Summary
Denne protokollen fokuserer på å skade den okulære overflaten av sebrafisk gjennom slitasje for å vurdere den påfølgende sårlukkingen på cellenivå. Denne tilnærmingen utnytter en okulær burr for delvis å fjerne hornhinnen epitel og bruker skanning elektronmikroskopi for å spore endringer i cellemorfologi under sårlukking.
Abstract
Som den gjennomsiktige overflaten av øyet er hornhinnen medvirkende for klart syn. På grunn av sin plassering er dette vevet utsatt for miljømessige fornærmelser. Faktisk er øyeskadene som oftest oppstår klinisk, de til hornhinnen. Mens hornhinnen sår healing har blitt grundig studert i små pattedyr (dvs. mus, rotter og kaniner), hornhinnen fysiologi studier har forsømt andre arter, inkludert sebrafisk, til tross for sebrafisk er en klassisk forskningsmodell.
Denne rapporten beskriver en metode for å utføre en hornhinne slitasje på sebrafisk. Såret utføres in vivo på bedøvet fisk ved hjelp av en okulær burr. Denne metoden gir mulighet for et reproduserbart epitelsår, slik at resten av øyet er intakt. Etter slitasje overvåkes sårlukking i løpet av 3 timer, hvorpå såret reepithelialiseres. Ved å bruke skanning elektronmikroskopi, etterfulgt av bildebehandling, kan epitelcelleformen og apikale fremspring undersøkes for å studere de ulike trinnene under hornhinnen epitelial sårlukking.
Egenskapene til sebrafiskmodellen tillater studie av epitelvevsfysiologien og epitelcellens kollektive oppførsel når vevet utfordres. Videre kan bruken av en modell fratatt påvirkning av tårefilmen gi nye svar angående hornhinnen respons på stress. Til slutt tillater denne modellen også avgrensning av cellulære og molekylære hendelser involvert i ethvert epitelvev utsatt for et fysisk sår. Denne metoden kan brukes til evaluering av legemiddeleffektivitet i preklinisk testing.
Introduction
Siden det meste av epithelia er i kontakt med det ytre miljø, er de utsatt for fysisk skade, noe som gjør dem godt egnet for studiet av sårhelingsprosesser. Blant de godt studerte vevene er hornhinnen en ekstremt nyttig modell i undersøkelsen av de cellulære og molekylære aspektene ved sårheling. Som en gjennomsiktig ekstern overflate gir den fysisk beskyttelse mot øyet og er det første elementet som fokuserer lyset på netthinnen. Mens strukturen og cellesammensetningen av netthinnen varierer mellom art1, er disse elementene i hornhinnen generelt like i alle kamera-type øyne, uavhengig av arter.
Hornhinnen består av tre hovedlag2. Det første og ytterste laget er epitelet, som stadig fornyes for å sikre gjennomsiktighet. Det andre laget er stroma, som inneholder spredte celler, kalt keratocytter, innenfor et tykt lag av strengt organiserte kollagenfibre. Det tredje og innerste laget er endotelet, som tillater næringsstoff og flytende diffusjon fra det fremre kammeret til de ytre lagene. Epitelceller og stromale celler samhandler via vekstfaktorer og cytokiner3. Denne interaksjonen fremheves av rask apoptose og påfølgende spredning av keratocytter etter epitelskade 4,5. Ved et dypere sår, for eksempel en punktering, tar keratocytter en aktiv rolle i helbredelsesprosessen6.
Å være i kontakt med det ytre miljø, hornhinnen fysiske skader er vanlig. Mange av dem er forårsaket av små fremmedlegemer7, for eksempel sand eller støv. Refleksen av øye gnidning kan føre til omfattende epitel slitasje og hornhinnen ombygging8. Ifølge sårstørrelse og dybde er disse fysiske skadene smertefulle og tar flere dager å helbrede9. De optimale sårhelingsegenskapene til en modell letter forståelsen av de cellulære og molekylære aspektene ved sårlukking. Videre har slike modeller også vist seg nyttige for å teste nye molekyler med potensial til å akselerere hornhinneheling, som tidligere demonstrert10,11.
