少なくとも 3 時間待ちます。
    メモ: 最高の再現性を得るには、IMS セル内の電圧を完全に安定させる必要があります。高電圧をオンにして、IMSの巡回解析の前に機器を一晩安定させます。さらに、イオン移動度セル内の圧力および温度は、可能な限り一定に保たれなければならない。圧力のリードバックは 真空 タブで利用できますが、温度のリードバックは利用できません。機器を熱測定された実験室に保管してください。この作業で使用された機器は、20°Cで熱測定された実験室で1.75mbarで動作します。
  2. サイクリック IMS 計器のセットアップ
    メモ:標準ソリューションは、機器のセットアップに内蔵のフルイディクスシステムを使用して注入する必要があります。
    1. 適切な製造業者提供の標準で満たされた流体工学容器を流体システム上に置きます:リザーバB(「ロックマス」):10pg/μLロイシンエンケファリン(LEU ENK)を50:50 ACN / H2O + 0.1%ギ酸に入れます。Reservoir C ('Calibrant'): MajorMix.
      注: このプロトコルでは、MajorMix キャリブレーションソリューションを使用して、 m/z 寸法と CCS 寸法の両方をキャリブレーションします。実用的な理由から、外部CCSキャリブレーションが実行されます(プロトコルのステップ5を参照)。したがって、CCS用の社内キャリブラント混合物と m / z 用の別のキャリブラント(例えば、ギ酸ナトリウムまたはヨウ化ナトリウム)を使用することもできる。
    2. Quartz コンソールの [チューニング] ページで、[フルイディクス] タブに移動します。サンプル流体をリザーバCに設定し、基準フルイディクスをリザーバBに設定します。両方の溶液をイオン源に連続して注入して、MS信号を確認します。
    3. ADCのセットアップ、検出器のセットアップ(LEU ENKを使用)、および質量校正(校正ソリューションについては 材料表 を参照)を、製造元の指示に従って 機器のセットアップ ページから実行します。
  3. 1 パス分離でキャリブレーション・ソリューションの IMS アクイジションを記録します (これは外部 IMS キャリブレーションに使用します)。
    メモ:イオン源と進行波(TW)パラメータ(静的波の高さと波速)は、すべての集録(キャリブレーションと集録)中に一定に保つ必要があります。ユーザーがサンプルに最適なパラメータに関する事前知識を持っていない場合、このステップはプロトコルのステップ3の後に実行することができます(中性オリゴ糖の[M + Li]+ 付加体の場合、代表的な結果は16VのTW高さと350 m/sのTW速度を使用し、最良の結果が得られます)。
    1. 「フルイディクス」タブから、バッフル位置サンプルを選択し、「サンプル」プローブを介してイオン源にキャリバート(材料表を参照)を10μL/minの流量で注入します。
    2. シングルパス IMS シーケンスをセットアップします。 「チューン」 ページで、インストゥルメントを モビリティ モードにし、 サイクリックシーケンスコントロール ウィンドウを開きます。 [詳細 モード] を選択します。この新しいウィンドウの 「循環関数 」タブから、「 バンドルの追加」を選択してから、「 シングル/マルチパス」を選択します。モビリティ イベントのシーケンスが同じウィンドウの [ シーケンス] タブに表示されるのを待ちます。
      メモ:リアルタイム表示を有効にするには、計測器パラメータを適用する必要があります:TOFモードでチューニングまたはモビリティモードで実行をクリックします。計測器をTOFモードとモビリティモードに切り替える前に、実行中の集録(Tuneページ表示を含む)を中止する必要があります。イオンの相対的な存在量は、イオン透過パラメータの変化のためにTOFモードとモビリティモードの間で変化し得る。
    3. すべてのキャリブラントイオンがサイクリックIMS競馬場の周りを1回通過するようにシーケンスを調整します。注入時間またはイジェクトおよび集録時間を変更しないでください。 ただし、[分離時間] を [シーケンス] タブの 1 ミリ秒に下げます。キャリブレーション混合気の一部のイオンが表示された到着時間枠に収まらない場合は、[ADC 設定]タブで[ビンあたりのプッシュ数]を増やして、IMSと直交加速度TOFアナライザのプッシャーとの同期を変更します。
      メモ: 制御シーケンスの時刻は、イオンゲーティング用の多機能アレイのみを制御します。イオンが競馬場の周りを最初に(またはn回目)通過している限り、その間に配列内でTWの方向が変わったとしても、そのパスを終了します。分離時間を1ミリ秒に短縮すると、アレイは1ミリ秒後にイジェクトモードに切り替わります。これにより、より速いイオンは、遅いイオンが最初のパスを終える前に、アレイを通過して2回目のパスに従事するのに十分な時間を持たないことが保証されます。したがって、すべてのイオンは、IMS較正を実行するために必要な同じパス数(すなわち、1パス)を受けることになる。
    4. 2 分間の集録を記録します。「サイクリックシーケンスコントロール」ウィンドウで、「集録」をクリックして「集録設定」ポップアップウィンドウを開きます。 ファイル名、説明、および取得期間(分)を入力し、「保存」をクリックします。
  4. ステップ2.3と同じ条件で校正溶液をさらに2分間取得して記録します(CCS校正の品質を確認するためにこれを使用します)。「サイクリックシーケンスコントロール」ウィンドウで、「集録」をクリックして「集録設定」ポップアップウィンドウを開きます。 ファイル名、説明、および取得期間(分)を入力し、「保存」をクリックします。
  5. 流体システムを50:50 H2O/ACNで徹底的に洗浄し、ピークチューブ内のキャリブラントの結晶化を防ぎます。

