Analyse af interaktionen mellem fluorescerende mærkede proteiner med kunstige fosfolipidmikrovesikler ved hjælp af kvantitativ flowcytometri

Summary

Her beskriver vi et sæt metoder til karakterisering af interaktionen mellem proteiner og membraner af celler eller mikrovesikler.

Abstract

I menneskekroppen fortsætter de fleste af de vigtigste fysiologiske reaktioner, der er involveret i immunresponset og blodkoagulationen, på cellernes membraner. Et vigtigt første skridt i enhver membranafhængig reaktion er binding af protein på fosfolipidmembranen. En tilgang til at studere proteininteraktion med lipidmembraner er udviklet ved hjælp af fluorescerende mærkede proteiner og flowcytometri. Denne metode tillader undersøgelse af protein-membran interaktioner ved anvendelse af levende celler og naturlige eller kunstige phospholipid vesikler. Fordelen ved denne metode er enkelheden og tilgængeligheden af reagenser og udstyr. I denne metode mærkes proteiner ved hjælp af fluorescerende farvestoffer. Imidlertid kan både selvfremstillede og kommercielt tilgængelige, fluorescerende mærkede proteiner anvendes. Efter konjugering med et fluorescerende farvestof inkuberes proteinerne med en kilde til phospholipidmembranen (mikrovesikler eller celler), og prøverne analyseres ved flowcytometri. De opnåede data kan bruges til at beregne de kinetiske konstanter og ligevægt K_d. Derudover er det muligt at estimere det omtrentlige antal proteinbindingssteder på fosfolipidmembranen ved hjælp af specielle kalibreringsperler.

Introduction

Biomembraner adskiller det indre indhold af dyreceller og ekstracellulært rum. Bemærk, at membraner også omgiver mikrovesikler dannet under cellens livscyklus og organeller. Cellemembranen består overvejende af lipider og proteiner. Membranproteiner udfører signal-, struktur-, transport- og klæbefunktioner. Lipiddobbeltlaget er imidlertid også afgørende for sammenhængen mellem dyrecellen og det ekstracellulære rum. Dette papir foreslår en metode til undersøgelse af den perifere interaktion mellem eksterne proteiner og lipidmembranen.

Det mest slående eksempel på reaktioner, der forekommer på det ydre membranlag af en dyrecelle, er blodkoagulationsreaktionen. Et vigtigt træk ved blodkoagulation er, at alle hovedreaktioner fortsætter på fosfolipidmembranerne i celler og mikrovesikler, der stammer fra disse celler og ikke i plasma ^1,2,3. Membranafhængige reaktioner indbefatter processen med at starte koagulation (på cellemembranerne i subendotelet, betændt endotel eller aktiverede immunceller med deltagelse af en vævsfaktor), alle reaktioner af hovedkaskadeaktivering af faktorer IX, X, protrombin; aktivering af faktor XI med thrombin (på membranerne i aktiverede blodplader, erythrocytter, lipoproteiner og mikrovesikler); reaktioner af protein C-vejen; inaktivering af koagulationsenzymer (på membranerne i endotelceller med deltagelse af trombomodulinkofaktorer, endotelprotein C-receptor, heparansulfat); og kontaktvejsreaktioner (på membraner af blodplader og nogle mikrovesikler med deltagelse af ukendte cofaktorer). Det er således umuligt at undersøge blodkoagulation uden at studere interaktionen mellem forskellige plasmaproteiner og blodcellernes membran.

Dette papir beskriver en flow-cytometribaseret metode til karakterisering af interaktionen mellem proteiner og lipidmembraner i celler eller mikrovesikler. Denne fremgangsmåde blev oprindeligt foreslået for at studere interaktionen mellem blodplasma og blodplader og kunstige fosfolipidvesikler. Desuden interagerer de fleste af de undersøgte proteiner direkte med negativt ladede membranphospholipider, især med phosphatidylserin ^4,5. Derudover er der proteiner, hvis interaktion med membranen medieres af specielle receptorer⁶.

