Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

تحليل تفاعل البروتينات ذات العلامات الفلورية مع الحويصلات الدقيقة الفوسفاتية الاصطناعية باستخدام قياس التدفق الخلوي الكمي

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63459
Automatic Translation
1,2, 1,4, 1,2,3, 1,2, 1,2,3,4
1Center for Theoretical Problems of Physicochemical Pharmacology, Russian Academy of Sciences, 2National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology named after Dmitry Rogachev, 3Faculty of Physics, Lomonosov Moscow State University, 4Faculty of Biological and Medical Physics, Moscow Institute of Physics and Technology

Summary

هنا ، نصف مجموعة من الطرق لتوصيف تفاعل البروتينات مع أغشية الخلايا أو الحويصلات الدقيقة.

Abstract

في جسم الإنسان ، تستمر معظم التفاعلات الفسيولوجية الرئيسية المشاركة في الاستجابة المناعية وتخثر الدم على أغشية الخلايا. الخطوة الأولى المهمة في أي تفاعل يعتمد على الغشاء هي ربط البروتين على غشاء الدهون الفوسفاتية. تم تطوير نهج لدراسة تفاعل البروتين مع الأغشية الدهنية باستخدام البروتينات ذات العلامات الفلورية وقياس التدفق الخلوي. تسمح هذه الطريقة بدراسة تفاعلات البروتين والأغشية باستخدام الخلايا الحية وحويصلات الدهون الفوسفاتية الطبيعية أو الاصطناعية. ميزة هذه الطريقة هي بساطة وتوافر الكواشف والمعدات. في هذه الطريقة ، يتم تصنيف البروتينات باستخدام أصباغ الفلورسنت. ومع ذلك ، يمكن استخدام كل من البروتينات ذاتية الصنع والمتاحة تجاريا ، والتي تحمل علامات الفلورسنت. بعد الاقتران مع صبغة الفلورسنت ، يتم تحضين البروتينات بمصدر للغشاء الفوسفوليبيد (الحويصلات الدقيقة أو الخلايا) ، ويتم تحليل العينات عن طريق قياس التدفق الخلوي. يمكن استخدام البيانات التي تم الحصول عليها لحساب الثوابت الحركية والتوازن Kd. بالإضافة إلى ذلك ، من الممكن تقدير العدد التقريبي لمواقع ربط البروتين على غشاء الدهون الفوسفاتية باستخدام حبات معايرة خاصة.

Introduction

تفصل الأغشية الحيوية المحتويات الداخلية للخلايا الحيوانية والفضاء خارج الخلية. لاحظ أن الأغشية تحيط أيضا بالحويصلات الدقيقة التي تشكلت خلال دورة حياة الخلية والعضيات. يتكون غشاء الخلية في الغالب من الدهون والبروتينات. تؤدي البروتينات الغشائية وظائف الإشارات والهيكلية والنقل والمواد اللاصقة. ومع ذلك ، فإن الطبقة الثنائية الدهنية ضرورية أيضا للترابط بين الخلية الحيوانية والفضاء خارج الخلية. تقترح هذه الورقة طريقة لدراسة التفاعل المحيطي للبروتينات الخارجية مع الغشاء الدهني.

المثال الأكثر لفتا للنظر للتفاعلات التي تحدث على طبقة الغشاء الخارجي للخلية الحيوانية هو تفاعل تخثر الدم. من السمات المهمة لتخثر الدم أن جميع التفاعلات الرئيسية تستمر على الأغشية الفوسفاتية للخلايا والحويصلات الدقيقة الناشئة عن هذه الخلايا وليس في البلازما1،2،3. تشمل التفاعلات المعتمدة على الغشاء عملية بدء التخثر (على أغشية الخلايا في البطانة السفلية ، أو البطانة الملتهبة ، أو الخلايا المناعية المنشطة ، بمشاركة عامل أنسجة) ، وجميع تفاعلات التنشيط المتتالي الرئيسي للعوامل التاسع والعاشر والبروثرومبين. تنشيط العامل الحادي عشر عن طريق الثرومبين (على أغشية الصفائح الدموية المنشطة ، كريات الدم الحمراء ، البروتينات الدهنية ، والحويصلات الدقيقة) ؛ ردود فعل مسار البروتين C ؛ تعطيل إنزيمات التخثر (على أغشية الخلايا البطانية بمشاركة العوامل المساعدة للثرومبومودولين ، مستقبلات البروتين البطاني C ، كبريتات الهيباران) ؛ وتفاعلات مسار الاتصال (على أغشية الصفائح الدموية وبعض الحويصلات الدقيقة بمشاركة عوامل مساعدة غير معروفة). وبالتالي ، من المستحيل التحقيق في تخثر الدم دون دراسة تفاعل بروتينات البلازما المختلفة مع غشاء خلايا الدم.

تصف هذه الورقة طريقة قائمة على قياس التدفق الخلوي لتوصيف تفاعل البروتينات مع الأغشية الدهنية للخلايا أو الحويصلات الدقيقة. تم اقتراح هذا النهج في البداية لدراسة تفاعل بلازما الدم مع الصفائح الدموية وحويصلات الدهون الفوسفاتية الاصطناعية. علاوة على ذلك ، تتفاعل معظم البروتينات المدروسة مباشرة مع الدهون الفوسفاتية الغشائية سالبة الشحنة ، خاصة مع فوسفاتيديل سيرين 4,5. بالإضافة إلى ذلك ، هناك بروتينات يتم التفاعل مع الغشاء بوساطة مستقبلات خاصة6.