3. IMS/IMS-MS の取得

  1. シリンジポンプを使用して、(リチウムドープ)サンプルを10 μg/mLでサンプルプローブに10 μL/minの流速で注入します。
  2. (MSチューニングページから)計測器をTOFモードに切り替えて、信号の安定性を確認します。サンプルの完全なMS取得(1分)を記録すると、同位体パターンと潜在的な汚染物質の存在を確認するのに役立ちます。
    注:サンプル濃度はフラグメントに対して良好なイオンシグナルを得るために選択されるため、このステップでTOF飽和が観察されることがあります。TOF飽和は、(i)人為的に増加したMS分解能、(ii)同位体比の変化、および(iii)同位体間の多数の低存在量ピークのアーティファクトを使用して同定することができる。DREレンズ(ダイナミックレンジエンハンスメント、メインチューンページのクワッド/MSプロファイル/DREタブ)を使用して、イオンの透過を減衰させ、TOFモードで飽和を破棄します(図2A、B)。
  3. 機器をMSMSモード(メインチューンページのクワッド/MSプロファイルタブ)にし、四重極で単離するためにMSMS質量フィールドで標的イオンの質量を選択します(例では、685.2のm/z、アラビノキシラン五糖の[M + Li]+イオン種に対応)。1分間の集録を記録して、データ処理時の前駆体の分離を確認します。
    注: リチウム付加物は、モノアイソトピックピークの -1 Da に同位体があるため、処理ステップに干渉しないように MS/MS 選択ウィンドウから除去する必要があります。これは、[クワッド/MSプロファイル]タブの[LM分解能]パラメータと[HM分解能]パラメータを使用して選択範囲を狭めることで削除できます(図2C)。
  4. IMS シーケンスを「スライス」して、目的の異性体のモビリティー・ベースの選択を実行します。
    1. 計測器をモビリティモードに切り替えます(ステップ2.3.2を参照)。「サイクリックシーケンスコントロール」ウィンドウの「サイクリック機能」タブで、「バンドルを追加」を選択し、「スライス」を選択します。モビリティ イベントの複雑なシーケンスが [シーケンス] タブに表示されるまで待ちます (図 3)。
      注: IMS/IMS プロセスの各ステップを視覚化することができます: 「シーケンス」タブの「排出および獲得」イベントをクリックします。赤でハイライト表示したら、[上へ]ボタンと[下へ]ボタンを使用して、シーケンス内の適切な位置に移動します。
    2. Eject イベントと Acquire イベントを最初の Separate イベントの直後に配置し (つまり、図 3 に示すシーケンスの行 8 ではなく行 3 に移動します)、[実行] をクリックします。リアルタイムで表示される初期分離の結果を探します。IMS ピークの解決が満足のいくものになるまで、シーケンス内のこのイベントの時間値を変更して、マルチパス分離の最初の分離イベントの継続時間を長くします。参照用に1分間の集録を記録します。
      メモ: [ADC のセットアップ]タブ の[ADC の開始遅延]の値に注意してください:絶縁の品質を確認すると便利です。
    3. 「一時停止」をクリックします。初期分離の結果が表示されますが、ユーザーが [実行] をもう一度クリックするまで、制御シーケンスの変更は適用されません。イジェクトおよび集録イベントを、イジェクト、プリストアへのイジェクト、および保留およびイジェクトの各イベントの下に配置します。ターゲットピークが「イジェクトからプリストアへ」領域にあり、その他のイオンが「イジェクト」領域または「ホールドアンドイジェクト」領域にあるように、イベントの継続時間を調整します。
      注: 到着時間分布 (ATD) と比較したこれら 3 つのイベントの継続時間は、[ モービログラム ] タブのモビリティ スペクトルの下にある色分けされたバーを使用して視覚化できます (図 3)。
    4. Eject イベントと Acquire イベントは、シーケンスの最後に、 プレストアからの再注入 イベントと 2 番目の [個別のイベント] の下に配置します。[ 実行 ]をクリックして、選択した母集団を表示します。
      注: 選択された母集団が IMS セルを離れたため、以前の分離はすべて失われ、シングルパス分離 (望ましい) に戻ります。
    5. 分離の品質を確認します。目的のピークのみが選択されたことを確認するには、図4に示すように、再注入前と同じ分離(すなわち、同じ分離時間)を再注入後に行う。参照用に1分間の集録を記録します。
      注:ユーザーは、排出された人口を確認することをお勧めします。[イジェクトからプリストアへ]時間枠はベースラインレベルである必要があります(図4B)。これを確認するには、[ADC 設定]タブで[手動モードのADC開始遅延]を表示し、ステップ3.4.2で記録した遅延時間を入力します。参照用に1分間の集録を記録します。
    6. [シーケンス] タブのユーザー定義のイベント時刻の横にある列 (赤で強調表示された [時間 Abs] 列) で、すべてのイベントの合計時間を探します。CCS キャリブレーションを実行するための [プレストアから再注入] イベントの行で見つかった時間 Abs に注意してください。
  5. IMS の 2 つのラウンド間のターゲット・ピークをフラグメント化します。再注入ステップの電圧を変更してイオンの運動エネルギーを増加させ、イオン移動度ガスとの衝突時にそれらを断片化する。
    1. イジェクトと集録の直前の Separate イベントの継続時間を 1 ミリ秒に設定します (ステップ 2.3.3 の説明を参照)。
    2. [ ストア前から再挿入 ] 行で、[ アクティブ化を有効にする] ボックスをオンにし、組み込みコントロールを使用して断片化を最適化します。スペクトルが満足のいく場合(例えば、塩基ピークがフラグメントである場合)、ステップ3.5.4に直接進む。
      メモ:アクティベーションを有効にすると、ライン上の3つの電圧が灰色に変わります:これらは、電圧を手動で最適化する必要がある場合にユーザーが変更する必要がある電圧です(次の手順を参照)。これら3つの電圧(プレアレイ 勾配、プレアレイバイアス、および アレイオフセット)は、イオンを活性化するために使用される勾配を形成します。イオンの運動エネルギーは、 プレアレイバイアス と アレイオフセット の間の傾きとともに増加します( 図5参照)。グラデーション→バイアス→オフセット値のデフォルト値は、アクティブ化なし 85 → 70 → 45 V です。組み込み関数の最大アクティブ化 185 → 170 → -5 V (+150 V)。フラグメンテーション後、 DREレンズ を使用してイオン透過を再調整することを忘れないでください(信号の減衰を減らす)(ステップ3.2を参照)。
    3. フラグメンテーションが内蔵コントロールで十分でない場合は、[アクティブ化を有効にする]ボックスのチェックを外し、再注入電圧を手動で最適化します。アレイ前勾配電圧を上げ(プリアレイバイアス電圧は常にアレイ前勾配より15 V低くする必要があります)、結果が満足できるようになるまでアレイオフセット電圧を下げます(負に設定できます)。
      メモ:多機能アレイの電圧を手動で調整する場合、ユーザは「モービログラム」ビューから多機能アレイに印加される電圧のインタラクティブな回路図(PE図)に切り替えて、電圧設定をより正確に視覚化することができます(図5A)。
    4. 2分間の集録を記録します。集録ポップアップウィンドウで、[ ドリフト時間を保持] オプションにチェックマークを付けて、到着時間と m/z (クロマトグラフィー分析に使用された集録時間、保持時間)のみを含むファイルを生成します。このファイルには *_dt というラベルが付けられていることに注意してください 。ラウ。
      注: ユーザーが 「ドリフト時間を保持する」 オプションをチェックし忘れた場合でも、ドリフトスコープ 2.9 ソフトウェアを使用して IMS ディメンションを抽出することができます (ファイル|マスリンクス|へのエクスポートドリフト時間を保持します)。
  6. メインのTuneページで計測器をTOFモードに戻し、50:50 MeOH/H2Oでシステムを十分にすすぎ、次のサンプルに進みます。

