Imaging tissutale altamente multiplexato con coloranti Raman

Summary

L’imaging a diffusione Raman (epr-SRS) stimolato dalla pre-risonanza elettronica di coloranti Raman simili a arcobaleno è una nuova piattaforma per l’imaging proteico a base di epitopi altamente multiplexati. Qui, presentiamo una guida pratica che include la preparazione degli anticorpi, la colorazione del campione di tessuto, l’assemblaggio del microscopio SRS e l’imaging tissutale epr-SRS.

Abstract

La visualizzazione di una vasta gamma di biomarcatori specifici nei tessuti svolge un ruolo vitale nell’esplorazione delle intricate organizzazioni di sistemi biologici complessi. Pertanto, le tecnologie di imaging altamente multiplexed sono state sempre più apprezzate. Qui, descriviamo una piattaforma emergente di imaging vibrazionale altamente multiplexato di proteine specifiche con sensibilità comparabile all’immunofluorescenza standard tramite imaging a diffusione Raman (epr-SRS) stimolato dalla pre-risonanza elettronica di coloranti Raman simili all’arcobaleno. Questo metodo aggira il limite dei canali risolvibili spettralmente nell’immunofluorescenza convenzionale e fornisce un approccio ottico one-shot per interrogare più marcatori nei tessuti con risoluzione subcellulare. È generalmente compatibile con i preparati tissutali standard, compresi i tessuti fissati alla paraformaldeide, i tessuti congelati e i tessuti umani incorporati nella paraffina fissata alla formalina (FFPE). Prevediamo che questa piattaforma fornirà un quadro più completo delle interazioni proteiche dei campioni biologici, in particolare per i tessuti intatti spessi. Questo protocollo fornisce il flusso di lavoro dalla preparazione degli anticorpi alla colorazione del campione di tessuto, all’assemblaggio del microscopio SRS, all’imaging tissutale epr-SRS.

Introduction

I sistemi tissutali complessi sono composti da distinte sottopopolazioni cellulari le cui posizioni spaziali e reti di interazione sono profondamente intrecciate con le loro funzioni e disfunzioni ^1,2. Per rivelare l’architettura del tessuto e interrogarne la complessità, è essenziale la conoscenza delle posizioni spaziali delle proteine a risoluzione monocellulare. Quindi, le tecnologie di imaging proteico altamente multiplexed sono state sempre più apprezzate e potrebbero diventare una pietra miliare per lo studio della biologia dei tessuti ^3,4,5. Gli attuali metodi comuni di imaging delle proteine multiplexate possono essere classificati in due categorie principali. Uno è l’imaging a immunofluorescenza seriale che si basa su più cicli di colorazione e imaging dei tessuti, e l’altro è la citometria di massa accoppiata con anticorpi marcati con metalli pesanti 6,7,8,9,10,11,12.

Qui viene introdotta una strategia alternativa per l’imaging proteico a base di anticorpi multiplexati. A differenza della modalità di imaging a fluorescenza prevalente, che può visualizzare solo 4-5 canali contemporaneamente a causa degli ampi spettri di eccitazione ed emissione (larghezza intera a metà massimo (FWHM) ~ 500 ^cm-1), la microscopia Raman presenta una larghezza di linea spettrale molto più stretta (FWHM ~ 10 ^cm-1) e quindi fornisce multiplextà scalabile. Recentemente, sfruttando lo spettro ristretto, è stato sviluppato un nuovo schema di microscopia Raman chiamato microscopia elettronica a dispersione Raman stimolata dalla pre-risonanza (epr-SRS), fornendo una potente strategia per l’imaging multiplexato¹³. Sondando le modalità vibrazionali accoppiate elettronicamente dei coloranti Raman, epr-SRS ottiene un drastico effetto di miglioramento di^{10 13} volte sulle sezioni trasversali Raman e supera il collo di bottiglia di sensibilità della microscopia Raman convenzionale (Figura 1A)13,14,15. Di conseguenza, il limite di rilevazione di epr-SRS è stato spinto al di sotto di μM, il che consente il rilevamento Raman di interessanti marcatori molecolari come proteine e organelli specifici all’interno delle cellule^13,16. In particolare, utilizzando anticorpi coniugati con colorante Raman, l’imaging epr-SRS di proteine specifiche in cellule e tessuti (chiamato immuno-eprSRS) è stato dimostrato con sensibilità comparabile all’immunofluorescenza standard (Figura 1B)^13,17. Regolando la lunghezza d’onda della pompa di soli 2 nm, il segnale epr-SRS sarà completamente spento (Figura 1B), che mostra un elevato contrasto vibrazionale.

Sul lato della sonda, è stata sviluppata una serie di sonde Raman arcobaleno chiamate coloranti Manhattan Raman scattering (MARS) per la coniugazione anticorpale 13,18,19,20. Questa tavolozza Raman unica è composta da nuovi coloranti con tripli legami coniugati π (materiale supplementare), ognuno dei quali mostra un picco epr-SRS singolo e stretto nell’intervallo spettrale Raman bioortogonale (Figura 1C). Modificando la struttura del cromoforo del nucleo e modificando isotopicamente entrambi gli atomi del triplo legame (Materiale Supplementare), sono state sviluppate sonde Raman separate spettralmente. Sfruttando la multiplexità scalabile, la microscopia epr-SRS abbinata alla tavolozza dei coloranti MARS offre una strategia ottica per l’imaging di proteine multiplex one-shot in cellule e tessuti.

Immuno-eprSRS fornisce una strategia alternativa agli attuali metodi di imaging delle proteine multiplex con punti di forza unici. Rispetto agli approcci di fluorescenza con colorazione ciclica, imaging e rimozione del segnale, questa piattaforma basata su Raman garantisce colorazione e imaging a singolo tondo. Pertanto, aggira la complessità pratica nelle procedure cicliche e semplifica in gran parte il protocollo, aprendo così nuovi territori di imaging di proteine multiplexate. Ad esempio, sfruttando un protocollo di compensazione dei tessuti su misura per il colorante Raman, l’immuno-eprSRS è stato esteso a tre dimensioni per la mappatura di proteine altamente multiplexate in tessuti intatti spessi¹⁷. Oltre 10 bersagli proteici sono stati visualizzati lungo tessuti cerebrali di topo spessi millimetri¹⁷. Più recentemente, l’accoppiamento di immuno-eprSRS con un protocollo di microscopia di espansione a ritenzione di biomolecole ottimizzato (ExM)^{protocollo 21}, è stato anche dimostrato l’imaging su scala nanometrica one-shot di più bersagli²². Rispetto alla spettroscopia di massa ^4,9, epr-SRS non è distruttivo e ha intrinsecamente capacità di sezionamento ottico. Inoltre, epr-SRS è più efficiente in termini di tempo nella scansione dei tessuti. In genere, una regione di tessuto di 0,25 mm² con una dimensione dei pixel di 0,5 μm richiede solo pochi minuti per l’immagine per un singolo canale epr-SRS. Ad esempio, il tempo totale di imaging di quattro canali SRS più quattro canali di fluorescenza nella Figura 4 è di circa 10 minuti.

Protocol

Il protocollo è stato condotto in conformità con il protocollo sperimentale animale (AC-AABD1552) approvato dall’Institutional Animal Care and Use Committee della Columbia University. 1. Preparazione di anticorpi coniugati con colorante Raman Preparare il tampone di coniugazione come ~0,1 M NaHCO3 in tampone PBS, pH = 8,3, conservare a 4 °C. Preparare la soluzione di sonda MARS (materiale supplementare) con funzione estere N-i…

Representative Results

La Figura 3 mostra immagini di esempio di epr-SRS in diversi campioni, tra cui cellule fisse (Figura 3A), tessuti di topo fissati per paraformaldeide (PFA) (Figura 3B) e campioni umani incorporati in paraffina fissa in formalina (FFPE) (Figura 3C). La risoluzione spaziale della microscopia SRS è limitata alla diffrazione, la risoluzione laterale tipica è di ~ 300 nm e la risoluzione assiale è di 1-2 …

Discussion

Qui, presentiamo il protocollo immuno-eprSRS che è ampiamente applicabile ai tipi di tessuto comuni, compresi i tessuti di topo appena conservati, i tessuti umani FFPE e i tessuti di topo congelati. Immuno-eprSRS è stato convalidato per un pannello di epitopi in cellule e tessuti, come elencato nella Tabella 1. Questa piattaforma one-shot è particolarmente adatta per applicazioni in cui le strategie cicliche non funzionano bene. Ad esempio, la fluorescenza ciclica è impegnativa per i tessuti spessi p…

Materials

16% Paraformaldehyde, EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15710
α-tubulin	Abcam	ab18251	Primary antibodies
α-tubulin	BioLegend	625902	Primary antibodies
β-III-tubulin	BioLegend	657402	Primary antibodies
β-III-tubulin	Abcam	ab41489	Primary antibodies
β-tubulin	Abcam	ab131205	Primary antibodies
Agarose, low gellling temperature	Sigma Aldrich	A9414	For brain embedding
Anti-a-tubulin antibody produced in rabbit (α-tubulin)	Abcam	ab52866	Primary antibodies
Anti-Calbindin antibody produced in mouse (Calbindin)	Abcam	ab82812	Primary antibodies
Anti-GABA B receptor R2  antibody produced in guinea pig (GABA B receptor R2)	Millipore Sigma	AB2255	Primary antibodies
Anti-GFAP antibody produced in goat (GFAP)	Thermo Scientific	PA5-18598	Primary antibodies
Anti-Glucagon  antibody produced in mouse (Glucagon)	Santa Cruz Biotechnology	sc-514592	Primary antibodies
Anti-insulin antibody produced in guinea pig (insulin)	DAKO	IR00261-2	Primary antibodies
Anti-MBP antibody produced in rat (MBP)	Abcam	ab7349	Primary antibodies
Anti-NeuN antibody produced in rabbit (NeuN)	Thermo Scientific	PA5-78639	Primary antibodies
Anti-Pancreatic polypeptide (PP) antibody produced in goat- Pancreatic polypeptide (PP)	Sigma Aldrich	SAB2500747	Primary antibodies
Anti-Pdx1 antibody produced in rabbit (Pdx1)	Milipore	06-1379	Primary antibodies
Anti-Somatostatin antibody produced in rat (Somatostatin)	Abcam	ab30788	Primary antibodies
Anti-Vimentin antibody produced in chicken (Vimentin)	Abcam	ab24525	Primary antibodies
Band-pass filter	KR Electronics	KR2724	8 MHz
BNC 50 Ohm Terminator	Mini Circuits	STRM-50
BNC cable	Thorlabs	2249-C	Coaxial Cable, BNC Male / Male
Broadband dielectric mirror	Thorlabs	BB1-E03	750 – 1100 nm
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	000664
Centrifuge
Condenser	Olympus		oil immersion, 1.4 N.A.
Cytokeratin 18	Abcam	ab7797	Primary antibodies
Cytokeratin 18	Abcam	ab24561	Primary antibodies
DC power supply	TopWard	6302D	Bias voltage is 64 V
Dichroic mount	Thorlabs	KM100CL	Kinematic Mount for up to 1.3" (33 mm) Tall Rectangular Optics, Left Handed
Donkey anti-Chicken IgY (H+L)	Jackson ImmunoResearch	703-005-155	Secondary antibodies for MARS conjugation
Donkey anti-Goat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	705-005-147	Secondary antibodies for MARS conjugation
Donkey anti-Guinea Pig IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	706-005-148	Secondary antibodies for MARS conjugation
Donkey anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	715-005-151	Secondary antibodies for MARS conjugation
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-005-152	Secondary antibodies for MARS conjugation
Donkey anti-Rat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	712-005-153	Secondary antibodies for MARS conjugation
Donkey anti-Sheep IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	713-005-147	Secondary antibodies for MARS conjugation
DPBS	Fisher Scientific	14-190-250
EpCAM	Abcam	ab71916	Primary antibodies
Ethanol	Sigma Aldrich	443611
Fast-speed look-in amplifier	Zurich Instruments	HF2LI	DC – 50 MHz
FFPE Kidney Sample	USBiomax	HuFPT072
Fibrillarin	Abcam	ab5821	Primary antibodies
Giantin	Abcam	ab24586	Primary antibodies
Glucagon	Santa Cruz Biotechnology	sc-514592	Primary antibodies
H2B	Abcam	ab1790	Primary antibodies
HeLa	ATCC	ATCC CCL-2
High O.D. bandpass filter	Chroma Technology	ET890/220m	Filter the Stokes beam and transmit the pump beam
Hydrophobic pen	Fisher Scientific	NC1384846
Insulin	ThermoFisher	701265	Primary antibodies
Integrated SRS laser system	Applied Physics & Electronics, Inc.	picoEMERALD	picoEMERALD provides an output pulse train at 1,064 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam. The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1,064-nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulse trains is achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope.
Inverted laser-scanning microscope	Olympus	FV1200MPE
Kinematic mirror mount	Thorlabs	POLARIS-K1-2AH	2 Low-Profile Hex Adjusters
Lectin from Triticum vulgaris (wheat)	Sigma Aldrich	L0636-5 mg
Long-pass dichroic beam splitter	Semrock	Di02-R980-25×36	980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter
MAP2	BioLegend	801810	Primary antibodies
Microscopy imaging software	Olympus	FluoView
NanoQuant Plate	Tecan		For absorbance-based, small volume analyses in a plate reader.
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI)	Thermo Scientific	R37606
Nunc 4-Well Dishes	Fisher Scientific	12-566-300
Objective lens	Olympus	XLPlan N	x25, 1.05-NA, MP, working distance = 2 mm
Paint brush
Periscope assembly	Thorlabs	RS99	includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork.
pH meter
Plate reader	Tecan	Infinite 200 PRO	An easy-to-use multimode plate reader. Absorbance measurement capabilities over a spectral range of 230–1000 nm.
ProLong Gold antifade reagent	Thermo Scientific	P36930
PSD95	Invitrogen	51-6900	Primary antibodies
Sephadex G-25 Medium	GE Life Sciences	17-0033-01	gel filtration resin for desalting and buffer exchange
Shielded box with BNC connectors	Pomona Electronics	2902	Aluminum Box With Cover, BNC Female/Female
Si photodiode	Thorlabs	FDS1010	350–1100 nm, 10 mm x 10 mm Active Area
Synapsin 2	ThermoFisher	OSS00073G	Primary antibodies
Tissue Path Superfrost Plus Gold Slides	Fisher Scientific	22-035813	Adhesive slide to attract and chemically bond fresh or formalin-fixed tissue sections firmly to the slide surface (tiisue bindling glass slides)
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500
Vibratome	Leica	VT1000
Vimentin	Abcam	ab8069	Primary antibodies
Xylenes	Sigma Aldrich	214736