Protokollen beskrevet her tar sikte på å bruke sebrafisk som en relevant modell for å studere hornhinnen fysisk skade. Denne modellen er svært praktisk for farmakologiske screeningstudier, da den gjør det mulig å legge molekyler direkte til tankvannet og derfor komme i kontakt med en helbredende hornhinne. Detaljene som er gitt her, vil hjelpe forskere med å utføre sine studier på sebrafiskmodellen. In vivo-skaden utføres med en kjedelig okulær burr. Virkningen på epitelceller ved siden av eller i avstand fra det kan analyseres ved å spesifikt fjerne det sentrale hornhinnen epitel. I de senere år fokuserte mange rapporter på en slik metode på gnager hornhinne 12,13,14,15,16,17; Til dags dato har imidlertid bare en enkelt rapport brukt denne metoden på sebrafisk18.
På grunn av sin enkelhet er det fysiske såret nyttig for å avgrense rollen som epitelceller i sårlukking. En annen veletablert modell av hornhinneskade er kjemisk brenning, spesielt alkalisk brenning 19,20,21. Imidlertid skader en slik tilnærming indirekte hele øyeoverflaten, inkludert perifer hornhinne og hornhinnen stroma19. Faktisk, alkali brenner potensielt indusere hornhinnen sår, perforeringer, epitelial opacification, og rask neovascularization22, og det ukontrollerbare utfallet av alkali brenner diskvalifiserer den tilnærmingen for generelle sår healing studier. Tallrike andre metoder brukes også til å undersøke hornhinnen sårheling i henhold til det spesielle fokuset i den aktuelle studien (f.eks. fullstendig epitelial debridement23, kombinasjonen av kjemisk og mekanisk skade for delvis tykkelse sår24, excimer laser ablasjon for sår som strekker seg til stroma25). Bruken av en okulær burr begrenser fokuspunktet til epitelresponsen på såret og gir et svært reproduserbart sår.
Som med hver metode for sårpåføring, har bruken av en okulær burr fordeler og ulemper. Den største ulempen er at responsen for det meste er epitelial, det gjenspeiler ikke perfekt slitasjene sett i den kliniske settingen. Denne metoden har imidlertid mange fordeler, inkludert hvor enkelt den kan settes opp og utføres, dens presisjon, dens reproduserbarhet og det faktum at den ikke er invasiv, noe som gjør den til en metode som tolereres godt av dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter ble godkjent av det nasjonale dyreeksperimentstavlen.
1. Forberedelser
- Forbered trikainbestandsløsningen som brukes til anestesi26 på forhånd (0,4% lagerløsning som brukes i denne protokollen). Bruk hansker og oppbevar materialene i en avtrekkshette når det er mulig.
- For 50 ml av en 0,4% løsning, vei 200 mg trikainpulver i et 50 ml rør. Løs pulveret i ca. 45 ml dobbeltdestillert vann.
- Juster pH i trikainbestandsløsningen til 7 med 1 M Tris (pH 8,8, ~1,25 ml). Tilsett Tris-løsningen til trikainbestanden i aliquots, bland aksjen grundig etter hver aliquot, og sjekk pH etter hvert tillegg av Tris.
- Før eksperimentet, lag en 0,02% arbeidsløsning av trikain.
- Tine 2 ml 0,4% lagerløsning og tilsett 40 ml systemvann (sluttkonsentrasjon 0,02%). Plasser løsningen i en liten beholder.
- Før eksperimentet, forbered utvinningsvannet som inneholder smertestillende midler. Bruk hansker og oppbevar materialene i avtrekkshette når det er mulig.
- For en liter utvinning vann, vei 2,5 mg lidokainhydrokloridpulver og oppløs det i ferskvann. Kontroller pH og juster til 7 om nødvendig.
- Før eksperimentet, klargjør festeløsningen (2,5% glutaraldehyd i 0,1 M natriumfosfat (Na-PO4) oppløsning ved pH 7,4). Bruk hansker og oppbevar materialene i en avtrekkshette.
