Summary
Her beskriver vi et sett med metoder for å karakterisere samspillet mellom proteiner med membraner av celler eller mikrovesicles.
Abstract
I menneskekroppen fortsetter de fleste av de viktigste fysiologiske reaksjonene som er involvert i immunresponsen og blodkoagulasjonen på cellemembranene. Et viktig første skritt i enhver membranavhengig reaksjon er binding av protein på fosfolipidmembranen. En tilnærming til å studere proteininteraksjon med lipidmembraner er utviklet ved hjelp av fluorescerende merkede proteiner og strømningscytometri. Denne metoden tillater studiet av proteinmembraninteraksjoner ved hjelp av levende celler og naturlige eller kunstige fosfolipid vesicles. Fordelen med denne metoden er enkelheten og tilgjengeligheten av reagenser og utstyr. I denne metoden er proteiner merket med fluorescerende fargestoffer. Imidlertid kan både selvlagde og kommersielt tilgjengelige, fluorescerende merkede proteiner brukes. Etter konjugering med fluorescerende fargestoff inkuberes proteinene med en kilde til fosfolipidmembranen (mikrovesicles eller celler), og prøvene analyseres ved strømningscytometri. De oppnådde dataene kan brukes til å beregne kinetiske konstanter og likevekt Kd. I tillegg er det mulig å estimere omtrentlig antall proteinbindingssteder på fosfolipidmembranen ved hjelp av spesielle kalibreringsperler.
Introduction
Biomembraner skiller det indre innholdet i dyreceller og ekstracellulært rom. Legg merke til at membraner også omgir mikrovesicles dannet under cellens livssyklus og organeller. Cellemembranen består hovedsakelig av lipider og proteiner. Membranproteiner utfører signalerings-, strukturelle, transport- og limfunksjoner. Imidlertid er lipidbilayeren også viktig for sammenhengen mellom dyrecellen og det ekstracellulære rommet. Dette papiret foreslår en metode for å studere perifer interaksjon av eksterne proteiner med lipidmembranen.
Det mest slående eksemplet på reaksjoner som oppstår på det ytre membranlaget av en dyrecelle er blodkoagulasjonsreaksjonen. Et viktig trekk ved blodkoagulasjon er at alle hovedreaksjonene fortsetter på fosfolipidmembranene til celler og mikrovesikler som oppstår fra disse cellene og ikke i plasma 1,2,3. Membranavhengige reaksjoner inkluderer prosessen med å starte koagulasjon (på cellemembranene i subendotelet, betent endotel eller aktiverte immunceller, med deltakelse av en vevsfaktor), alle reaksjoner av hovedkaskadeaktivering av faktorer IX, X, protrombin; aktivering av faktor XI ved trombin (på membranene til aktiverte blodplater, erytrocytter, lipoproteiner og mikrovesicles); reaksjoner av protein C-banen; inaktivering av koagulasjonsenzymer (på membranene til endotelceller med deltakelse av trombomodulinkofaktorer, endotelprotein C-reseptor, heparansulfat); kontaktveireaksjoner (på membraner av blodplater og noen mikrovesicles med deltakelse av ukjente kofaktorer). Dermed er det umulig å undersøke blodkoagulasjon uten å studere samspillet mellom ulike plasmaproteiner med membranen av blodceller.
Dette dokumentet beskriver en strømningscytometribasert metode for å karakterisere samspillet mellom proteiner med lipidmembraner av celler eller mikrovesicles. Denne tilnærmingen ble opprinnelig foreslått å studere samspillet mellom blodplasma med blodplater og kunstige fosfolipid vesikler. Videre samhandler de fleste av de studerte proteinene direkte med negativt ladede membranfolipider, spesielt med fosfatidylserin 4,5. I tillegg er det proteiner hvis interaksjon med membranen er mediert av spesielle reseptorer6.
En viktig evne til strømningscytometri er å diskriminere mellom frie og bundne ligander uten ytterligere separasjon. Denne egenskapen av cytometri tillater studiet av ligand likevektsbinding ved endepunktet og bidrar til å utføre kontinuerlige kinetiske målinger. Teknikken er usofistikert og krever ikke kompleks prøvepreparering. Flowcytometri brukes aktivt til kvantitativt å studere dynamikken i interaksjon mellom fluorescerende peptider, reseptorer og G-proteiner i intakte og vaskemiddelgjennomtrengelige nøytrofiler7. Denne tilnærmingen gjelder også for å utforske protein-DNA-interaksjoner og kinetikken til endonukleaseaktivitet i sanntid8. Over tid ble denne metoden brukt til kvantitativt å studere proteinproteininteraksjoner med renset lipid vesicles9, eller mer generelt, med membranproteiner uttrykt i et svært effektivt Sf9-celleuttrykkssystem10. Kvantitative metoder er også beskrevet for karakterisering av protein-liposom interaksjoner ved hjelp av strømningcytometri for transmembrane proteiner11.
Denne teknikken bruker selvlagde kalibreringsperler for å unngå å bruke kommersielt tilgjengelige perler7. Kalibreringsperlene som ble brukt tidligere7 var ment å fungere med fluorescein, som substansielt begrenset sortimentet av tilgjengelige fluorescerende ligander på proteinene. I tillegg tilbyr dette dokumentet en ny måte å skaffe og analysere kinetiske data for rimelig tidsoppløsning. Selv om denne metoden er beskrevet for kunstige fosfolipid vesicles, er det ingen åpenbare begrensninger for tilpasningsevnen til celler, naturlige vesikler eller kunstige fosfolipid vesicles med en annen lipidsammensetning. Metoden beskrevet heri tillater estimering av parametrene for interaksjon (kpå, koff) og likevekt (Kd) og letter kvantitativ karakterisering av antall proteinbindingssteder på membranen. Vær oppmerksom på at denne teknikken gir et omtrentlig estimat av antall bindingsområder. Fordelene ved metoden er dens relative enkelhet, tilgjengelighet og tilpasningsevne til innfødte celler og naturlige og kunstige mikrovesicles.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fluorescerende proteinmerking
- Materialforberedelse
- Forbered 1 M natriumbikarbonatbuffer, pH 9,0, oppbevar den ved 4 °C, og bruk den innen en uke.
- Klargjør 1,5 M hydroksylaminhydrokloridbuffer, pH 8,5, umiddelbart før bruk.
- Forbered en 10 mg/ml oppløsning av fluorescerende fargestoff (se materialtabellen) i dimetylsulfoksid.
MERK: Denne oppløsningen kan oppbevares i en måned ved -20 °C i mørket. - Forbered løsninger av rensede antistoffer eller andre proteiner ved 1-10 mg / ml.
MERK: Unngå buffere som inneholder ammoniumioner eller primære aminer. Bytt ut bufferne som inneholder Tris eller glyserol med fosfatbufret saltvann (PBS) ved dialyse. Verken natriumazid (≤3 mM) eller thimerosal (≤1 mM) vil påvirke konjugeringsreaksjonen betydelig. - Inkuber gelfiltreringsmediet (se materialtabellen) for proteinrensing i PBS over natten ved romtemperatur eller i 2 timer ved 60 °C. Påfør gelfiltreringsmediet på spinnkolonner med 0,2 μm membraner.
- Beregn mengden reaktiv fargestoff som skal brukes for hver reaksjon i henhold til konsentrasjonen av protein som skal merkes ved hjelp av Eq (1).
Hvor Vfargestoff er volumet av fargestoffet lager løsning; Cpr, Vpr og MWpr er konsentrasjonen, volumet og molarvekten av proteinet; MWfargestoff er fargestoffet molar vekt; 100 er en enhetskonverteringsfaktor. MR er molarforholdet mellom fargestoff og protein i reaksjonsblandingen.
MERK: Følgende MR anbefales for IgG-merkingsreaksjoner: MR = 40 hvis antistoffet er på 1-3 mg/ml eller MR = 30 hvis antistoffet er på 4-10 mg/ml. For koagulasjonsfaktorer brukes MR = 5 vanligvis. - Konjugeringsreaksjon
- I et reaksjonsrør blander du proteinoppløsningen med et 10x lavere volum på 1 M bikarbonatoppløsning.
- Tilsett ønsket mengde fluorescerende fargestoff (se trinn 1.2) med kontinuerlig omrøring.
- Inkuber reaksjonsblandingen ved romtemperatur i ca. 1 time, beskyttet mot lys og med kontinuerlig omrøring.
- For hver 200 μL proteinoppløsning tilsett 5 μL 1,5 M hydroksylaminhydroklorid.
- Inkuber reaksjonsblandingen ved romtemperatur i ca. 30 min, beskyttet mot lys og med kontinuerlig omrøring.
- Forbered spinnkolonnen.
- Tilsett 500 μL gelfiltreringsmedium for proteinrensing til en kolonne. Sentrifuger kolonnen i 3 min ved 1000 × g.
- Kast bufferen fra oppsamlingsrøret. Hvis kolonnen ikke er full, legg til mer gelfiltreringsmedium, og sentrifuger kolonnen i 3 min ved 1000 × g. Gjenta dette trinnet til kolonnen er full.
- Rensing
- Sentrifuger reaksjonsblandingen (fra trinn 1,3,5) i 5 min ved 17 000 × g og fjern bunnfallet.
- Overfør supernatanten til spinnkolonnen med gelfiltreringsmedium. La løsningen absorbere inn i gelsengen.
- Bruk et tomt oppsamlingsrør for spinnsøylen og sentrifuger det i 5 minutter ved 1000 × g. Etter sentrifugering, samle det merkede proteinet fra oppsamlingsrøret.
- Bestemmelse av graden av merking
- Korrekt for fargestoffets bidrag til absorbansen ved A280 ved å måle absorbansen av fritt fargestoff ved 280 nm (A280) og λmax for fargestoffet (maks.) (se Eq (2)).
(2) - Mål absorbansen av proteinfargekonjugaten ved 280 nm (A280) og λmax for fargestoffet (maks.) og beregn proteinkonetrasjonen ved hjelp av Eq (3).
(3)
Hvor εM er molar utryddelseskoeffisienten til proteinet ved 280 nm; d er den optiske banelengden under måling av absorbansen; CF er fargestoffets bidrag til absorbansen ved A280 (trinn 1.6.1). - Beregn graden av merking (DOL) ved hjelp av Eq (4).
(4)
Hvor εM fargestoff er molar utryddelseskoeffisienten til fargestoffet ved λmax nm; d er den optiske banelengden under måling av absorbansen; C-protein er konsentrasjonen av proteinet (trinn 1,6,2).
- Korrekt for fargestoffets bidrag til absorbansen ved A280 ved å måle absorbansen av fritt fargestoff ved 280 nm (A280) og λmax for fargestoffet (maks.) (se Eq (2)).
(2)
(3)
(4)2. Tilberedning av fosfolipid vesicles
- Tilberedning og lagring av lipidblandingen
- Kombiner lipidene i riktig forhold (fosfatidylserin/fosfatidylkolin i et forhold på 20 mol% til 80 mol%).
- Tørk lipidblandingen etter lyofilisering eller fordampning og oppbevar den under en inert atmosfære i glassampuller.
- Lipid filmproduksjon
- Åpne ampullen, og resuspend lipidblandingen i en liten mengde (~ 100 μL) kloroform.
MERK: Ikke bruk for mye kloroform, da det ikke fordampes helt. - Tilsett DiIC16(3) i etanol ved 0,2 mol%. Overfør lipidblandingen til en rund bunnflaske. Spred blandingen tynt over sidene av kolben ved å rotere den. Tørk lipidblandingen i 30 min under en argonstrøm.
- Åpne ampullen, og resuspend lipidblandingen i en liten mengde (~ 100 μL) kloroform.
- Hydrering av lipidblandingen
- Tilsett en passende varm (~55 °C) vandig buffer (HEPES 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4) i et volum som tilsvarer den forventede lipidkonsentrasjonen til kolben med lipidfilmen. Inkuber blandingen med virvel ved 55 °С i 30 min for fullstendig hydrering.
- Plasser prøverøret i en fryser eller varm termostat for å få lipidfjæringen til å gjennomgå 3-5 fryse-tine sykluser.
- Dannelse av lipid vesicles ved ekstrudering
- Forbered ekstruderen i henhold til produsentens instruksjoner. Varm opp alle ekstruderkomponentene til faseovergangstemperaturen til lipidblandingen.
- Fyll en av ekstrudersprøytene med den hydrerte lipidblandingen. Vent i 5-10 min for temperaturen på lipidfjæringen for å likevekte med temperaturen på ekstruderen.
- Ekstruder lipidblandingen gjennom membranen minst 10 ganger. For den endelige ekstruderingen, plasser lipidfjæringen i den alternative sprøyten og se etter en endring i utseende fra en litt tåkete til en klar løsning.
- Oppbevar den resulterende blandingen av lipid vesicles ved 4 °C, helst i en inert atmosfære av argon eller nitrogen, i 3-4 dager. Skal ikke fryses.
3. Isolering av blodplater fra fullblod
- Samle fullblod fra friske donorer i rør som inneholder 3,2% natriumsitrat.
- Tilsett prostaglandin E1 (PGE1) (1 μM) og apyrase (0,1 U/ml) i blodet, etterfulgt av sentrifugering ved romtemperatur ved 100 × g i 8 min.
- Etter sentrifugering, ta det blodplaterike plasmaet og tilsett natriumsitratoppløsning (106 mM, pH 5,5) til et plasma/ sitratforhold på 3: 1. Sentrifuger plasma ved romtemperatur ved 400 × g i 5 min.
- Fjern supernatanten, og resuspend pellet i 300 μL av Tyrodes buffer uten BSA (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 0,4 mM NaH2PO4, 2,5 mM CaCl2, 5 mM glukose, pH 7.4). Rens blodplater fra plasmaproteiner ved gelkromatografi på gelfiltreringsmediet for blodplaterensing (se materialtabellen).
4. Påvisning av protein - lipidinteraksjon ved strømningscytometri
- Kinetiske bindingseksperimenter
- Fortynn fosfolipid vesikler (fra trinn 2.4.4) i Tyrodes buffer (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 0,4 mM NaH2PO4, 2,5 mM CaCl2, 5 mM glukose, 0,5% BSA, pH 7,4) til en konsentrasjon på 1 μM og totalt volum på 250 μL.
- Bland fluorescerende koagulasjonsfaktor X (fX-fd) fra trinn 1 i en konsentrasjon på 500 nM med fosfolipid vesikler fra trinn 4.1.1 i et 1:1-forhold (endelig vesiclekonsentrasjon 0,5 μM, fX-fd konsentrasjon er 250 nM fX) til et totalt volum på 500 μL.
- Injiser umiddelbart 500 μL av blandet suspensjon (~ 20 min for analyse med lav hellingshastighet) i strømningscytometeret. Bruk lav strømningshastighet og påse at terskelen for kanal FL2 (exсitation 488 nm, utslippsfilter 585/42 nm) er som verdi 200. Mål gjennomsnittlig fluorescens i kanal FL4 (exсitation 633 nm, utslippsfilter 660/20) for fluorescensfargen fra materialtabellen.
MERK: Velg et cytometer uten autosampler. Dette vil øke hastigheten på injeksjonsprosessen av prøven i målecellen. - Når metning av binding oppnås (ingen signifikant økning i fluorescens innen 5 min), fortynn raskt prøven 20 ganger med Tyrodes buffer, og overvåk dissosiasjonen til baseline fluorescens er nådd (fullstendig dissosiasjon) eller til et platå er nådd (ingen signifikant reduksjon i fluorescens innen 5 minutter).
MERK: Som en kontroll, legg til 10 μM EDTA og overvåk fullstendig dissosiasjon i 5 minutter.
- Likevektsbindingseksperimenter
MERK: Bruk den kinetiske bindingskurven til å bestemme tidspunktet for metning; tiden for metning for fX-fd og kunstige vesicles er 20 min.- Inkuber kunstig fosfolipid vesicles (5 μM) for bindingsanalysen med forskjellige konsentrasjoner av fX-fd (fra 0 til 1000 nM) i Tyrodes buffer i 20 minutter.
- Fortynn hver prøve fra trinn 4.2.1 x 20x til et endelig volum på 200 μL med Tyrodes buffer. Analyser umiddelbart den fortynnede prøven ved strømningscytometri innen 30 s. Bruk innstillinger fra trinn 4.1.3.
MERK: Som en kontroll for ikke-spesifikk binding, bruk lignende prøver med EDTA (10 μM) og inkuber dem i 5 minutter.
5. Analyse av strømningscytometridata
- Eksporter eksperimenter i FSC-format fra cytometri datainnsamlingsprogramvare til cytometerprogramvare for dataanalyse (se materialtabellen). Velg Fil | Eksportere | FCS filer. Åpne FSC-filer i cytometer programvare for dataanalyse ved å velge filene på datamaskinen og dra dem til arbeidsområdet til programmet.
- For gating av mikrovesicles, identifiser mikrovesicles-regionen ved fluorescensen av lipofilfargen DiIC16(3). Bruk menykommandoer eller tegneknapp i regnearket til å opprette dot plot SSC fra FL2 (fargestoff DilC16(3)) i loggkoordinater. Velg Den rektangulære portknappen for å tegne et område slik at hendelser fra et utvalg uten vesikler ikke inkluderes i denne regionen (figur 1B, C).
- Analyser kinetiske eksperimenter.
- Lag en prikkplott ved hjelp av koordinatene for fluorescens (FL4) over tid for vesiklerområdet (dobbeltklikk i vesiklerområdet i trinn 5.2)
- Eksporter dataene om endringen i fluorescens over tid i CSV-format. Velg Eksempel | Høyreklikk | Eksportere | Velg FL4 og klokkeslett i parametere | Velg katalog for lagring av | Velg CSV-format | Eksporter.
- Åpne CSV-filen i all statistisk programvare (se materialtabellen). Beregn et enkelt glidende gjennomsnitt av fluorescens og tid for hver 1000 hendelser.
- Omtrentlig en graf over avhengigheten av den enkle glidende gjennomsnittlige fluorescensen i tide under forutsetning av eksponentiell avhengighet (Analyse > Montering >Nonlinear Curve Fit) og bruk dette til å beregne den kinetiske tilknytningskonstanten ved hjelp av Eq (5).
(5)
Der [XB] er den bundne faktorkonsentrasjonen til hvert øyeblikk (brukerdefinerte enheter) i henhold til det enkle glidende gjennomsnittet fra trinn 5.3.3; [X] er den ekstra faktorkonsentrasjonen; [X]max er den maksimale grensefaktorkonsentrasjonen; k er tilknytningskonstanten. t er klokkeslettet. - Gjenta det samme settet med handlinger (5.3.1-5.3.4) for å beregne den kinetiske dissosiasjonskonstanten ved hjelp av Eq (6).
(6)
Hvor [XB] er den bundne faktorkonsentrasjonen i hvert øyeblikk; [X]0 er den bundne faktorkonsentrasjonen i begynnelsen av tiden; k er dissosiasjonskonstanten; t er klokkeslettet.
- Likevektsbindingsanalyse
- Bestem gjennomsnittlig fluorescens av fX-fd i vesiklene for hver valgte konsentrasjon av fX-fd.
- Omtrent avhengigheten av den bundne faktoren fluorescens fra konsentrasjonen av den tilsatte faktoren i antagelsen om enkel binding på ett sted. Beregn de gjennomsnittlige bindingsparameterne ved hjelp av Eq (7) fra tre uavhengige gjentakelser på et minimum.
(7)
Hvor [XB] er den bundne faktorkonsentrasjonen; [X] er den ekstra faktorkonsentrasjonen; nx er det tilsynelatende antallet bindingsområder per vesicle. Kd er den tilsynelatende dissosiasjonskonstanten.
(5)
(6)
(7)6. Konvertering av fluorescensintensitet til gjennomsnittlig antall bindingssteder
- Forbered kalibrerte perler.
- Inkuber gelfiltrerede blodplater (se trinn 3.3) med A23187 (10 μM) i nærvær av CaCl2 (2,5 mM) i 10 minutter ved romtemperatur.
- Legg til de aktiverte blodplater de ulike konsentrasjonene av fX-fd (0 til 1000 nM). Tilsett 2% v / v formaldehyd og inkuber i 1 time. Stopp reaksjonen ved å inkubere blodplater med 3 M glycin og 5% BSA i 30 minutter ved romtemperatur.
- Rens blandingen fra det ikke-vedtatte fargestoffet. Sentrifuger blodplater i 5 min ved 400 × g, fjern supernatanten og resuspend pelletsen i Tyrodes buffer (inneholder 0,5% BSA).
MERK: Gjenta trinn 6.1.3 tre ganger.
- Mål fluorescensnivået til kalibreringsperlene i hver prøve først ved hjelp av et spektrofluorometer (for fluorescerende fargestoff fra materialtabellen, eksitasjon 633 nm, utslipp 670 nm) og bruk deretter strømningscytometeret (i kanal FL4: eksitasjon 633 nm, utslippsfilter 660/20). Bruk en celleteller til å bestemme antall perler i hvert utvalg.
- Konverter fluorescensintensiteten til hver respektive perleprøve til konsentrasjonen av løselig fluorescerende fargestoff ved hjelp av et spektrofluorometer. Omberegn fluorescerende fargekonsentrasjon for antall fluoroformolekyler ved hjelp av Eq (8).
