Summary
L’isolement des microbes résistants aux métaux lourds des sources géothermiques est un sujet brûlant pour le développement de biosystèmes de bioremédiation et de surveillance de l’environnement. Cette étude fournit une approche méthodologique pour isoler et identifier les bactéries tolérantes aux métaux lourds des sources chaudes.
Abstract
Les sources géothermiques sont riches en divers ions métalliques en raison de l’interaction entre la roche et l’eau qui a lieu dans l’aquifère profond. De plus, en raison de la variation saisonnière du pH et de la température, une fluctuation de la composition des éléments est périodiquement observée dans ces environnements extrêmes, influençant les communautés microbiennes environnementales. Les micro-organismes extrêmophiles qui se développent dans les cheminées thermiques volcaniques ont développé des mécanismes de résistance pour gérer plusieurs ions métalliques présents dans l’environnement, participant ainsi à des cycles biogéochimiques métalliques complexes. De plus, les extrêmophiles et leurs produits ont trouvé un ancrage important sur le marché, et cela est vrai en particulier pour leurs enzymes. Dans ce contexte, leur caractérisation est fonctionnelle au développement de biosystèmes et de bioprocédés pour la surveillance de l’environnement et la bioremédiation. À ce jour, l’isolement et la culture en laboratoire de micro-organismes extrêmophiles représentent encore un goulot d’étranglement pour exploiter pleinement leur potentiel biotechnologique. Ce travail décrit un protocole simplifié pour l’isolement des micro-organismes thermophiles des sources chaudes ainsi que leur identification génotypique et phénotypique à travers les étapes suivantes: (1) Échantillonnage de micro-organismes à partir de sites géothermiques (« Pisciarelli », une zone volcanique de Campi Flegrei à Naples, Italie); (2) Isolement des micro-organismes résistants aux métaux lourds; 3° l’identification des isolats microbiens; (4) Caractérisation phénotypique des isolats. Les méthodologies décrites dans ce travail pourraient être généralement appliquées également pour l’isolement des micro-organismes d’autres environnements extrêmes.
Introduction
Les environnements extrêmes de notre planète sont d’excellentes sources de micro-organismes capables de tolérer des conditions difficiles (température, pH, salinité, pression et métaux lourds)1,2, étant l’Islande, l’Italie, les États-Unis, la Nouvelle-Zélande, le Japon, l’Afrique centrale et l’Inde, les zones volcaniques les mieux reconnues et étudiées 3,4,5,6,7,8,9 . Les thermophiles ont évolué dans des environnements difficiles dans une gamme de températures allant de 45 °C à 80 °C 10,11,12. Les micro-organismes thermophiles, appartenant aux règnes archéal ou bactérien, sont un réservoir pour l’étude de la biodiversité, la phylogenèse et la production de biomolécules exclusives pour des applications industrielles 13,14,15,16. En effet, au cours des dernières décennies, la demande industrielle continue sur le marché mondial a encouragé l’exploitation des extrêmophiles et des thermozymes pour leurs applications diversifiées dans plusieurs domaines biotechnologiques 17,18,19.