تتمثل إحدى القدرات المهمة لقياس التدفق الخلوي في التمييز بين الأربطة الحرة والمربوطة دون فصل إضافي. تسمح هذه الميزة في قياس الخلايا بدراسة ربط توازن الرباط عند نقطة النهاية وتساعد على إجراء قياسات حركية مستمرة. هذه التقنية غير متطورة ولا تتطلب إعداد عينة معقدة. يستخدم قياس التدفق الخلوي بنشاط لدراسة ديناميات التفاعل بين الببتيدات الفلورية والمستقبلات وبروتينات G في العدلات السليمة والقابلة للنفاذ إلى المنظفات7. هذا النهج قابل للتطبيق أيضا لاستكشاف التفاعلات بين البروتين والحمض النووي وحركية نشاط endonuclease في الوقت الحقيقي8. بمرور الوقت ، تم استخدام هذه الطريقة لدراسة تفاعلات البروتين والبروتين عالية التقارب مع الحويصلات الدهنية النقية9 ، أو بشكل أعم ، مع بروتينات الغشاء المعبر عنها في نظام تعبير خلية Sf9 عالي الكفاءة10. كما تم وصف الطرق الكمية لتوصيف التفاعلات بين البروتين والجسيمات الشحمية باستخدام قياس التدفق الخلوي للبروتينات عبر الغشاء11.

تستخدم هذه التقنية حبات معايرة ذاتية الصنع لتجنب استخدام الخرز المتوفر تجاريا7. كانت خرزات المعايرة المستخدمة سابقا7 تهدف إلى العمل مع الفلوريسين ، مما قيد بشكل كبير مجموعة متنوعة من روابط الفلورسنت التي يمكن الوصول إليها على البروتينات. بالإضافة إلى ذلك ، تقدم هذه الورقة طريقة جديدة للحصول على البيانات الحركية وتحليلها للحصول على دقة زمنية معقولة. على الرغم من وصف هذه الطريقة لحويصلات الدهون الفوسفاتية الاصطناعية ، إلا أنه لا توجد قيود واضحة على قدرتها على التكيف مع الخلايا أو الحويصلات الطبيعية أو الحويصلات الفوسفاتية الاصطناعية ذات تركيبة دهنية مختلفة. تسمح الطريقة الموضحة هنا بتقدير معلمات التفاعل (kon ، koff) والتوازن (Kd) وتسهل التوصيف الكمي لعدد مواقع ربط البروتين على الغشاء. لاحظ أن هذه التقنية توفر تقديرا تقريبيا لعدد مواقع الربط. مزايا هذه الطريقة هي بساطتها النسبية ، وإمكانية الوصول إليها ، وقدرتها على التكيف مع الخلايا الأصلية والحويصلات الدقيقة الطبيعية والاصطناعية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. وضع العلامات على البروتين الفلورسنت