(8)
Hvor Nx er antall fluoroformolekyler; C er den fluorescerende fargekonsentrasjonen; NA er Avogadro-konstant. NA = 6,02214076×1023 mol -1. - Lag en avhengighetsgraf over gjennomsnittlig fluorescens av perlene i et strømningscytometer (trinn 6.2) på antall fluoroformolekyler (se trinn 6.3) for hver prøve ved hjelp av statistisk programvare (se materialtabellen). Omtrentlig denne avhengigheten etter linjeproporsjonalitet (analyse | Montere | Passer lineært). Fra tilnærmingen i Eq (9) beregner du omregningsfaktoren for gjennomsnittlig fluorescens til bindingssteder.
(9)
Hvor MF er gjennomsnittlig fluorescens av perler ved strømningscytometri; Nx er antall fluoroformolekyler per per perle; CF representerer konverteringsfaktoren for gjennomsnittlig fluorescens til bindingssteder. CF og b er hentet fra resultatene av å tilpasse grafen ved lineær proporsjonalitet. - Beregn det tilsynelatende antallet bindingssteder per interesseområde ved hjelp av Eq (10).
(10)
Hvor nx er det tilsynelatende antall bindende steder per vesicle av interesse; MF er gjennomsnittlig fluorescens av vesiklene av interesse ved strømningscytometri; CF og b er konverteringsfaktorer fra Eq (8).
(8)
(9)
(10)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Strømningscytometrimetoden som er beskrevet her, brukes til å karakterisere bindingen av plasmakoagulasjonsproteiner til aktiverte blodplater. I tillegg ble fosfolipid vesicles PS:PC 20:80 brukt som et modellsystem. Dette papiret fokuserer hovedsakelig på kunstige fosfolipid vesicles som et eksempel. Parametrene til cytometeret, spesielt fotomultiplierrøret (PMT) spenning og kompensasjonen må velges for hver bestemt enhet, studieobjektet (celler, kunstige eller naturlige mikrovesicles) og fargestoffene som brukes. Figur 1B,C viser et eksempel på gating kunstig fosfolipid vesicles som er ~1 μm i størrelse med det inkorporerte lipofile fluorescerende fargestoffet DiIC16 (3). Stor vesicle størrelse og lipofil fluorescerende fargestoff bidro til å oppdage vesikler ved hjelp av et cytometer. Porten ble satt basert på en prøve som inneholder kunstige lipidveiser i samme størrelse, men uten fluorescerende fargestoff (figur 1B). Bare hendelser inne i denne porten ble brukt i analysen.
Kinetikken til proteinbinding til vesicles ble analysert i første fase. Prøven for dette ble samlet inn fortløpende som beskrevet i trinn 4.1. En vanlig prikkplott vises i figur 1D-F. Dataene som ble innhentet ble analysert ved hjelp av flowcytometriprogramvaren. Den resulterende kurven vises i figur 1G. Faste linjer viser kurvene for tilnærming, hvorfra de kinetiske konstantene for tilknytning (kpå) og dissosiasjon (kav) ble oppnådd. Når faktor X binder seg til fosfolipid vesikler reversibelt og Ca2 +-avhengig, kontrollerte prøver med EDTA spesifisiteten og reversibiliteten til denne bindingen. De resulterende konstantene vises i tabell 1.
Basert på bindingens kinetikk ble det valgt en tid på 20 min for ytterligere likevektsforsøk for å beskrive metning i binding nøyaktig. Den gjennomsnittlige fluorescensintensiteten av faktoren ble senere bestemt i vesiklene. Hver prøve ble analysert i nærvær og fravær av EDTA. Fluorescensintensiteten i nærvær av EDTA ble tatt som bakgrunn og trukket fra det totale signalet som binding av fX til membranen i fravær av Ca2 + ioner anses som ikke-spesifikk. Den resulterende fluorescensen ble konvertert til antall bindingssteder per vesicle ved hjelp av kalibreringsperlene.
