Summary
Här beskriver vi en uppsättning metoder för att karakterisera interaktionen mellan proteiner och membran av celler eller mikrovesiklar.
Abstract
I människokroppen fortsätter de flesta av de stora fysiologiska reaktionerna som är involverade i immunsvaret och blodkoagulationen på cellernas membran. Ett viktigt första steg i någon membranberoende reaktion är bindning av protein på fosfolipidmembranet. Ett tillvägagångssätt för att studera proteininteraktion med lipidmembran har utvecklats med hjälp av fluorescerande märkta proteiner och flödescytometri. Denna metod möjliggör studier av protein-membraninteraktioner med användning av levande celler och naturliga eller artificiella fosfolipidblåsor. Fördelen med denna metod är enkelheten och tillgängligheten av reagens och utrustning. I denna metod märks proteiner med användning av fluorescerande färgämnen. Men både självtillverkade och kommersiellt tillgängliga, fluorescerande märkta proteiner kan användas. Efter konjugering med ett fluorescerande färgämne inkuberas proteinerna med en källa till fosfolipidmembranet (mikrovesiklar eller celler) och proverna analyseras med flödescytometri. De erhållna data kan användas för att beräkna de kinetiska konstanterna och jämvikten Kd. Dessutom är det möjligt att uppskatta det ungefärliga antalet proteinbindningsställen på fosfolipidmembranet med användning av speciella kalibreringspärlor.
Introduction
Biomembraner separerar det inre innehållet i djurceller och extracellulärt utrymme. Observera att membran också omger mikrovesiklar som bildas under cellens livscykel och organeller. Cellmembranet består huvudsakligen av lipider och proteiner. Membranproteiner utför signalerings-, struktur-, transport- och limfunktioner. Lipid-dubbelskiktet är emellertid också viktigt för djurcellens inbördes förhållande med det extracellulära utrymmet. Detta papper föreslår en metod för att studera den perifera interaktionen mellan externa proteiner och lipidmembranet.
Det mest slående exemplet på reaktioner som uppträder på det yttre membranskiktet hos en djurcell är blodkoagulationsreaktionen. En viktig egenskap hos blodkoagulation är att alla huvudreaktioner fortsätter på fosfolipidmembranen i celler och mikrovesiklar som härrör från dessa celler och inte i plasma 1,2,3. Membranberoende reaktioner innefattar processen att starta koagulering (på cellmembranen i subendotelet, inflammerat endotel eller aktiverade immunceller, med deltagande av en vävnadsfaktor), alla reaktioner av huvudkaskadaktiveringen av faktorer IX, X, protrombin; aktivering av faktor XI med trombin (på membranen av aktiverade blodplättar, erytrocyter, lipoproteiner och mikrovesiklar); reaktioner av protein C-vägen; inaktivering av koagulationsenzymer (på membranen av endotelceller med deltagande av trombomodulinkofaktorer, endotelprotein C-receptor, heparansulfat); och kontaktvägsreaktioner (på membran av blodplättar och vissa mikrovesiklar med deltagande av okända kofaktorer). Således är det omöjligt att undersöka blodkoagulation utan att studera interaktionen mellan olika plasmaproteiner och membranet i blodceller.
Denna uppsats beskriver en flödescytometribaserad metod för att karakterisera interaktionen mellan proteiner och lipidmembran i celler eller mikrovesiklar. Detta tillvägagångssätt föreslogs ursprungligen för att studera interaktionen mellan blodplasma och blodplättar och artificiella fosfolipidblåsor. Dessutom interagerar de flesta av de studerade proteinerna direkt med negativt laddade membranfosfolipider, särskilt med fosfatidylserin 4,5. Dessutom finns det proteiner vars interaktion med membranet förmedlas av speciella receptorer6.