  1. إعداد المواد
    1. تحضير 1 M بيكربونات الصوديوم العازلة، الرقم الهيدروجيني 9.0، وتخزينها في 4 درجة مئوية، واستخدامها في غضون أسبوع واحد.
    2. تحضير 1.5 M هيدروكسيلامين هيدروكلوريد العازل، الرقم الهيدروجيني 8.5، مباشرة قبل الاستخدام.
    3. تحضير محلول 10 ملغم / مل من صبغة الفلورسنت (انظر جدول المواد) في ثنائي ميثيل سلفوكسيد.
      ملاحظة: يمكن تخزين هذا الحل لمدة شهر عند -20 درجة مئوية في الظلام.
    4. تحضير محاليل من الأجسام المضادة النقية أو البروتينات الأخرى في 1-10 ملغ / مل.
      ملاحظة: تجنب المخازن المؤقتة التي تحتوي على أيونات الأمونيوم أو الأمينات الأولية. استبدل المخازن المؤقتة التي تحتوي على تريس أو الجلسرين بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) عن طريق غسيل الكلى. لن يؤثر أزيد الصوديوم (≤3 ملليمتر) ولا الثيميروسال (≤1 ملليمتر) بشكل كبير على تفاعل الاقتران.
    5. احتضان وسط ترشيح الجل (انظر جدول المواد) لتنقية البروتين في PBS بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة أو لمدة 2 ساعة عند 60 درجة مئوية. ضع وسط ترشيح الجل على أعمدة الدوران ذات الأغشية 0.2 ميكرومتر.
  2. احسب كمية الصبغة التفاعلية التي سيتم استخدامها لكل تفاعل وفقا لتركيز البروتين المراد تصنيفه باستخدام Eq (1).
    Equation 1
    حيثصبغة V هي حجم محلول مخزون الصبغة ؛ C pr و V pr و MWpr هو تركيز البروتين وحجمه ووزنه المولي. صبغة MW هي الوزن المولي للصبغة. 100 هو عامل تحويل الوحدة. MR هي النسبة المولية للصبغة إلى البروتين في خليط التفاعل.
    ملاحظة: يوصى باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي التالي لتفاعلات وضع العلامات على IgG: MR = 40 إذا كان الجسم المضاد عند 1-3 ملغم / مل أو MR = 30 إذا كان الجسم المضاد عند 4-10 ملغ / مل. بالنسبة لعوامل التخثر ، عادة ما يتم استخدام MR = 5.
  3. تفاعل الاقتران
    1. في أنبوب التفاعل ، امزج محلول البروتين مع حجم أقل 10 مرات من محلول بيكربونات 1 M.
    2. أضف الكمية المطلوبة من صبغة الفلورسنت (انظر الخطوة 1.2) مع التحريك المستمر.
    3. احتضن خليط التفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة تقريبا ، محميا من الضوء مع التحريك المستمر.
    4. لكل 200 ميكرولتر من محلول البروتين ، أضف 5 ميكرولتر من 1.5 م هيدروكسي لامين هيدروكلوريد.
    5. احتضن خليط التفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة تقريبا ، محميا من الضوء مع التحريك المستمر.
  4. قم بإعداد عمود الدوران.
    1. أضف 500 ميكرولتر من وسط ترشيح الجل لتنقية البروتين إلى عمود. قم بطرد العمود لمدة 3 دقائق عند 1000 × جم.
    2. تخلص من المخزن المؤقت من أنبوب التجميع. إذا لم يكن العمود ممتلئا ، فأضف المزيد من وسط ترشيح الهلام ، وقم بالطرد المركزي للعمود لمدة 3 دقائق عند 1000 × جم. كرر هذه الخطوة حتى يمتلئ العمود.
  5. تنقيه
    1. الطرد المركزي لخليط التفاعل (من الخطوة 1.3.5) لمدة 5 دقائق عند 17000 × غرام وإزالة الراسب.
    2. انقل السوبرناتانت إلى عمود الدوران باستخدام وسط ترشيح الهلام. اسمح للمحلول بالامتصاص في سرير الجل.
    3. استخدم أنبوب تجميع فارغ لعمود الدوران وقم بطرده مركزيا لمدة 5 دقائق عند 1000 × جم. بعد الطرد المركزي ، اجمع البروتين المسمى من أنبوب التجميع.
  6. تحديد درجة وضع العلامات
    1. صحيح لمساهمة الصبغة في الامتصاص عند A 280 عن طريق قياس امتصاص الصبغة الحرة عند 280 نانومتر (A 280) والحد الأقصى λ للصبغة (Amax) (انظر Eq (2)).
      Equation 2(2)
    2. قم بقياس امتصاص مقترن صبغة البروتين عند 280 نانومتر (A 280) والحد الأقصى λ للصبغة (Amax) واحسب تأقلم البروتين باستخدام Eq (3).
      Equation 3(3)
      حيث εM هو معامل الانقراض المولي للبروتين عند 280 نانومتر. d هو طول المسار البصري أثناء قياس الامتصاص ؛ CF هو مساهمة الصبغة في الامتصاص عند A280 (الخطوة 1.6.1).
    3. احسب درجة وضع العلامات (DOL) باستخدام Eq (4).
      Equation 4(4)
      حيث εM صبغة هي معامل الانقراض المولي للصبغة عند λmax nm. d هو طول المسار البصري أثناء قياس الامتصاص ؛ بروتين C هو تركيز البروتين (الخطوة 1.6.2).

2. إعداد الحويصلات الفوسفاتية

  1. تحضير وتخزين خليط الدهون
    1. الجمع بين الدهون في النسبة المناسبة (فوسفاتيديل سيرين / فوسفاتيديل كولين بنسبة 20 مول٪ إلى 80 مول٪).
    2. جفف خليط الدهون بعد التجفيد أو التبخر وخزنه تحت جو خامل في أمبولات زجاجية.
  2. إنتاج أفلام الدهون
    1. افتح الأمبولة ، وأعد تعليق خليط الدهون بكمية صغيرة (~ 100 ميكرولتر) من الكلوروفورم.
      ملاحظة: لا تستخدم الكثير من الكلوروفورم لأنه لا يتبخر تماما.
    2. أضف DiIC16 (3) في الإيثانول عند 0.2 مول٪. انقل خليط الدهون إلى قارورة مستديرة القاع. انشر الخليط بشكل رقيق على جانبي القارورة عن طريق تدويرها. جفف مزيج الدهون لمدة 30 دقيقة تحت تيار الأرجون.
  3. ترطيب خليط الدهون
    1. أضف عازلا مائيا دافئا بشكل مناسب (~ 55 درجة مئوية) (HEPES 20 mM ، NaCl 140 mM ، pH 7.4) في حجم يتوافق مع تركيز الدهون المتوقع إلى القارورة مع فيلم الدهون. احتضني الخليط مع الدوامة عند 55 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة للترطيب الكامل.
    2. وضع أنبوب العينة في الفريزر أو منظم الحرارة الدافئ لجعل تعليق الدهون يخضع ل 3-5 دورات تجميد وإذابة.
  4. تشكيل الحويصلات الدهنية عن طريق البثق
    1. قم بإعداد الطارد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قم بتسخين جميع مكونات الطارد إلى درجة حرارة انتقال الطور لخليط الدهون.
    2. املأ إحدى محاقن الطارد بخليط الدهون المائي. انتظر لمدة 5-10 دقائق حتى تتوازن درجة حرارة تعليق الدهون مع درجة حرارة الطارد.
    3. بثق خليط الدهون من خلال الغشاء 10 مرات على الأقل. بالنسبة للبثق النهائي ، ضع تعليق الدهون في المحقنة البديلة وابحث عن تغيير في المظهر من غامض قليلا إلى محلول واضح.
    4. تخزين الخليط الناتج من الحويصلات الدهنية في 4 درجات مئوية ، ويفضل أن يكون ذلك في جو خامل من الأرجون أو النيتروجين ، لمدة 3-4 أيام. لا تجمد.