4. MZmine 224によるIMS/IMS-MS処理

注:MZmine 2は、 資料表に記載されているURLから入手できます。MZmine 2.51 の使用をお勧めします。この原稿の作成時点では、インポート機能の変更により、それ以降のバージョンではサイクリックIMSインストゥルメントからRAWファイルを開くことができません。

  1. IMS および m/z ディメンション (*_dt のみを含むロー・ファイルをインポートします。RAW) 生データメソッドを使用して|生データのインポート。
    注:RAWファイルはメインMZmineウィンドウの左側に表示されます。元の*をインポートしないでください 。 保持期間ディメンションがまだ含まれている RAW ファイル。MZmine は保持時間と IMS 到着時間を区別せず、両方のディメンションのデータ・ポイントが重複します。
  2. 代表的なファイルのワークフローパラメータを最適化するには、 生データファイル リスト。
    1. データ内のノイズレベルを評価します。「 生データ ファイル」リストでファイルを右クリックし、「 TICを表示 」を選択して、ベースピーク「クロマトグラム」(BPC)を表示します。目で観測できる最小のピークをダブルクリックすると、そのマススペクトルが表示されます。データ内のノイズレベルがこのスペクトルのベースピークの2番目の同位体のノイズレベル付近にあると考え、次の処理ステップのすべての強度しきい値にこの同じ値を使用します。
      注:データは四重極分離を使用して取得されたため、MZmineはMS / MSと見なします。MZmine処理全体を通して、 MSレベル= 2で動作するようにしてください。
    2. 生データメソッドを使用した質量検出の実行 |機能検出|質量検出。プロファイルモードで集録したデータの場合は、 ウェーブレット変換 アルゴリズムを使用します。MZmineでアルゴリズムのパラメータを設定するには、アルゴリズムの横にある [... ]ボタンをクリックし、[ プレビューを表示] オプションを使用してパラメータを最適化しながらデータを視覚化します。
      注: この段階では、アルゴリズムによって選択されたピークがプレビュー ウィンドウに赤で表示されます。独自のRAWファイルで ウェーブレット変換 アルゴリズムを使用すると、MZmineはプロファイルデータポイントを重心ピークと間違えることがあります。ソフトウェアは、ユーザーが重心スペクトルでプロファイルアルゴリズムを実行していることを示すメッセージを表示します。このメッセージを無視して[ OK]をクリックします。
    3. 抽出されたイオン移動度スペクトル(EIM)を、各フラグメント質量について 、生データ法を用いて再構成する|機能検出| 前のステップで生成された「質量」質量リスト上のADAPクロマトグラムビルダー。この段階でのm/z公差入力はスキャン /スキャン公差 であるため、予想される精度全体の少なくとも3~4倍高い値にしてください。
    4. 前の手順にはプレビューオプションがないため、メインMZmineウィンドウの右側のパネルに表示された 機能リスト を使用して、ピークピッキングの品質を直接確認します。 「フィーチャー」リストを開き、すべての行を選択して右クリックし、「 表示/XIC (ダイアログ)」を選択します。[ すべて ]をクリックして、移動度スペクトル上のすべてのイオンを表示します。色で表示される選択したピークを調べて、明らかな欠落したピークがないことを確認します。
    5. EIM を逆畳んで、複数のフィーチャに異なるピークを含む m/z を分割します。 機能リストのメソッドを使用する |機能検出|クロマトグラムデコンボリューション、および ウェーブレット(ADAP) アルゴリズムを選択します。 プレビュー表示 オプションと、 S/N しきい値、係数/面積しきい値、および RT ウェーブレット範囲の主要なパラメーターを使用して、データのアルゴリズムを最適化します。
      メモ: デコンボリューションされたスペクトルのアスペクトを確認することをお勧めします。手順 4.2.4 で説明したクロマトグラム視覚化ツールを使用します。図 6Aに示すように、畳み取り解除されたピークは色で表示され、同じ質量のピークは分割する必要があります。
    6. フィーチャー・リスト・メソッドを使用して、デコンボリューションされた EIM をデアイソトープ |同位体|同位体ピークハタ。 m/z 公差値に計器の期待精度を使用し、IMS 分離中に同位体が分解されないため、到着時間公差を 0.1 ms (MZmine では 保持時間許容値 0.1 分と表示) に設定します。フィーチャ リストを確認する: 同位体が残っている場合は、公差値を増やします。
      注: 理論的には、デアイソトーピングはフィーチャ リスト処理の任意の時点で実行できますが、電荷値をエクスポートできるように、最後に行うことが重要です (他の手順で使用されるアルゴリズムによって、電荷状態情報が削除されることがあります)。
  3. 複数のIMS/IMS-MSスペクトルを処理する場合は、これらの最適化されたパラメータで処理を繰り返します。すべてのスペクトルに対して同じパラメータを保持します。
  4. 複数のスペクトルの場合は、それらを1つのテーブルにグループ化してエクスポートします。そうでない場合は、ステップ 4.5 に直接進んでください。スペクトルをグループ化するには、 フィーチャリストメソッドを使用して|整列|アライナーに参加します。目的は実際にピークを揃えることではないため、 m/z と到着時間の両方に制限的な許容値を使用します。両方の寸法に同じ重みを与えます。
  5. 最終的な機能リストを *.csv ファイルにエクスポートします。 機能リストのメソッドを使用する |エクスポート/インポート|CSV ファイルに エクスポートし、エクスポート行 m/z、 エクスポート行保存時間 (実際の IMS 到着時間)、 ピーク m/z、および ピーク高さの値をエクスポートします。コンマをフィールド区切り文字として使用します。

5. 重心付きIMS/IMSスペクトルのTWCCSN2

注:このプロトコルでは、対数フィットキャリブレーション25,26が使用され、線形キャリブレーションよりも優れた結果が得られる傾向があり、スプレッドシートまたは社内の処理スクリプトに簡単に実装できます。社内スクリプト(Rで書かれています)は、材料表に記載されているURLから入手できます。

  1. キャリブラントの集録から基準到達時間値を選択します(ステップ2.3を参照)。コンストラクター・ソフトウェア ( 材料表を参照) を使用して手動でこれを行い、すべての IMS キャリブラント・ピークの側面を確認します。
    1. クロマトグラムウィンドウで、*_dtを開きます。キャリバートに対応するRAWファイル。
    2. キャリブレーション・ポイントごとに、 ディスプレイ・|を使用して EIM を生成マスオプション 。
    3. EIM のプロファイルを確認してください。定義が不十分なものがある場合は、プロセス |を使用して滑らかにします。 スムーズ オプション(最良の結果は、通常、サヴィツキー・ゴレイアルゴリズムで得られるため、3ビンにわたって2回滑らかになります)。頂点値をスプレッドシートで報告します。
      メモ: 基準点は通常、低分解能DTIMSデバイスを使用して取得されるため、キャリブラントによっては、サイクリックIMSに一部のマルチモーダル分布が表示される場合があります。このような分布を示すピークをキャリブレーションリストから削除します。
  2. キャリブラントから対数適合パラメータを計算します。
    1. すべてのキャリブレーションポイントについて、次の計算を行います。
      1. 式(1)を使用してドリフト時間を計算します。
        Equation 1 (1)
        td はドリフト時間、tA は測定された到着時間、tinj は IMS セルへの注入時間です (すべてミリ秒単位)。
        注: オリゴ糖フラグメントなどの小分子の場合、異なる質量間のデッドタイム(IMSセルからの出口と検出器間の飛行時間)の変動はCCSキャリブレーションの誤差範囲内にあり、無視できます。
      2. Eq(2)を使用してイオンの中性質量を計算します。
        Equation 2 (2)
        zはイオンの電荷状態、mionは対イオンの質量(Da)である。正確な質量を使用して、不確実性の発生を回避します。対イオンの代わりに原子損失がある場合は、負のミオン値を使用します(たとえば、[M-H]-mneutral = (m/z) * |z| - (- 1.007276) = (m/z) * |z| + 1.007276)。 
      3. 式(3)を使用してCCSのパラメータを計算します。
        Equation 3 (3)
        CCSでは、基準ドリフトチューブDTCCSN2値(nm2単位)、およびmgasはドリフトガスの質量(Da単位、窒素の場合:mgas = 28.01Da)。
      4. 式 (4) を使用して td' パラメータを計算します。
        Equation 4 (4)
        dでは、検出器の起動遅延は、デッドタイム(通常は〜1.5ms)を補正するために実験的に使用されました。
      5. 上記のパラメータの対数を計算します。
        ln (CCS') および ln (t'd)
    2. 線形回帰を実行して、式(5)を使用して、対数適合のR2係数とxパラメータとyパラメータ(xは傾き、ln(y)は切片)を決定します。
      Equation 5 (5)
      メモ: ln(CCS') vs ln(td') の値をプロットして、キャリブレーションの結果を視覚的に確認できますが、これはオプションです。
  3. キャリブレーションを実験データに適用して、*.csv ファイルにエクスポートされたすべての IMS/IMS スペクトルについて、MZmine によって選択されたピークをキャリブレーションします。ポイントごとに、次の計算を行います。
    1. 式(6)を使用してドリフト時間を計算します。
      Equation 6 (6)
      tseq を指定すると、最終的な IMS 分離に先立つ時間 (ステップ 3.4.6 で示された「時間 Abs」値)。
      メモ: 異なるシーケンスで取得した複数の IMS/IMS スペクトルを較正する場合は、tseq 値を慎重に確認してください。
    2. Eq(7)を使用してイオンの中性質量を計算します。
      Equation 7 (7)
    3. 式 (8) と式 (9) を使用して td' および td'' パラメータを計算します。
      Equation 8 (8)
      Equation 9 (9)
    4. 式(10)を使用して、最終的な較正されたCCS値(nm2のTWCCSN2)を計算します。
      Equation 10 (10)
      注:ステップ5.2.2ですが。はインターセプトとして ln(y) を与え、最終的な CCS 値を取得するには y を使用しなければなりません。指数関数を適用することを忘れないでください。
  4. ステップ2.4で取得した校正溶液の2回目の取得に校正を適用して、校正の精度を確認します。
    注:キャリブレーションでは、約1〜2%の誤差が生じるはずです。