En viktig förmåga hos flödescytometri är att skilja mellan fria och bundna ligander utan ytterligare separation. Denna funktion av cytometri möjliggör studier av ligandjämviktsbindning vid slutpunkten och hjälper till att utföra kontinuerliga kinetiska mätningar. Tekniken är osofistikerad och kräver inte komplex provberedning. Flödescytometri används aktivt för att kvantitativt studera dynamiken i interaktionen mellan fluorescerande peptider, receptorer och G-proteiner i intakta och tvättmedelsgenomsläppliga neutrofiler7. Detta tillvägagångssätt är också tillämpligt för att utforska protein-DNA-interaktioner och kinetiken för endonukleasaktivitet i realtid8. Med tiden användes denna metod för att kvantitativt studera protein-proteininteraktioner med hög affinitet med renade lipidblåsor9, eller mer allmänt med membranproteiner uttryckta i ett mycket effektivt Sf9-celluttryckssystem10. Kvantitativa metoder har också beskrivits för att karakterisera protein-liposominteraktioner med hjälp av flödescytometri för transmembranproteiner11.
Denna teknik använder självtillverkade kalibreringspärlor för att undvika att använda kommersiellt tillgängliga pärlor7. Kalibreringspärlorna som användes tidigare7 var avsedda att arbeta med fluorescein, vilket väsentligt begränsade sortimentet av tillgängliga fluorescerande ligander på proteinerna. Dessutom erbjuder detta dokument ett nytt sätt att förvärva och analysera kinetiska data för rimlig tidsupplösning. Även om denna metod beskrivs för artificiella fosfolipidblåsiklar, finns det inga uppenbara begränsningar för dess anpassningsförmåga till celler, naturliga vesiklar eller konstgjorda fosfolipidblåsiklar med en annan lipidkomposition. Metoden som beskrivs häri möjliggör uppskattning av parametrarna för interaktion (kpå, kav) och jämvikt (Kd) och underlättar kvantitativ karakterisering av antalet proteinbindningsställen på membranet. Observera att den här tekniken ger en ungefärlig uppskattning av antalet bindningsställen. Fördelarna med metoden är dess relativa enkelhet, tillgänglighet och anpassningsförmåga till inhemska celler och naturliga och konstgjorda mikrovesiklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fluorescerande proteinmärkning
- Materialberedning
- Förbered 1 M natriumbikarbonatbuffert, pH 9,0, förvara den vid 4 °C och använd den inom en vecka.
- Bered 1,5 M hydroxylaminhydrokloridbuffert, pH 8,5, omedelbart före användning.
- Bered en 10 mg/ml lösning av fluorescerande färgämne (se materialförteckningen) i dimetylsulfoxid.
OBS: Denna lösning kan förvaras i en månad vid -20 °C i mörker. - Bered lösningar av renade antikroppar eller andra proteiner vid 1-10 mg / ml.
OBS: Undvik buffertar som innehåller ammoniumjoner eller primära aminer. Ersätt buffertarna som innehåller Tris eller glycerol med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) genom dialys. Varken natriumazid (≤3 mM) eller tiomerosal (≤1 mM) kommer signifikant att påverka konjugeringsreaktionen. - Inkubera gelfiltreringsmediet (se materialtabellen) för proteinrening i PBS över natten vid rumstemperatur eller i 2 timmar vid 60 °C. Applicera gelfiltreringsmediet på spinnkolonner med 0,2 μm membran.
- Beräkna mängden reaktivt färgämne som ska användas för varje reaktion enligt koncentrationen av protein som ska märkas med hjälp av Eq (1).
DärV-färgämne är volymen av färgämneslösningen; Cpr, Vpr och MWpr är proteinets koncentration, volym och molära vikt; MW-färgämne är färgämnets molära vikt; 100 är en enhetsomvandlingsfaktor; MR är det molära förhållandet mellan färgämne och protein i reaktionsblandningen.
OBS: Följande MR rekommenderas för IgG-märkningsreaktioner: MR = 40 om antikroppen är vid 1-3 mg / ml eller MR = 30 om antikroppen är vid 4-10 mg / ml. För koagulationsfaktorer används vanligtvis MR = 5. - Konjugering reaktion
- Blanda proteinlösningen i ett reaktionsrör med en 10x lägre volym 1 M bikarbonatlösning.
- Tillsätt önskad mängd fluorescerande färgämne (se steg 1.2) under kontinuerlig omrörning.
- Inkubera reaktionsblandningen vid rumstemperatur i ca 1 h, skyddad från ljus och under kontinuerlig omrörning.
- Tillsätt 5 μl μl hydroxilaminhydroklorid för varje 200 μL proteinlösning.
- Inkubera reaktionsblandningen vid rumstemperatur i cirka 30 minuter, skyddad från ljus och under kontinuerlig omrörning.