Figur 1: Spesifikk binding av fX til kunstige fosfolipid vesikler. (A) Eksperimentordning. (B, C) Typiske prikkplott av fosfolipid vesikler uten (B) eller med (C) lipofil fluorescerende fargestoff DiIC16 (3). (D-F) Typiske punktplott av faktor X-interaksjon med fosfolipid vesikler før (D) eller etter (E) 20 ganger fortynning og i nærvær EDTA (F). (G) Kinetikk av FX (250 nM) binding og dissosiasjon til fosfolipid vesikler. (H) Likevektsinteraksjon av faktor X til fosfolipid vesikler. Resultater er midlene ±SD for n=3 forskjellige utvalg. Forkortelser: FX = Faktor X; Ph vesicles = fosfolipid vesicles; SSC = sidespredning; a.u. = vilkårlig enhet). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Tilsynelatende Kd ± SEM (nM) | kpå ± SEM (μM-1 s-1) | Kav ± SEM (s-1) | Tilsynelatende antall bindingssteder per vesicle ± SEM |
| 400 ± 80 | 0,371 ± 0,012 | 0,019 ± 0,004 | 8 000 ± 800 |
Tabell 1: Parametere for fX-interaksjon med kunstige fosfolipid vesikler. Parametrene ble bestemt fra kurvene (se figur 1F,G). Resultater er gjennomsnittlig ± SEM for n = 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den foreslåtte metoden kan tilpasses for en grov karakterisering av samspillet mellom proteiner med fosfolipidmembraner fra ulike kilder og sammensetninger. Den kvantitative strømningscytometrien som er beskrevet her, innrømmer overflateplasmonresonans (SPR) i flere parametere. Spesielt har den lavere følsomhet og tidsoppløsning og krever fluorescerende merking av proteiner. Fluorescerende merking kan føre til en endring i konformasjon og tap av aktivitet for mange proteiner og krever derfor nøye kontroll. Denne teknikken har imidlertid betydelige fordeler i forhold til andre. Denne metoden gir en mulighet til å utforske samspillet mellom proteiner med den innfødte cellemembranen, som ikke er lett implementert ved hjelp av SPR. Videre tillater tilnærmingen estimering av antall proteinbindingssteder på membranoverflaten og kan være effektiv for noen analyseoppgaver.
Kommersielt tilgjengelige perler er tilgjengelige for noen fluorescerende fargestoffer for å telle bindesteder. Det er imidlertid ingen slike perler for mange mye brukte fargestoffer. Derfor er selvlagde perler den beste måten å løse dette på. De samme cellene ble brukt til å forberede disse perlene som for alle andre eksperimenter. Men ettersom perlene krever høye sentrifugeringshastigheter under vask, kan fosfolipid vesicles ikke brukes. Celler eller vesicles kan imidlertid erstattes med perler med aminoreaktive grupper, som kan konjugeres til det valgte fargestoffet. Handlingssekvensen vil være lik den som er beskrevet i trinn 6.1.
Begrensningene i denne kvantitative strømningscytometrimetoden er relatert til de tekniske egenskapene til det brukte cytometeret. Tre forskjellige modeller av strømningscytometere (med variable lasere, detektorer, pumper) ble brukt til å reprodusere denne teknikken uten komplikasjoner. Valget av en fluorescerende etikett som passer for cytometeret som brukes, må imidlertid vurderes nøye fordi settet med lasere, detektorer og optiske filtre varierer fra enhet til enhet, selv innenfor samme modell. Det er nødvendig å fokusere på cytometerets evne til å måle mikropartikler med en bestemt diameter; Ikke alle instrumenter er like i stand til å oppdage partikler ved oppløsninger under 200 nm (for å bestemme dette, bruk kalibreringsperlene med fast størrelse levert av instrumentets produsent). I tillegg kan noen strømningscytometere, som prøves ved hjelp av en sprøytepumpe, ikke måle kontinuerlig bindende kinetikk i prinsippet. I dette tilfellet kan kinetikken bare registreres punkt for punkt, og tar separate prøver for måling på bestemte punkter i tid 4,6.
Flowcytometri brukes til å undersøke uttrykket av antigener på ulike celler - tilstedeværelse / fravær av et antigen og prosentandelen cellepopulasjoner som uttrykker og ikke uttrykker dette antigenet. Evnen til strømningscytometri til samtidig å diskriminere frie og bundne ligander uten ytterligere separasjonsprosedyrer gir også mulighet for kvantitativ vurdering av ligandbindende dynamikk. Metoden foreslått heri beskriver utarbeidelsen av selvlagde kalibreringsperler for å kvantifisere bindingen av en fluorescerende ligand til kunstige fosfolipid vesicles. Denne tilnærmingen begrenser ikke valget av kommersielt tilgjengelige fluoroforer. Utover det muliggjør teknikken beskrevet her for innsamling og analyse av kinetiske data forbedret tidsoppløsning. Dermed kan metoden beskrevet heri brukes alene som et første skritt i karakterisering av proteinmembraninteraksjoner eller i kombinasjon med andre metoder (for eksempel SPR eller mikroskopi) for å forbedre målenøyaktigheten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ble støttet av et russisk Science Foundation-tilskudd 20-74-00133.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A23187 | Sigma Aldrich | C7522-10MG | |
| Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | Thermo Fisher Scientific | A37573 | fluorescent dye |
| Apyrase from potatoes | Sigma Aldrich | A2230 | |
| BD FACSCantoII | BD Bioscience | ||
| bovine serum albumin | VWR Life Science AMRESCO | Am-O332-0.1 | |
| Calcium chloride, anhydrous, powder, ≥97% | Sigma Aldrich | C4901-100G | |
| Cary Eclipse Fluorescence Spectrometer | Agilent | ||
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7528-1KG | |
| DiIC16(3) (1,1'-Dihexadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate) | Thermo Fisher Scientific | D384 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D8418 | |
| EDTA disodium salt | VWR Life Science AMRESCO | Am-O105B-0.1 | |
| FACSDiva | BD Bioscience | cytometry data acquisition software | |
| FlowJo | Tree Star | cytometer software for data analysis | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034-500G | |
| Human Factor X | Enzyme research | HFX 1010 | |
| Hydroxylamine hydrochloride | Panreac | 141914.1209 | |
| L-α-phosphatidylcholine (Brain, Porcine) | Avanti Polar Lipids | 840053P | |
| L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids | 840032P | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | M8266-100G | |
| Mini-Extruder | Avanti Polar Lipids | 610020-1EA | |
| OriginPro 8 SR4 v8.0951 | OriginLab Corporation | Statistical software | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, Biotechnology Grade | VWR Life Science AMRESCO | 97062-732 | |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9541-500G | |
| Prostaglandin E1 | Cayman Chemical | 13010 | |
| Sephadex G25 | GE Healthcare | GE17-0033-01 | gel filtration medium for protein purification |
| Sepharose CL-2B | Sigma Aldrich | CL2B300-500ML | gel filtration medium for platelet purification |
| Sodium bicarbonate | Corning | 61-065-RO | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S3014-500G | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S3139-250G | |
| Spin collumns with membrane 0.2 µm | Sartorius | VS0171 | |
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma Aldrich | S1804-1KG |
References
- Hoffman, M., Monroe, D. M.
- Roberts, H. R., Hoffman, M., Monroe, D. M.
- Panteleev, M. A., Dashkevich, N. M., Ataullakhanov, F. I. Hemostasis and thrombosis beyond biochemistry: roles of geometry, flow and diffusion. Thrombosis Research. 136 (4), 699-711 (2015).
- Podoplelova, N. A., et al. Hysteresis-like binding of coagulation factors X/Xa to procoagulant activated platelets and phospholipids results from multistep association and membrane-dependent multimerization. Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1216-1227 (2016).
- Panteleev, M. A., Ananyeva, N. M., Greco, N. J., Ataullakhanov, F. I., Saenko, E. L. Two subpopulations of thrombin-activated platelets differ in their binding of the components of the intrinsic factor X-activating complex. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 3 (11), 2545-2553 (2005).
- Kotova, Y., et al. Binding of coagulation factor XIII zymogen to activated platelet subpopulations: roles of integrin αIIbβ3 and fibrinogen. Thrombosis and Haemostasis. 119 (6), 906-915 (2019).
- Fay, S. P., Posner, R. G., Swann, W. N., Sklar, L. A. Real-time analysis of the assembly of ligand, receptor, and G protein by quantitative fluorescence flow cytometry. Biochemistry. 30 (20), 5066-5075 (2002).
- Nolan, J. P., Shen, B., Park, M. S., Sklar, L. A. Kinetic analysis of human flap endonuclease-1 by flow cytometry. Biochemistry. 35 (36), 11668-11676 (1996).
- Sarvazyan, N. A., Lim, W. K., Neubig, R. R. Fluorescence analysis of receptor−G protein interactions in cell membranes. Biochemistry. 41 (42), 12858-12867 (2002).
- Sarvazyan, N. A., Neubig, R. R. Analysis of molecular assemblies by flow cytometry: determinants of Gi1 and by binding. Advances in Optical Biophysics. 3256, 122-131 (1998).
- De Franceschi, N., et al. ProLIF - Quantitative integrin protein-protein interactions and synergistic membrane effects on proteoliposomes. Journal of Cell Science. 132 (4), (2018).
