Summary
지열 온천에서 중금속 내성 미생물을 분리하는 것은 생물 정화 및 환경 모니터링 바이오 시스템 개발을위한 뜨거운 주제입니다. 이 연구는 온천에서 중금속 내성 박테리아를 분리하고 식별하기위한 방법 론적 접근법을 제공합니다.
Abstract
지열 온천은 깊은 대수층에서 일어나는 암석과 물 사이의 상호 작용으로 인해 다양한 금속 이온이 풍부합니다. 더욱이, pH와 온도의 계절성 변화로 인해, 원소 조성의 변동은 이러한 극한 환경 내에서 주기적으로 관찰되어 환경 미생물 군집에 영향을 미친다. 화산 열 통풍구에서 번성하는 극단 성 미생물은 환경에 존재하는 여러 금속 이온을 처리하기위한 저항 메커니즘을 개발하여 복잡한 금속 생화학 적 사이클에 참여합니다. 또한, 극단 동물과 그 제품은 시장에서 광범위한 발판을 마련했으며, 이는 특히 효소에 해당됩니다. 이러한 맥락에서, 그들의 특성화는 환경 모니터링 및 생물 개선을위한 바이오 시스템 및 바이오 프로세스의 개발에 기능적입니다. 현재까지, 극단성 미생물의 실험실 조건에서의 분리 및 재배는 여전히 그들의 생명 공학 잠재력을 완전히 활용하기위한 병목 현상을 나타냅니다. 이 연구는 온천에서 고온성 미생물을 분리하고 다음 단계를 통해 유전 형 및 표현형을 식별하기위한 간소화 된 프로토콜을 설명합니다 : (1) 지열 사이트 ( "Pisciarelli", 이탈리아 나폴리의 Campi Flegrei의 화산 지역)에서 미생물 샘플링; (2) 중금속 내성 미생물의 분리; (3) 미생물 분리물의 확인; (4) 단리물의 표현형 특성화. 이 연구에서 설명 된 방법론은 일반적으로 다른 극한 환경으로부터 미생물을 격리하는 데에도 적용될 수 있습니다.
Introduction
지구상의 극한 환경은 가혹한 조건 (즉, 온도, pH, 염분, 압력 및 중금속)1,2을 견딜 수있는 미생물의 훌륭한 원천이며, 아이슬란드, 이탈리아, 미국, 뉴질랜드, 일본, 중앙 아프리카 및 인도, 가장 잘 인정되고 연구 된 화산 지역 3,4,5,6,7,8,9 . 열병은 45°C에서 80°C까지의 온도 범위에서 열악한 환경에서 진화해 왔습니다10,11,12. 고세균 또는 박테리아 왕국에 속하는 고온성 미생물은 생물 다양성, 계통 발생 및 산업 응용을위한 독점적 인 생체 분자 생산 연구를위한 저수지입니다 13,14,15,16. 실제로, 지난 수십 년 동안, 세계 시장에서의 지속적인 산업 수요는 여러 생명 공학 분야 17,18,19에서 다양한 응용 분야를 위해 극단 성애자 및 열접합체의 착취를 장려했습니다.
유기체가 컨소시엄에 살고있는 온천은 생물 다양성의 풍부한 원천이므로 미생물 생태학20,21을 연구하는 매력적인 서식지를 나타냅니다. 더욱이, 이러한 화산 금속이 풍부한 지역은 일반적으로 중금속(22,23)의 존재에 생존하고 적응하기 위해 관용 시스템을 진화시킨 미생물에 의해 식민지화되어 생지화학적 순환에 적극적으로 관여한다. 요즘 중금속은 인간과 환경에 우선 오염 물질로 간주됩니다. 중금속 내성 미생물은 금속을 변형시키고 생태계를 리모델링함으로써 금속을 가용화하고 침전시킬 수 있습니다24,25. 중금속 저항의 분자 메커니즘에 대한 이해는 새로운 녹색 접근법26,27,28을 개발하는 것이 시급한 주제입니다. 이러한 맥락에서, 새로운 내성 박테리아의 발견은 환경 생물 개선을위한 새로운 전략을 개발하기위한 출발점을 나타냅니다24,29. 미생물 실험을 통해 수열 환경을 탐구하고 중금속 내성을 뒷받침하는 유전자의 역할에 대한 지식을 높이려는 노력과 함께 이탈리아의 캄피 플레 그리 (Campi Flegrei)의 온천 지역에서 미생물 스크리닝이 수행되었습니다. 이러한 중금속이 풍부한 환경은 강력한 수열 활동, 푸마롤 및 끓는 풀을 나타내며, 계절성, 강우량 및 지하 지질 운동에 의존하여 pH 및 온도가 가변적입니다30. 이러한 관점에서, 우리는 중금속에 내성을 가진 박테리아를 분리하는 적용하기 쉽고 효과적인 방법, 예를 들어 Geobacillus stearothermophilus GF1631 (분리 1로 명명) 및 Alicyclobacillus mali FL1832 (분리 2로 명명)를 Campi Flegrei의 Pisciarelli 영역에서 설명합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 지열 부위의 미생물 샘플링
- 원하는 온도와 pH를 가진 기준 장소로 사용하여 샘플링 할 부위를 선택하십시오. 디지털 써모커플 프로브를 통해 물리적 파라미터를 측정하여 선택한 풀이나 진흙에 삽입합니다.
- 토양 샘플 20g (이 경우 Pisciarelli Solfatara의 수열 부위의 진흙에서)을 수집하여 멸균 된 숟가락으로 채취하십시오. 선택한 각 사이트에 대해 적어도 두 개의 샘플을 채취하십시오.
- 샘플을 50 mL 멸균 폴리프로필렌 튜브에 넣고 즉시 닫는다.
- 디지털 열전대 프로브를 샘플링 사이트에 직접 삽입하여 pH와 온도를 측정합니다. 사용 후 프로브를 탈이온수로 조심스럽게 헹구십시오.
2. 중금속 내성 미생물의 분리
참고: 멸균된 생물학적 후드 아래에서 2.1-2.7단계를 수행하십시오.
- 각 채취한 시료 2 g을 갓 제조된 루리아-베르타니 배지(LB) 50 mL에 접종하고, 여기서 pH는 HCl 또는 NaOH의 첨가를 통해 4 또는 7로 조정하였다.
- 샘플을 샘플링 부위의 동일한 온도와 ±5°C(피시아렐리 샘플의 경우 55°C 및 60°C)에서 180rpm의 진탕 속도로 24시간 동안 온도 조절된 오비탈 진탕기에서 인큐베이션한다.
- 성장된 샘플 200 μL를 LB 한천 (pH 4 또는 pH 7) 상에서 플레이트하고, 55°C 또는 60°C에서 48시간 동안 정적 조건에서 인큐베이션한다.
- 단일 콜로니를 분리하고 줄무늬 도금 사이클(단계 2.3 및 2.4)을 적어도 세 번 반복한다.
- -80°C 냉동 세포 스톡을 제조하기 위해, 배양물을 밤새 성장시키고(ON) 성장된 세포에 20% 글리세롤을 첨가한다(최종 부피 1 mL에서); 빠른 동결을 위해 아세톤과 드라이 아이스의 혼합물을 사용하십시오.
- 글리세롤 스톡으로부터 접종물을 제조하기 위해, 50 mL의 LB (pH 4 또는 pH 6)에 50 μL를 접종하고, 180 rpm ON에서 오비탈 진탕기에서 55°C 또는 60°C에서 인큐베이션한다.
- 성장 프로파일을 얻기 위해, 예비배양물(단계 2.6으로부터 수득됨)을 10 mL의 LB(pH 4 또는 pH 6)에0.1 OD600 nm로 희석하고, 세포를 오비탈 진탕기에서 16시간 동안 55°C 또는 60°C에서 성장시키고, 30분 간격으로OD600 nm 를 측정하였다.
- 단계 2.7에서 수득된 데이터로부터 성장 곡선을 X축 상에서 시간(min)으로 구성하고,OD600 nm 를 Y축에 작제한다.
- 단계 2.7 및 2.8에 기술된 동일한 성장 곡선을 실현하되 배양 배지의 pH(± 1 unit)를 변화시키지만(예를 들어, pH 4에서 성장한 샘플의 경우 pH 3 및 5) 실험실 조건에 대한 최적의 pH를 결정한다.
3. 미생물 분리물의 확인
- 게놈 DNA의 제조
- 글리세롤 스톡으로부터 줄무늬가 있는 단리물을 50 mL의 LB 배지 (pH 4 또는 pH 6)에 접종하고 180 rpm ON에서 55°C 또는 60°C에서 오비탈 진탕기에서 성장시킨다.
- ON 배양물을 5000 x g에서 10분 동안 원심분리하여 수확 한다. 상층액을 버리십시오.
- 사용 직전에 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 2 mM EDTA, 1.2% 트리톤 X-100 및 라이소자임(20 mg/mL)으로 구성된 박테리아 용해 완충액 10 mL를 준비하십시오.
- 펠렛을 180 μL의 박테리아 용해 완충액에 재현탁시킨다. 37°C에서 30분 동안 인큐베이션한다.
- 게놈 DNA 정제 키트 (표 물질)에 표시된 지침에 따라 게놈 DNA를 추출하십시오.
- UV-Vis 측정에 의해 추출된 게놈 DNA 및 이의 순도를 정량화한다. 순도의 경우 비율 - OD 260 / 280 nm 및 OD 260 / 230 nm를 결정하십시오.
- 각 샘플의 200 ng을 0.8% 아가로스 겔에 로딩하고 크기 분포를 고중량 분자 마커와 비교함으로써 게놈 DNA의 완전성을 평가한다.
- 의뢰하여 16S rRNA 단편 준비, 시퀀싱 및 얻어진 서열의 비교 분석(1000 bp)을 미국 국립 생명공학정보센터(NCBI)33의 뉴클레오타이드 데이터베이스에 존재하는 것들과 비교한다.
- 16S rRNA 시퀀싱의 데이터를 확증하기 위해, 소화된 염색체 DNA에 대해 자동화된 리보타이핑을 수행한다(외부 서비스, Table of Materials).
- 리보타이핑 데이터로만 스펙 식별을 결정할 수 없는 경우, 지방산 식별을 위해 MALDI-TOF MS 분석을 의뢰합니다.
- 동정된 속의 계통발생학적 분석을 수행하기 위해, 단리물의 16S rRNA 서열을 BLASTn34로 분석한다. 99%에서 97%까지의 동일성을 가진 서열은 CLUSTAL 오메가35를 사용하여 다중 서열 정렬을 구축하는 데 사용해야 합니다. ClustalW2(Simple Phylogeny)의 기본 옵션을 사용하여 인접 조인 트리를 구성합니다.
4. 중금속 및 항생제 감수성
- 글리세롤 스톡으로부터 단리된 생성물을 접종하고(단계 2.5 참조) 이를 이전에 결정된 최적의 pH 및 온도 조건 하에서 LB 200 mL에서 성장시킨다.
- 각 예비배양물을 0.1OD600 nm 에서 증가된 농도의 중금속을 함유하는 LB 배지 5 mL (적절한 pH에서)에 희석한다. 농도는 중금속 [As(V), As(III), Cd(II), Co(III), Cr(VI), Cu(II), Hg(II), Ni(II), V(V)] 또는 항생제[암피실린, 바시트라신, 클로람페니콜, 시프로플록사신, 에리스로마이신, 카나마이신, 스트렙토마이신, 테트라사이클린 및 반코마이신]의 경우 0.5-1 mg/mL로 다양하다.
- 중금속과 항생제 치료를 별도로 수행하십시오. 50 mL 폴리프로필렌 튜브를 사용하여 각 조건/처리에 대해 16시간 동안 55°C 또는 60°C에서 180rpm의 진탕 속도로 온도 조절 오비탈 진탕기에서 세포를 성장시킵니다.
- 미생물 성장이 일어나지 않는 튜브의 농도 값, 즉 16 시간 후에 세포 성장을 완전히 억제하는 값을 결정하여 항생제 또는 중금속에 대한 최소 억제 농도 (MIC)를 계산하십시오.
- LB-agar 플레이트 상에 MIC로 간주되는 값에서 성장한 배양물 200 μL를 (적절한 pH 및 온도에서) 플레이팅하여 세포에 대한 농도가 억제되고 치명적이지 않은지 확인하고 ON 배양 후 콜로니의 존재를 검증하였다.
주: LB 한천 플레이트 상에서의 배양은 단지 몇 주 동안 4°C에서 생존가능하기 때문에, 단리물을 더 긴 시간 동안 보존하기 위해, 글리세롤 스톡을 제조하고 -80°C에서 저장하였다. MIC 결정을 위해, 독립적인 배양물을 사용하여 적어도 세 개의 독립적인 반복실험이 수행되었다. 표준 편차는 삼중 실험들 사이에서 계산되었다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
샘플링 사이트
이 프로토콜은 온천으로부터 중금속 내성 박테리아를 분리하는 방법을 예시한다. 이 연구에서, 산-황화 지열 환경인 피시아렐리 지역을 샘플링 부위로 사용하였다(도 1). 이 생태계는 화산 활동에서 파생 된 공격적인 유황 유체의 흐름을 특징으로합니다. 산 황화 지열 시스템의 미생물 군집이 고농도의 중금속의 존재에 의해 만들어진 극단적 인 선택적 압력을 받는다는 것이 입증되었습니다. 샘플은 버블링 진흙 풀에 대하여 한계가 있는진흙 풀 2,21개로부터 연중 두 개의 상이한 기간(4월과 9월)에 수집되었다. 진흙 풀에서는 pH 값의 변동 (4 월의 ~ pH 6 및 9 월의 ~ pH 5)이 등록되었지만 온도는 두 경우 모두 ~ 55 °C였습니다. 그러나, 더 높은 온도는 또한 다른 년32에서 진흙 웅덩이 (~ 70 °C)에서 기록되었다.
격리 및 식별
수집된 샘플을 LB 배지에 접종하고 이전에 보고된 바와 같이 55°C 및 60°C에서 24시간 동안 인큐베이션하였고, 따라서 세포 샘플의 성장을 위한 실험실 조건을 환경 화학적-물리적 조건을 모방하도록 설정하였다. 세포 성장을 선호하기 위해, 단일 콜로니를 플레이트 상에 줄무늬로 묶고, 풍부한 액체 배지에서 여러 희석 (적어도 3) 후에 단리하였다; 분리된 균주는 55°C 및 60°C에서 그들의 최적 성장 온도를 나타내었다 (도 2). 새로운 단리물을 확인하기 위해, 게놈 DNA 제제를 수행하였고, 16S rRNA 시퀀싱 및 지방산 질량 분광분석이 외부 서비스로서 달성되었다. 보고된 바와 같이, 지방산의 분석은 다른 접근법(36)과 조합될 때 박테리아의 정확한 식별에 도움을 주는 강력한 생체분석 방법이다. 16S rRNA의 다중 정렬은 가장 가까운 친척(37)을 확인하기 위해 계통수를 구축하는데 사용되었다.
중금속 감수성 시험
독성 분자의 공존은 solfataric 환경을 특징으로합니다. 특히, Pisciarelli의 온천은 As, Hg, Fe, Be, Ni, Co, Cu30,38과 공존하는 높은 수준의CO2, H2S,NH4를 특징으로합니다. 이러한 이유로, 분리된 미생물의 표현형 특성화는 표 1에 보고된 바와 같이 중금속의 농도가 증가하는 존재 하에 수행되었다. 흥미롭게도, 분리 1은 As(V) 및 V(V)에 대해 더 높은 내성을 나타냈다. 비소와 바나데이트에 대한 높은 내성은 화학 구조 때문일 수 있습니다. 사실, 두 이온 모두 인산염 이온과 유사하며, 이는 V(V)와 As(V)가 인산염 수송 시스템을 통해 세포에 의해 흡수될 수 있음을 시사한다. 이러한 분리 물은 MIC 값이 상대적으로 낮지 만 Cd (II)에도 내성이있는 것으로 나타났습니다. 이 결과는 풀에 Cd(II)가 없기 때문에 설명할 수 있습니다. 두 미생물이 동일한 부위에서 샘플링되었지만, 그들은 서로 다른 중금속 내성 프로파일을 보였다. 그러나, 이들은 상이한 기간에 샘플링되었고, 따라서 미생물 군집의 조성을 형성하는 주요 원동력으로서 중금속 농도의 계절 의존적 변화와 중금속에 대한 그들의 차별적 내성(39)을 가리킨다. 이 비교 데이터로부터, 분리 1은 As(V)에 대해 강한 저항력을 갖는 반면, As(III)에 대해서는 2를 분리하는 것으로 나타났다. 분자 저항 메커니즘을 풀고 표현형이 온천의 선택적 압력에 의해 어떻게 영향을 받는지 더 잘 이해하기 위해서는 더 많은 유전 적 조사가 필요합니다.
항생제 내성 테스트
극한 환경에서 진화 된 미생물 균주는 일반적으로 다른 항생제에 대한 내성을 나타냅니다. 중금속 내성과 항생제 사이의 상관관계는 잘 알려져 있다40. 이러한 이유로, 우리는 두 단리물 모두에 대해 항생제에 대한 내성을 시험하였다 (표 2). 분리 물 1은 낮은 농도가 사용 된 경우에도 테스트 된 모든 항생제에 대해 높은 감도를 나타 냈습니다. 대조적으로, 분리 2는 클로람페니콜과 테트라 사이클린을 제외하고 테스트 된 모든 항생제에 내성이 있습니다. 흥미롭게도, 암피실린, 에리스로마이신, 카나마이신, 스트렙토마이신 및 반코마이신에 대한 결정된 MIC 값은 다른 항생제 내성 박테리아의 수치와 비슷했으며 바시트라신 및 시프로플록사신41에 대해서는 훨씬 더 높았다. 이러한 매혹적인 데이터는 추가 조사가 필요합니다. 아마도, 무작위 돌연변이 또는 수평 유전자 전달로 인해, 미생물은 항생제 내성을 획득했으며, 이는 그러한 극한 환경 조건에서 선택적 이점을 나타낼 수 있습니다.
그림 1. 샘플링 사이트 : Pisciarelli, Campi Flegrei (나폴리, 이탈리아)의 solfataric 지역. 샘플링 사이트는 Pisciarelli fumarole의 지열 영역에서 40 ° 49 '45.3 "N - 14 ° 08' 49.9 E에 위치하고 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 실험 절차의 개략적인 표현. 미생물은 온천에서 샘플링되고, 실험실에서 재배되며, 반복적 인 스트레칭 및 도금을 통해 분리되며, 16S rRNA 시퀀싱시 유전 적으로 확인됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 금속 이온 | 격리 1 | 격리 2 |
| 로 (III) | 1.9 밀리지미터 | 41 밀리지미터 |
| 로 (V) | 117 밀리지미터 | 11 밀리지미터 |
| Cd (II) | 0.9 밀리지미터 | 0.8 μM |
| 공동 (II) | 2 밀리지미터 | 3 밀리지미터 |
| 공동 (III) | 2.75 밀리지미터 | n.a. |
| Cr (VI) | 0.25 밀리지미터 | n.a. |
| Cu (II) | 4.1 밀리지미터 | 0.5 밀리지미터 |
| Hg (II) | 20 μM | 17 μM |
| Ni (II) | 1.3 밀리지미터 | 30 밀리지미터 |
| V (V) | 128 밀리지미터 | n.a |
표 1. MIC는 단리물의 중금속 이온을 향하여 값이다. MICs는 16 h 후에 세포 성장을 완전히 억제하는 최소 농도 값으로 간주된다; 값은 세 번의 실험의 평균으로 보고됩니다.
| 항생제 | 격리 1 | 격리 2 |
| 암피실린 | n.d. | 20 μg/mL |
| 바시트라신 | n.d. | 700 μg/mL |
| 클로람페니콜 | n.d. | <0.5 μg/mL |
| 시프로플록사신 | n.d. | >1 밀리그램/mL |
| 에리스로 마이신 | n.d. | 70 μg/mL |
| 카나마이신 | n.d. | 80 μg/mL |
| 스트렙토마이신 | n.d. | 70 μg/mL |
| 테트라 사이클린 | n.d. | <0.5 μg/mL |
| 반코마이신 | n.d. | 1 μg/mL |
표 2. 단리물의 항생제에 대한 MIC 값. MICs는 16 h 후에 세포 성장을 완전히 억제하는 최소 농도로 간주된다; 값은 세 번의 실험의 평균으로 보고됩니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
온천은 똑같이 다양한 대사 능력을 가진 미개척 미생물의 다양성을 함유한다12. 중금속을 덜 독성이 적은 화합물(10 )로 효율적으로 전환시킬 수 있는 미생물의 격리를 위한 전략의 개발은 전 세계적으로 관심이 높아지고 있는 연구 분야이다. 이 논문은 독성 화학 물질에 저항 할 수있는 능력을 갖춘 미생물의 선별 및 분리를위한 간소화 된 접근 방식을 설명하는 것을 목표로합니다. 기술된 방법은 물, 음식, 토양 또는 퇴적물과 같은 다양한 환경 공급원으로부터 미생물을 분리하도록 용이하게 변형될 수 있다. 그러나, 미생물 배양에 의존하는 것과 관련된 이 기술에는 몇 가지 한계가 있다. 따라서이 설정은 쉽게 배양 할 수없는 환경에서 박테리아를 분리하는 데 적합하지 않습니다. 이 문제를 극복하는 한 가지 방법은 다른 박테리아 배지 (즉, 선택적 배지 또는 사전 적응 전략)와 더 긴 배양 시간42를 사용하는 것입니다.
그럼에도 불구하고, 생물개선에 관심있는 종의 대다수는 본원에 기술된 조건 하에서 성장할 것으로 예상된다. 이 프로토콜은 화학 물질에 대한 선택적 한천 매체가 지금까지 알려지지 않았다는 점을 고려할 때 전통적인 도금 기술에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 내성 미생물을 식별하기 위해 MIC를 사용하는 것은 새로운 종이나 새로운 균주의 특성화에 이르는 길을 열어주는 개별 분리 물에 악용되는 빠른 전략입니다. 이 연구는 오염 물질을 비활성화하고 무해한 제품으로 전환함으로써 효과적인 생물 개선에 기여할 수있는 환경 미생물을 선택하는 이러한 방법의 유용성을 보여줍니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 작업은 ERA-NET Cofund MarTERA: "FLAshMoB: Functional Amyloid Chimera for Marine Biosensing", PRIN 2017-PANACEA CUP:E69E19000530001 및 GoodbyWaste: Obtain GOOD제품-익스플로잇 BY-product-reduce WASTE, MIUR 2017-JTNK78.006, Italy의 지원을 받았습니다. 지열 사이트의 식별 및 특성화에 대해 Monica Piochi 박사와 Angela Mormone 박사 (Istituto Nazionale di Geofisica e Vulcanologia, Sezione di Napoli Osservatorio Vesuviano, Italy)에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393 | |
| Aura Mini | bio air s.c.r.l. | Biological hood | |
| Bacitracin | Sigma Aldrich | B0125 | |
| Cadmium chloride | Sigma Aldrich | 202908 | |
| Chloramphenicol | Sigma Aldrich | C0378 | |
| Ciprofloxacin | Sigma Aldrich | 17850 | |
| Cobalt chloride | Sigma Aldrich | C8661 | |
| Copper chloride | Sigma Aldrich | 224332 | |
| Erythromycin | Sigma Aldrich | E5389 | |
| Exernal Service | DSMZ | Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH | |
| Genomic DNA Purification Kit | Thermo Scientific | #K0721 | |
| Kanamycin sulphate | Sigma Aldrich | 60615 | |
| MaxQTM 4000 Benchtop Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE4000 | |
| Mercury chloride | Sigma Aldrich | 215465 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| Nickel chloride | Sigma Aldrich | 654507 | |
| Orion Star A221 Portable pH Meter | Thermo Scientific | STARA2218 | |
| Sodium (meta) arsenite | Sigma Aldrich | S7400 | |
| Sodium arsenate dibasic heptahydrate | Sigma Aldrich | A6756 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S5886 | |
| Streptomycin | Sigma Aldrich | S6501 | |
| Tetracycline | Sigma Aldrich | 87128 | |
| Tryptone BioChemica | Applichem Panreac | A1553 | |
| Vancomycin | Sigma Aldrich | PHR1732 | |
| Yeast extract for molecular biology | Applichem Panreac | A3732 |
References
- Arora, N. K., Panosyan, H. Extremophiles: applications and roles in environmental sustainability. Environmental Sustainability. 2, 217-218 (2019).
- Gallo, G., Puopolo, R., Carbonaro, M., Maresca, E., Fiorentino, G. Extremophiles, a nifty tool to face environmental pollution: From exploitation of metabolism to genome engineering. International Journal of Environmental Research and Public Health. 18 (10), 5228 (2021).
- Saxena, R., et al. Metagenomic analysis of hot springs in Central India reveals hydrocarbon degrading thermophiles and pathways essential for survival in extreme environments. Frontiers in Microbiology. 7, 2123 (2017).
- Papke, R. T., Ramsing, N. B., Bateson, M. M., Ward, D. M. Geographical isolation in hot spring cyanobacteria. Environmental Microbiology. 5 (8), 650-659 (2003).
- Zitelle, L., Lan Pe, N. I. al The role of photosynthesis and CO2 evasion in travertine formation: a quantitative investigation at an important travertine-depositing hot spring. Journal of the Geological Society. 164, 843-853 (2007).
- Kubo, K., Knittel, K., Amann, R., Fukui, M., Matsuura, K. Sulfur-metabolizing bacterial populations in microbial mats of the Nakabusa hot spring. Japan. Systematic and Applied Microbiology. 34 (4), 293-302 (2011).
- Siljeström, S., Li, X., Brinckerhoff, W., van Amerom, F., Cady, S. L. ExoMars mars organic molecule analyzer (MOMA) laser desorption/ionization mass spectrometry (LDI-MS) analysis of phototrophic communities from a silica-depositing hot spring in Yellowstone national park, USA. Astrobiology. , (2021).
- Aulitto, M., Tom, L. M., Ceja-Navarro, J. A., Simmons, B. A., Singer, S. W. Whole-genome sequence of Brevibacillus borstelensis SDM, isolated from a sorghum-adapted microbial community. Microbiology Resource Announcements. 9 (48), 8-9 (2020).
- Antranikian, G., et al. Diversity of bacteria and archaea from two shallow marine hydrothermal vents from Vulcano Island. Extremophiles. 21 (4), 733-742 (2017).
- Gallo, G., Puopolo, R., Limauro, D., Bartolucci, S., Fiorentino, G. Metal-tolerant thermophiles: from the analysis of resistance mechanisms to their biotechnological exploitation. The Open Biochemistry Journal. 12 (1), 149-160 (2018).
- Aulitto, M., et al. Draft genome sequence of Bacillus coagulans MA-13, a thermophilic lactic acid producer from lignocellulose. Microbiology Resource Announcements. 8 (23), 341-360 (2019).
- Mehta, D., Satyanarayana, T. Diversity of hot environments and thermophilic microbes. Thermophilic Microbes in Environmental and Industrial Biotechnology: Biotechnology of Thermophiles. , Springer. Dordrecht. (2013).
- Fusco, S., et al. The interaction between the F55 virus-encoded transcription regulator and the RadA host recombinase reveals a common strategy in Archaea and Bacteria to sense the UV-induced damage to the host DNA. Biochimica et Biophysica Acta - Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (5), (2020).
- Puopolo, R., et al. Self-assembling thermostable chimeras as new platform for arsenic biosensing. Scientific Reports. 11 (1), (2021).
- Fiorentino, G., Contursi, P., Gallo, G., Bartolucci, S., Limauro, D. A peroxiredoxin of Thermus thermophilus HB27: Biochemical characterization of a new player in the antioxidant defence. International Journal of Biological Macromolecules. 153, 608-615 (2020).
- Fiorentino, G., Del Giudice, I., Bartolucci, S., Durante, L., Martino, L., Del Vecchio, P. Identification and physicochemical characterization of BldR2 from Sulfolobus solfataricus, a novel archaeal member of the MarR transcription factor family. Biochemistry. 50 (31), 6607-6621 (2011).
- Bhattacharya, A., Gupta, A. G. Microbial Extremozymes. Current trends in applicability of thermophiles and thermozymes in bioremediation of environmental pollutants. , Elsevier, Academic Press. 161-176 (2022).
- Aulitto, M., et al. Prebiotic properties of Bacillus coagulans MA-13: Production of galactoside hydrolyzing enzymes and characterization of the transglycosylation properties of a GH42 β-galactosidase. Microbial Cell Factories. 20 (1), 1-18 (2021).
- Ing, N., et al. A multiplexed nanostructure-initiator mass spectrometry (NIMS) assay for simultaneously detecting glycosyl hydrolase and lignin modifying enzyme activities. Scientific Reports. 11 (1), 11803 (2021).
- Saw, J. H. W. Characterizing the uncultivated microbial minority: towards understanding the roles of the rare biosphere in microbial communities. mSystems. 6 (4), 0077321 (2021).
- He, Q., et al. Temperature and microbial interactions drive the deterministic assembly processes in sediments of hot springs. Science of the Total Environment. 772, 145465 (2021).
- Shakhatreh, M. A. K., et al. Microbiological analysis, antimicrobial activity, and heavy-metals content of Jordanian Ma'in hot-springs water. Journal of Infection and Public Health. 10 (6), 789-793 (2017).
- Antonucci, I., et al. An ArsR/SmtB family member regulates arsenic resistance genes unusually arranged in Thermus thermophilus HB27. Microbial Biotechnology. 10 (6), 1690-1701 (2017).