- Förbered snurrkolonnen.
- Tillsätt 500 μL gelfiltreringsmedium för proteinrening till en kolonn. Centrifugera kolonnen i 3 min vid 1 000 × g.
- Kassera bufferten från uppsamlingsröret. Om kolonnen inte är full, tillsätt mer gelfiltreringsmedium och centrifugera kolonnen i 3 minuter vid 1 000 × g. Upprepa detta steg tills kolumnen är full.
- Rening
- Centrifugera reaktionsblandningen (från steg 1.3.5) i 5 min vid 17 000 × g och avlägsna fällningen.
- Överför supernatanten till spinnkolonnen med gelfiltreringsmedium. Låt lösningen absorberas i gelbädden.
- Använd ett tomt uppsamlingsrör för rotationskolonnen och centrifugera det i 5 min vid 1 000 × g. Efter centrifugering, samla det märkta proteinet från uppsamlingsröret.
- Bestämning av graden av märkning
- Korrigera för färgämnets bidrag till absorbansen vid A280 genom mätning av absorbansen hos fritt färgämne vid 280 nm (A280) och λmax för färgämnet (Amax) (se Eq (2)).
(2) - Mät absorbansen hos proteinfärgämneskonjugatet vid 280 nm (A280) och λmax för färgämnet (Amax) och beräkna proteinkonetrationen med Eq (3).
(3)
Där εM är proteinets molära extinktionskoefficient vid 280 nm; d är den optiska banlängden under mätningen av absorbansen, CF är färgämnets bidrag till absorbansen vid A280 (steg 1.6.1). - Beräkna graden av märkning (DOL) med Eq (4).
(4)
Där εM färgämne är färgämnets molära extinktionskoefficient vid λmax nm; d är den optiska banlängden under mätningen av absorbansen, C-protein är koncentrationen av proteinet (steg 1.6.2).
- Korrigera för färgämnets bidrag till absorbansen vid A280 genom mätning av absorbansen hos fritt färgämne vid 280 nm (A280) och λmax för färgämnet (Amax) (se Eq (2)).
(2)
(3)
(4)2. Beredning av fosfolipidblåsiklar
- Framställning och lagring av lipidblandningen
- Kombinera lipiderna i lämpligt förhållande (fosfatidylserin / fosfatidylkolin i ett förhållande av 20 mol% till 80 mol%).
- Torka lipidblandningen efter lyofilisering eller avdunstning och förvara den under en inert atmosfär i glasampuller.
- Produktion av lipidfilm
- Öppna ampullen och resuspendera lipidblandningen i en liten mängd (~ 100 μL) kloroform.
OBS: Använd inte för mycket kloroform eftersom det inte avdunstar helt. - Tillsätt DiIC16(3) i etanol vid 0,2 mol%. Överför lipidblandningen till en rund bottenkolv. Sprid blandningen tunt över kolvens sidor genom att rotera den. Torka lipidblandningen i 30 min under en argonström.
- Öppna ampullen och resuspendera lipidblandningen i en liten mängd (~ 100 μL) kloroform.
- Hydrering av lipidblandningen
- Tillsätt en lämpligt varm (~55 °C) vattenbuffert (HEPES 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4) i en volym som motsvarar den förväntade lipidkoncentrationen till kolven med lipidfilmen. Inkubera blandningen med virvel vid 55 °є i 30 minuter för fullständig hydrering.
- Placera provröret i en frys eller varm termostat för att få lipidsuspensionen att genomgå 3-5 frys-tina cykler.
- Bildning av lipidblåsor genom extrudering
- Förbered extrudern enligt tillverkarens instruktioner. Värm upp alla extruderkomponenter till lipidblandningens fasövergångstemperatur.
- Fyll en av extrudersprutorna med den hydratiserade lipidblandningen. Vänta i 5-10 minuter tills lipidsuspensionens temperatur motsvarar extruderens temperatur.
- Extrudera lipidblandningen genom membranet minst 10 gånger. För den slutliga extruderingen, placera lipidsuspensionen i den alternativa sprutan och leta efter en förändring i utseende från en något nebulös till en klar lösning.
- Förvara den resulterande blandningen av lipidblåsor vid 4 °C, helst i en inert atmosfär av argon eller kväve, i 3–4 dagar. Frys inte.