- For 10 ml festeløsning, pipette 5 ml 0,2 M Na-PO4 i et rør. Tilsett 0,5 ml 50% glutaraldehyd, og tilsett dobbeltdestillert vann for å oppnå det endelige volumet på 10 ml. Beskytt oppløsningen mot lys, og oppbevar den på is eller i kjøleskapet før bruk.
MERK: Hvis prøver må samles opp i flere timer etter såring, klargjør du festeløsningen rett før bruk.
- For 10 ml festeløsning, pipette 5 ml 0,2 M Na-PO4 i et rør. Tilsett 0,5 ml 50% glutaraldehyd, og tilsett dobbeltdestillert vann for å oppnå det endelige volumet på 10 ml. Beskytt oppløsningen mot lys, og oppbevar den på is eller i kjøleskapet før bruk.
- Klargjør utstyret for såring (figur 1).
- Fyll utvinningstankene eller mindre beholdere med systemvann.
- Ha den oftalmiske burr klar. Kontroller at burrspissen er ren. Fjern om nødvendig cellerester med en fuktig bomullspinne.
- Lag et snitt på siden av en myk svamp, og fukt svampen med systemvann. Plasser svampen på bunnen/scenen på et dissekeringsmikroskop. Sørg for nok arbeidsplass til å bruke boret og nok belysning fra sidene og/eller over til å se øyeoverflaten ordentlig.
2. Anestesi
- Overfør en fisk fra tanken til 0,02% trikainoppløsningen med et nett så forsiktig som mulig.
- Overvåk anestesi, kontroller for mangel på respons på lysmekanisk stimulans.
MERK: For konsistent anestesi brukes en 2 min eksponering for trikain før slitasje med voksen villtype AB-fisk. Med fisk med annen genetisk bakgrunn kan det være behov for en annen varighet.
3. Slitasje
- Plasser forsiktig den bedøvede fisken med en skje inn i snittet på svampen, hodet som stikker ut fra svampoverflaten.
- Slå på burr, og fokuser mikroskopvisningen på øyeoverflaten.
- Ven deg forsiktig til øyeoverflaten med burrspissen. Når du berører øyeoverflaten, må du begynne å bevege burrspissen på øyeoverflaten med sirkulær bevegelse. Unngå plutselig bevegelse, da det kan føre til at øyet vipper i stikkontakten og burrspissen glir.
- Når slitasjen er ferdig, plasser fisken forsiktig i systemvann som inneholder smertestillende for utvinning.
- Rengjør boret rett etter bruk med en fuktig bomullspinne.
4. Innsamling av prøver
- På ønsket tidspunkt, plukk fisken opp med et nett og legg den i 0,02% trikainløsning. Hold dyret i løsningen til den operkulære bevegelsen har opphørt helt, og fisken reagerer ikke på berøring.
- Legg fisken på en Petri-tallerken med en skje, og hold den med pinsett. Decapitate fisken med dissekering saks. Unngå riper på øyeoverflaten når du håndterer prøven.
- Sett vevet inn i et prøverør som inneholder 0,1 M Na-PO4.
- Skyll vevet ved å erstatte 0,1 M Na-PO4 med ren buffer slik at det ikke blir igjen blod i oppløsningen.
5. Prøvebehandling for elektronmikroskopi
- Fest vevet i 2,5% glutaraldehyd/0,1 M Na-PO4 (pH 7,4) i ~24 timer ved +4 °C. Oppbevar prøven på en roterende/ristende prøveholder for å sikre riktig fiksering.
- Fjern festeløsningen og skyll prøven flere ganger med 0,1 M Na-PO4.
- Disseker prøven på dette tidspunktet.
- Plasser prøven på en dråpe på 0,1 M Na-PO4 på en dissekeringsplate. Hvis begge øynene fra samme fisk må avbildes, kutt hodeprøven i to med fin dissekeringssaks.
- Alternativt kan du bare samle øynene ved å forsiktig plassere spissene av fine pinsett i øyekontakten fra siden av øyet, og vær ekstra forsiktig så du ikke riper på øyeoverflaten. Trekk deretter øyet ut av stikkontakten.