3. عزل الصفائح الدموية عن الدم الكامل

  1. جمع الدم الكامل من المتبرعين الأصحاء في أنابيب تحتوي على 3.2٪ سترات الصوديوم.
  2. أضف البروستاجلاندين E1 (PGE1) (1 ميكرومتر) و apyrase (0.1 U / mL) إلى الدم ، متبوعا بالطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة عند 100 × جم لمدة 8 دقائق.
  3. بعد الطرد المركزي ، خذ البلازما الغنية بالصفائح الدموية وأضف محلول سترات الصوديوم (106 mM ، الرقم الهيدروجيني 5.5) إلى نسبة البلازما / السترات من 3: 1. الطرد المركزي للبلازما في درجة حرارة الغرفة عند 400 × غرام لمدة 5 دقائق.
  4. قم بإزالة السوبرناتانت ، وأعد تعليق الكريات في 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت ل Tyrode بدون BSA (20 mM HEPES ، 150 mM NaCl ، 2.7 mM KCl ، 1 mM MgCl 2 ، 0.4 mM NaH 2 PO 4 ، 2.5 mM CaCl 2 ، 5 mM glucose ، pH7.4). تنقية الصفائح الدموية من بروتينات البلازما عن طريق كروماتوغرافيا هلام على وسط ترشيح الجل لتنقية الصفائح الدموية (انظر جدول المواد).

4. الكشف عن البروتين - تفاعل الدهون عن طريق قياس التدفق الخلوي

  1. تجارب الربط الحركي
    1. تمييع الحويصلات الفوسفاتية (من الخطوة 2.4.4) في المخزن المؤقت ل Tyrode (20 mM HEPES ، 150 mM NaCl ، 2.7 mM KCl ، 1 mM MgCl 2 ، 0.4 mM NaH 2 PO 4 ، 2.5mM CaCl2 ، 5 mM glucose ، 0.5٪ BSA ، pH 7.4) إلى تركيز 1 μM والحجم الإجمالي 250 μL.
    2. امزج عامل التخثر المسمى بالفلورسنت X (fX-fd) من الخطوة 1 بتركيز 500 نانومتر مع الحويصلات الفوسفاتية من الخطوة 4.1.1 بنسبة 1:1 (تركيز الحويصلة النهائي 0.5 ميكرومتر ، تركيز fX-fd هو 250 نانومتر من fX) إلى حجم إجمالي قدره 500 ميكرولتر.
    3. حقن على الفور 500 ميكرولتر من التعليق المختلط (~ 20 دقيقة للتحليل بمعدل تدفق منخفض) في مقياس التدفق الخلوي. استخدم معدل تدفق منخفض وتأكد من أن عتبة القناة FL2 (exсitation 488 nm ، مرشح الانبعاثات 585/42 nm) هي كقيمة 200. قم بقياس متوسط التألق في القناة FL4 (exсitation 633 nm ، مرشح الانبعاثات 660/20) لصبغة التألق من جدول المواد.
      ملاحظة: اختر مقياس خلوي بدون جهاز أخذ عينات تلقائي. سيؤدي ذلك إلى تسريع عملية حقن العينة في خلية القياس.
    4. عندما يتم تحقيق تشبع الارتباط (لا توجد زيادة كبيرة في التألق في غضون 5 دقائق) ، قم بتخفيف العينة بسرعة 20 ضعفا باستخدام مخزن Tyrode المؤقت ، وراقب التفكك حتى يتم الوصول إلى التألق الأساسي (التفكك الكامل) أو حتى يتم الوصول إلى هضبة (لا يوجد انخفاض كبير في التألق في غضون 5 دقائق).
      ملاحظة: كعنصر تحكم، أضف 10 ميكرومتر EDTA وراقب الانفصال الكامل لمدة 5 دقائق.
  2. تجارب ربط التوازن
    ملاحظة: استخدم المنحنى الحركي للربط لتحديد وقت الوصول إلى التشبع. وقت التشبع ل fX-fd والحويصلات الاصطناعية هو 20 دقيقة.
    1. احتضان حويصلات فوسفوليبيد اصطناعية (5 ميكرومتر) لفحص الربط بتركيزات مختلفة من fX-fd (من 0 إلى 1000 نانومتر) في مخزن Tyrode المؤقت لمدة 20 دقيقة.
    2. قم بتخفيف كل عينة من الخطوة 4.2.1 × 20x إلى حجم نهائي قدره 200 ميكرولتر باستخدام المخزن المؤقت ل Tyrode. قم على الفور بتحليل العينة المخففة عن طريق قياس التدفق الخلوي في غضون 30 ثانية. استخدم الإعدادات من الخطوة 4.1.3.
      ملاحظة: كعنصر تحكم للربط غير المحدد ، استخدم عينات مماثلة مع EDTA (10 ميكرومتر) واحتضنها لمدة 5 دقائق.

5. تحليل بيانات قياس التدفق الخلوي

  1. تصدير التجارب بتنسيق FSC من برنامج الحصول على بيانات القياس الخلوي إلى برنامج قياس الخلايا لتحليل البيانات (انظر جدول المواد). اختر ملف | | التصدير ملفات FCS. افتح FSC الملفات في برنامج مقياس الخلايا لتحليل البيانات عن طريق تحديد الملفات الموجودة على الكمبيوتر وسحبها إلى مساحة عمل البرنامج.
  2. لبوابة الحويصلات الدقيقة ، حدد منطقة الحويصلات الدقيقة عن طريق تألق الصبغة المحبة للدهون DiIC16 (3). استخدم أوامر القائمة أو زر الرسم في ورقة العمل لإنشاء SSC مخطط نقطي من FL2 (صبغ DilC16(3)) في إحداثيات السجل. اختر زر البوابة المستطيلة لرسم منطقة بوابة بحيث لا يتم تضمين الأحداث من عينة بدون حويصلات في هذه المنطقة (الشكل 1B,C).
  3. تحليل التجارب الحركية.
    1. إنشاء مخطط نقطي باستخدام إحداثيات التألق (FL4) بمرور الوقت لمنطقة الحويصلات (انقر نقرا مزدوجا في منطقة الحويصلات في الخطوة 5.2)
    2. تصدير البيانات المتعلقة بالتغيير في التألق بمرور الوقت بتنسيق csv. اختر عينة | انقر بزر الماوس الأيمن فوق | | التصدير اختر FL4 والوقت في المعلمات | حدد الدليل لحفظ | حدد تنسيق CSV | التصدير.
    3. افتح ملف CSV في أي برنامج إحصائي (انظر جدول المواد). احسب متوسطا متحركا بسيطا للتألق والوقت لكل 1000 حدث.
    4. تقريب رسم بياني لاعتماد المتوسط المتحرك البسيط للتألق على الوقت تحت افتراض الاعتماد الأسي (تحليل > التركيب >ملاءمة المنحنى غير الخطي) واستخدام هذا لحساب ثابت الارتباط الحركي باستخدام Eq (5).
      Equation 5(5)
      حيث [XB] هو تركيز العامل المرتبط في كل لحظة زمنية (وحدات يحددها المستخدم) وفقا للمتوسط المتحرك البسيط من الخطوة 5.3.3 ؛ [X] هو تركيز العامل المضاف. [X] الحد الأقصى هو الحد الأقصى لتركيز العامل المقيد. k هو ثابت الارتباط. ر هو الوقت.
    5. كرر نفس مجموعة الإجراءات (5.3.1-5.3.4) لحساب ثابت التفكك الحركي باستخدام Eq (6).
      Equation 6(6)
      حيث [XB] هو تركيز العامل المحدد في كل لحظة من الزمن؛ [X]0 هو تركيز العامل المحدد في اللحظة الأولى من الزمن. k هو ثابت الانفصال. ر هو الوقت.
  4. فحص ربط التوازن
    1. أوجد متوسط تألق fX-fd في منطقة الحويصلات لكل تركيز محدد من fX-fd.
    2. تقريب اعتماد تألق العامل المرتبط من تركيز العامل المضاف في افتراض الربط البسيط في موقع واحد. احسب متوسط معلمات الربط باستخدام Eq (7) من ثلاثة تكرارات مستقلة كحد أدنى.
      Equation 7(7)
      حيث [XB] هو تركيز العامل المقيد؛ [X] هو تركيز العامل المضاف. nx هو العدد الظاهري لمواقع الربط لكل حويصلة ؛ Kd هو ثابت التفكك الظاهر.

6. تحويل كثافة التألق إلى متوسط عدد مواقع الربط

  1. إعداد الخرز معايرة.
    1. احتضان الصفائح الدموية المصفاة بالهلام (انظر الخطوة 3.3) باستخدام A23187 (10 ميكرومتر) في وجود CaCl 2 (2.5 mM) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    2. أضف إلى الصفائح الدموية المنشطة تركيزات مختلفة من fX-fd (0 إلى 1000 نانومتر). أضف 2٪ v / v الفورمالديهايد واحتضن لمدة 1 ساعة. أوقف التفاعل عن طريق احتضان الصفائح الدموية ب 3 M glycine و 5٪ BSA لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    3. تنقية الخليط من الصبغة غير المتفاعلة. قم بالطرد المركزي للصفائح الدموية لمدة 5 دقائق عند 400 × جم ، وقم بإزالة السوبرناتانت ، وأعد تعليق الكريات في مخزن Tyrode العازل (الذي يحتوي على 0.5٪ BSA).
      ملاحظة: كرر الخطوة 6.1.3 ثلاث مرات.
  2. قم بقياس مستوى التألق لخرز المعايرة في كل عينة أولا باستخدام مقياس الطيف الفلوري (لصبغة الفلورسنت من جدول المواد ، الإثارة 633 نانومتر ، الانبعاثات 670 نانومتر) ثم باستخدام مقياس التدفق الخلوي (في القناة FL4: الإثارة 633 نانومتر ، مرشح الانبعاثات 660/20). باستخدام عداد خلايا، حدد عدد الخرز في كل عينة.
  3. قم بتحويل شدة التألق لكل عينة خرزة إلى تركيز صبغة الفلورسنت القابلة للذوبان باستخدام مقياس الطيف الفلوري. أعد حساب تركيز صبغة الفلورسنت لعدد جزيئات الفلوروفور باستخدام Eq (8).
    Equation 8(8)
    حيث Nx هو عدد جزيئات الفلوروفور. C هو تركيز صبغة الفلورسنت. NA هو ثابت أفوغادرو. NA = 6.02214076×1023 مول -1.
  4. قم بإنشاء رسم بياني للاعتماد على متوسط تألق الخرز في مقياس التدفق الخلوي (الخطوة 6.2) على عدد جزيئات الفلوروفور (انظر الخطوة 6.3) لكل عينة باستخدام أي برنامج إحصائي (انظر جدول المواد). تقريب هذا الاعتماد حسب تناسب الخط (تحليل | | التركيب تناسب الخطية). من التقريب في Eq (9) ، احسب عامل التحويل لمتوسط التألق إلى مواقع الربط.
    Equation 9(9)
    حيث MF هو متوسط تألق الخرز عن طريق قياس التدفق الخلوي ؛ Nx هو عدد جزيئات الفلوروفور لكل حبة. يمثل CF عامل تحويل متوسط التألق إلى مواقع الربط. يتم الحصول على CF و b من نتائج تركيب الرسم البياني بالتناسب الخطي.
  5. احسب العدد الظاهري لمواقع الربط لكل حويصلة ذات أهمية باستخدام Eq (10).
    Equation 10(10)
    حيث nx هو العدد الظاهر لمواقع الربط لكل حويصلة ذات أهمية ؛ MF هو متوسط التألق للحويصلات ذات الأهمية عن طريق قياس التدفق الخلوي. CF و b هما عاملان تحويلان من Eq (8).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تستخدم طريقة قياس التدفق الخلوي الموصوفة هنا لتوصيف ارتباط بروتينات تخثر البلازما بالصفائح الدموية المنشطة. بالإضافة إلى ذلك ، تم تطبيق الحويصلات الفوسفاتية PS: PC 20: 80 كنظام نموذجي. تركز هذه الورقة بشكل أساسي على الحويصلات الفوسفاتية الاصطناعية كمثال. يجب اختيار معلمات مقياس الخلايا ، على وجه الخصوص ، جهد أنبوب المضاعف الضوئي (PMT) والتعويض لكل جهاز محدد ، وموضوع الدراسة (الخلايا ، الحويصلات الدقيقة الاصطناعية أو الطبيعية) ، والأصباغ المستخدمة. يوضح الشكل 1B ، C مثالا على الحويصلات الفوسفوليبيدية الاصطناعية التي يبلغ حجمها ~ 1 ميكرومتر مع صبغة الفلورسنت المحبة للدهون المدمجة DiIC16 (3). ساعد حجم الحويصلة الكبيرة وصبغة الفلورسنت المحبة للدهون في اكتشاف الحويصلات باستخدام مقياس الخلايا. تم تعيين البوابة بناء على عينة تحتوي على حويصلات دهنية اصطناعية بنفس الحجم ولكن بدون صبغة الفلورسنت (الشكل 1B). تم استخدام الأحداث داخل هذه البوابة فقط في التحليل.

تم تحليل حركية ارتباط البروتين بالحويصلات في المرحلة الأولى. تم جمع العينة لهذا بشكل مستمر كما هو موضح في الخطوة 4.1. يظهر مخطط نقطي نموذجي في الشكل 1D-F. تم تحليل البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام برنامج قياس التدفق الخلوي. يظهر المنحنى الناتج في الشكل 1G. تظهر الخطوط الصلبة منحنيات التقريب ، والتي تم من خلالها الحصول على الثوابت الحركية للارتباط (kon) والتفكك (koff). نظرا لأن العامل X يرتبط بحويصلات الدهون الفوسفاتية بشكل عكسي و Ca2 + - اعتمادا ، فإن العينات التي تحتوي على EDTA تتحكم في خصوصية وانعكاس هذا الربط. وترد الثوابت الناتجة في الجدول 1.

استنادا إلى حركية الربط ، تم اختيار وقت 20 دقيقة لمزيد من تجارب التوازن لوصف التشبع في الربط بدقة. تم تحديد متوسط شدة التألق للعامل لاحقا في منطقة الحويصلات. تم تحليل كل عينة في وجود وغياب EDTA. تم أخذ شدة التألق في وجود EDTA كخلفية وطرحها من الإشارة الكلية حيث يعتبر ارتباط fX بالغشاء في حالة عدم وجود أيونات Ca2+ غير محدد. تم تحويل التألق الناتج إلى عدد مواقع الربط لكل حويصلة باستخدام حبات المعايرة.

Figure 1
الشكل 1: ربط محدد ل fX بحويصلات الدهون الفوسفاتية الاصطناعية. (أ) مخطط التجربة. (ب، ج) قطع نقطي نموذجية من الحويصلات الفوسفاتية بدون (B) أو مع (C) صبغة فلورسنت محبة للدهون DiIC16 (3). (مد إلى واو) مخططات نقطية نموذجية لتفاعل العامل X مع الحويصلات الفوسفاتية قبل (D) أو بعد (E) تخفيف 20 ضعفا وفي وجود EDTA (F). (ز) حركية FX (250 نانومتر) الارتباط والتفكك إلى الحويصلات الفوسفوليبيدية. (ح) تفاعل التوازن بين العامل X والحويصلات الفوسفاتية. النتائج هي وسيلة ±SD ل n = 3 عينات مختلفة. الاختصارات: FX = العامل X; حويصلات الأس الهيدروجيني = حويصلات فوسفوليبيدية. SSC = مبعثر جانبي. a.u. = وحدة تعسفية). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ظاهر Kd ± SEM (نانومتر) kعلى ± SEM (μM-1 s-1) Kقبالة ± SEM (S-1) العدد الظاهر لمواقع الربط لكل حويصلة ± SEM
400 ± 80 0.371 ± 0.012 0.019 ± 0.004 8,000 ± 800