3. Isolering av blodplättar från helblod
- Samla helblod från friska givare i rör som innehåller 3,2% natriumcitrat.
- Tillsätt prostaglandin E1 (PGE1) (1 μM) och apyras (0,1 U/ml) till blodet, följt av centrifugering vid rumstemperatur vid 100 × g i 8 minuter.
- Efter centrifugering, ta den trombocytrika plasman och tillsätt natriumcitratlösning (106 mM, pH 5,5) till ett plasma/citratförhållande på 3:1. Centrifugera plasman vid rumstemperatur vid 400 × g i 5 min.
- Ta bort supernatanten och återsuspendera pelleten i 300 μL tyrodes buffert utan BSA (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 0,4 mM NaH2PO4, 2,5 mM CaCl2, 5 mM glukos, pH 7,4). Rena blodplättarna från plasmaproteiner genom gelkromatografi på gelfiltreringsmediet för trombocytrening (se materialtabellen).
4. Detektion av protein-lipidinteraktion genom flödescytometri
- Kinetiska bindningsexperiment
- Utspädda fosfolipidblåsor (från steg 2.4.4) i Tyrodes buffert (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 0,4 mM NaH2PO4, 2,5 mM CaCl2, 5 mM glukos, 0,5% BSA, pH 7,4) till en koncentration av 1 μM och total volym på 250 μL.
- Blanda fluorescerande märkt koagulationsfaktor X (fX-fd) från steg 1 i en koncentration av 500 nM med fosfolipidblåsorna från steg 4.1.1 i ett förhållande 1: 1 (slutlig vesikelkoncentration 0,5 μM, fX-fd-koncentrationen är 250 nM fX) till en total volym av 500 μL.
- Injicera omedelbart 500 μl av den blandade suspensionen (~ 20 min för analys med låg flödeshastighet) i flödescytometern. Använd en låg flödeshastighet och se till att tröskeln för kanal FL2 (exсitation 488 nm, emissionsfilter 585/42 nm) är som värde 200. Mät medelvärdet av fluorescensen i kanal FL4 (exсitation 633 nm, emissionsfilter 660/20) för fluorescensfärgämnet från materialtabellen.
OBS: Välj en cytometer utan autosampler. Detta kommer att påskynda processen för injektion av provet i mätcellen. - När mättnad av bindning uppnås (ingen signifikant ökning av fluorescensen inom 5 min), späd snabbt provet 20 gånger med Tyrodes buffert och övervaka dissociationen tills baslinjefluorescens uppnås (fullständig dissociation) eller tills en platå uppnås (ingen signifikant minskning av fluorescensen inom 5 min).
OBS: Som en kontroll, lägg till 10 μM EDTA och övervaka fullständig dissociation i 5 minuter.
- Experiment med jämviktsbindning
OBS: Använd den kinetiska bindningskurvan för att bestämma tiden för att nå mättnad; tiden för mättnad för fX-fd och konstgjorda vesiklar är 20 min.- Inkubera konstgjorda fosfolipidblåsor (5 μM) för bindningsanalysen med olika koncentrationer av fX-fd (från 0 till 1 000 nM) i Tyrodes buffert i 20 min.
- Späd varje prov från steg 4.2.1 med 20x till en slutlig volym på 200 μL med Tyrodes buffert. Analysera omedelbart det utspädda provet med flödescytometri inom 30 s. Använd inställningarna från steg 4.1.3.
OBS: Som en kontroll för ospecifik bindning, använd liknande prover med EDTA (10 μM) och inkubera dem i 5 minuter.
5. Analys av flödescytometridata
- Exportera experiment i FSC-format från cytometri datainsamlingsprogramvara till cytometerprogramvara för dataanalys (se materialtabellen). Välj | Exportera | FCS-filer. Öppna FSC-filer i cytometerprogramvara för dataanalys genom att välja filerna på datorn och dra dem till programmets arbetsyta.
- För gating av mikrovesiklarna, identifiera regionen av mikrovesiklar genom fluorescensen av det lipofila färgämnet DiIC16(3). Använd menykommandon eller rita-knappen i kalkylbladet för att skapa punktdiagram SSC från FL2 (färga DilC16(3)) i loggkoordinater. Välj knappen Rektangulär grind om du vill rita ett grindområde så att händelser från ett prov utan blåsor inte inkluderas i det här området (bild 1B,C).
- Analysera de kinetiska experimenten.
- Skapa ett punktdiagram med hjälp av koordinaterna för fluorescens (FL4) över tid för vesiklarnas område (dubbelklicka i området för vesiklar i steg 5.2)
- Exportera data om förändringen i fluorescens över tid i csv-format. Välj exempel | Högerklicka på | Exportera | Välj FL4 och Tid i parametrar | Välj katalog för att spara | Välj CSV-format | Exportera.
- Öppna CSV-filen i valfri statistisk programvara (se materialförteckningen). Beräkna ett enkelt glidande medelvärde av fluorescens och tid för varje 1 000 händelser.
- Approximera en graf över beroendet av det enkla glidande medelvärdet fluorescens i tid under antagandet om exponentiellt beroende (Analys > Fitting >Nonlinear Curve Fit) och använd detta för att beräkna den kinetiska associeringskonstanten med eq (5).
(5)
Där [XB] är den bundna faktorkoncentrationen vid varje tidpunkt (användardefinierade enheter) enligt det enkla glidande medelvärdet från steg 5.3.3. [X] är den tillsatta faktorkoncentrationen, [X]max är den maximala bundna faktorkoncentrationen, k är föreningskonstanten; t är tiden. - Upprepa samma uppsättning åtgärder (5.3.1-5.3.4) för att beräkna den kinetiska dissociationskonstanten med Eq (6).
(6)
Där [XB] är den bundna faktorkoncentrationen vid varje tidpunkt. [X]0 är den bundna faktorkoncentrationen vid den första tidpunkten, k är dissociationskonstanten; t är tiden.
- Jämviktsbindande analys
- Bestäm den genomsnittliga fluorescensen av fX-fd i vesiklarnas område för varje vald koncentration av fX-fd.
- Approximera beroendet av den bundna faktorn fluorescens från koncentrationen av den tillsatta faktorn i antagandet om enkel enkel bindning på en plats. Beräkna de genomsnittliga bindningsparametrarna med eq (7) från minst tre oberoende upprepningar.
(7)
Där [XB] är den bundna faktorkoncentrationen. [X] är den tillsatta faktorkoncentrationen, nx är det uppenbara antalet bindningsställen per vesikel, Kd är den uppenbara dissociationskonstanten.
(5)
(6)
(7)6. Omvandling av fluorescensintensitet till medelantalet bindningsställen
- Förbered kalibrerade pärlor.
- Inkubera gelfiltrerade blodplättar (se steg 3.3) med A23187 (10 μM) i närvaro av CaCl2 (2,5 mM) i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Lägg till de aktiverade blodplättarna de olika koncentrationerna av fX-fd (0 till 1 000 nM). Tillsätt 2% v/v formaldehyd och inkubera i 1 h. Stoppa reaktionen genom att inkubera blodplättarna med 3 M glycin och 5% BSA i 30 minuter vid rumstemperatur.
- Rena blandningen från det oreagerade färgämnet. Centrifugera blodplättarna i 5 minuter vid 400 × g, ta bort supernatanten och återsuspendera pelleten i Tyrodes buffert (innehållande 0,5% BSA).
OBS: Upprepa steg 6.1.3 tre gånger.
- Mät fluorescensnivån för kalibreringspärlorna i varje prov först med hjälp av en spektrofluorometer (för fluorescerande färgämne från materialförteckningen, excitation 633 nm, emission 670 nm) och sedan med flödescytometern (i kanal FL4: excitation 633 nm, emissionsfilter 660/20). Använd en cellräknare för att bestämma antalet pärlor i varje prov.
- Konvertera fluorescensintensiteten för varje respektive pärlprov till koncentrationen av lösligt fluorescerande färgämne med hjälp av en spektrofluorometer. Beräkna om den fluorescerande färgkoncentrationen för antalet fluoroformolekyler med användning av Eq (8).
(8)
Där Nx är antalet fluorofonmolekyler; C är den fluorescerande färgkoncentrationen; NA är Avogadro konstant; NA = 6,02214076×1023 mol -1. - Skapa ett beroendediagram över pärlornas genomsnittliga fluorescens i en flödescytometer (steg 6.2) på antalet fluorofonmolekyler (se steg 6.3) för varje prov med hjälp av någon statistisk programvara (se materialtabellen). Approximera detta beroende efter linjeproportionalitet (Analys | Passande | Passa linjärt). Från approximationen i Eq (9), beräkna omvandlingsfaktorn för medelfluorescensen till bindningsställen.