- Overfør den dissekerte prøven til et rør som inneholder 0,1 M Na-PO4. Pass på at det ikke er noe ekstra vev i prøverøret, da det kan holde seg til toppen av øyet under prøvebehandling.
- Oppbevar prøven i 0,1 M Na-PO4 (maksimum en uke) ved +4 °C.
- Behandle prøvene for elektronmikroskopiavbildning.
- Etterrett prøvene i 2% osmium tetroxide i 0,1 M Na-PO4 buffer i 1 time ved romtemperatur (RT).
- Vask prøvene 3 ganger i 5 minutter hver vask i 0,1 M Na-PO4 ved RT.
- Dehydrer prøvene suksessivt i 30%, 50% og 70% etanol i 1 time i hver løsning ved RT.
- Senk prøvene ned i 96% etanol i 2-3 timer ved RT.
- Deretter inkuberer du prøvene to ganger i 100% etanol, først i 1 time og deretter i frisk 100% etanol over natten ved +4 °C.
- Utsett prøvene i 30 sykluser i en automatisert kritisk punkttørker.
- Bygg inn og platinabelegge prøvene.
- Plasser en klebende tlik på en brakett. Hvis prøven må merkes på toppen av braketten, legger du igjen et stykke kategoriforsidepapir i kategorien og skriver prøve-IDen på papiret.
- Plasser braketten med tappen på bunnen av et dissekeringsmikroskop.
- Plasser vevsprøven forsiktig på braketten med fine pinsett, hornhinnen vendt opp.
- Belegge prøven med platina ved hjelp av riktig enhet. Etter belegg, lagre prøvene ved romtemperatur til avbildning.
6. Bildebehandling (figur 2)
- Bruk enhetene som anbefalt i brukerhåndboken og av bildeeksperter.
- Hent bilder av ønsket forstørrelse, og bruk 2000-2500x bilder til analyse.
- Juster lysstyrken og kontrasten slik at det ikke er overeksponerte områder i bildet, og cellekantlinjer og mikroridges blir sett så tydelig som mulig.
MERK: Vevets posisjon og vinkel påvirker innstillingene for lysstyrke og kontrast. De må kanskje justeres fra prøve til prøve og mellom forskjellige områder av vevet.
7. Måling av celleform, størrelse og mikroridgemønster
- Åpne TIFF-bildet i Fiji ImageJ 1.5327. Angi skalaen ved hjelp av skaleringslinjen i bildet: Opprett en linje som er lik skalalinjen med linjeverktøyet . Velg Analyser | Angi skala, og skriv inn den kjente avstanden. Åpne avkastningsansvarlig fra Analyser-| Verktøy-menyen .
- For cellestørrelse og rundhet velger du Analyser | Angi mål | Figurbeskrivelser. Bruk forstørrelsesglassverktøyet til å se cellene under forstørrelse. Merk celler med mangekantverktøyet , og legg til hver markering i ROI-behandling. Til slutt måler du de merkede cellene og lagrer målingen.
- Mikroridgeanalyse (figur 3 og figur 4)
- Kontroller at bildet er i 8-biters format fra Bilde-| Type-menyen .
- Merk en celle med mangekantverktøyet , og fjern bakgrunnen fra Rediger | Rydd utenfor.
- Jevne ut bildet én til tre ganger ved å velge Behandle | Jevn ut, og juster lysstyrken og kontrasten fra Bilde-| Juster | Lysstyrke/kontrast slik at mikroridges skiller seg ut så tydelig som mulig.
- Konvoler bildet fra Prosess | Filtre | Konvolve, bli binær fra Prosess | Binær | Gjør binært, og lag et skjelett av svart-hvitt-bildet ved å velge Prosess | Binær | Skeletonize.
- Bruke funksjonen Analyser skjelett i Analyser | Skjelettmeny for å måle mikroridgeparametrene og lagre verdiene.