En vigtig evne til flowcytometri er at skelne mellem frie og bundne ligander uden yderligere adskillelse. Denne funktion af cytometri tillader undersøgelse af ligandligevægtbinding ved slutpunktet og hjælper med at udføre kontinuerlige kinetiske målinger. Teknikken er usofistikeret og kræver ikke kompleks prøveforberedelse. Flowcytometri bruges aktivt til kvantitativt at studere dynamikken i interaktion mellem fluorescerende peptider, receptorer og G-proteiner i intakte og vaskemiddelgennemtrængelige neutrofiler⁷. Denne tilgang kan også anvendes til udforskning af protein-DNA-interaktioner og kinetikken af endonukleaseaktivitet i realtid⁸. Over tid blev denne metode brugt til kvantitativt at studere protein-proteininteraktioner med høj affinitet med oprensede lipidvesikler⁹ eller mere generelt med membranproteiner udtrykt i et meget effektivt Sf9-celleekspressionssystem¹⁰. Kvantitative metoder er også blevet beskrevet til karakterisering af protein-liposominteraktioner ved anvendelse af flowcytometri til transmembranproteiner¹¹.

Denne teknik bruger selvfremstillede kalibreringsperler for at undgå at bruge kommercielt tilgængelige perler⁷. Kalibreringsperlerne, der blev brugt tidligere⁷ , var beregnet til at arbejde med fluorescein, hvilket væsentligt begrænsede sortimentet af tilgængelige fluorescerende ligander på proteinerne. Derudover tilbyder dette papir en ny måde at erhverve og analysere kinetiske data til rimelig tidsopløsning. Selvom denne metode er beskrevet for kunstige fosfolipidvesikler, er der ingen åbenlyse begrænsninger for dens tilpasningsevne til celler, naturlige vesikler eller kunstige fosfolipidvesikler med en anden lipidsammensætning. Metoden beskrevet heri tillader estimering af parametrene for interaktion (k_on, k_off) og ligevægt (K_d) og letter kvantitativ karakterisering af antallet af proteinbindingssteder på membranen. Bemærk, at denne teknik giver et omtrentligt skøn over antallet af bindingssteder. Fordelene ved metoden er dens relative enkelhed, tilgængelighed og tilpasningsevne til indfødte celler og naturlige og kunstige mikrovesikler.

Protocol

1. Fluorescerende protein mærkning

1. Materiale forberedelse
   1. Forbered 1 M natriumbicarbonatbuffer, pH 9,0, opbevar den ved 4 °C, og brug den inden for en uge.
   2. Der fremstilles 1,5 M hydroxylaminhydrochloridbuffer, pH 8,5, umiddelbart før brug.
   3. Der fremstilles en 10 mg/ml opløsning af fluorescerende farvestof (se materialetabellen) i dimethylsulfoxid.
      BEMÆRK: Denne opløsning kan opbevares i en måned ved -20 °C i mørke.
   4. Der fremstilles opløsninger af oprensede antistoffer eller andre proteiner ved 1-10 mg/ml.
      BEMÆRK: Undgå buffere indeholdende ammoniumioner eller primære aminer. Bufferne indeholdende Tris eller glycerol erstattes med phosphatbufferet saltvand (PBS) ved dialyse. Hverken natriumazid (≤3 mM) eller thimerosal (≤1 mM) vil påvirke konjugeringsreaktionen signifikant.
   5. Gelfiltreringsmediet (se materialetabellen) inkuberes til proteinrensning i PBS natten over ved stuetemperatur eller i 2 timer ved 60 °C. Gelfiltreringsmediet påføres spinkolonner med 0,2 μm membraner.
2. Mængden af reaktivt farvestof, der skal anvendes til hver reaktion, beregnes i henhold til den proteinkoncentration, der skal mærkes, ved anvendelse af Eq (1).
   
   Hvor_V-farvestof er volumenet af farvestofopløsningen; C_pr, V_pr og MW_pr er proteinets koncentration, volumen og molvægt; MW_farvestof er farvestoffets molære vægt; 100 er en enhedskonverteringsfaktor; MR er det molære forhold mellem farvestof og protein i reaktionsblandingen.
   BEMÆRK: Følgende TR'er anbefales til IgG-mærkningsreaktioner: MR = 40, hvis antistoffet er ved 1-3 mg / ml eller MR = 30, hvis antistoffet er ved 4-10 mg / ml. Til koagulationsfaktorer anvendes MR = 5 normalt.
3. Konjugering reaktion
   1. I et reaktionsrør blandes proteinopløsningen med et 10x lavere volumen af 1 M bicarbonatopløsning.
   2. Der tilsættes den nødvendige mængde fluorescerende farvestof (se trin 1.2) under kontinuerlig omrøring.
   3. Reaktionsblandingen inkuberes ved stuetemperatur i ca. 1 time, beskyttet mod lys og under kontinuerlig omrøring.
   4. For hver 200 μL proteinopløsning tilsættes 5 μL 1,5 M hydroxylaminhydrochlorid.
   5. Reaktionsblandingen inkuberes ved stuetemperatur i ca. 30 minutter, beskyttet mod lys og under kontinuerlig omrøring.
4. Forbered spinkolonnen.
   1. Tilsæt 500 μL gelfiltreringsmedium til proteinrensning til en søjle. Centrifuger søjlen i 3 minutter ved 1.000 × g.
   2. Kassér bufferen fra opsamlingsrøret. Hvis søjlen ikke er fuld, tilsættes mere gelfiltreringsmedium, og søjlen centrifugeres i 3 minutter ved 1.000 × g. Gentag dette trin, indtil kolonnen er fuld.
5. Rensning
   1. Reaktionsblandingen (fra trin 1.3.5) centrifugeres i 5 min. ved 17.000 × g , og bundfaldet fjernes.
   2. Overfør supernatanten til spinkolonnen med gelfiltreringsmedium. Lad opløsningen absorbere i gellejet.
   3. Brug et tomt opsamlingsrør til spinkolonnen og centrifuger det i 5 minutter ved 1.000 × g. Efter centrifugering opsamles det mærkede protein fra opsamlingsrøret.
6. Bestemmelse af graden af mærkning
   1. Korrigeres for farvestoffets bidrag til absorbansen ved A₂₈₀ ved måling af absorbansen af frit farvestof ved 280 nm (A₂₈₀) og λ_max for farvestoffet (A_max) (se Eq (2)).
      (2)
   2. Absorbansen af proteinfarvestofkonjugatet måles ved 280 nm (A₂₈₀) og _λ-max for farvestoffet (A_max), og proteinkontegraationen beregnes ved hjælp af Eq (3).
      (3)
      Hvor ε_M er proteinets molære uddøenningskoefficient ved 280 nm; d er den optiske banelængde under målingen af absorbansen CF er farvestoffets bidrag til absorbansen ved A₂₈₀ (trin 1.6.1).
   3. Beregn graden af mærkning (DOL) ved hjælp af Eq (4).
      (4)
      Hvor ε_{M farvestof farvestof farvestoffets} molære udryddelseskoefficient ved λ_max nm; d er den optiske banelængde under målingen af absorbansen _C-protein er koncentrationen af proteinet (trin 1.6.2).

2. Fremstilling af fosfolipidvesikler

1. Forberedelse og opbevaring af lipidblandingen
   1. Kombiner lipiderne i det passende forhold (phosphatidylserin / phosphatidylcholin i et forhold på 20 mol% til 80 mol%).
   2. Tør lipidblandingen efter frysetørring eller fordampning og opbevar den under en inert atmosfære i glasampuller.
2. Produktion af lipidfilm
   1. Åbn ampullen, og resuspend lipidblandingen i en lille mængde (~ 100 μL) chloroform.
      BEMÆRK: Brug ikke for meget chloroform, da det ikke fordamper helt.
   2. Der tilsættes DiIC16(3) i ethanol ved 0,2 mol%. Lipidblandingen overføres til en rundbundet kolbe. Bland blandingen tyndt over kolbens sider ved at dreje den. Tør lipidblandingen i 30 minutter under en argonstrøm.
3. Hydrering af lipidblandingen
   1. Der tilsættes en passende varm (~55 °C) vandig buffer (HEPES 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4) i et volumen svarende til den forventede lipidkoncentration til kolben med lipidfilmen. Inkuber blandingen med hvirvel ved 55 °є i 30 minutter for fuldstændig hydrering.
   2. Placering af prøverøret i en fryser eller varm termostat for at få lipidsuspensionen til at gennemgå 3-5 fryse-optøningscyklusser.
4. Dannelse af lipidvesikler ved ekstrudering
   1. Forbered ekstruderen i henhold til producentens anvisninger. Varm alle ekstruderkomponenterne op til lipidblandingens faseovergangstemperatur.
   2. Fyld en af ekstrudersprøjterne med den hydrerede lipidblanding. Vent i 5-10 minutter, indtil temperaturen på lipidsuspensionen balancerer med ekstruderens temperatur.
   3. Ekstruder lipidblandingen gennem membranen mindst 10 gange. For den endelige ekstrudering skal du placere lipidsuspensionen i den alternative sprøjte og se efter en ændring i udseende fra en let tåget til en klar opløsning.
   4. Den resulterende blanding af lipidblærer opbevares ved 4 °C, fortrinsvis i en inert atmosfære af argon eller nitrogen, i 3-4 dage. Må ikke fryses.

3. Isolering af blodplader fra fuldblod

1. Saml fuldblod fra raske donorer i rør indeholdende 3,2% natriumcitrat.
2. Prostaglandin E1 (PGE1) (1 μM) og apyrase (0,1 U/ml) tilsættes til blodet efterfulgt af centrifugering ved stuetemperatur ved 100 × g i 8 min.
3. Efter centrifugering udtages det trombocytrige plasma, og natriumcitratopløsningen (106 mM, pH 5,5) tilsættes til et plasma/citratforhold på 3:1. Plasmaet centrifugeres ved stuetemperatur ved 400 × g i 5 min.
4. Supernatanten fjernes, og pelleten genanvendes i 300 μL Tyrodes buffer uden BSA (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM_MgCl2, 0,4 mM NaH₂PO₄, 2,5 mM CaCl₂, 5 mM glucose, pH 7,4). Rens blodpladerne fra plasmaproteiner ved gelkromatografi på gelfiltreringsmediet til blodpladeoprensning (se materialetabellen).

4. Påvisning af protein - lipidinteraktion ved flowcytometri

1. Kinetiske bindingseksperimenter
   1. Fosfolipidvesikler (fra trin 2.4.4) fortyndes i Tyrodes buffer (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 0,4 mM NaH_{2 PO4}, 2,5 mM CaCl₂, 5 mM glucose, 0,5% BSA, pH 7,4) til en koncentration på 1 μM og et samlet volumen på 250 μL.
   2. Fluorescerende mærket koagulationsfaktor X (fX-fd) fra trin 1 i en koncentration på 500 nM med fosfolipidvesklerne fra trin 4.1.1 i et forhold på 1: 1 (endelig vesikelkoncentration 0,5 μM, fX-fd koncentration er 250 nM fX) til et samlet volumen på 500 μL.
   3. Injicer straks 500 μL af den blandede suspension (~ 20 minutter til analyse med en lav strømningshastighed) i flowcytometeret. Brug en lav strømningshastighed, og sørg for, at tærsklen for kanal FL2 (exсitation 488 nm, emissionsfilter 585/42 nm) er som værdi 200. Mål den gennemsnitlige fluorescens i kanal FL4 (exсitation 633 nm, emissionsfilter 660/20) for fluorescensfarvestoffet fra materialetabellen.
      BEMÆRK: Vælg et cytometer uden en autosampler. Dette vil fremskynde injektionsprocessen af prøven i målecellen.
   4. Når bindingsmætning er opnået (ingen signifikant stigning i fluorescens inden for 5 minutter), fortyndes prøven hurtigt 20 gange med Tyrodes buffer, og dissociationen overvåges, indtil baseline fluorescens er nået (fuldstændig dissociation) eller indtil et plateau er nået (intet signifikant fald i fluorescens inden for 5 minutter).
      BEMÆRK: Som kontrol skal du tilføje 10 μM EDTA og overvåge fuldstændig dissociation i 5 minutter.
2. Eksperimenter med ligevægtsbinding
   BEMÆRK: Brug den kinetiske kurve for binding til at bestemme tiden for at nå mætning; tiden for mætning for fX-fd og kunstige vesikler er 20 min.
   1. Kunstige fosfolipidvesikler (5 μM) inkuberes til bindingsassay med forskellige koncentrationer af fX-fd (fra 0 til 1.000 nM) i Tyrodes buffer i 20 min.
   2. Hver prøve fortyndes fra trin 4.2.1 x 20x til et endeligt volumen på 200 μL med Tyrodes buffer. Analysér straks den fortyndede prøve ved flowcytometri inden for 30 s. Brug indstillinger fra trin 4.1.3.
      BEMÆRK: Som en kontrol for uspecifik binding skal du bruge lignende prøver med EDTA (10 μM) og inkubere dem i 5 min.

5. Analyse af flowcytometridata

1. Eksporter eksperimenter i FSC-format fra cytometridataopsamlingssoftware til cytometersoftware til dataanalyse (se materialetabellen). Vælg | Eksport | FCS-filer. Åbn FSC-filer i cytometersoftware til dataanalyse ved at vælge filerne på computeren og trække dem til programmets arbejdsområde.
2. Til gating af mikrovesiklerne identificeres mikrovesiklernes region ved fluorescensen af det lipofile farvestof DiIC₁₆(3). Brug menukommandoer eller afbildningsknap i regnearket til at oprette punktdiagram SSC fra FL2 (farvestof DilC₁₆(3)) i logkoordinater. Vælg knappen Rektangulær port for at tegne et gatingområde, så hændelser fra en prøve uden vesikler ikke medtages i dette område (figur 1B,C).
3. Analyser de kinetiske eksperimenter.
   1. Opret et prikplot ved hjælp af fluorescenskoordinaterne (FL4) over tid for vesiklernes område (dobbeltklik i vesiklerområdet i trin 5.2)
   2. Eksporter dataene om ændringen i fluorescens over tid i csv-format. Vælg | Højreklik på | Eksport | Vælg FL4 og Tid i Parametre | Vælg mappe til lagring af | Vælg CSV-format | Udførsel.
   3. Åbn CSV-filen i enhver statistisk software (se materialetabellen). Beregn et simpelt glidende gennemsnit af fluorescens og tid for hver 1.000 hændelser.
   4. Tilnærme en graf over afhængigheden af den enkle glidende gennemsnitlige fluorescens til tiden under antagelse af eksponentiel afhængighed (Analyse > Fitting >Nonlinear Curve Fit) og brug denne til at beregne den kinetiske associeringskonstant ved hjælp af Eq (5).
      (5)
      Hvor [X^B] er den bundne faktorkoncentration på hvert tidspunkt (brugerdefinerede enheder) i henhold til det simple glidende gennemsnit fra trin 5.3.3 [X] er koncentrationen af den tilsatte faktor [X]_max er den maksimale bundne faktorkoncentration k er foreningen konstant; t er tiden.
   5. Det samme sæt handlinger gentages (5.3.1-5.3.4) for at beregne den kinetiske dissociationskonstant ved hjælp af Eq (6).
      (6)
      Hvor [X^B] er den bundne faktorkoncentration på hvert tidspunkt [X]₀ er den bundne faktorkoncentration i begyndelsesøjeblikket k er dissociationskonstanten; t er tiden.
4. Ligevægtsbindende assay
   1. Den gennemsnitlige fluorescens af fX-fd i vesiklernes område bestemmes for hver valgt koncentration af fX-fd.
   2. Tilnærmet afhængigheden af den bundne faktor fluorescens fra koncentrationen af den tilsatte faktor i antagelsen om simpel enkeltstedsbinding. Beregn de gennemsnitlige bindingsparametre ved hjælp af Eq (7) fra mindst tre uafhængige gentagelser.
      (7)
      Hvor [X^B] er den bundne faktorkoncentration [X] er koncentrationen af den tilsatte faktor n^x er det tilsyneladende antal bindingssteder pr. vesikel; K_d er den tilsyneladende dissociationskonstant.

6. Konvertering af fluorescensintensitet til det gennemsnitlige antal bindingssteder

1. Forbered kalibrerede perler.
   1. Gelfiltrerede blodplader (se trin 3.3) inkuberes med A23187 (10 μM) i nærværelse af_CaCl2 (2,5 mM) i 10 minutter ved stuetemperatur.
   2. Til de aktiverede blodplader tilsættes de forskellige koncentrationer af fX-fd (0 til 1.000 nM). Tilsæt 2% v/v formaldehyd og inkuberes i 1 time. Stop reaktionen ved at inkubere blodpladerne med 3 M glycin og 5% BSA i 30 minutter ved stuetemperatur.
   3. Rens blandingen fra det ikke-reagerede farvestof. Blodpladerne centrifugeres i 5 minutter ved 400 × g, supernatanten fjernes, og pelleten resuspenderes i Tyrodes buffer (indeholdende 0,5% BSA).
      BEMÆRK: Gentag trin 6.1.3 tre gange.
2. Kalibreringsperlernes fluorescensniveau måles først ved hjælp af et spektrofluorometer (for fluorescerende farvestof fra materialetabellen, excitering 633 nm, emission 670 nm) og derefter ved hjælp af flowcytometeret (i kanal FL4: excitering 633 nm, emissionsfilter 660/20). Brug en celletæller til at bestemme antallet af perler i hver prøve.
3. Fluorescensintensiteten af hver enkelt perleprøve konverteres til koncentrationen af opløseligt fluorescerende farvestof ved hjælp af et spektrofluorometer. Genberegn den fluorescerende farvestofkoncentration for antallet af fluoroformolekyler ved anvendelse af Eq (8).
   (8)
   Hvor N_x er antallet af fluoroformolekyler; C er den fluorescerende farvestofkoncentration; N_A er Avogadro konstant; N_A = 6,02214076×10²³ mol ^-1.
4. Opret en afhængighedsgraf for den gennemsnitlige fluorescens af perlerne i et flowcytometer (trin 6.2) på antallet af fluoroformolekyler (se trin 6.3) for hver prøve ved hjælp af statistisk software (se materialetabellen). Tilnærme denne afhængighed efter linjeproportionalitet (Analyse | Montering af | Passer lineært). Ud fra tilnærmelsen i Eq (9) beregnes omregningsfaktoren for middelfluorescensen til bindingsstederne.
   (9)
   Hvor MF er den gennemsnitlige fluorescens af perler ved flowcytometri; Nx er antallet af fluorophoremolekyler pr. perle; CF repræsenterer omregningsfaktoren for den gennemsnitlige fluorescens til bindingssteder. CF og b opnås ved resultaterne af tilpasning af grafen ved lineær proportionalitet.
5. Det tilsyneladende antal bindingssteder pr. vesikel af interesse beregnes ved hjælp af Eq (10).
   (10)
   Hvor nx er det tilsyneladende antal bindingssteder pr. vesikel af interesse; MF er den gennemsnitlige fluorescens af vesikler af interesse ved flowcytometri; CF og b er omregningsfaktorer fra Eq (8).

Representative Results

Flowcytometrimetoden beskrevet heri anvendes til at karakterisere bindingen af plasmakoagulationsproteiner til aktiverede blodplader. Derudover blev fosfolipidvesikler PS:PC 20:80 anvendt som et modelsystem. Dette papir fokuserer primært på kunstige fosfolipidvesikler som et eksempel. Parametrene for cytometeret, især fotomultiplierrørets (PMT) spænding og kompensationen, skal vælges for hver specifik enhed, genstanden for undersøgelsen (celler, kunstige eller naturlige mikrovesikler) og de anvendte farvestoffer. Figur 1B,C viser et eksempel på gating kunstige fosfolipidvesikler, der er ~ 1 μm i størrelse med det inkorporerede lipofile fluorescerende farvestof DiIC16 (3). Stor vesikelstørrelse og lipofilt fluorescerende farvestof hjalp med at detektere vesikler ved hjælp af et cytometer. Porten blev sat på baggrund af en prøve indeholdende kunstige lipidblærer af samme størrelse, men uden det fluorescerende farvestof (figur 1B). Kun begivenheder inden for denne port blev brugt i analysen.

Kinetikken af proteinbinding til vesikler blev analyseret i første fase. Prøven hertil blev indsamlet kontinuerligt som beskrevet i trin 4.1. Et typisk prikdiagram er vist i figur 1D-F. De opnåede data blev analyseret ved hjælp af flowcytometrisoftwaren. Den resulterende kurve er vist i figur 1G. Faste linjer viser kurverne for tilnærmelse, hvorfra de kinetiske konstanter for forening (k_on) og dissociation (k_off) blev opnået. Da faktor X binder sig reversibelt til fosfolipidvesikler og Ca²⁺-afhængig, kontrollerede prøver med EDTA specificiteten og reversibiliteten af denne binding. De resulterende konstanter er vist i tabel 1.

Baseret på bindingens kinetik blev der valgt en tid på 20 min til yderligere ligevægtseksperimenter for at beskrive mætning i binding nøjagtigt. Faktorens gennemsnitlige fluorescensintensitet blev efterfølgende bestemt i vesiklernes område. Hver prøve blev analyseret i nærvær og fravær af EDTA. Fluorescensintensiteten i nærvær af EDTA blev taget som baggrund og trukket fra det samlede signal, da bindingen af fX til membranen i fravær af Ca²⁺ ioner betragtes som uspecifik. Den resulterende fluorescens blev konverteret til antallet af bindingssteder pr. vesikel ved hjælp af kalibreringsperlerne.

Figur 1: Specifik binding af fX til kunstige fosfolipidvesikler. (A) Forsøgsordning. (B, C) Typiske prikplotter af fosfolipidvesikler uden (B) eller med (C) lipofilt fluorescerende farvestof DiIC16 (3). (D-F) Typiske prikdiagrammer for faktor X-interaktion med fosfolipidvesikler før (D) eller efter (E) 20-fold fortynding og i nærvær EDTA (F). (G) Kinetik af FX (250 nM) binding og dissociation til phospholipid vesikler. (H) Ligevægtsinteraktion mellem faktor X og fosfolipidvesikler. Resultater er midlerne ±SD for n = 3 forskellige prøver. Forkortelser: FX = Faktor X; Ph vesikler = fosfolipid vesikler; SSC = sidespredning; a.u. = vilkårlig enhed). Klik her for at se en større version af denne figur.

Tilsyneladende Kd ± SEM (nM)	kpå ± SEM (μM-1 s-1)	Kud ± SEM (s-1)	Tilsyneladende antal bindingssteder pr. vesikel ± SEM
400 ± 80	0,371 ± 0,012	0,019 ± 0,004	8.000 ± 800

Tabel 1: Parametre for fX-interaktion med kunstige fosfolipidvesikler. Parametre blev bestemt ud fra kurverne (se figur 1F,G). Resultaterne er den gennemsnitlige ± SEM for n = 3.

Discussion

Den foreslåede metode kan tilpasses til en grov karakterisering af interaktionen mellem proteiner og fosfolipidmembraner fra forskellige kilder og sammensætninger. Den kvantitative flowcytometri, der er beskrevet her, indrømmer overfladeplasmonresonans (SPR) i flere parametre. Det har især en lavere følsomhed og tidsopløsning og kræver fluorescerende mærkning af proteiner. Fluorescerende mærkning kan føre til en ændring i konformation og tab af aktivitet for mange proteiner og kræver derfor omhyggelig kontrol. Denne teknik har imidlertid betydelige fordele i forhold til andre. Denne metode giver mulighed for at udforske interaktionen mellem proteiner og den oprindelige cellemembran, som ikke let implementeres ved hjælp af SPR. Desuden tillader tilgangen estimering af antallet af proteinbindingssteder på membranoverfladen og kan være effektiv til nogle analyseopgaver.

Kommercielt tilgængelige perler er tilgængelige for nogle fluorescerende farvestoffer til at tælle bindingssteder. Der er dog ingen sådanne perler til mange meget anvendte farvestoffer. Derfor er selvfremstillede perler den bedste måde at løse dette på. De samme celler blev brugt til at forberede disse perler som for alle andre eksperimenter. Men da perlerne kræver høje centrifugeringshastigheder under vask, kan fosfolipidvesikler ikke anvendes. Imidlertid kan celler eller vesikler erstattes med perler med aminoreaktive grupper, som kan konjugeres til det valgte farvestof. Rækkefølgen af handlinger svarer til dem, der er beskrevet i trin 6.1.

Begrænsningerne ved denne kvantitative flowcytometrimetode er relateret til det anvendte cytometers tekniske egenskaber. Tre forskellige modeller af flowcytometre (med de variable lasere, detektorer, pumper) blev anvendt til at gengive denne teknik uden komplikationer. Valget af en fluorescerende etiket, der passer til det anvendte cytometer, skal dog overvejes nøje, fordi sættet af lasere, detektorer og optiske filtre er forskelligt fra enhed til enhed, selv inden for samme model. Det er nødvendigt at fokusere på cytometerets evne til at måle mikropartikler med en bestemt diameter; ikke alle instrumenter er lige i stand til at detektere partikler ved opløsninger under 200 nm (for at bestemme dette skal du bruge kalibreringsperler i fast størrelse leveret af instrumentets producent). Derudover kan nogle flowcytometre, der udtages ved hjælp af en sprøjtepumpe, i princippet ikke måle kontinuerlig bindingskinetik. I dette tilfælde kan kinetikken kun registreres punkt for punkt, idet der udtages separate prøver til måling på bestemte tidspunkter ^4,6.

Flowcytometri bruges til at undersøge ekspressionen af antigener på forskellige celler - tilstedeværelsen / fraværet af et antigen og procentdelen af cellepopulationer, der udtrykker og ikke udtrykker dette antigen. Flowcytometriens evne til samtidig at diskriminere frie og bundne ligander uden yderligere separationsprocedurer giver også mulighed for kvantitativ vurdering af ligandbindende dynamik. Den metode, der foreslås heri, beskriver fremstillingen af selvfremstillede kalibreringsperler for at kvantificere bindingen af en fluorescerende ligand til kunstige fosfolipidvesikler. Denne fremgangsmåde begrænser ikke valget af kommercielt tilgængelige fluorophorer. Derudover muliggør den teknik, der er beskrevet her til indsamling og analyse af kinetiske data, forbedret tidsopløsning. Således kan den metode, der er beskrevet heri, anvendes alene som et første skridt i karakterisering af protein-membran-interaktioner eller i kombination med andre metoder (for eksempel SPR eller mikroskopi) for at forbedre målenøjagtigheden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
A23187	Sigma Aldrich	C7522-10MG
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)	Thermo Fisher Scientific	A37573	fluorescent dye
Apyrase from potatoes	Sigma Aldrich	A2230
BD FACSCantoII	BD Bioscience
bovine serum albumin	VWR Life Science AMRESCO	Am-O332-0.1
Calcium chloride, anhydrous, powder, ≥97%	Sigma Aldrich	C4901-100G
Cary Eclipse Fluorescence Spectrometer	Agilent
D-(+)-Glucose	Sigma Aldrich	G7528-1KG
DiIC16(3) (1,1'-Dihexadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate)	Thermo Fisher Scientific	D384
DMSO	Sigma Aldrich	D8418
EDTA disodium salt	VWR Life Science AMRESCO	Am-O105B-0.1
FACSDiva	BD Bioscience		cytometry data acquisition software
FlowJo	Tree Star		cytometer software for data analysis
HEPES	Sigma Aldrich	H4034-500G
Human Factor X	Enzyme research	HFX 1010
Hydroxylamine hydrochloride	Panreac	141914.1209
L-α-phosphatidylcholine (Brain, Porcine)	Avanti Polar Lipids	840053P
L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt)	Avanti Polar Lipids	840032P
Magnesium chloride	Sigma Aldrich	M8266-100G
Mini-Extruder	Avanti Polar Lipids	610020-1EA
OriginPro 8 SR4 v8.0951	OriginLab Corporation		Statistical software
Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, Biotechnology Grade	VWR Life Science AMRESCO	97062-732
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P9541-500G
Prostaglandin E1	Cayman Chemical	13010
Sephadex G25	GE Healthcare	GE17-0033-01	gel filtration medium for protein purification
Sepharose CL-2B	Sigma Aldrich	CL2B300-500ML	gel filtration medium for platelet purification
Sodium bicarbonate	Corning	61-065-RO
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S3014-500G
Sodium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	S3139-250G
Spin collumns with membrane 0.2 µm	Sartorius	VS0171
Trisodium citrate dihydrate	Sigma Aldrich	S1804-1KG