(9)
Där MF är medelvärdet för fluorescens av pärlor genom flödescytometri; Nx är antalet fluoroformolekyler per pärla; CF representerar omvandlingsfaktorn för medelfluorescensen till bindningsställen. CF och b erhålls från resultaten av anpassning av grafen med linjär proportionalitet. - Beräkna det skenbara antalet bindningsställen per vesikel av intresse med hjälp av Eq (10).
(10)
Där nx är det uppenbara antalet bindemedel per vesikel av intresse. MF är medelvärdet för fluorescensen hos vesiklarna av intresse genom flödescytometri; CF och b är omvandlingsfaktorer från Eq (8).
(8)
(9)
(10)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flödescytometrimetoden som beskrivs häri används för att karakterisera bindningen av plasmakoagulationsproteiner till aktiverade blodplättar. Dessutom applicerades fosfolipidblåsiklar PS: PC 20:80 som ett modellsystem. Detta dokument fokuserar främst på konstgjorda fosfolipidblåsiklar som ett exempel. Cytometerns parametrar, i synnerhet fotomultiplikatorrörets (PMT) spänning och kompensationen måste väljas för varje specifik anordning, studieobjektet (celler, konstgjorda eller naturliga mikrovesiklar) och de färgämnen som används. Figur 1B,C visar ett exempel på gating konstgjorda fosfolipidblåsor som är ~ 1 μm stora med det införlivade lipofila fluorescerande färgämnet DiIC16 (3). Stor vesikelstorlek och lipofilt fluorescerande färgämne hjälpte till att upptäcka vesiklar med hjälp av en cytometer. Grinden sattes baserat på ett prov som innehöll konstgjorda lipidblåsor av samma storlek men utan fluorescerande färgämne (figur 1B). Endast händelser innanför denna grind användes i analysen.
Kinetiken för proteinbindning till vesiklar analyserades i det första steget. Provet för detta samlades in kontinuerligt enligt beskrivningen i steg 4.1. Ett typiskt punktdiagram visas i figur 1D-F. De erhållna data analyserades med hjälp av flödescytometriprogramvaran. Den resulterande kurvan visas i figur 1G. Heldragna linjer visar approximationskurvorna, från vilka de kinetiska konstanterna för association (kpå) och dissociation (koff) erhölls. Eftersom faktor X binder till fosfolipidblåsiklar reversibelt och Ca2+-beroende, kontrollerade prover med EDTA specificiteten och reversibiliteten hos denna bindning. De resulterande konstanterna visas i tabell 1.
Baserat på bindningens kinetik valdes en tid på 20 min för ytterligare jämviktsexperiment för att beskriva mättnad i bindning exakt. Den genomsnittliga fluorescensintensiteten hos faktorn bestämdes därefter i vesiklarnas område. Varje prov analyserades i närvaro och frånvaro av EDTA. Fluorescensintensiteten i närvaro av EDTA togs som bakgrund och subtraherades från den totala signalen eftersom bindningen av fX till membranet i frånvaro av Ca2+ joner anses vara ospecifik. Den resulterande fluorescensen omvandlades till antalet bindningsställen per vesikel med användning av kalibreringspärlorna.