Les sources chaudes, où les organismes vivent en consortiums, sont de riches sources de biodiversité, représentant ainsi un habitat attrayant pour étudier l’écologie microbienne20,21. De plus, ces zones riches en métaux volcaniques sont généralement colonisées par des micro-organismes qui ont développé des systèmes de tolérance pour survivre et s’adapter à la présence de métaux lourds22,23 et sont donc activement impliqués dans leurs cycles biogéochimiques. De nos jours, les métaux lourds sont considérés comme des polluants prioritaires pour l’homme et l’environnement. Les micro-organismes résistants aux métaux lourds sont capables de solubiliser et de précipiter les métaux en les transformant et en remodelant leurs écosystèmes24,25. La compréhension des mécanismes moléculaires de la résistance aux métaux lourds est un sujet brûlant pour l’urgence de développer de nouvelles approches vertes 26,27,28. Dans ce contexte, la découverte de nouvelles bactéries tolérantes représente le point de départ pour le développement de nouvelles stratégies de bioremédiation environnementale24,29. Dans le cadre des efforts visant à explorer les environnements hydrothermaux par le biais de procédures microbiologiques et à accroître les connaissances sur le rôle du ou des gènes à l’origine de la tolérance aux métaux lourds, un dépistage microbien a été effectué dans la région des sources chaudes de Campi Flegrei en Italie. Cet environnement riche en métaux lourds présente une puissante activité hydrothermale, des bassins fumaroles et bouillants, dont le pH et la température varient en fonction de la saisonnalité, des précipitations et des mouvements géologiques souterrains30. Dans cette perspective, nous décrivons un moyen facile à appliquer et efficace d’isoler les bactéries résistantes aux métaux lourds, par exemple, Geobacillus stearothermophilus GF1631 (nommé isolat 1) et Alicyclobacillus mali FL1832 (nommé isolat 2) de la région de Pisciarelli de Campi Flegrei.
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Protocol
1. Échantillonnage des micro-organismes des sites géothermiques
- Choisissez le site d’échantillonnage en utilisant comme critère des endroits avec la température et le pH souhaités. Mesurez les paramètres physiques à l’aide d’une sonde thermocouple numérique, en l’insérant dans les piscines ou les boues sélectionnées.
- Prélever 20 g d’échantillons de sol (dans ce cas, de la boue dans le site hydrothermal de Pisciarelli Solfatara), en les ramassant avec une cuillère stérilisée. Prélever au moins deux échantillons pour chaque site choisi.
- Mettez les échantillons dans des tubes de polypropylène stériles de 50 mL et fermez immédiatement.
- Mesurez le pH et la température à l’aide d’une sonde thermocouple numérique en l’insérant directement dans le site d’échantillonnage. Après utilisation, rincez soigneusement la sonde à l’eau désionisée.
2. Isolement des micro-organismes résistants aux métaux lourds
REMARQUE: Effectuez les étapes 2.1 à 2.7 sous une hotte biologique stérile.
- Inoculer 2 g de chaque échantillon prélevé dans 50 mL de milieu Luria-Bertani (LB) fraîchement préparé, dans lequel le pH a été ajusté à 4 ou 7 par addition de HCl ou de NaOH.
- Incuber les échantillons à la même température du site d’échantillonnage et à ±5 °C (55 °C et 60 °C pour les échantillons pisciarelli) dans un agitateur orbital à température contrôlée pendant 24 h avec une vitesse d’agitation de 180 tr/min.
- Plaquer 200 μL des échantillons cultivés sur gélose LB (pH 4 ou pH 7) et incuber à l’état statique pendant 48 h à 55 °C ou 60 °C.
- Isoler des colonies individuelles et répéter les cycles de stries (étapes 2.3 et 2.4) au moins trois fois.
- Pour préparer des stocks cellulaires congelés à -80 °C, faire pousser les cultures pendant la nuit (ON) et ajouter aux cellules cultivées 20 % de glycérol (dans un volume final de 1 mL); utilisez un mélange d’acétone et de glace carbonique pour une congélation rapide.
- Pour préparer un inoculum à partir d’un stock de glycérol, inoculer 50 μL dans 50 mL de LB (pH 4 ou pH 6) et incuber à 55 °C ou 60 °C dans l’agitateur orbital à 180 tr/min ON.
- Pour obtenir un profil de croissance, diluer une préculture (obtenue à partir de l’étape 2.6) à 0,1 OD600 nm dans 10 mL de LB (pH 4 ou pH 6), faire croître les cellules à 55 °C ou 60 °C pendant 16 h dans l’agitateur orbital et mesurer la DO600 nm à des intervalles de 30 min.
- Construisez une courbe de croissance à partir des données obtenues à l’étape 2.7 avec le temps (min) sur l’axe X et OD600 nm sur l’axe Y.
- Réaliser la même courbe de croissance décrite aux étapes 2.7 et 2.8, mais en faisant varier le pH (± 1 unité) du milieu de culture (p. ex., pH 3 et 5 pour les échantillons cultivés à pH 4) afin de déterminer le pH optimal pour les conditions de laboratoire.
3. Identification des isolats microbiens
- Préparation de l’ADN génomique
- Inoculer l’isolat strié du stock de glycérol dans 50 mL de milieu LB (pH 4 ou pH 6) et croître dans un agitateur orbital à 55 °C ou 60 °C à 180 tr/min ON.
- Récolter la culture ON par centrifugation pendant 10 min à 5000 x g. Jetez le surnageant.
- Préparer 10 mL de tampon de lyse bactérienne composé de : 20 mM de Tris-HCl pH 8,0, 2 mM d’EDTA, 1,2 % de Triton X-100 et de lysozyme (20 mg/mL) immédiatement avant utilisation.
- Remettre en suspension la pastille dans 180 μL de tampon de lyse bactérienne. Incuber pendant 30 min à 37 °C.
- Suivez les directives indiquées par un kit de purification de l’ADN génomique (Table des matériaux) pour extraire l’ADN génomique.
- Quantifier l’ADN génomique extrait et sa pureté par mesure UV-Vis. Pour la pureté, déterminez les rapports-OD 260/280 nm et OD 260/230 nm.
- Évaluez l’intégrité de l’ADN génomique en chargeant 200 ng de chaque échantillon sur un gel d’agarose à 0,8 % et en comparant la distribution granulométrique à un marqueur moléculaire de poids élevé.
- Confier à un service externe la préparation, le séquençage et l’analyse comparative des fragments d’ARNr 16S de la séquence obtenue (1000 pb) avec ceux présents dans la base de données sur les nucléotides du National Center for Biotechnology Information (NCBI) des États-Unis(33).
- Pour corroborer les données du séquençage de l’ARNr 16S, effectuez également un ribotypage automatisé sur l’ADN chromosomique digéré (service externe, table des matériaux).
- Dans le cas où l’identification de l’espèce ne peut pas être déterminée uniquement à l’aide de données de ribotypage, commander une analyse MALDI-TOF MS pour l’identification des acides gras.
- Pour effectuer une analyse phylogénétique du genre identifié, analysez la séquence d’ARNr 16S de l’isolat avec BLASTn34. Les séquences avec des identités de 99% à 97% doivent être utilisées pour construire un alignement de séquences multiples à l’aide de CLUSTAL Omega35. Construisez un arbre voisin à l’aide de l’option par défaut ClustalW2 (phylogénie simple).
4. Sensibilité aux métaux lourds et aux antibiotiques
- Inoculez l’isolat d’un stock de glycérol (voir étape 2.5) et cultivez-le dans 200 mL de LB dans les conditions optimales de pH et de température préalablement déterminées.
- Diluer chaque préculture à 0,1 OD600 nm dans 5 mL de milieu LB (au pH approprié) contenant des concentrations croissantes de métaux lourds. Les concentrations varient de 0,01 à 120 mM pour les métaux lourds [As(V), As(III), Cd(II), Co(III), Cr(VI), Cu(II), Hg(II), Ni(II), V(V)] ou de 0,5-1 mg/mL pour les antibiotiques [ampicilline, bacitracine, chloramphénicol, ciprofloxacine, érythromycine, kanamycine, streptomycine, tétracycline et vancomycine].
- Effectuez des traitements aux métaux lourds et aux antibiotiques séparément. Utilisez un tube en polypropylène de 50 mL et faites pousser les cellules dans un agitateur orbital à température contrôlée avec une vitesse d’agitation de 180 tr/min à 55 °C ou 60 °C pendant 16 h pour chaque condition/traitement.
- Calculer la concentration minimale inhibitrice (CMI) pour les antibiotiques ou les métaux lourds en identifiant les valeurs de concentration dans les tubes où la croissance microbienne ne se produit pas, c’est-à-dire en déterminant les valeurs qui inhibent complètement la croissance cellulaire après 16 h.