- Ozdemir, S., Kılınç, E., Poli, A., Nicolaus, B. Biosorption of Heavy Metals (Cd 2+, Cu 2+ , Co 2+ , and Mn 2+ ) by Thermophilic Bacteria, Geobacillus thermantarcticus and Anoxybacillus amylolyticus Equilibrium and Kinetic Studies. Bioremediation Journal. 17 (2), 86-96 (2013).
- Hlihor, R. -M., Apostol, L. -C., Gavrilescu, M. Environmental bioremediation by biosorption and bioaccumulation: Principles and applications. Enhancing Cleanup of Environmental Pollutants: Volume 1: Biological Approaches. , Springer. Cham. 289-315 (2017).
- Del Giudice, I., Limauro, D., Pedone, E., Bartolucci, S., Fiorentino, G. A novel arsenate reductase from the bacterium Thermus thermophilus HB27: its role in arsenic detoxification. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics. 1834 (10), 2071-2079 (2013).
- Politi, J., Spadavecchia, J., Fiorentino, G., Antonucci, I., Casale, S., De Stefano, L. Interaction of Thermus thermophilus ArsC enzyme and gold nanoparticles naked-eye assays speciation between As(III) and As(V). Nanotechnology. 26 (43), 435703 (2015).
- Antonucci, I., et al. Characterization of a promiscuous cadmium and arsenic resistance mechanism in Thermus thermophilus HB27 and potential application of a novel bioreporter system. Microbial Cell Factories. 17 (1), (2018).
- Ilyas, S., Lee, J. C., Kim, B. S. Bioremoval of heavy metals from recycling industry electronic waste by a consortium of moderate thermophiles: Process development and optimization. Journal of Cleaner Production. 70, 194-202 (2014).
- Piochi, M., Mormone, A., Strauss, H., Balassone, G. The acid-sulfate zone and the mineral alteration styles of the Roman Puteolis (Neapolitan area, Italy): clues on fluid fracturing progression at the Campi Flegrei volcano. Solid Earth. 10 (6), 1809-1831 (2019).
- Puopolo, R., et al. Identification of a new heavy-metal-resistant strain of Geobacillus stearothermophilus isolated from a hydrothermally active volcanic area in southern Italy. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (8), 2678 (2020).
- Aulitto, M., et al. Genomic insight of Alicyclobacillus mali FL18 isolated from an Arsenic-rich hot spring. Frontiers in Microbiology. 12, 639697 (2021).
- Agarwala, R., et al. Database resources of the National Center for Biotechnology Information. Nucleic Acids Research. 46, 8-13 (2018).
- Altschul, S. F., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research. 25 (17), 3389-3402 (1997).
- Sievers, F., Higgins, D. G.
- Kliem, M., Sauer, S. The essence on mass spectrometry based microbial diagnostics. Current Opinion in Microbiology. 15 (3), 397-402 (2012).
- Madeira, F., et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).
- Piochi, M., Mormone, A., Balassone, G., Strauss, H., Troise, C., De Natale, G. Native sulfur, sulfates and sulfides from the active Campi Flegrei volcano (southern Italy): Genetic environments and degassing dynamics revealed by. Journal of Volcanology and Geothermal Research. 301, 180-193 (2015).
- Hsu, H. -C., et al. Assessment of temporal effects of a mud volcanic eruption on the bacterial community and their predicted metabolic functions in the mud volcanic sites of Niaosong, Southern Taiwan. Nicroorganisms. 9 (11), 2315 (2021).
- Ye, J., Rensing, C., Su, J., Zhu, Y. G. From chemical mixtures to antibiotic resistance. Journal of Environmental Sciences (China). 62, 138-144 (2017).
- Farias, P., et al. Natural hot spots for gain of multiple resistances: arsenic and antibiotic resistances in heterotrophic, aerobic bacteria from marine hydrothermal vent fields. Applied and Environmental Microbiology. 81 (7), 2534-2543 (2015).
- Aulitto, M., Fusco, S., Nickel, D. B., Bartolucci, S., Contursi, P., Franzén, C. J. Seed culture pre-adaptation of Bacillus coagulans MA-13 improves lactic acid production in simultaneous saccharification and fermentation. Biotechnology for Biofuels. 12 (1), 45 (2019).