Figur 1: Specifik bindning av fX till artificiella fosfolipidblåsor. (B, C) Typiska punktdiagram av fosfolipidblåsor utan (B) eller med (C) lipofilt fluorescerande färgämne DiIC16 (3). (D-F) Typiska punktdiagram av faktor X-interaktion med fosfolipidblåsor före (D) eller efter (E) 20-faldig utspädning och i närvaro EDTA (F). (G) Kinetik av FX (250 nM) bindning och dissociation till fosfolipidblåsiklar. (H) Jämviktsinteraktion mellan faktor X och fosfolipidblåsor. Resultaten är medelvärdet ±SD för n = 3 olika prover. Förkortningar: FX = Faktor X; Ph vesiklar = fosfolipidblåsiklar; SSC = sidospridning; a.u. = godtycklig enhet). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Skenbart Kd ± SEM (nM) | kpå ± SEM (μM-1 s-1) | Kav ± SEM (s-1) | Skenbart antal bindningsställen per vesikel ± SEM |
| 400 ± 80 | 0,371 ± 0,012 | 0,019 ± 0,004 | 8 000 ± 800 |
Tabell 1: Parametrar för fX-interaktion med artificiella fosfolipidblåsiklar. Parametrarna bestämdes utifrån kurvorna (se figur 1F,G). Resultaten är medelvärdet ± SEM för n = 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den föreslagna metoden kan anpassas för en grov karakterisering av interaktionen mellan proteiner och fosfolipidmembran från olika källor och kompositioner. Den kvantitativa flödescytometrin som beskrivs här medger ytplasmonresonans (SPR) i flera parametrar. I synnerhet har den en lägre känslighet och tidsupplösning och kräver fluorescerande märkning av proteiner. Fluorescerande märkning kan leda till en förändring i konformation och förlust av aktivitet för många proteiner och kräver därför noggrann kontroll. Denna teknik har dock betydande fördelar jämfört med andra. Denna metod ger en möjlighet att utforska interaktionen mellan proteiner och det ursprungliga cellmembranet, vilket inte lätt implementeras med hjälp av SPR. Dessutom möjliggör tillvägagångssättet uppskattning av antalet proteinbindningsställen på membranytan och kan vara effektivt för vissa analysuppgifter.
Kommersiellt tillgängliga pärlor finns tillgängliga för vissa fluorescerande färgämnen för att räkna bindningsställen. Det finns dock inga sådana pärlor för många allmänt använda färgämnen. Därför är självgjorda pärlor det bästa sättet att lösa detta. Samma celler användes för att förbereda dessa pärlor som för alla andra experiment. Men eftersom pärlorna kräver höga centrifugeringshastigheter under tvätt, kan fosfolipidblåsiklar inte användas. Celler eller vesiklar kan emellertid ersättas med pärlor med aminoreaktiva grupper, som kan konjugeras till det valda färgämnet. Sekvensen av åtgärder kommer att likna dem som beskrivs i steg 6.1.
Begränsningarna för denna kvantitativa flödescytometrimetod är relaterade till de tekniska egenskaperna hos den använda cytometern. Tre olika modeller av flödescytometrar (med de variabla lasrarna, detektorerna, pumparna) applicerades för att reproducera denna teknik utan komplikationer. Valet av en fluorescerande etikett som är lämplig för den använda cytometern måste dock övervägas noggrant eftersom uppsättningen lasrar, detektorer och optiska filter skiljer sig från enhet till enhet, även inom samma modell. Det är nödvändigt att fokusera på cytometerns förmåga att mäta mikropartiklar med en specifik diameter; inte alla instrument är lika kapabla att detektera partiklar vid upplösningar under 200 nm (för att bestämma detta, använd de kalibreringspärlor med fast storlek som tillhandahålls av instrumentets tillverkare). Dessutom kan vissa flödescytometrar, som provtas med hjälp av en sprutpump, i princip inte mäta kontinuerlig bindningskinetik. I detta fall kan kinetiken endast registreras punkt för punkt och ta separata prover för mätning vid vissatidpunkter 4,6.