MERK: I SEM kan enkeltbilder variere i lysstyrke og kontrast. Dermed kan trinnene i analysen trenge justeringer fra bilde til bilde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne studien beskriver en metode ved hjelp av en oftalmisk burr i sebrafisk hornhinnen sår healing eksperimenter. Metoden er modifisert fra tidligere studier på mus, hvor burr ble vist å fjerne epitelcellelagene effektivt13. Utfordringene i sebrafisk hornhinnen sår inkluderer den relativt små størrelsen på øyet, og i tilfelle av tidkrevende eksperimenter, behovet for å opprettholde en konstant vannstrøm gjennom gjellene (som beskrevet av Xu og kolleger28). De viktigste fordelene med denne metoden er dens enkelhet og hastighet. Et standard dissekeringsmikroskop brukes til kontrollert bruk av boret (figur 1). Siden prosedyren er av kort varighet (ca. 3 min fra anestesistart), gjenoppretter fisken godt fra håndteringen, og det er ikke nødvendig med ekstra utstyr for vedlikehold av anestesi og oksygenlevering.
Det er flere måter å visualisere hornhinnens sår på. Denne protokollen bruker skanning elektronmikroskopi (SEM, figur 2), som har en lang historie med bruk i hornhinnen studier29,30. Selv om denne tilnærmingen ikke tillater en vurdering av de nedre lagene i epitelet, gir det en enkel metode for å estimere sårhelingshastigheten og sammenligne hornhinnens overflater i forskjellige områder av øyet. Ved 3 timers stolpesår, mens sårområdet er stengt (figur 2), forblir stedet der sårgrensene er forbundet, synlig (figur 2).
De overfladiske cellene på sebrafisk hornhinnen inneholder uttalt mikroridges31. Nylig rapporterte en studie disse strukturene som tapt i langstrakte celler ved siden av sår på sebrafiskhud32. De presenterte resultatene viser imidlertid at mikroridges på slipt hornhinnen epitel kan observeres i noen langstrakte celler ved siden av sårstedet (figur 4B). I noen perifere områder går mikroridges tapt fra midten av cellen (figur 4C, D). For en mer detaljert analyse kvantifiseres apikalt celleområde og rundhet, i tillegg til mikroridgemengde og gjennomsnittlig lengde i ImageJ27 (figur 3 og figur 4E-H).
Mikroridgeanalysen gjøres ved hjelp av Skeleton-funksjonen (modifisert fra van Loon og kolleger33). En sammenligning mellom de to perifere områdene (figur 4A (region C og D), figur 4C og figur 4D) viser at cellene i figur 4D er lengre (noe som indikerer celle omorganiseringer som en reaksjon på såring) og har kortere gjennomsnittlige mikroridges enn celler i figur 4C. Dette resultatet antyder at endringen i celleform korrelerer med mikroridge modifikasjonen og understreker heterogeniteten i hornhinnen epitel i sårrespons.
Måling av det apikale celleområdet og rundheten på SEM-bilder er en enkel og reproduserbar måte å skaffe kvantitative data om celleutseende i forskjellige regioner i hornhinnen. Selv om den er begrenset til 2D, bidrar denne tilnærmingen til å oppnå en generell forståelse av dynamikken og hastigheten til celle omorganiseringer under sårlukking. SEM-bildene brukes til å analysere mikroridgemønstrene på den apikale celleoverflaten. Bildebehandlingen beskrevet her gir en tilnærming av endringene i mikroridgeparametrene, noe som ville være kjedelig å måle for hånd.
Figur 1: Oppsettet for hornhinnens slitasje. (A) Et dissekerende mikroskop er nødvendig for kontrollert slitasje på det lille sebrafiskøyet. (B) Svampen bidrar til å stabilisere den bedøvede fisken under prosedyren. (C) Fisken bedøves på en Petri-tallerken, og det bedøvede dyret overføres til svampen med en liten skje. En okulær burr med en 0,5 mm spiss brukes til å slipe hornhinnen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Visualisering av såret hornhinne med skanning elektronmikroskopi. Oversikten over slipt hornhinnen samlet på 0, 1, 2 eller 3 h innleggssår (HPW). Den stiplede omrisset angir sårkantlinjen. Skalastenger = 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Et eksempel på bildeendringen før mikroridgemåling. Selv om det ikke er en nøyaktig kopi av den opprinnelige celleoverflaten, fanger det endelige skjelettmønsteret forskjellene mellom cellesenteret og periferien. Skalalinje = 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: En sammenligning av apikale celleområde-, rundhets- og mikroridgeverdier mellom to perifere områder etter hornhinnens slitasje. (A) En oversikt over det sårede øyet. Boksene angir plasseringen av bildene med høyere forstørrelse (i B, C og D). (C, D) Celler som er merket for figurbeskrivelsesanalyse, merkes med en grønn disposisjon. (E, F) Apikale celleområdeverdier (E) og rundhetsverdier (F) for merkede celler. (G, H) Microridge total lengde (G) og gjennomsnittlig lengde (H) av de samme cellene. Gruppene ble statistisk sammenlignet med en tosidet t-test (*p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01) Skalastenger = 500 μm i A, 50 μm i B, C og D. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hornhinnen fysiske skader er den vanligste årsaken til oftalmologi pasientbesøk til sykehuset. Derfor er det viktig å etablere relevante modeller for studiet av ulike aspekter av hornhinnen patofysiologi. Så langt er musen den mest brukte modellen for studiet av hornhinnen sårheling. Men å legge øyedråper på murine sårede øyne for å validere virkningen av spesifikke stoffer på hornhinnen sårheling kan være vanskelig. I denne forbindelse er sebrafiskmodellen spesielt nyttig for farmakologisk screening av molekyler som påvirker hornhinnens sårheling. Metoden beskrevet her er veldig lik den som er beskrevet for mus13.
To spesifikke forskjellspunkter må imidlertid huskes. For det første krever bruk av en oftalmisk burr praksis for å sikre sår reproduserbarhet, spesielt med hensyn til trykket som utøves på øyet, noe som er kritisk for riktig slitasje. I tillegg bør slipespissen endres når epitelet ikke lenger fjernes effektivt. For det andre, mens strukturen og morfologien til sebrafisk hornhinnen ligner på andre hornhinner31, har dette dyret regenerativ kapasitet som er uten sidestykke i pattedyrorganismer 34,35,36. Mens sårlukking i musen varer i 48-72 h 11,14,37, rapporteres en tidslinje på 3 timer for sebrafisk. På grunn av strukturelle og molekylære likheter er den cellulære oppførselen indusert av et hornhinnen fysisk sår sannsynligvis lik i de fleste vertebrater. Imidlertid styres den raske responsen i sebrafisk sannsynligvis av en avansert regenerativ mekanisme som er spesifikk for det dyret.
Den beskrevne protokollen bruker SEM til å spore sårlukking. Tallrike andre studier har brukt fluorescensmikroskopi i stedet for å spore denne prosessen 15,17,38. Bruken av SEM forenkler imidlertid analysen av celleformmodifisering etter epitelslitering. Ulempen med denne teknologien er at stratifiseringstrinnene ikke kan spores, da SEM bare tillater avbildning av det mest eksterne laget. For å studere epitelet i 3D under full hornhinneheling, bør fluorescerende modeller, som Zebrabow39, eller immunolabeling brukes.
Bruken av sebrafisk som hornhinne sårhelingsmodell forbedrer omfanget av undersøkelsen, da den tillater anvendelse av mange molekylære verktøy tilgjengelig, for eksempel genetisk modifiserte fiskelinjer, morfiolinos og kjemisk screening, for å utvide det mulige spekteret av hornhinnen sårhelingsstudier betydelig. Videre tillater størrelsen på sebrafiskøyne utviklingen av nye bildestrategier for å studere epitelcelledynamikk mer detaljert enn det som kan gjøres med murinøyne.
Hovedmålet med denne rapporten er ikke bare å tilpasse den fysiske hornhinnens såringstilnærming til sebrafiskmodellen, men også å demonstrere at bruken av nye modeller gjør at nye spørsmål kan stilles og besvares og peker på nye måter å undersøke grunnleggende biologiske fenomener på. Disse fordelene vil til slutt være gunstige for pasientene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Pertti Panula for tilgangen til Sebrafish-enheten og Henri Koivula for veiledning og hjelp med sebrafiskeksperimentene. Denne forskningen ble støttet av Finlands akademi, Jane og Aatos Erkko Foundation, den finske kulturstiftelsen og ATIP-Avenir-programmet. Imaging ble utført ved Electron Microscopy-enheten og Light Microscopy Unit, Institute of Biotechnology, støttet av HiLIFE og Biocenter Finland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4 | in-house | Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2 HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2 PO4 ). | |
| 0.2M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4 | in-house | Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2 HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2 PO4 ). | |
| 0.5mm burr tips | Alger Equipment Company | BU-5S | |
| 1M Tris, pH 8.8 | in-house | ||
| adhesive tabs | Agar Scientific | G3347N | |
| Algerbrush burr, Complete instrument | Alger Equipment Company | BR2-5 | |
| Cotton swaps | Heinz Herenz Hamburg | 1030128 | |
| Dissecting plate | in-house | ||
| Dissecting tools | Fine Science Tools | ||
| double-distilled water | in-house | ||
| Eppedorf tubes, 2ml | any provider | ||
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma | A5040 | Caution: causes irritation. |
| Glutaraldehyde, 50% aqueous solution, grade I | Sigma | G7651 | Caution: toxic. |
| Lidocaine hydrochloride | Sigma | L5647 | Caution: toxic. |
| mounts | Agar Scientific | G301P | |
| Petri dish | Thermo Scientific | 101VR20 | |
| pH indicator strips | Macherey-Nagel | 92110 | |
| Plastic spoons | any provider | ||
| Plastic tubes, 15 ml | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Plastic tubes, 50 ml | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Scanning electron microscope | FEI | Quanta 250 FEG | |
| Soft sponge | any provider | ||
| Sputter coater | Quorum Technologies | GQ150TS | |
| Stereomicroscope | Leica |
References
- Baden, T., Euler, T., Berens, P. Understanding the retinal basis of vision across species. Nature Reviews.Neuroscience. 21 (1), 5-20 (2020).
- Nishida, T., Saika, S., Morishige, N. Cornea and sclera: Anatomy and physiology. Cornea: Fundamentals, diagnosis and management, 4th ed. Manis, M. J., Holland, E. J. , Elsevier. 1-22 (2017).
- Wilson, S. E., Liu, J. J., Mohan, R. R. Stromal-epithelial interactions in the cornea. Progress in Retinal and Eye Research. 18 (3), 293-309 (1999).
- Wilson, S. E., et al. Epithelial injury induces keratocyte apoptosis: hypothesized role for the interleukin-1 system in the modulation of corneal tissue organization and wound healing. Experimental Eye Research. 62 (4), 325-327 (1996).
- Zieske, J. D., Guimaraes, S. R., Hutcheon, A. E. Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement. Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).
- West-Mays, J. A., Dwivedi, D. J. The keratocyte: corneal stromal cell with variable repair phenotypes. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 38 (10), 1625-1631 (2006).
- Ahmed, F., House, R. J., Feldman, B. H. Corneal abrasions and corneal foreign bodies. Primary Care. 42 (3), 363-375 (2015).
- Ben-Eli, H., Erdinest, N., Solomon, A. Pathogenesis and complications of chronic eye rubbing in ocular allergy. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 19 (5), 526-534 (2019).
- Wilson, S. A., Last, A. Management of corneal abrasions. American Family Physician. 70 (1), 123-128 (2004).
- Nagata, M., et al. JBP485 promotes corneal epithelial wound healing. Scientific Reports. 5, 14776 (2015).
- Wang, X., et al. MANF promotes diabetic corneal epithelial wound healing and nerve regeneration by attenuating hyperglycemia-induced endoplasmic reticulum stress. Diabetes. 69 (6), 1264-1278 (2020).
- Li, F. J., et al. Evaluation of the AlgerBrush II rotating burr as a tool for inducing ocular surface failure in the New Zealand White rabbit. Experimental Eye Research. 147, 1-11 (2016).