- Vérifier que la concentration est inhibitrice et non létale pour les cellules en plaquant 200 μL de la culture cultivée à la valeur considérée comme CMI sur des plaques de gélose LB (au pH et à la température appropriés) et en vérifiant la présence de colonies après incubation ON.
NOTE: Étant donné que la culture sur plaque de gélose LB n’est viable à 4 °C que pendant quelques semaines, afin de conserver les isolats plus longtemps, des stocks de glycérol ont été préparés et stockés à -80 °C. Pour la détermination de la CMI, au moins trois répétitions indépendantes utilisant des cultures indépendantes ont été effectuées. L’écart-type a été calculé parmi les expériences triples.
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Representative Results
Site d’échantillonnage
Ce protocole illustre une méthode d’isolement des bactéries résistantes aux métaux lourds d’une source chaude. Dans cette étude, la région de Pisciarelli, un environnement géothermique acido-sulfidique, a été utilisée comme site d’échantillonnage (figure 1). Cet écosystème est caractérisé par l’écoulement de fluides sulfureux agressifs dérivés des activités volcaniques. Il a été démontré que les communautés microbiennes dans les systèmes géothermiques acides-sulfidiques sont soumises à une pression sélective extrême exercée par la présence de fortes concentrations de métaux lourds. Les échantillons ont été prélevés à deux périodes différentes de l’année (avril et septembre) à partir de 2,21 un bassin de boue marginal par rapport à un bassin de boue bouillonnante. Dans le bassin de boue, des fluctuations des valeurs de pH (~pH 6 en avril et ~pH 5 en septembre) ont été enregistrées, tandis que la température était d’environ 55 °C dans les deux cas. Cependant, des températures plus élevées ont également été enregistrées dans la piscine de boue (~ 70 ° C) les autres années32.
Isolement et identification
Les échantillons prélevés ont été inoculés dans un milieu LB et incubés pendant 24 h à 55 °C et 60 °C comme indiqué précédemment, établissant ainsi les conditions de laboratoire pour la croissance des échantillons cellulaires afin d’imiter les conditions physico-chimiques de l’environnement. Pour favoriser la croissance cellulaire, des colonies uniques ont été striées sur la plaque et isolées après plusieurs dilutions (au moins 3) dans un milieu riche-liquide; les souches isolées ont montré leur température de croissance optimale à 55 °C et 60 °C (figure 2). Pour identifier les nouveaux isolats, une préparation génomique de l’ADN a été effectuée et le séquençage de l’ARNr 16S et l’analyse par spectrométrie de masse des acides gras ont été effectués en tant que service externe. Comme indiqué, l’analyse des acides gras est une méthode bioanalytique puissante qui aide à l’identification précise des bactéries lorsqu’elle est combinée avec d’autres approches36. De multiples alignements d’ARNr 16S ont été utilisés pour construire l’arbre phylogénétique afin d’identifier les parents les plus proches37.
Test de sensibilité aux métaux lourds
La coexistence de molécules toxiques caractérise les environnements solfatariques. En particulier, les sources chaudes de Pisciarelli sont caractérisées par des niveaux élevés de CO2, H2S, NH4 en coexistence avec As, Hg, Fe, Be, Ni, Co, Cu30,38. Pour cette raison, une caractérisation phénotypique des micro-organismes isolés a été effectuée en présence d’une concentration croissante de métaux lourds, comme indiqué dans le tableau 1. Fait intéressant, l’isolat 1 a montré une tolérance plus élevée à As(V) et V(V). La haute résistance à l’arséniate et au vanadate peut être due à leurs structures chimiques; en fait, les deux ions sont similaires aux ions phosphate, ce qui suggère que V(V) et As(V) pourraient être absorbés par les cellules à travers des systèmes de transport de phosphate. Ces isolats se sont avérés également résistants au Cd(II), bien que la valeur de la CMI soit relativement faible. Ce résultat peut s’expliquer par l’absence de Cd(II) dans le pool. Bien que les deux micro-organismes aient été échantillonnés sur le même site, ils présentaient des profils de résistance aux métaux lourds différents. Cependant, ils ont été échantillonnés à différentes périodes, indiquant ainsi que la variation saisonnière de la concentration en métaux lourds est la principale force motrice qui façonne la composition des communautés microbiennes et leur résistance différentielle aux métaux lourds39. À partir de ces données comparatives, il a été démontré que l’isolat 1 a une forte résistance à As(V), tandis que l’isolat 2 pour As(III). D’autres recherches génétiques sont nécessaires pour démêler les mécanismes de résistance moléculaire et mieux comprendre comment les phénotypes sont affectés par la pression sélective des sources chaudes.
Tests de résistance aux antibiotiques
Les souches microbiennes développées dans des environnements extrêmes présentent généralement une résistance à différents antibiotiques. La corrélation entre la résistance aux métaux lourds et les antibiotiques est bien connue40. Pour cette raison, nous avons testé la résistance aux antibiotiques pour les deux isolats (tableau 2). L’isolat 1 a montré une sensibilité élevée à tous les antibiotiques testés, même lorsque de faibles concentrations ont été utilisées. En revanche, l’isolat 2 est résistant à tous les antibiotiques testés, à l’exception du chloramphénicol et de la tétracycline. Fait intéressant, les valeurs de CMI déterminées pour l’ampicilline, l’érythromycine, la kanamycine, la streptomycine et la vancomycine étaient comparables à celles d’autres bactéries résistantes aux antibiotiques et encore plus élevées pour la bacitracine et la ciprofloxacine41. Ces données fascinantes méritent d’être approfondies; probablement, en raison de mutations aléatoires ou de transfert horizontal de gènes, le micro-organisme a acquis une résistance aux antibiotiques, ce qui pourrait représenter un avantage sélectif dans des conditions environnementales aussi extrêmes.
Graphique 1. Site d’échantillonnage: zone solfatarique de Pisciarelli, Campi Flegrei (Naples, Italie).. Le site d’échantillonnage est situé à 40° 49' 45,3 » N - 14° 08' 49,9 E, dans la zone géothermique de Pisciarelli fumarole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 2. Représentation schématique de la procédure expérimentale. Les micro-organismes sont échantillonnés dans des sources chaudes, cultivés en laboratoire, isolés par stries et placages répétés, et identifiés génotypiquement lors du séquençage de l’ARNr 16S. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Ions métalliques | Isoler 1 | Isoler 2 |
| Comme (III) | 1,9 mM | 41 mM |
| En tant que (V) | 117 mM | 11 mM |
| Cd (II) | 0,9 mM | 0,8 μM |
| Co (II) | 2 mM | 3 mM |
| Co (III) | 2,75 mM | n.d. |
| Cr (VI) | 0,25 mM | n.d. |
| Cu (II) | 4,1 mM | 0,5 mM |
| Hg (II) | 20 μM | 17 μM |
| Ni (II) | 1,3 mM | 30 mM |
| V (V) | 128 mM | n.d. |
Tableau 1. Valeurs MIC par rapport aux ions de métaux lourds des isolats. Les MIC sont considérés comme les valeurs de concentration minimales qui inhibent complètement la croissance cellulaire après 16 h; les valeurs sont rapportées en moyenne de trois expériences.
| Antibiotiques | Isoler 1 | Isoler 2 |
| Ampicilline | s.d. | 20 μg/mL |
| Bacitracine | s.d. | 700 μg/mL |
| Chloramphénicol | s.d. | <0,5 μg/mL |
| Ciprofloxacine | s.d. | >1 mg/mL |
| Érythromycine | s.d. | 70 μg/mL |
| Kanamycine | s.d. | 80 μg/mL |
| Streptomycine | s.d. | 70 μg/mL |
| Tétracycline | s.d. | <0,5 μg/mL |
| Vancomycine | s.d. | 1 μg/mL |
Tableau 2. Valeurs de CMI pour les antibiotiques des isolats. Les MIC sont considérés comme les concentrations minimales qui inhibent complètement la croissance cellulaire après 16 h; les valeurs sont rapportées en moyenne de trois expériences.
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Discussion
Les sources chaudes contiennent une diversité inexploitée de microbiomes aux capacités métaboliques tout aussi diverses12. Le développement de stratégies d’isolement des micro-organismes capables de convertir efficacement les métaux lourds en composés moins toxiques10 représente un domaine de recherche d’intérêt croissant dans le monde entier. Cet article vise à décrire une approche simplifiée pour le dépistage et l’isolement des microbes ayant la capacité de résister aux produits chimiques toxiques. La méthode décrite peut être facilement modifiée pour isoler les microbes de diverses sources environnementales telles que l’eau, la nourriture, le sol ou les sédiments. Cependant, il existe certaines limites dans cette technique liées à la dépendance à la culture microbienne. Par conséquent, cette configuration ne conviendrait pas pour isoler les bactéries d’un environnement qui n’est pas facilement cultivable. Une façon de surmonter ce problème consiste à utiliser différents milieux bactériens (c.-à-d. milieux sélectifs ou stratégies de préadaptation) et des temps d’incubation plus longs42.
Néanmoins, la majorité des espèces présentant un intérêt pour la bioremédiation devraient croître dans les conditions décrites dans le présent document. Ce protocole présente certains avantages par rapport aux techniques de placage traditionnelles, étant donné que les milieux de gélose sélectifs pour les produits chimiques sont inconnus jusqu’à présent. L’utilisation de la CMI pour identifier les microbes résistants est une stratégie rapide à exploiter sur des isolats individuels qui ouvre la voie à la caractérisation de nouvelles espèces ou de nouvelles souches. Cette étude démontre l’utilité d’une telle méthode pour sélectionner les micro-organismes environnementaux qui peuvent contribuer à une bioremédiation efficace en inactivant les polluants et en les convertissant en produits inoffensifs.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par ERA-NET Cofund MarTERA: « FLAshMoB: Functional Amyloid Chimera for Marine Biosensing », PRIN 2017-PANACEA CUP:E69E19000530001 et par GoodbyWaste: ObtainGOOD products-exploit BY-products-reduce WASTE, MIUR 2017-JTNK78.006, Italie. Nous remercions Dr. Monica Piochi et Dr. Angela Mormone (Istituto Nazionale di Geofisica e Vulcanologia, Sezione di Napoli Osservatorio Vesuviano, Italie) pour l’identification et la caractérisation du site géothermique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393 | |
| Aura Mini | bio air s.c.r.l. | Biological hood | |
| Bacitracin | Sigma Aldrich | B0125 | |
| Cadmium chloride | Sigma Aldrich | 202908 | |
| Chloramphenicol | Sigma Aldrich | C0378 | |
| Ciprofloxacin | Sigma Aldrich | 17850 | |
| Cobalt chloride | Sigma Aldrich | C8661 | |
| Copper chloride | Sigma Aldrich | 224332 | |
| Erythromycin | Sigma Aldrich | E5389 | |
| Exernal Service | DSMZ | Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH | |
| Genomic DNA Purification Kit | Thermo Scientific | #K0721 | |
| Kanamycin sulphate | Sigma Aldrich | 60615 | |
| MaxQTM 4000 Benchtop Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE4000 | |
| Mercury chloride | Sigma Aldrich | 215465 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| Nickel chloride | Sigma Aldrich | 654507 | |
| Orion Star A221 Portable pH Meter | Thermo Scientific | STARA2218 | |
| Sodium (meta) arsenite | Sigma Aldrich | S7400 | |
| Sodium arsenate dibasic heptahydrate | Sigma Aldrich | A6756 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S5886 | |
| Streptomycin | Sigma Aldrich | S6501 | |
| Tetracycline | Sigma Aldrich | 87128 | |
| Tryptone BioChemica | Applichem Panreac | A1553 | |
| Vancomycin | Sigma Aldrich | PHR1732 | |
| Yeast extract for molecular biology | Applichem Panreac | A3732 |
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