Flödescytometri används för att undersöka uttrycket av antigener på olika celler - närvaron / frånvaron av ett antigen och andelen cellpopulationer som uttrycker och inte uttrycker detta antigen. Flödescytometrins förmåga att samtidigt diskriminera fria och bundna ligander utan ytterligare separationsförfaranden ger också möjlighet till kvantitativ bedömning av ligandbindande dynamik. Den metod som föreslås här beskriver framställningen av självtillverkade kalibreringspärlor för att kvantifiera bindningen av en fluorescerande ligand till konstgjorda fosfolipidblåsiklar. Detta tillvägagångssätt begränsar inte valet av kommersiellt tillgängliga fluoroforer. Utöver det möjliggör tekniken som beskrivs här för förvärv och analys av kinetiska data förbättrad tidsupplösning. Således kan metoden som beskrivs häri användas ensam som ett första steg för att karakterisera protein-membraninteraktioner eller i kombination med andra metoder (till exempel SPR eller mikroskopi) för att förbättra mätnoggrannheten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Författarna stöddes av ett bidrag från Russian Science Foundation 20-74-00133.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A23187 | Sigma Aldrich | C7522-10MG | |
| Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | Thermo Fisher Scientific | A37573 | fluorescent dye |
| Apyrase from potatoes | Sigma Aldrich | A2230 | |
| BD FACSCantoII | BD Bioscience | ||
| bovine serum albumin | VWR Life Science AMRESCO | Am-O332-0.1 | |
| Calcium chloride, anhydrous, powder, ≥97% | Sigma Aldrich | C4901-100G | |
| Cary Eclipse Fluorescence Spectrometer | Agilent | ||
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7528-1KG | |
| DiIC16(3) (1,1'-Dihexadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate) | Thermo Fisher Scientific | D384 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D8418 | |
| EDTA disodium salt | VWR Life Science AMRESCO | Am-O105B-0.1 | |
| FACSDiva | BD Bioscience | cytometry data acquisition software | |
| FlowJo | Tree Star | cytometer software for data analysis | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034-500G | |
| Human Factor X | Enzyme research | HFX 1010 | |
| Hydroxylamine hydrochloride | Panreac | 141914.1209 | |
| L-α-phosphatidylcholine (Brain, Porcine) | Avanti Polar Lipids | 840053P | |
| L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids | 840032P | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | M8266-100G | |
| Mini-Extruder | Avanti Polar Lipids | 610020-1EA | |
| OriginPro 8 SR4 v8.0951 | OriginLab Corporation | Statistical software | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, Biotechnology Grade | VWR Life Science AMRESCO | 97062-732 | |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9541-500G | |
| Prostaglandin E1 | Cayman Chemical | 13010 | |
| Sephadex G25 | GE Healthcare | GE17-0033-01 | gel filtration medium for protein purification |
| Sepharose CL-2B | Sigma Aldrich | CL2B300-500ML | gel filtration medium for platelet purification |
| Sodium bicarbonate | Corning | 61-065-RO | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S3014-500G | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S3139-250G | |
| Spin collumns with membrane 0.2 µm | Sartorius | VS0171 | |
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma Aldrich | S1804-1KG |
References
- Hoffman, M., Monroe, D. M.
- Roberts, H. R., Hoffman, M., Monroe, D. M.
- Panteleev, M. A., Dashkevich, N. M., Ataullakhanov, F. I. Hemostasis and thrombosis beyond biochemistry: roles of geometry, flow and diffusion. Thrombosis Research. 136 (4), 699-711 (2015).
- Podoplelova, N. A., et al. Hysteresis-like binding of coagulation factors X/Xa to procoagulant activated platelets and phospholipids results from multistep association and membrane-dependent multimerization. Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1216-1227 (2016).
- Panteleev, M. A., Ananyeva, N. M., Greco, N. J., Ataullakhanov, F. I., Saenko, E. L. Two subpopulations of thrombin-activated platelets differ in their binding of the components of the intrinsic factor X-activating complex. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 3 (11), 2545-2553 (2005).
- Kotova, Y., et al. Binding of coagulation factor XIII zymogen to activated platelet subpopulations: roles of integrin αIIbβ3 and fibrinogen. Thrombosis and Haemostasis. 119 (6), 906-915 (2019).
- Fay, S. P., Posner, R. G., Swann, W. N., Sklar, L. A. Real-time analysis of the assembly of ligand, receptor, and G protein by quantitative fluorescence flow cytometry. Biochemistry. 30 (20), 5066-5075 (2002).
- Nolan, J. P., Shen, B., Park, M. S., Sklar, L. A. Kinetic analysis of human flap endonuclease-1 by flow cytometry. Biochemistry. 35 (36), 11668-11676 (1996).
- Sarvazyan, N. A., Lim, W. K., Neubig, R. R. Fluorescence analysis of receptor−G protein interactions in cell membranes. Biochemistry. 41 (42), 12858-12867 (2002).
- Sarvazyan, N. A., Neubig, R. R. Analysis of molecular assemblies by flow cytometry: determinants of Gi1 and by binding. Advances in Optical Biophysics. 3256, 122-131 (1998).
- De Franceschi, N., et al. ProLIF - Quantitative integrin protein-protein interactions and synergistic membrane effects on proteoliposomes. Journal of Cell Science. 132 (4), (2018).