- Kalha, S., Kuony, A., Michon, F. Corneal epithelial abrasion with ocular burr as a model for cornea wound healing. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (137), e58071 (2018).
- Kalha, S., et al. Bmi1+ progenitor cell dynamics in murine cornea during homeostasis and wound healing. Stem Cells. 36 (4), 562-573 (2018).
- Park, M., et al. Visualizing the contribution of keratin-14(+) limbal epithelial precursors in corneal wound healing. Stem Cell Reports. 12 (1), 14-28 (2019).
- Kuony, A., et al. Ectodysplasin-A signaling is a key integrator in the lacrimal gland-cornea feedback loop. Development. 146 (14), (2019).
- Farrelly, O., et al. Two-photon live imaging of single corneal stem cells reveals compartmentalized organization of the limbal niche. Cell Stem Cell. 28 (7), 1233-1247 (2021).
- Ikkala, K., Michon, F., Stratoulias, V. Unilateral Zebrafish corneal injury induces bilateral cell plasticity supporting wound closure. Scientific Reports. , (2021).
- Ormerod, L. D., Abelson, M. B., Kenyon, K. R. Standard models of corneal injury using alkali-immersed filter discs. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (10), 2148-2153 (1989).
- Anderson, C., Zhou, Q., Wang, S. An alkali-burn injury model of corneal neovascularization in the mouse. Journal of visualized experiments: JoVE. (86), e51159 (2014).
- Choi, H., et al. Comprehensive modeling of corneal alkali injury in the rat eye. Current Eye Research. 42 (10), 1348-1357 (2017).
- Singh, P., Tyagi, M., Kumar, Y., Gupta, K. K., Sharma, P. D. Ocular chemical injuries and their management. Oman Journal of Ophthalmology. 6 (2), 83-86 (2013).
- Pal-Ghosh, S. BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds. Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).
- Chen, J. J., Tseng, S. C. Abnormal corneal epithelial wound healing in partial-thickness removal of limbal epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (8), 2219-2233 (1991).
- Xeroudaki, M., Peebo, B., Germundsson, J., Fagerholm, P., Lagali, N. RGTA in corneal wound healing after transepithelial laser ablation in a rabbit model: a randomized, blinded, placebo-controlled study. Acta Ophthalmologica. 94 (7), 685-691 (2016).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio. , Available from: https://zfinorg/zf_info/zfbook/zfbk.html (2000).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Xu, C., Volkery, S., Siekmann, A. F. Intubation-based anesthesia for long-term time-lapse imaging of adult zebrafish. Nature Protocols. 10 (12), 2064-2073 (2015).
- Crosson, C. E., Klyce, S. D., Beuerman, R. W. Epithelial wound closure in the rabbit cornea. A biphasic process. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 27 (4), 464-473 (1986).
- Parlanti, P., et al. Axonal debris accumulates in corneal epithelial cells after intraepithelial corneal nerves are damaged: A focused Ion Beam Scanning Electron Microscopy (FIB-SEM) study. Experimental Eye Research. 194, 107998 (2020).
- Zhao, X. C., et al. The zebrafish cornea: structure and development. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (10), 4341-4348 (2006).
- Richardson, R., et al. Re-epithelialization of cutaneous wounds in adult zebrafish combines mechanisms of wound closure in embryonic and adult mammals. Development. 143 (12), 2077-2088 (2016).
- van Loon, A. P., Erofeev, I. S., Maryshev, I. V., Goryachev, A. B., Sagasti, A. Cortical contraction drives the 3D patterning of epithelial cell surfaces. The Journal of Cell Biology. 219 (3), (2020).
- Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina. Journal of Neurobiology. 44 (3), 289-307 (2000).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).
- Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish. The Journal of Comparative Neurology. 377 (4), 577-595 (1997).
- Hu, X., et al. Sirt6 deficiency impairs corneal epithelial wound healing. Aging. 10 (8), 1932-1946 (2018).
- Ksander, B. R., et al. ABCB5 is a limbal stem cell gene required for corneal development and repair. Nature. 511 (7509), 353-357 (2014).
- Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140 (13), 2835-2846 (2013).