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Representative Results

アラビノキシラン五糖XA2XXを、このプロトコルを説明する例として選択した。この化合物は市販されているが、別のアラビノキシラン五糖との混合物としてのみ、XA3XX(純粋なXA3XXも市販されている)。XA2XX および XA3XX の構造は、補足図 S1 に示されています。市販の混合物中のXA2XXとXA3XXの比が〜50:50となるように、混合物の20μg/mLの溶液を調製し、50:50MeOH/H2O + 500μM LiClにおいて〜10μg/mLのXA2XX濃度に達した。

まず、XA2XX+XA3XX混合物のMS分析を、高分解能MSを用いて行った。2つの化合物は異性体であるため、[M+Li]+m/z 685.24に単一のピークが観察された。このMSピークは、四重極と選択ウィンドウを調整して-1Daリチウム同位体を除去することで選択されましたが、これは処理アルゴリズムによってモノアイソトピックピークと誤解される可能性があります(図2)。

次に、五糖の[M+Li]+付加物をIMS分離の第1段階に投入した:環状IMS細胞の周りを3回通過した後、3つのピークが83、90、および94msの到着時間で分離された。このプロファイルを純粋なXA3XX(10μg/mLで注入)のプロファイルと比較し、83msと90msのピークがXA3XXに対応し、94msのピークがXA2XXに対応することを示しました(図4A)。IMS/IMS分析では、94msのピークが選択され、XA3XXに属するイオンが排出され(図4B)、目的のピークがプリアレイストアセルに送られました。活性化せずにイオンを再注入した後に3パス分離を行い、選択後にXA2XXピークのみが残るようにしました(図4Cの199ミリ秒に到着)。

次いで、復元領域からの再注入時にイオンを断片化し、すべての断片に対してシングルパスIMS分離を行った。2つの異なるアクティブ化が試行されました:組み込みのprestore アクティブ化関数の最大設定が最初に試行されました (図 5B、C)。しかしながら、前駆体はスペクトルのベースピークのままであった。これは、参照スペクトルの場合、特定の強度閾値未満のフラグメントが通常除去されるため、望ましくない。したがって、手動で定義されたプレアレイ勾配→プレアレイバイアス→アレイオフセット電圧勾配が選択されました(図5D,E)。

生成されたIMS/IMS-MSデータは、到着時間とm /z 次元(図6A)を使用してMZmine 2.51でデコンボリューションされ、フラグメントの移動度情報のみを含むIMS/IMSスペクトルが得られました。0.2%の相対強度を超えるピークをCCS較正のためにエクスポートした(詳細なMZmineパラメータは 補足表S1に示されている)。CCS較正を較正溶液を用いて行った(R2 =0.995、対照の平均絶対偏差=1.63%、 補足表S3参照)。この処理により、最終的に重心付きCCS較正済みのIMS/IMSスペクトルが得られました(図6B)。

Figure 1
図 1: IMS/IMS データ生成プロセスの概要略語: IMS = イオン移動度分光法;IMS/IMS = タンデム IMS。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:XA3XX+XA2XXアラビノキシラン五糖混合物の同位体パターン。(B)5%のイオン透過(すなわち、95%の減衰)を有するDREを用いて補正された信号;(C)四重極選択後のプロファイルは、リチウム同位体に対応する−1Daピークを除去する。紫色:彩度によってアーチファクトピークが現れる可能性がある領域を6倍に拡大します。略語: DRE = ダイナミックレンジの強化;MS = 質量分析;MSMS = タンデム MS;LM Res = 低質量分解能;HM Res = 高質量分解能。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図 3: ユーザーが IMS/IMS シーケンスを定義するサイクリック IMS 制御ウィンドウの概要。表示されるシーケンスは、3 回のパス後に XA2XX を選択して、IMS/IMS での分離の品質を検査する方法を示しています (表示されるスペクトルは、第 1 段階の分離後の選択イベントの設定に対応します)。このシーケンスは、最初の3パスIMS分離を58msにわたって実行し、次にIMSセルから2つのより速いアイソフォーム(セグメント3)を排出し、より遅いアイソフォーム(92〜96msの間のATD)をプリア(セグメント4)で排出し、活性化せずにIMSセルに再注入し(セグメント6)、イオンがさらに3パス(58ms)分離を受けることを可能にする(セグメント7)、 次に、IMS セルからイオンを排出し、データを集録します (セグメント 8)。略語: IMS = イオン移動度分光法;cIMS = サイクリック IMS;IMS/IMS = タンデム IMS;ADC = アナログ-デジタルコンバータ;TW = 進行波;PE = 位置エネルギー;ATD = 到着時刻の分布。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図 4: XA2XX と XA3XX の混合物からの XA2XX の選択。 (a)アラビノキシラン五糖、XA3XXおよびXA2XXの分離は、環状IMS細胞の周囲で3パス後(58msに設定された分離時間に相当)。(B)IMS分離の第1段階の直後に噴出されたフラクション。(C) IMS/IMS 用に選択された画分で、再注入後に別の 3 パス分離が行われたもの。対象となる XA2XX ピークがグレーで強調表示されます。イオン移動度スペクトルはデータビンに表示され、到着時間(ms)で注釈が付けられます。略語: IMS = イオン移動度分光法;IMS/IMS = タンデム IMS。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:プリアレイ格納領域を使用した衝突誘発解離の原理。(A) IMS/IMS 実験中の選択、再注入、およびアクティブ化に使用される主要な電圧 (赤色) を詳述した多機能アレイ領域の回路図。青い矢印は、多機能アレイ内の進行波の方向を示しています。(B, C)組み込みの復元活動化関数 (+150 V) を使用して XA2XX について取得した IMS/IMS および MS/MS スペクトル。カラーバーはイオン強度スケール(青=低、赤=高)を表します。(D、E)電圧を手動で最適化してXA2XXについて得られたIMS/IMSおよびMS/MSスペクトル(プリアレイ勾配195V、プリアレイバイアス180V、アレイオフセット-10V)。前駆体イオンはスペクトル上のアスタリスクで示される。イオン移動度スペクトルはデータビンに表示され、到着時間(ms)で注釈が付けられます。略語: IMS = イオン移動度分光法;IMS/IMS = タンデム IMS;TOF = 飛行時間。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 6
図 6: 処理ステップの説明図。 (A)MZmineピークピッキング及び(B)アラビノキシラン五糖XA2XXのCCS較正の結果。 A は、IMS/IMS スペクトルの質量デコンボリューションをカラーコードで示しています。 B は、重心および CCS キャリブレーション後の最終的な IMS/IMS スペクトルを示しています。略語: IMS = イオン移動度分光法;IMS/IMS = タンデム IMS;CCS = 衝突断面。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 7
図7:XA2XXの2つのIMS/IMSスペクトルの比較は、この方法の再現性を示しています。 この論文(上)の最終的な較正スペクトルは、Ollivierらの研究からのスペクトルと比較される。21 (下、反転)。略語: IMS = イオン移動度分光法;IMS/IMS = タンデム IMS;CCS = 衝突断面。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足図 S1: XA2XX および XA3XX アラビノキシラン 5 糖の構造。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図S2:XA2XXを用いた日中再現性の評価。IMS/IMS の取得は、1 日目 (上) と 95 日目 (下) に繰り返されました。略語: IMS = イオン移動度分光法;IMS/IMS = タンデム IMS。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表S1:詳細なMZmineパラメータ。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表S2:再現性を評価するために変更された機器パラメータ。 略語: ESI = エレクトロスプレーイオン化。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表S3:較正溶液の第2の取得を用いたCCS較正の制御。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

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Discussion

SELECT SERIES サイクリックIMSは、上流のクロマトグラフィー分離を必要とせずに、所定の m/z とイオン移動度の定義済みイオン集団を選択できる強力なツールです。この装置は、このイオン集団の二次元フラグメンテーションマップを生成する可能性を提供し、そこからMS/MSスペクトルとIMS/IMSスペクトルの両方を抽出することができます。ただし、ユーザーは、実験プロセス中に注意を必要とするいくつかの重要な点に注意する必要があります。

まず、MS分離ウィンドウで等圧汚染物質の存在を慎重に確認する必要があります。実際、四重極の分離ウィンドウは比較的広く、四重極で共選択できるわずかに異なる m / z のイオンを知ることは、ユーザーがイオン移動度に関心のあるピークを適切に割り当てるのに役立ちます。

第2に、最初の分離を行うとき、ユーザは、すべてのイオンが環状イオン移動度セルの周囲で同じ回数の通過を受けるようにしなければならない。これは、環状装置におけるイオン移動度分離の重要かつトリッキーな側面である。所与のイオンのパス数の誤った評価は、ピークの不適切な同定および解釈につながる可能性がある。異なるイオン集団のパス数を制御することは、シングルパスの長さが比較的短い(〜1m)ため難しい場合があり、移動度が非常に異なる種はすぐに重複する可能性があります。

特に、このイオン集団が通過したときにアレイが方向を切り替えると、ピークが2つの異なるパス間で分割される可能性があります(これは比較的簡単に識別できます:分割ピークは 、Eject and Acquire イベントの開始時に母集団でよりシャープに見えます)。パス数を適切に設定するには、ユーザーは短い分離時間 (1 ~ 5 ミリ秒) から開始して、1 パス プロファイルを取得する必要があります。次に、ユーザーは、母集団全体がより高い到着時間に移動するまで分離時間を徐々に増やす必要があり、これにより2パスプロファイルが得られます。2 パス プロファイルは 1 パス プロファイルに似ていますが、ピークの分解能は高くなります。所与のイオン集団が環状セルの周りを1回通過するのに要する時間は、ユーザが分離時間の関数としてパスの数を計算するために使用できる定数である。たとえば、1 番目と 2 番目のパスの間に 10 ミリ秒の差がある場合、2 番目と 3 番目のパスの間にも 10 ミリ秒の差があります。

第 3 に、IMS の選択段階では、図 4 に示すように、ユーザーは分離の品質を慎重にチェックする必要があります。TW の高さと速度の設定が低すぎると、他の母集団の排出が完了しない可能性があるため、再注入プロファイルを確認することは特に重要です。上級ユーザーは、[チューニング] ページの [RF] タブで [ドリフトセル RF] 無線周波電圧を調整することで、これを修正できます。

第四に、フラグメンテーションスペクトルを生成する際、特に電圧を手動で調整する場合は、適切な衝突エネルギーを選択する際に注意する必要があります。実際、 アレイオフセット 電圧を過度に下げると、再注入が妨げられて全体的なイオン強度に悪影響を及ぼす可能性があります。さらに、前駆体および断片は、広範囲の可動性にまたがる可能性がある。したがって、最終的な分離時間が長い場合、それらは急速に異なる数のパスを受けるため、プロトコルステップ2.3.3で説明したように1ミリ秒 のSeparate イベントを保持することが重要です。これは、シングルパス長が比較的短く、オリゴ糖27のシングルパス分解能を〜100に制限しているため、大きな制限です。この点で、1回のパスでパス長を長くすると有益です(つまり、パス長が13 m28のTWIMSベースのロスレスイオン操作用構造またはSLIM)。SLIMセットアップはごく最近商業的に発売されました29。

最後に、ユーザーは、特に荷電イオンの乗算作業を行う場合、 Push per bin コマンドを使用して最終的な集録モビリティ範囲を定義する際に注意する必要があります。イオン移動度は確かに電荷の関数12であり、例えば、二重に荷電した前駆体から生成された単電荷断片は、前駆体よりも遅くなる可能性が高い(ただし、それらはより小さい化合物である)。

前駆体を選択するためにMS分離とIMS分離のみを使用することの主な制限は(例えば、クロマトグラフィーの上流ステップではない)、所与のm/zがIMSに複数のピークを生じさせ、複数のピークが同じ化合物から来る可能性があることである。これは、図 4A の XA2XX+XA3XX 混合物と純粋な XA3XX の両方に対する m/z 685.2 の分布によって示されています。単一のm/zのマルチモーダルIMS分布は、異なる気相立体配座から生じる。陽イオン付加体として分析された種の場合(正のモード)、異なる立体構造は、おそらく対イオン30、31、32との配位の違いから生じる。

オリゴ糖の場合、それらはまた、還元末端アノマーの分離から生じる可能性があるが、還元末端アノマーを分離することは、典型的には、ここで使用されているものよりも高いIMS分解能を必要とする33、34、35。この場合、図 4A のマルチモーダル IMS 分布は、XA2XX および XA3XX の個々の寄与から部分的に生じます。しかし、XA3XXが2つのピークを生じることは注目に値し、これはカチオン配位適合者である可能性が高い。純粋なXA3XXは市販されており、その移動度プロファイルを別々に記録できるため、どのピークがXA2XXに対応するか(すなわち、目的の種)を特定するのは容易であった。生物学的媒体などの複雑な混合物で作業するには、クロマトグラフィー分離ステージの追加を検討することが重要かもしれません。

大量にデコンボリューションされたIMS/IMSスペクトルを取得するために使用される処理ワークフローに関して、2つの点に注意する必要があります。まず、このプロトコルでは、MZmine 224 を使用して MS 次元を使用して IMS/IMS スペクトルをデコンボリューションし、特に ADAP アルゴリズム 36 を使用して EIM を異なるピークに分割することが提案されています。図6に示すように、かなり良い結果が得られますが、ADAPアルゴリズムはクロマトグラフィー分析用に設計されているため、ピークテーリングなどの液相クロマトグラフィーに固有の非対称因子を考慮しています。したがって、ADAPアルゴリズムは、IMSピーク(例えば、肩)に適用されたときに、いくつかの特徴を識別しない結果となり得る。本質的に、IMSデータはクロマトグラフィーデータよりも単純であり、化合物とカラムとの化学的相互作用がないため、適切な条件下で(すなわち、IMS細胞を飽和させることなく)取得されたIMSデータは、ガウス分布に従うことが期待される37,38。理想的には、ADAPデコンボリューション・ステップは、CUISuite 239のようなIMS向けのソフトウェアで使用されるようなガウス・フィッティング関数に置き換えるのが最善です。しかし、現状では、ガウスデコンボリューションは、このプロトコルに記載されている治療の完全な連鎖に直接適合していませんでした。したがって、無料のオープンソースソフトウェアMZmineを使用することは、エンドユーザーにとって良い妥協点であるように見えました。

議論に値する処理の2番目の部分は、CCSキャリブレーションです。このプロトコルは、対数フィット校正25,26と、分光計と同じプロバイダからの市販のキャリブラント混合物を使用することを提案しています(材料表を参照)。この手順は、ラボで実装するのが最も簡単です。キャリブラント混合物の選択に関して、ユーザーは、いくつかの研究で述べたように、分析物と同じ分子クラスおよび電荷状態のキャリブラントを使用する場合、CCS較正の精度が向上することを考慮する必要があります26,40,41。比較的類似したタイプの化合物(例えば、炭水化物対ペプチド)を用いて較正するときに生じる誤差は中程度である。ただし、炭水化物を測定する際には、例えば塩クラスターを口径物質として使用するなど、非常に異なるイオンを使用しないことをお勧めします41。較正方法の選択に関して、Richardsonらは最近、較正の精度を向上させるためにTWIMSの物理学を考慮に入れた新しい較正方法を(提供されたソフトウェアを用いて)報告した。しかし、このアプローチでは、代謝産物から天然タンパク質まで、さまざまな種類の化合物の分析を通じて、高度に特異的なパラメータを評価する必要があります。このような種々の化合物の混合物は商業的に見出すことができないので、この方法は本プロトコールでは実施されなかった。

最後に、本方法の再現性を評価するために、1日目と95日目にIMS/IMS-MS取得を繰り返して日中の再現性を評価した(補足図S2)。この実験では、IMS/IMS-MSデータは再現性が高く、この長期間にわたってIMSピークが0.2ms以上ずれることはないことが示されました。この研究で生成されたIMS/IMSスペクトルは、イオン移動度-分子ネットワークに関する以前の研究21のために異なる条件下で取得されたXA2XXの別のスペクトルとさらに比較された21。イオン構造およびイオン移動度プロファイル13 に影響を与え得るいくつかの器械パラメータは、意図的に変更された−ソースパラメータおよび活性化電圧勾配(様々な器械的条件の比較は 、補足表S2に与えられる)。次に、GNPSプラットフォーム5 (一致するフラグメントに対するCCS耐性= 0.015nm2)上で、メタボロミクスにおけるMS/MSスペクトルの比較に一般的なコサイン類似性スコアを使用して、2つのスペクトルを比較しました。

比較の結果、コサイン類似性スコアは0.87(図7)であり、これは適用される重要な器械的変動に関して高いと考えることができる。これは、IMS/IMSスペクトルライブラリを使用して、MS/MSスペクトルでは当てはまらないような、高いレベルの信頼性で複雑な混合物中のグリカンを複製することができるという考えにつながります。現在のアプローチではフラグメンテーションスペクトルの CCS 次元のみが使用されますが、IMS/IMS-MS データには MS 情報も含まれており、CCS と重複していないことに注意してください。IMS/IMS の非複製能力を最適化するには、2 次元スコアリング・システムを開発する必要があります。

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Disclosures

著者らは、開示する利益相反はありません。

Acknowledgments

S.O.は、博士号(助成金ANR-18-CE29-0006)に資金を提供してくれたフランス国立研究庁に感謝しています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
33-α-L- plus 23-α-L-Arabinofuranosyl-xylotetraose (XA3XX/XA2XX) mixture Megazyme Ltd., Wicklow, Ireland O-XAXXMIX XA2XX + XA3XX mixture
33-α-L-Arabinofuranosyl-xylotetraose (XA3XX) Megazyme Ltd., Wicklow, Ireland O-XA3XX Pure XA3XX standard
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, Eppendorf Quality, colorless, 1,000 tubes Eppendorf, Hamburg, Germany 0030120086 Used to prepare the carbohydrate stock solution and dilution
FALCON 50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm Corning Science México S.A. de C.V., Reynosa, Tamaulipas, Mexico 352070 Used to prepare the aqueous stock solution of 100 mM LiCl
Lithium Chloride (ACS reagent, ≥99 %) Sigma-Aldrich Inc., Saint Quentin Fallavier, France 310468 Used to dope the sample with lithium
Major Mix IMS/Tof Calibration Kit Waters Corp., Wilmslow, UK 186008113 Calibration solution for MS and IMS
MassLynx 4.2 SCN1016 Release 6 (Waters Embedded Analyser Platform for Cyclic IMS 2.9.1 Release 9) Waters Corp., Wilmslow, UK 721022377 Cyclic IMS vendor software for instrument control and data processing
Methanol for HPLC PLUS Gradient grade Carlo-Erba Reagents, Val de Reuil, France 412383 High-purity solvent
MS Leucine Enkephaline Kit Waters Corp., Wilmslow, UK 700002456 Reference compound used for tuning of the mass spectrometer
SCHOTT DURAN 100 mL borosilicate glass bottle VWR INTERNATIONAL, Radnor, Pennsylvania, US 218012458 Used to prepare the solution of 500 µM LiCl in 50:50 MeOH/Water
SELECT SERIES Cyclic IMS Waters Corp., Wilmslow, UK 186009432 Ion mobility-mass spectrometer equipped with a cylic IMS cell
Website: http://mzmine.github.io/ MZmine Development Team - Link to download the MZmine software
Website: https://github.com/siollivier/IM-MN INRAE, UR BIA, BIBS Facility, Nantes, France - Link to an in-house R script containing a CCS calibration function

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References

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化学 第179号
タンデムイオン移動度実験のための周期的イオン移動度分光計の使用
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Ollivier, S., Fanuel, M., Rogniaux,… More

Ollivier, S., Fanuel, M., Rogniaux, H., Ropartz, D. Using a Cyclic Ion Mobility Spectrometer for Tandem Ion Mobility Experiments. J. Vis. Exp. (179), e63451, doi:10.3791/63451 (2022).

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