الجدول 1: معلمات تفاعل FX مع الحويصلات الفوسفاتية الاصطناعية. تم تحديد المعلمات من المنحنيات (انظر الشكل 1F ، G). النتائج هي متوسط ± SEM ل n = 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يمكن تكييف الطريقة المقترحة للتوصيف التقريبي لتفاعل البروتينات مع أغشية الدهون الفوسفاتية من مصادر وتركيبات مختلفة. يعترف قياس التدفق الخلوي الكمي الموصوف هنا برنين البلازمون السطحي (SPR) في العديد من المعلمات. على وجه الخصوص ، لديها حساسية أقل ودقة زمنية وتتطلب وضع علامات الفلورسنت على البروتينات. يمكن أن يؤدي وضع العلامات الفلورية إلى تغيير في التشكيل وفقدان النشاط للعديد من البروتينات وبالتالي يتطلب تحكما دقيقا. ومع ذلك ، فإن هذه التقنية لها مزايا كبيرة على الآخرين. توفر هذه الطريقة فرصة لاستكشاف تفاعل البروتينات مع غشاء الخلية الأصلي ، والذي لا يتم تنفيذه بسهولة باستخدام SPR. علاوة على ذلك ، يسمح النهج بتقدير عدد مواقع ربط البروتين على سطح الغشاء ويمكن أن يكون فعالا لبعض مهام التحليل.

تتوفر الخرز المتاح تجاريا لبعض أصباغ الفلورسنت لحساب مواقع الربط. ومع ذلك ، لا توجد مثل هذه الخرز للعديد من الأصباغ المستخدمة على نطاق واسع. وبالتالي ، فإن الخرز المصنوع ذاتيا هو أفضل طريقة لحل هذه المشكلة. تم استخدام نفس الخلايا لإعداد هذه الخرز كما هو الحال بالنسبة لجميع التجارب الأخرى. ومع ذلك ، نظرا لأن الخرز يتطلب سرعات طرد مركزي عالية أثناء الغسيل ، فلا يمكن استخدام حويصلات الدهون الفوسفاتية. ومع ذلك ، يمكن استبدال الخلايا أو الحويصلات بالخرز مع مجموعات تفاعلية أمينية ، والتي يمكن أن تكون مقترنة بالصبغة المختارة. سيكون تسلسل الإجراءات مشابها لتلك الموضحة في الخطوة 6.1.

ترتبط قيود طريقة قياس التدفق الخلوي الكمي هذه بالقدرات التقنية للمقياس الخلوي المستخدم. تم تطبيق ثلاثة نماذج مختلفة من مقاييس التدفق الخلوي (مع الليزر المتغير وأجهزة الكشف والمضخات) لإعادة إنتاج هذه التقنية دون أي مضاعفات. ومع ذلك ، يجب النظر بعناية في اختيار ملصق الفلورسنت المناسب لمقياس الخلايا المستخدم لأن مجموعة الليزر وأجهزة الكشف والمرشحات البصرية تختلف من جهاز إلى آخر ، حتى داخل نفس الطراز. من الضروري التركيز على قدرة مقياس الخلايا على قياس الجسيمات الدقيقة ذات القطر المحدد ؛ ليست كل الأدوات قادرة بنفس القدر على اكتشاف الجسيمات بدقة أقل من 200 نانومتر (لتحديد ذلك ، استخدم حبات المعايرة ذات الحجم الثابت التي توفرها الشركة المصنعة للأداة). بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن لبعض مقاييس التدفق الخلوي ، التي يتم أخذ عينات منها باستخدام مضخة حقنة ، قياس حركية الربط المستمر من حيث المبدأ. في هذه الحالة ، يمكن تسجيل الحركية فقط نقطة بنقطة ، مع أخذ عينات منفصلة للقياس في نقاط معينة في الوقت المناسب 4,6.

يستخدم قياس التدفق الخلوي للتحقيق في التعبير عن المستضدات على الخلايا المختلفة - وجود / عدم وجود مستضد والنسبة المئوية لمجموعات الخلايا التي تعبر عن هذا المستضد ولا تعبر عنه. كما أن قدرة قياس التدفق الخلوي على التمييز في وقت واحد بين الأربطة الحرة والمربوطة دون إجراءات فصل إضافية تتيح الفرصة للتقييم الكمي لديناميكيات ربط الليغاند. تصف الطريقة المقترحة هنا إعداد حبات معايرة ذاتية الصنع لتحديد ارتباط الرباط الفلوري بحويصلات الدهون الفوسفاتية الاصطناعية. هذا النهج لا يحد من اختيار الفلوروفورات المتاحة تجاريا. علاوة على ذلك ، فإن التقنية الموضحة هنا للحصول على البيانات الحركية وتحليلها تمكن من تحسين دقة الوقت. وبالتالي ، يمكن استخدام الطريقة الموضحة هنا بمفردها كخطوة أولى في توصيف تفاعلات البروتين والغشاء أو بالاشتراك مع طرق أخرى (على سبيل المثال ، SPR أو الفحص المجهري) لتحسين دقة القياس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Acknowledgments

تم دعم المؤلفين بمنحة مؤسسة العلوم الروسية 20-74-00133.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A23187 Sigma Aldrich C7522-10MG
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) Thermo Fisher Scientific A37573 fluorescent dye
Apyrase from potatoes Sigma Aldrich A2230
BD FACSCantoII BD Bioscience
bovine serum albumin VWR Life Science AMRESCO Am-O332-0.1
Calcium chloride, anhydrous, powder, ≥97% Sigma Aldrich C4901-100G
Cary Eclipse Fluorescence Spectrometer Agilent
D-(+)-Glucose Sigma Aldrich G7528-1KG
DiIC16(3) (1,1'-Dihexadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate) Thermo Fisher Scientific D384
DMSO Sigma Aldrich D8418
EDTA disodium salt VWR Life Science AMRESCO Am-O105B-0.1
FACSDiva BD Bioscience cytometry data acquisition software
FlowJo Tree Star cytometer software for data analysis
HEPES Sigma Aldrich H4034-500G
Human Factor X Enzyme research HFX 1010
Hydroxylamine hydrochloride Panreac 141914.1209
L-α-phosphatidylcholine (Brain, Porcine) Avanti Polar Lipids 840053P
L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt) Avanti Polar Lipids 840032P
Magnesium chloride Sigma Aldrich M8266-100G
Mini-Extruder Avanti Polar Lipids 610020-1EA
OriginPro 8 SR4 v8.0951 OriginLab Corporation Statistical software
Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, Biotechnology Grade VWR Life Science AMRESCO 97062-732
Potassium chloride Sigma Aldrich P9541-500G
Prostaglandin E1 Cayman Chemical 13010
Sephadex G25 GE Healthcare GE17-0033-01 gel filtration medium for protein purification
Sepharose CL-2B Sigma Aldrich CL2B300-500ML gel filtration medium for platelet purification
Sodium bicarbonate Corning 61-065-RO
Sodium chloride Sigma Aldrich S3014-500G
Sodium phosphate monobasic Sigma Aldrich S3139-250G
Spin collumns with membrane 0.2 µm Sartorius VS0171
Trisodium citrate dihydrate Sigma Aldrich S1804-1KG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoffman, M., Monroe, D. M. A cell-based model of hemostasis. Thrombosis and haemostasis. 85 (6), 958-965 (2001).
  2. Roberts, H. R., Hoffman, M., Monroe, D. M. A cell-based model of thrombin generation. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 32, Suppl 1 32-38 (2006).
  3. Panteleev, M. A., Dashkevich, N. M., Ataullakhanov, F. I. Hemostasis and thrombosis beyond biochemistry: roles of geometry, flow and diffusion. Thrombosis Research. 136 (4), 699-711 (2015).
  4. Podoplelova, N. A., et al. Hysteresis-like binding of coagulation factors X/Xa to procoagulant activated platelets and phospholipids results from multistep association and membrane-dependent multimerization. Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1216-1227 (2016).
  5. Panteleev, M. A., Ananyeva, N. M., Greco, N. J., Ataullakhanov, F. I., Saenko, E. L. Two subpopulations of thrombin-activated platelets differ in their binding of the components of the intrinsic factor X-activating complex. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 3 (11), 2545-2553 (2005).
  6. Kotova, Y., et al. Binding of coagulation factor XIII zymogen to activated platelet subpopulations: roles of integrin αIIbβ3 and fibrinogen. Thrombosis and Haemostasis. 119 (6), 906-915 (2019).
  7. Fay, S. P., Posner, R. G., Swann, W. N., Sklar, L. A. Real-time analysis of the assembly of ligand, receptor, and G protein by quantitative fluorescence flow cytometry. Biochemistry. 30 (20), 5066-5075 (2002).
  8. Nolan, J. P., Shen, B., Park, M. S., Sklar, L. A. Kinetic analysis of human flap endonuclease-1 by flow cytometry. Biochemistry. 35 (36), 11668-11676 (1996).
  9. Sarvazyan, N. A., Lim, W. K., Neubig, R. R. Fluorescence analysis of receptor−G protein interactions in cell membranes. Biochemistry. 41 (42), 12858-12867 (2002).
  10. Sarvazyan, N. A., Neubig, R. R. Analysis of molecular assemblies by flow cytometry: determinants of Gi1 and by binding. Advances in Optical Biophysics. 3256, 122-131 (1998).
  11. De Franceschi, N., et al. ProLIF - Quantitative integrin protein-protein interactions and synergistic membrane effects on proteoliposomes. Journal of Cell Science. 132 (4), (2018).

Tags

الكيمياء الحيوية ، العدد 182 ،
تحليل تفاعل البروتينات ذات العلامات الفلورية مع الحويصلات الدقيقة الفوسفاتية الاصطناعية باستخدام قياس التدفق الخلوي الكمي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Podoplelova, N., Soloveva, P.,… More

Podoplelova, N., Soloveva, P., Garzon Dasgupta, A., Filkova, A., Panteleev, M. Analyzing the Interaction of Fluorescent-Labeled Proteins with Artificial Phospholipid Microvesicles using Quantitative Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (182), e63459, doi:10.3791/63459 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter