Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Zebrafish Corneal Wound Healing: van abrasie tot wond closure imaging analyse

Published: March 1, 2022 doi: 10.3791/63605
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Institute of Biotechnology, HiLIFE, University of Helsinki, 2Institute for Neurosciences of Montpellier, Univ Montpellier

Summary

Dit protocol richt zich op het beschadigen van het oculaire oppervlak van zebravissen door middel van slijtage om de daaropvolgende wondsluiting op cellulair niveau te beoordelen. Deze benadering maakt gebruik van een oculaire braam om het hoornvliesepitheel gedeeltelijk te verwijderen en maakt gebruik van scanning elektronenmicroscopie om veranderingen in de celmorfologie tijdens wondsluiting te volgen.

Abstract

Als het transparante oppervlak van het oog is het hoornvlies instrumenteel voor helder zicht. Vanwege de locatie is dit weefsel gevoelig voor omgevingsbeledigingen. Inderdaad, de oogletsels die het vaakst klinisch worden aangetroffen, zijn die aan het hoornvlies. Hoewel hoornvlieswondgenezing uitgebreid is bestudeerd bij kleine zoogdieren (d.w.z. muizen, ratten en konijnen), hebben hoornvliesfysiologiestudies andere soorten verwaarloosd, waaronder zebravissen, ondanks dat zebravissen een klassiek onderzoeksmodel zijn.

Dit rapport beschrijft een methode voor het uitvoeren van een hoornvliesslijtage op zebravissen. De wond wordt in vivo uitgevoerd op verdoofde vissen met behulp van een oculaire braam. Deze methode zorgt voor een reproduceerbare epitheliale wond, waardoor de rest van het oog intact blijft. Na slijtage wordt de wondsluiting in de loop van 3 uur gecontroleerd, waarna de wond opnieuw wordt gepipitheliseerd. Door gebruik te maken van scanning elektronenmicroscopie, gevolgd door beeldverwerking, kunnen de epitheelcelvorm en apicale uitsteeksels worden onderzocht om de verschillende stappen tijdens het sluiten van hoornvliesepitheelwonden te bestuderen.

De kenmerken van het zebravismodel maken het mogelijk om de epitheelweefselfysiologie en het collectieve gedrag van de epitheelcellen te bestuderen wanneer het weefsel wordt uitgedaagd. Bovendien kan het gebruik van een model dat verstoken is van de invloed van de traanfilm nieuwe antwoorden opleveren met betrekking tot de reactie van het hoornvlies op stress. Ten slotte maakt dit model ook de afbakening mogelijk van de cellulaire en moleculaire gebeurtenissen die betrokken zijn bij epitheelweefsel dat wordt blootgesteld aan een fysieke wond. Deze methode kan worden toegepast op de evaluatie van de effectiviteit van geneesmiddelen in preklinische tests.

Introduction

Omdat de meeste epithelia in contact staan met de externe omgeving, zijn ze gevoelig voor lichamelijk letsel, waardoor ze zeer geschikt zijn voor de studie van wondgenezingsprocessen. Onder de goed bestudeerde weefsels is het hoornvlies een uiterst nuttig model bij het onderzoek naar de cellulaire en moleculaire aspecten van wondgenezing. Als transparant extern oppervlak biedt het fysieke bescherming aan het oog en is het het eerste element dat het licht op het netvlies richt. Hoewel de structuur en celsamenstelling van het netvlies verschillen tussen soort1, zijn deze elementen van het hoornvlies over het algemeen vergelijkbaar in alle camera-achtige ogen, ongeacht de soort.

Het hoornvlies bestaat uit drie hoofdlagen2. De eerste en buitenste laag is het epitheel, dat voortdurend wordt vernieuwd om de transparantie ervan te garanderen. De tweede laag is het stroma, dat verspreide cellen bevat, keratocyten genaamd, in een dikke laag strikt georganiseerde collageenvezels. De derde en binnenste laag is het endotheel, dat voedings- en vloeistofdiffusie van de voorste kamer naar de buitenste lagen mogelijk maakt. De epitheel- en stromale cellen interageren via groeifactoren en cytokines3. Deze interactie wordt benadrukt door de snelle apoptose en de daaropvolgende proliferatie van keratocyten na epitheliaal letsel 4,5. Bij een diepere wond, zoals een punctie, nemen keratocyten actief deel aan het genezingsproces6.

Omdat ze in contact zijn met de externe omgeving, komen lichamelijke verwondingen van het hoornvlies vaak voor. Veel van hen worden veroorzaakt door kleine vreemde voorwerpen7, zoals zand of stof. De reflex van oogwrijven kan leiden tot uitgebreide epitheliale schaafwonden en cornea-remodellering8. Afhankelijk van de wondgrootte en -diepte zijn deze fysieke verwondingen pijnlijk en duurt het enkele dagen om te genezen9. De optimale wondgenezingskenmerken van een model vergemakkelijken het begrip van de cellulaire en moleculaire aspecten van wondsluiting. Bovendien zijn dergelijke modellen ook nuttig gebleken voor het testen van nieuwe moleculen met het potentieel om de genezing van het hoornvlies te versnellen, zoals eerder is aangetoond10,11.

Het hier beschreven protocol heeft tot doel zebravissen te gebruiken als een relevant model om hoornvliesletsel te bestuderen. Dit model is zeer geschikt voor farmacologische screeningstudies omdat het moleculen mogelijk maakt om rechtstreeks aan het tankwater toe te voegen en daarom in contact te komen met een genezend hoornvlies. De details die hier worden verstrekt, zullen wetenschappers helpen hun studies over het zebravismodel uit te voeren. De in vivo verwonding wordt uitgevoerd met een afgestompte oculaire braam. De impact op epitheelcellen die eraan grenzen of op afstand ervan liggen, kan worden geanalyseerd door specifiek het centrale hoornvliesepitheel te verwijderen. In de afgelopen jaren richtten talrijke rapporten zich op een dergelijke methode op het hoornvlies van knaagdieren 12,13,14,15,16,17; tot op heden heeft echter slechts één rapport deze methode toegepast op zebravissen18.

Vanwege zijn eenvoud is de fysieke wond nuttig bij het afbakenen van de rol van epitheelcellen bij wondsluiting. Een ander bekend model van hoornvliesletsel is de chemische verbranding, met name de alkaliverbranding 19,20,21. Een dergelijke benadering beschadigt echter indirect het hele oogoppervlak, inclusief het perifere hoornvlies en het hoornvliesstroma19. Inderdaad, alkalibrandwonden induceren mogelijk hoornvlieszweren, perforaties, epitheliale opacificatie en snelle neovascularisatie22, en de oncontroleerbare uitkomst van alkalibrandwonden diskwalificeert die benadering voor algemene wondgenezingsstudies. Tal van andere methoden worden ook gebruikt om hoornvlieswondgenezing te onderzoeken volgens de specifieke focus van de studie in kwestie (bijv. Volledig epitheeldebridement23, de combinatie van chemisch en mechanisch letsel voor wond met gedeeltelijke dikte24, excimeerlaserablatie voor wonden die zich uitstrekken tot het stroma25). Het gebruik van een oculaire braam beperkt het brandpunt tot de epitheliale respons op de wond en zorgt voor een zeer reproduceerbare wond.

Zoals bij elke methode van wondtoebrengen, heeft het gebruik van een oculaire braam voor- en nadelen. Het grootste nadeel is dat de respons meestal epitheeliaal is, het weerspiegelt niet perfect de schaafwonden die in de klinische setting worden gezien. Deze methode heeft echter tal van voordelen, waaronder het gemak waarmee het kan worden opgezet en uitgevoerd, de precisie, de reproduceerbaarheid en het feit dat het niet-invasief is, waardoor het een methode is die goed wordt verdragen door dieren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle experimenten zijn goedgekeurd door de landelijke proefdiercommissie.

1. Voorbereidingen

  1. Bereid de tricaine stock-oplossing die wordt gebruikt voor anesthesie26 van tevoren (0,4% stockoplossing die in dit protocol wordt gebruikt). Gebruik handschoenen en bewaar de materialen waar mogelijk in een zuurkast.
    1. Weeg voor 50 ml van een 0,4% oplossing 200 mg tricaïnepoeder in een buis van 50 ml. Los het poeder op in ongeveer 45 ml dubbel gedestilleerd water.
    2. Stel de pH van de tricaïne-stamoplossing in op 7 met 1 M Tris (pH 8,8, ~ 1,25 ml). Voeg de Tris-oplossing toe aan de tricainebouillon in aliquots, meng de bouillon grondig na elke aliquot en controleer de pH na elke toevoeging van Tris.
  2. Bereid vóór het experiment een 0,02% werkende oplossing van tricaïne voor.
    1. Ontdooi 2 ml 0,4% stamoplossing en voeg toe aan 40 ml systeemwater (eindconcentratie 0,02%). Plaats de oplossing in een kleine container.
  3. Bereid vóór het experiment het herstelwater voor dat pijnstillend middel bevat. Gebruik handschoenen en bewaar de materialen waar mogelijk in de zuurkast.
    1. Weeg voor een liter herstelwater 2,5 mg lidocaïnehydrochloridepoeder en los het op in zoet systeemwater. Controleer de pH en stel deze indien nodig in op 7.
  4. Bereid vóór het experiment de fixatieoplossing (2,5% glutaaraldehyde in 0,1 M natriumfosfaat (Na-PO4) oplossing bij pH 7,4). Gebruik handschoenen en bewaar de materialen in een zuurkast.
    1. Pipetteer voor 10 ml van de bevestigingsoplossing 5 ml van 0,2 M Na-PO4 in een buis. Voeg 0,5 ml 50% glutaaraldehyde toe en voeg dubbel gedestilleerd water toe om het uiteindelijke volume van 10 ml te verkrijgen. Bescherm de oplossing tegen licht en bewaar deze voor gebruik op ijs of in de koelkast.
      OPMERKING: Als monsters enkele uren na het verwonden moeten worden verzameld, bereidt u de bevestigingsoplossing vlak voor gebruik voor.
  5. Bereid de apparatuur voor op verwonding (figuur 1).
    1. Vul de bergingstanks of kleinere containers met systeemwater.
    2. Houd de oogheelkundige braam klaar. Controleer of de braampunt schoon is. Verwijder indien nodig celresten met een vochtig wattenstaafje.
    3. Maak een incisie aan de zijkant van een zachte spons en bevochtig de spons met systeemwater. Plaats de spons op de basis/het podium van een ontleedmicroscoop. Zorg voor voldoende werkruimte voor het gebruik van de braam en voldoende verlichting vanaf de zijkanten en/of boven om het oogoppervlak goed te kunnen zien.

2. Anesthesie

  1. Breng een vis zo voorzichtig mogelijk over van de tank naar de 0,02% tricaïne-oplossing met een net.
  2. Controleer de anesthesie en controleer op een gebrek aan respons op lichte mechanische stimuli.
    OPMERKING: Voor consistente anesthesie wordt een blootstelling van 2 minuten aan tricaïne gebruikt voorafgaand aan slijtage met volwassen wild-type AB-vissen. Bij vissen met een andere genetische achtergrond kan een andere duur nodig zijn.

3. Slijtage

  1. Plaats de verdoofde vis voorzichtig met een lepel in de incisie op de spons, hoofd steekt uit het sponsoppervlak.
  2. Zet de braam aan en richt de microscoop op het oogoppervlak.
  3. Benader het oogoppervlak voorzichtig met de braampunt. Wanneer u het oogoppervlak aanraakt, begint u de braampunt met cirkelvormige beweging op het oogoppervlak te bewegen. Vermijd plotselinge beweging, omdat dit ertoe kan leiden dat het oog in de oogkas kantelt en de braampunt wegglijdt.
  4. Wanneer de schaafwond is voltooid, plaatst u de vis voorzichtig in systeemwater met het pijnstillend middel voor herstel.
  5. Reinig de braam direct na gebruik met een vochtig wattenstaafje.

4. Monsters verzamelen

  1. Pak de vis op het gewenste tijdstip op met een net en plaats deze in 0,02% tricaïne-oplossing. Houd het dier in de oplossing totdat de operculaire beweging volledig is gestopt en de vis niet reageert op aanraking.
  2. Leg de vis met een lepel op een petrischaaltje en houd hem met een pincet vast. Onthoofd de vis met een ontleedschaar. Vermijd krassen op het oogoppervlak bij het hanteren van het monster.
  3. Doe het weefsel in een monsterbuis met 0,1 M Na-PO4.
    1. Spoel het weefsel door de 0,1 M Na-PO4 te vervangen door een schone buffer zodat er geen bloed in de oplossing achterblijft.

5. Monsterverwerking voor elektronenmicroscopie

  1. Fixeer het weefsel in 2,5% glutaaraldehyde/0,1 M Na-PO4 (pH 7,4) gedurende ~24 uur bij +4 °C. Bewaar het monster op een roterende/schuddende monsterhouder om een goede fixatie te garanderen.
  2. Verwijder de bevestigingsoplossing en spoel het monster meerdere keren met 0,1 M Na-PO4.
  3. Ontleed het monster op dit punt.
    1. Plaats het monster op een druppel van 0,1 M Na-PO4 op een ontleedplaat. Als beide ogen van dezelfde vis moeten worden afgebeeld, knipt u het kopmonster in tweeën met een fijne ontleedschaar.
    2. U kunt de ogen ook alleen verzamelen door de uiteinden van een fijn pincet voorzichtig vanaf de zijkant van het oog in de oogkas te plaatsen, waarbij u extra voorzichtig bent om het oogoppervlak niet te krassen. Trek vervolgens het oog uit de kom.
    3. Breng het ontleedde monster over in een buis met 0,1 M Na-PO4. Zorg ervoor dat er geen extra weefsel in de monsterbuis zit, omdat deze zich tijdens de monsterverwerking aan de bovenkant van het oog kan hechten.
  4. Bewaar het monster in 0,1 M Na-PO4 (maximaal één week) bij +4 °C.
  5. Verwerk de monsters voor elektronenmicroscopie beeldvorming.
    1. Postfix de monsters in 2% osmiumtetroxide in 0,1 M Na-PO4 buffer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (RT).
    2. Was de monsters 3 keer gedurende 5 minuten elke wasbeurt in 0,1 M Na-PO4 bij RT.
    3. Droog de monsters achtereenvolgens uit in 30%, 50% en 70% ethanol gedurende 1 uur in elke oplossing bij RT.
    4. Dompel de monsters onder in 96% ethanol gedurende 2-3 uur bij RT.
    5. Incubeer vervolgens de monsters twee keer in 100% ethanol, eerst gedurende 1 uur en vervolgens in verse 100% ethanol gedurende een nacht bij +4 °C.
    6. Onderwerp de monsters aan 30 cycli in een geautomatiseerde kritische puntdroger.
  6. Sluit de monsters in en platina-coat ze.
    1. Plaats een zelfklevend lipje op een houder. Als het monster bovenop de houder moet worden gemarkeerd, laat u een stuk papier met tabdeksel op het tabblad liggen en schrijft u de monster-ID op het papier.
    2. Plaats de houder met het lipje op de basis van een ontleedmicroscoop.
    3. Plaats het weefselmonster voorzichtig op de houder met een fijn pincet, hoornvlies naar boven gericht.
    4. Bekleed het monster met platina met het juiste apparaat. Bewaar de monsters na het coaten bij kamertemperatuur totdat ze worden afgebeeld.

6. Beeldvorming (figuur 2)

  1. Bedien de apparaten zoals geadviseerd in de gebruikershandleiding en door imaging-experts.
  2. Verkrijg afbeeldingen van de gewenste vergroting en gebruik 2.000-2.500x afbeeldingen voor analyse.
  3. Pas de helderheid en het contrast aan zodat er geen overbelichte gebieden in het beeld zijn en celranden en microridges zo duidelijk mogelijk worden gezien.
    OPMERKING: De positie en hoek van het weefsel zijn van invloed op de helderheids- en contrastinstellingen. Ze moeten mogelijk worden aangepast van monster tot monster en tussen verschillende delen van het weefsel.

7. Het meten van celvorm, grootte en microridgepatroon

  1. Open de TIFF-afbeelding in Fiji ImageJ 1.5327. Stel de schaal in met de schaalbalk van de afbeelding: maak een lijn die qua grootte gelijk is aan de schaalbalk met het gereedschap Lijn . Selecteer | analyseren Stel de schaal in en typ de bekende afstand. Open de ROI-manager vanuit het | Analyseren Menu Extra .
  2. Voor celgrootte en ronding selecteert u | analyseren Stel metingen | in Vormbeschrijvingen. Gebruik het gereedschap Vergrootglas om de cellen onder vergroting te zien. Selecteer cellen met het gereedschap Veelhoek en voeg elke selectie toe aan de ROI-manager. Meet ten slotte de geselecteerde cellen en sla de meting op.
  3. Microridge-analyse (figuur 3 en figuur 4)
    1. Zorg ervoor dat de afbeelding de 8-bits indeling heeft van de | Typ menu.
    2. Selecteer een cel met het gereedschap Veelhoek en wis de achtergrond uit Bewerken | Helder buiten.
    3. Maak de afbeelding één tot drie keer vloeiend door Proces | Vloeiend en pas de helderheid en het contrast aan vanuit Afbeelding | | aanpassen Helderheid/Contrast zodat de microridges zo duidelijk mogelijk opvallen.
    4. Voeg het beeld samen vanuit Process | Filters | Convolve, verander in binair van Proces | Binaire | Maak binair en skelet de zwart-witafbeelding door Proces | Binaire | Skeletoniseren.
    5. Gebruik de functie Skelet analyseren in de | Skeletmenu om de microridgeparameters te meten en de waarden op te slaan.
      OPMERKING: In SEM kunnen afzonderlijke afbeeldingen verschillen in helderheid en contrast. De stappen in de analyse moeten dus mogelijk worden aangepast van afbeelding tot afbeelding.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Deze studie beschrijft een methode met behulp van een oogheelkundige braam in zebravis corneale wondgenezingsexperimenten. De methode is aangepast van eerdere studies bij muizen, waarbij werd aangetoond dat de braam de epitheelcellagen efficiënt verwijdert13. De uitdagingen bij het verwonden van het hoornvlies van zebravissen omvatten de relatief kleine omvang van het oog en in het geval van tijdrovende experimenten de noodzaak om een constante waterstroom door de kieuwen te behouden (zoals beschreven door Xu en collega's28). De belangrijkste voordelen van deze methode zijn de eenvoud en snelheid. Een standaard ontleedmicroscoop wordt gebruikt voor gecontroleerd gebruik van de braam (figuur 1). Omdat de procedure van korte duur is (ongeveer 3 minuten vanaf het begin van de anesthesie), herstelt de vis goed van de behandeling en is er geen extra apparatuur nodig voor het onderhoud van anesthesie en zuurstoftoevoer.

Er zijn verschillende manieren om de hoornvlieswond te visualiseren. Dit protocol maakt gebruik van scanning elektronenmicroscopie (SEM, figuur 2), die een lange geschiedenis van gebruik in hoornvliesstudies heeft29,30. Hoewel deze aanpak geen beoordeling van de onderste lagen van het epitheel mogelijk maakt, biedt het een eenvoudige methode om de wondgenezingssnelheid te schatten en de hoornvliesoppervlakken van verschillende delen van het oog te vergelijken. Na 3 uur na de wond, terwijl het wondgebied gesloten is (figuur 2), blijft de plaats waar de wondranden zijn samengevoegd zichtbaar (figuur 2).

De oppervlakkige cellen op het hoornvlies van zebravissen bevatten uitgesproken microridges31. Onlangs meldde een studie dat deze structuren verloren zijn gegaan in langwerpige cellen naast wonden op de huid van zebravissen32. De gepresenteerde resultaten laten echter zien dat op geschuurd hoornvliesepitheel microridges kunnen worden waargenomen in sommige langwerpige cellen naast de wondplaats (figuur 4B). In sommige perifere gebieden gaan de microridges verloren vanuit het midden van de cel (figuur 4C,D). Voor een meer gedetailleerde analyse worden het apicale celoppervlak en de ronding gekwantificeerd, naast de hoeveelheid microridge en de gemiddelde lengte in afbeeldingJ27 (figuur 3 en figuur 4E-H).

De microridge-analyse wordt gedaan met behulp van de Skeleton-functie (aangepast van van Loon en collega's33). Uit een vergelijking tussen de twee perifere regio's (figuur 4A (regio's C en D), figuur 4C en figuur 4D) blijkt dat de cellen in figuur 4D meer langwerpig zijn (wat wijst op celherschikkingen als reactie op verwonding) en kortere gemiddelde microridges hebben dan cellen in figuur 4C. Dit resultaat suggereert dat de verandering in celvorm correleert met de microridgemodificatie en benadrukt de heterogeniteit binnen het cornea-epitheel in wondrespons.

Het meten van het apicale celoppervlak en de ronding op SEM-beelden is een eenvoudige en reproduceerbare manier om kwantitatieve gegevens te verkrijgen over het uiterlijk van cellen in verschillende regio's van het hoornvlies. Hoewel beperkt tot 2D, helpt deze aanpak bij het verkrijgen van een algemeen begrip van de dynamiek en snelheid van celherschikkingen tijdens wondsluiting. De SEM-beelden worden gebruikt voor het analyseren van de microridgepatronen op het apicale celoppervlak. De hier beschreven beeldverwerking geeft een benadering van de veranderingen in de microridge-parameters, die vervelend zouden zijn om met de hand te meten.

Figure 1
Figuur 1: De opstelling voor hoornvliesslijtage. (A) Een ontleedmicroscoop is nodig voor de gecontroleerde slijtage op het kleine zebravisoog. (B) De spons helpt de verdoofde vis tijdens de procedure te stabiliseren. (C) De vis wordt verdoofd op een petrischaaltje en het verdoofde dier wordt met een kleine lepel naar de spons overgebracht. Een oculaire braam met een punt van 0,5 mm wordt gebruikt om het hoornvlies te schuren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Visualisatie van het gewonde hoornvlies met scanning elektronenmicroscopie. Het overzicht van het geschuurde hoornvlies verzameld op 0, 1, 2 of 3 h post wound (HPW). De stippellijn geeft de wondrand aan. Schaalbalken = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Een voorbeeld van de beeldmodificatie voorafgaand aan microridgemeting. Hoewel het geen exacte replica is van het oorspronkelijke celoppervlak, legt het uiteindelijke geskeletiseerde patroon de verschillen tussen het celcentrum en de periferie vast. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Een vergelijking van apicale celoppervlak, rondheid en microridgewaarden tussen twee perifere gebieden na cornea-abrasie. (A) Een overzicht van het gewonde oog. De vakken geven de locatie aan van de hogere vergrotingsafbeeldingen (in B, C en D). (C, D) Cellen die zijn geselecteerd voor de analyse van vormdescriptoren zijn gemarkeerd met een groene omtrek. (E, F) Apicale celgebied (E) en ronding (F) waarden van geselecteerde cellen. (G, H) Microridge totale lengte (G) en gemiddelde lengte (H) van dezelfde cellen. Groepen werden statistisch vergeleken met een tweezijdige t-test (*p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01) Schaalbalken = 500 μm in A, 50 μm in B, C en D. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Cornea lichamelijk letsel is de meest voorkomende oorzaak van oogheelkundige patiëntbezoeken aan het ziekenhuis. Daarom is het belangrijk om relevante modellen vast te stellen voor de studie van verschillende aspecten van cornea-pathofysiologie. Tot nu toe is de muis het meest gebruikte model voor de studie van hoornvlieswondgenezing. Het toevoegen van oogdruppels op muriene gewonde ogen om de impact van specifieke geneesmiddelen op de genezing van hoornvlieswonden te valideren, kan echter moeilijk zijn. In dit opzicht is het zebravismodel bijzonder nuttig voor de farmacologische screening van moleculen die de genezing van hoornvlieswonden beïnvloeden. De hier beschreven methode lijkt sterk op die beschreven voor muis13.

Twee specifieke punten van verschil moeten echter in gedachten worden gehouden. Ten eerste vereist het gebruik van een oogheelkundige braam oefening om de reproduceerbaarheid van de wond te garanderen, met name met betrekking tot de druk die op het oog wordt uitgeoefend, wat van cruciaal belang is voor een goede slijtage. Bovendien moet de schuurpunt worden vervangen wanneer het epitheel niet langer efficiënt wordt verwijderd. Ten tweede, terwijl de structuur en morfologie van het hoornvlies van de zebravis vergelijkbaar zijn met andere hoornvliezen31, bezit dit dier regeneratieve capaciteiten die ongeëvenaard zijn in zoogdierorganismen 34,35,36. Terwijl wondsluiting bij muis 48-72 hduurt 11,14,37, wordt een tijdlijn van 3 h gemeld voor zebravissen. Vanwege structurele en moleculaire overeenkomsten is het cellulaire gedrag geïnduceerd door een hoornvliesvlieswond waarschijnlijk vergelijkbaar bij de meeste gewervelde dieren. De snelle reactie bij zebravissen wordt echter waarschijnlijk geleid door een geavanceerd regeneratief mechanisme dat specifiek is voor dat dier.

Het beschreven protocol maakt gebruik van SEM om wondsluiting te volgen. Tal van andere studies hebben in plaats daarvan fluorescentiemicroscopie gebruikt om dit proces te volgen 15,17,38. Het gebruik van SEM vergemakkelijkt echter de analyse van celvormmodificatie na epitheliale slijtage. Het nadeel van die technologie is dat de stratificatiestappen niet kunnen worden gevolgd, omdat SEM alleen de beeldvorming van de meest externe laag mogelijk maakt. Om het epitheel in 3D te bestuderen tijdens volledige hoornvliesgenezing, moeten fluorescerende modellen, zoals Zebrabow39, of immunolabeling worden gebruikt.

Het gebruik van zebravissen als een hoornvlies wondgenezingsmodel verbetert de reikwijdte van het onderzoek, omdat het de toepassing van tal van beschikbare moleculaire hulpmiddelen mogelijk maakt, zoals genetisch gemodificeerde vislijnen, morfo's en chemische screening, om het mogelijke bereik van hoornvlieswondgenezingsstudies aanzienlijk uit te breiden. Bovendien maakt de grootte van de zebravisogen de ontwikkeling van nieuwe beeldvormingsstrategieën mogelijk om epitheelceldynamica in meer detail te bestuderen dan met muizenogen kan worden gedaan.

Het belangrijkste doel van dit rapport is niet alleen om de fysische hoornvlieswondenbenadering aan te passen aan het zebravismodel, maar ook om aan te tonen dat het gebruik van nieuwe modellen het mogelijk maakt om nieuwe vragen te stellen en te beantwoorden en wijst op nieuwe manieren om fundamentele biologische verschijnselen te onderzoeken. Deze voordelen zullen uiteindelijk gunstig zijn voor patiënten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs bedanken Pertti Panula voor de toegang tot de Zebraviseenheid en Henri Koivula voor de begeleiding en hulp bij de zebravisexperimenten. Dit onderzoek werd ondersteund door de Academie van Finland, de Jane and Aatos Erkko Foundation, de Finnish Cultural Foundation en het ATIP-Avenir Program. Beeldvorming werd uitgevoerd op de elektronenmicroscopie-eenheid en de lichtmicroscopie-eenheid, Instituut voor Biotechnologie, ondersteund door HiLIFE en Biocenter Finland.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4 in-house Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2 HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2 PO4 ).
0.2M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4 in-house Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2 HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2 PO4 ).
0.5mm burr tips Alger Equipment Company BU-5S
1M Tris, pH 8.8 in-house
adhesive tabs Agar Scientific G3347N
Algerbrush burr, Complete instrument Alger Equipment Company BR2-5
Cotton swaps Heinz Herenz Hamburg 1030128
Dissecting plate in-house
Dissecting tools Fine Science Tools
double-distilled water in-house
Eppedorf tubes, 2ml any provider
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt Sigma A5040 Caution: causes irritation.
Glutaraldehyde, 50% aqueous solution, grade I Sigma G7651 Caution: toxic.
Lidocaine hydrochloride Sigma L5647 Caution: toxic.
mounts Agar Scientific G301P
Petri dish Thermo Scientific 101VR20
pH indicator strips Macherey-Nagel 92110
Plastic spoons any provider
Plastic tubes, 15 ml Greiner Bio-One 188271
Plastic tubes, 50 ml Greiner Bio-One 227261
Scanning electron microscope FEI Quanta 250 FEG
Soft sponge any provider
Sputter coater Quorum Technologies GQ150TS
Stereomicroscope Leica

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baden, T., Euler, T., Berens, P. Understanding the retinal basis of vision across species. Nature Reviews.Neuroscience. 21 (1), 5-20 (2020).
  2. Nishida, T., Saika, S., Morishige, N. Cornea and sclera: Anatomy and physiology. Cornea: Fundamentals, diagnosis and management, 4th ed. Manis, M. J., Holland, E. J. , Elsevier. 1-22 (2017).
  3. Wilson, S. E., Liu, J. J., Mohan, R. R. Stromal-epithelial interactions in the cornea. Progress in Retinal and Eye Research. 18 (3), 293-309 (1999).
  4. Wilson, S. E., et al. Epithelial injury induces keratocyte apoptosis: hypothesized role for the interleukin-1 system in the modulation of corneal tissue organization and wound healing. Experimental Eye Research. 62 (4), 325-327 (1996).
  5. Zieske, J. D., Guimaraes, S. R., Hutcheon, A. E. Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement. Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).
  6. West-Mays, J. A., Dwivedi, D. J. The keratocyte: corneal stromal cell with variable repair phenotypes. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 38 (10), 1625-1631 (2006).
  7. Ahmed, F., House, R. J., Feldman, B. H. Corneal abrasions and corneal foreign bodies. Primary Care. 42 (3), 363-375 (2015).
  8. Ben-Eli, H., Erdinest, N., Solomon, A. Pathogenesis and complications of chronic eye rubbing in ocular allergy. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 19 (5), 526-534 (2019).
  9. Wilson, S. A., Last, A. Management of corneal abrasions. American Family Physician. 70 (1), 123-128 (2004).
  10. Nagata, M., et al. JBP485 promotes corneal epithelial wound healing. Scientific Reports. 5, 14776 (2015).
  11. Wang, X., et al. MANF promotes diabetic corneal epithelial wound healing and nerve regeneration by attenuating hyperglycemia-induced endoplasmic reticulum stress. Diabetes. 69 (6), 1264-1278 (2020).
  12. Li, F. J., et al. Evaluation of the AlgerBrush II rotating burr as a tool for inducing ocular surface failure in the New Zealand White rabbit. Experimental Eye Research. 147, 1-11 (2016).
  13. Kalha, S., Kuony, A., Michon, F. Corneal epithelial abrasion with ocular burr as a model for cornea wound healing. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (137), e58071 (2018).
  14. Kalha, S., et al. Bmi1+ progenitor cell dynamics in murine cornea during homeostasis and wound healing. Stem Cells. 36 (4), 562-573 (2018).
  15. Park, M., et al. Visualizing the contribution of keratin-14(+) limbal epithelial precursors in corneal wound healing. Stem Cell Reports. 12 (1), 14-28 (2019).
  16. Kuony, A., et al. Ectodysplasin-A signaling is a key integrator in the lacrimal gland-cornea feedback loop. Development. 146 (14), (2019).
  17. Farrelly, O., et al. Two-photon live imaging of single corneal stem cells reveals compartmentalized organization of the limbal niche. Cell Stem Cell. 28 (7), 1233-1247 (2021).
  18. Ikkala, K., Michon, F., Stratoulias, V. Unilateral Zebrafish corneal injury induces bilateral cell plasticity supporting wound closure. Scientific Reports. , (2021).
  19. Ormerod, L. D., Abelson, M. B., Kenyon, K. R. Standard models of corneal injury using alkali-immersed filter discs. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (10), 2148-2153 (1989).
  20. Anderson, C., Zhou, Q., Wang, S. An alkali-burn injury model of corneal neovascularization in the mouse. Journal of visualized experiments: JoVE. (86), e51159 (2014).
  21. Choi, H., et al. Comprehensive modeling of corneal alkali injury in the rat eye. Current Eye Research. 42 (10), 1348-1357 (2017).
  22. Singh, P., Tyagi, M., Kumar, Y., Gupta, K. K., Sharma, P. D. Ocular chemical injuries and their management. Oman Journal of Ophthalmology. 6 (2), 83-86 (2013).
  23. Pal-Ghosh, S. BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds. Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).
  24. Chen, J. J., Tseng, S. C. Abnormal corneal epithelial wound healing in partial-thickness removal of limbal epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (8), 2219-2233 (1991).
  25. Xeroudaki, M., Peebo, B., Germundsson, J., Fagerholm, P., Lagali, N. RGTA in corneal wound healing after transepithelial laser ablation in a rabbit model: a randomized, blinded, placebo-controlled study. Acta Ophthalmologica. 94 (7), 685-691 (2016).
  26. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio. , Available from: https://zfinorg/zf_info/zfbook/zfbk.html (2000).
  27. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  28. Xu, C., Volkery, S., Siekmann, A. F. Intubation-based anesthesia for long-term time-lapse imaging of adult zebrafish. Nature Protocols. 10 (12), 2064-2073 (2015).
  29. Crosson, C. E., Klyce, S. D., Beuerman, R. W. Epithelial wound closure in the rabbit cornea. A biphasic process. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 27 (4), 464-473 (1986).
  30. Parlanti, P., et al. Axonal debris accumulates in corneal epithelial cells after intraepithelial corneal nerves are damaged: A focused Ion Beam Scanning Electron Microscopy (FIB-SEM) study. Experimental Eye Research. 194, 107998 (2020).
  31. Zhao, X. C., et al. The zebrafish cornea: structure and development. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (10), 4341-4348 (2006).
  32. Richardson, R., et al. Re-epithelialization of cutaneous wounds in adult zebrafish combines mechanisms of wound closure in embryonic and adult mammals. Development. 143 (12), 2077-2088 (2016).
  33. van Loon, A. P., Erofeev, I. S., Maryshev, I. V., Goryachev, A. B., Sagasti, A. Cortical contraction drives the 3D patterning of epithelial cell surfaces. The Journal of Cell Biology. 219 (3), (2020).
  34. Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina. Journal of Neurobiology. 44 (3), 289-307 (2000).
  35. Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).
  36. Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish. The Journal of Comparative Neurology. 377 (4), 577-595 (1997).
  37. Hu, X., et al. Sirt6 deficiency impairs corneal epithelial wound healing. Aging. 10 (8), 1932-1946 (2018).
  38. Ksander, B. R., et al. ABCB5 is a limbal stem cell gene required for corneal development and repair. Nature. 511 (7509), 353-357 (2014).
  39. Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140 (13), 2835-2846 (2013).

Tags

Biologie Hoornvlies epitheel slijtage oculaire braam wondsluiting SEM zebravis.
Zebrafish Corneal Wound Healing: van abrasie tot wond closure imaging analyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ikkala, K., Raatikainen, S., Michon, … More

Ikkala, K., Raatikainen, S., Michon, F. Zebrafish Corneal Wound Healing: From Abrasion to Wound Closure Imaging Analysis. J. Vis. Exp. (181), e63605, doi:10.3791/63605 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter