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Biology

Guérison des plaies cornéennes du poisson-zèbre: de l’abrasion à l’analyse d’imagerie de fermeture de plaie

Published: March 1, 2022 doi: 10.3791/63605
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Institute of Biotechnology, HiLIFE, University of Helsinki, 2Institute for Neurosciences of Montpellier, Univ Montpellier

Summary

Ce protocole se concentre sur l’endommagement de la surface oculaire du poisson-zèbre par abrasion pour évaluer la fermeture ultérieure de la plaie au niveau cellulaire. Cette approche exploite une bavure oculaire pour enlever partiellement l’épithélium cornéen et utilise la microscopie électronique à balayage pour suivre les changements dans la morphologie cellulaire pendant la fermeture de la plaie.

Abstract

En tant que surface transparente de l’œil, la cornée est essentielle à une vision claire. En raison de son emplacement, ce tissu est sujet aux insultes environnementales. En effet, les lésions oculaires les plus fréquemment rencontrées cliniquement sont celles de la cornée. Bien que la cicatrisation des plaies cornéennes ait été largement étudiée chez les petits mammifères (c.-à-d. les souris, les rats et les lapins), les études de physiologie cornéenne ont négligé d’autres espèces, y compris le poisson-zèbre, bien que le poisson-zèbre soit un modèle de recherche classique.

Ce rapport décrit une méthode d’abrasion cornéenne sur le poisson-zèbre. La plaie est réalisée in vivo sur des poissons anesthésiés à l’aide d’une bavure oculaire. Cette méthode permet d’obtenir une plaie épithéliale reproductible, laissant le reste de l’œil intact. Après abrasion, la fermeture de la plaie est surveillée pendant 3 heures, après quoi la plaie est réépithélialisée. En utilisant la microscopie électronique à balayage, suivie du traitement de l’image, la forme des cellules épithéliales et les protubérances apicales peuvent être étudiées pour étudier les différentes étapes de la fermeture de la plaie épithéliale cornéenne.

Les caractéristiques du modèle du poisson-zèbre permettent d’étudier la physiologie du tissu épithélial et le comportement collectif des cellules épithéliales lorsque le tissu est mis à l’épreuve. De plus, l’utilisation d’un modèle privé de l’influence du film lacrymal peut produire de nouvelles réponses concernant la réponse cornéenne au stress. Enfin, ce modèle permet également la délimitation des événements cellulaires et moléculaires impliqués dans tout tissu épithélial soumis à une plaie physique. Cette méthode peut être appliquée à l’évaluation de l’efficacité des médicaments dans les tests précliniques.

Introduction

Comme la plupart des épithéliums sont en contact avec l’environnement extérieur, ils sont sujets aux blessures physiques, ce qui les rend bien adaptés à l’étude des processus de cicatrisation des plaies. Parmi les tissus bien étudiés, la cornée est un modèle extrêmement utile dans l’étude des aspects cellulaires et moléculaires de la cicatrisation des plaies. En tant que surface externe transparente, il fournit une protection physique à l’œil et est le premier élément à concentrer la lumière sur la rétine. Bien que la structure et la composition cellulaire de la rétine diffèrent d’une espèceà l’autre, ces éléments de la cornée sont généralement similaires dans tous les yeux de type caméra, quelle que soit l’espèce.

La cornée est composée de trois couches principales2. La première couche et la plus externe est l’épithélium, qui est constamment renouvelé pour assurer sa transparence. La deuxième couche est le stroma, qui contient des cellules dispersées, appelées kératocytes, dans une épaisse couche de fibres de collagène strictement organisées. La troisième couche, la plus interne, est l’endothélium, qui permet la diffusion des nutriments et des liquides de la chambre antérieure vers les couches externes. Les cellules épithéliales et stromales interagissent via des facteurs de croissance et des cytokines3. Cette interaction est mise en évidence par l’apoptose rapide et la prolifération subséquente des kératocytes après une lésion épithéliale 4,5. En cas de plaie plus profonde, telle qu’une ponction, les kératocytes participent activement au processus de guérison6.

Étant en contact avec l’environnement extérieur, les blessures physiques cornéennes sont fréquentes. Beaucoup d’entre eux sont causés par de petits corps étrangers7, tels que le sable ou la poussière. Le réflexe de frottement des yeux peut entraîner des abrasions épithéliales étendues et un remodelage cornéen8. Selon la taille et la profondeur de la plaie, ces blessures physiques sont douloureuses et prennent plusieurs jours pour guérir9. Les caractéristiques optimales de cicatrisation d’un modèle facilitent la compréhension des aspects cellulaires et moléculaires de la fermeture de la plaie. En outre, de tels modèles se sont également révélés utiles pour tester de nouvelles molécules ayant le potentiel d’accélérer la guérison de la cornée, comme démontré précédemment10,11.

Le protocole décrit ici vise à utiliser le poisson-zèbre comme modèle pertinent pour étudier les lésions physiques cornéennes. Ce modèle est très pratique pour les études de dépistage pharmacologique car il permet d’ajouter des molécules directement à l’eau du réservoir et, par conséquent, d’entrer en contact avec une cornée cicatrisante. Les détails fournis ici aideront les scientifiques à effectuer leurs études sur le modèle du poisson-zèbre. La blessure in vivo est réalisée avec une bavure oculaire émoussée. L’impact sur les cellules épithéliales adjacentes ou éloignées de celui-ci peut être analysé en enlevant spécifiquement l’épithélium cornéen central. Au cours des dernières années, de nombreux rapports se sont concentrés sur une telle méthode sur la cornée de rongeurs 12,13,14,15,16,17; toutefois, à ce jour, un seul rapport a appliqué cette méthode au poisson-zèbre18.

En raison de sa simplicité, la plaie physique est utile pour délimiter le rôle des cellules épithéliales dans la fermeture de la plaie. Un autre modèle bien établi de lésion cornéenne est la brûlure chimique, en particulier la brûlure alcaline 19,20,21. Cependant, une telle approche endommage indirectement toute la surface de l’œil, y compris la cornée périphérique et le stroma cornéen19. En effet, les brûlures alcalines induisent potentiellement des ulcères cornéens, des perforations, une opacification épithéliale et une néovascularisation rapide22, et le résultat incontrôlable des brûlures alcalines disqualifie cette approche pour les études générales de cicatrisation des plaies. De nombreuses autres méthodes sont également utilisées pour étudier la cicatrisation des plaies cornéennes en fonction de l’objectif particulier de l’étude en question (par exemple, le débridement épithélial complet23, la combinaison de lésions chimiques et mécaniques pour la plaied’épaisseur partielle 24, l’ablation au laser excimère pour les plaies s’étendant jusqu’au stroma25). L’utilisation d’une bavure oculaire limite le point focal à la réponse épithéliale à la plaie et fournit une plaie hautement reproductible.

Comme pour chaque méthode d’infliction de plaie, l’utilisation d’une bavure oculaire présente des avantages et des inconvénients. Le principal inconvénient est que la réponse étant principalement épithéliale, elle ne reflète pas parfaitement les abrasions observées dans le cadre clinique. Cependant, cette méthode présente de nombreux avantages, notamment la facilité avec laquelle elle peut être mise en place et exécutée, sa précision, sa reproductibilité et le fait qu’elle est non invasive, ce qui en fait une méthode bien tolérée par les animaux.

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Protocol

Toutes les expériences ont été approuvées par le conseil national de l’expérimentation animale.

1. Préparatifs

  1. Préparer à l’avance la solution mère de tricaïne utilisée pour l’anesthésie26 (solution mère à 0,4 % utilisée dans ce protocole). Utilisez des gants et conservez les matériaux dans une hotte chaque fois que possible.
    1. Pour 50 mL d’une solution à 0,4%, peser 200 mg de poudre de tricaïne dans un tube de 50 mL. Dissoudre la poudre dans environ 45 mL d’eau double distillée.
    2. Ajuster le pH de la solution mère de tricaïne à 7 avec 1 M Tris (pH 8,8, ~1,25 mL). Ajouter la solution de Tris au bouillon de tricaïne en aliquotes, bien mélanger le bouillon après chaque aliquote et vérifier le pH après chaque ajout de Tris.
  2. Avant l’expérience, préparez une solution de travail à 0,02% de tricaïne.
    1. Décongeler 2 mL de solution mère à 0,4 % et ajouter à 40 mL d’eau de système (concentration finale 0,02 %). Placez la solution dans un petit récipient.
  3. Avant l’expérience, préparez l’eau de récupération contenant un analgésique. Utilisez des gants et gardez les matériaux dans la hotte chaque fois que possible.
    1. Pour un litre d’eau de récupération, peser 2,5 mg de poudre de chlorhydrate de lidocaïne et la dissoudre dans de l’eau douce du système. Vérifiez le pH et ajustez-le à 7 si nécessaire.
  4. Avant l’expérience, préparer la solution fixatrice (2,5% de glutaraldéhyde dans une solution de phosphate de sodium (Na-PO4) à 0,1 M à pH 7,4). Utilisez des gants et conservez les matériaux dans une hotte aspirante.
    1. Pour 10 mL de la solution de fixation, pipeter 5 mL de 0,2 M Na-PO4 dans un tube. Ajouter 0,5 mL de glutaraldéhyde à 50 % et ajouter de l’eau double distillée pour obtenir le volume final de 10 mL. Protégez la solution de la lumière et conservez-la sur la glace ou au réfrigérateur avant utilisation.
      REMARQUE: Si les échantillons doivent être prélevés pendant plusieurs heures après la blessure, préparez la solution de fixation juste avant utilisation.
  5. Préparer l’équipement pour la blessure (Figure 1).
    1. Remplissez les réservoirs de récupération ou les petits contenants avec de l’eau du système.
    2. Préparez la bavure ophtalmique. Vérifiez que la pointe de la bavure est propre. Si nécessaire, enlevez les débris cellulaires avec un coton-tige humide.
    3. Faites une incision sur le côté d’une éponge molle et humidifiez l’éponge avec de l’eau du système. Placez l’éponge sur la base/la scène d’un microscope à dissection. Assurez-vous d’avoir suffisamment d’espace de travail pour utiliser la bavure et suffisamment d’éclairage sur les côtés et/ou au-dessus pour voir correctement la surface des yeux.

2. Anesthésie

  1. Transférer un poisson de l’aquarium à la solution de tricaïne à 0,02% avec un filet aussi doucement que possible.
  2. Surveillez l’anesthésie, en vérifiant l’absence de réponse au stimulus mécanique léger.
    REMARQUE: Pour une anesthésie uniforme, une exposition de 2 minutes à la tricaïne est utilisée avant l’abrasion avec les poissons AB adultes de type sauvage. Avec des poissons d’un autre fond génétique, une durée différente peut être nécessaire.

3. Abrasion

  1. Placez doucement le poisson anesthésié avec une cuillère dans l’incision sur l’éponge, la tête dépassant de la surface de l’éponge.
  2. Allumez la bavure et concentrez la vue du microscope sur la surface de l’œil.
  3. Approchez-vous soigneusement de la surface des yeux avec la pointe de la bavure. Lorsque vous touchez la surface de l’œil, commencez à déplacer la pointe de la bavure sur la surface de l’œil avec un mouvement circulaire. Évitez les mouvements brusques, car cela pourrait entraîner l’inclinaison de l’œil dans l’alvéole et le glissement de la pointe de la bavure.
  4. Lorsque l’abrasion est terminée, placez soigneusement le poisson dans l’eau du système contenant l’analgésique pour la récupération.
  5. Nettoyez la bavure juste après utilisation avec un coton-tige humide.

4. Prélèvement d’échantillons

  1. Au moment souhaité, ramassez le poisson avec un filet et placez-le dans une solution de tricaïne à 0,02%. Gardez l’animal dans la solution jusqu’à ce que le mouvement operculaire ait complètement cessé et que le poisson ne réagisse pas au toucher.
  2. Placez le poisson sur une boîte de Pétri avec une cuillère et tenez-le avec une pince à épiler. Décapitez le poisson avec des ciseaux disséquants. Évitez de faire des rayures sur la surface des yeux lorsque vous manipulez l’échantillon.
  3. Placer le tissu dans un tube d’échantillonnage contenant 0,1 M de Na-PO4.
    1. Rincez le tissu en remplaçant le Na-PO4 de 0,1 M par un tampon propre afin qu’il ne reste pas de sang dans la solution.

5. Traitement des échantillons pour la microscopie électronique

  1. Fixer le tissu dans 2,5 % de glutaraldéhyde/0,1 M Na-PO4 (pH 7,4) pendant ~24 h à +4 °C. Conservez l’échantillon sur un porte-échantillon rotatif ou agité pour assurer une bonne fixation.
  2. Retirez la solution de fixation et rincez l’échantillon plusieurs fois avec 0,1 M Na-PO4.
  3. Disséquez l’échantillon à ce stade.
    1. Placer l’échantillon sur une goutte de 0,1 M Na-PO4 sur une plaque de dissection. Si les deux yeux du même poisson doivent être imagés, coupez l’échantillon de tête en deux avec de fins ciseaux à disséquer.
    2. Alternativement, collectez les yeux uniquement en plaçant soigneusement les pointes de la pince à épiler fine dans l’orbite du côté de l’œil, en prenant soin de ne pas rayer la surface de l’œil. Ensuite, retirez l’œil de l’orbite.
    3. Transférer l’échantillon disséqué dans un tube contenant 0,1 M de Na-PO4. Assurez-vous qu’il n’y a pas de tissu supplémentaire dans le tube d’échantillonnage, car il peut adhérer au sommet de l’œil pendant le traitement de l’échantillon.
  4. Conserver l’échantillon dans 0,1 M Na-PO4 (maximum une semaine) à +4 °C.
  5. Traiter les échantillons pour l’imagerie par microscopie électronique.
    1. Postfixer les échantillons dans du tétroxyde d’osmium à 2 % dans un tampon Na-PO4 de 0,1 M pendant 1 h à température ambiante (RT).
    2. Lavez les échantillons 3 fois pendant 5 minutes chaque lavage dans 0,1 M Na-PO4 à RT.
    3. Déshydrater les échantillons successivement dans de l’éthanol à 30%, 50% et 70% pendant 1 h dans chaque solution à TA.
    4. Immerger les échantillons dans de l’éthanol à 96% pendant 2-3 h à TA.
    5. Ensuite, incuber les échantillons deux fois dans de l’éthanol à 100 %, d’abord pendant 1 h, puis dans de l’éthanol frais à 100 % pendant la nuit à +4 °C.
    6. Soumettez les échantillons à 30 cycles dans un sécheur automatisé de points critiques.
  6. Intégrez et recouvrez les échantillons de platine.
    1. Placez une languette adhésive sur un support. Si l’échantillon doit être marqué sur le dessus de la monture, laissez un morceau de papier de couverture d’onglet sur l’onglet et écrivez l’ID de l’échantillon sur le papier.
    2. Placez la monture avec la languette sur la base d’un microscope à dissection.
    3. Placez doucement l’échantillon de tissu sur la monture avec une pince à épiler fine, la cornée vers le haut.
    4. Enduire l’échantillon de platine à l’aide du dispositif approprié. Après le revêtement, conservez les échantillons à température ambiante jusqu’à l’imagerie.

6. Imagerie (Figure 2)

  1. Utilisez les appareils comme conseillé dans le manuel de l’utilisateur et par des experts en imagerie.
  2. Acquérez des images du grossissement souhaité et utilisez des images 2 000 à 2 500x pour l’analyse.
  3. Ajustez la luminosité et le contraste de sorte qu’il n’y ait pas de zones surexposées dans l’image, et que les bordures de cellules et les micro-réfrigérateurs soient vus aussi clairement que possible.
    REMARQUE: La position et l’angle du tissu affectent les paramètres de luminosité et de contraste. Ils peuvent avoir besoin d’être ajustés d’un échantillon à l’autre et entre différentes régions du tissu.

7. Mesure de la forme, de la taille et du motif de microgravure de la cellule

  1. Ouvrez l’image TIFF dans Fiji ImageJ 1.5327. Définissez l’échelle à l’aide de la barre d’échelle de l’image : créez une ligne de taille égale à la barre d’échelle à l’aide de l’outil Ligne . Sélectionnez Analyser | Définissez l’échelle et tapez la distance connue. Ouvrez le gestionnaire de retour sur investissement à partir de la | Analyser Menu Outils .
  2. Pour la taille et l’arrondi des cellules, sélectionnez Analyser | Définir les | de mesures Descripteurs de forme. Utilisez l’outil Loupe pour voir les cellules sous grossissement. Sélectionnez des cellules à l’aide de l’outil Polygone et ajoutez chaque sélection au gestionnaire de retour sur investissement. Enfin, mesurez les cellules sélectionnées et enregistrez la mesure.
  3. Analyse de microridge (Figure 3 et Figure 4)
    1. Assurez-vous que l’image est au format 8 bits à partir de l’image | Tapez menu.
    2. Sélectionnez une cellule à l’aide de l’outil Polygone et effacez l’arrière-plan de la | Modifier Clair à l’extérieur.
    3. Lissez l’image une à trois fois en sélectionnant Traiter | Lissez et ajustez la luminosité et le contraste à partir de l’image | Ajuster | Luminosité/Contraste pour que les microgravures se démarquent le plus clairement possible.
    4. Convolve l’image de Process | Filtres | Convolve, transformez en binaire à partir de Process | | binaire Rendez binaire et squelettez l’image en noir et blanc en sélectionnant Traiter | | binaire Squeletter.
    5. Utilisez la fonction Analyser le squelette dans le | Analyser Menu squelette pour mesurer les paramètres de la microgravure et enregistrer les valeurs.
      REMARQUE: Dans SEM, les images individuelles peuvent différer en luminosité et en contraste. Ainsi, les étapes de l’analyse peuvent nécessiter des ajustements d’image en image.

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Representative Results

Cette étude décrit une méthode utilisant une bavure ophtalmique dans des expériences de cicatrisation des plaies cornéennes du poisson-zèbre. La méthode est modifiée par rapport à des études antérieures sur des souris, où il a été démontré que la bavure enlevait efficacement les couches de cellules épithéliales13. Les défis de la blessure cornéenne du poisson-zèbre comprennent la taille relativement petite de l’œil et, dans le cas d’expériences fastidieuses, la nécessité de maintenir un flux d’eau constant à travers les branchies (comme décrit par Xu et ses collègues28). Les principaux avantages de cette méthode sont sa simplicité et sa rapidité. Un microscope à dissection standard est utilisé pour une utilisation contrôlée de la bavure (Figure 1). Comme la procédure est de courte durée (environ 3 minutes à partir du début de l’anesthésie), les poissons récupèrent bien de la manipulation et aucun équipement supplémentaire n’est nécessaire pour le maintien de l’anesthésie et de l’apport en oxygène.

Il existe plusieurs façons de visualiser la plaie cornéenne. Ce protocole utilise la microscopie électronique à balayage (MEB, Figure 2), qui a une longue histoire d’utilisation dans les études cornéennes29,30. Bien que cette approche ne permette pas d’évaluer les couches inférieures de l’épithélium, elle fournit une méthode facile pour estimer la vitesse de cicatrisation des plaies et comparer les surfaces cornéennes de différentes régions de l’œil. À 3 h après la plaie, alors que la zone de la plaie est fermée (figure 2), le site où les bordures de la plaie sont jointes reste visible (figure 2).

Les cellules superficielles de la cornée du poisson-zèbre contiennent des microridges prononcés31. Récemment, une étude a rapporté que ces structures étaient perdues dans des cellules allongées adjacentes à des plaies sur la peau du poisson-zèbre32. Cependant, les résultats présentés montrent que sur l’épithélium cornéen abrasé, des micro-bouillies peuvent être observées dans certaines cellules allongées à côté du site de la plaie (Figure 4B). Dans certaines régions périphériques, les microgravures sont perdues du centre de la cellule (Figure 4C,D). Pour une analyse plus détaillée, la surface et la rondeur des cellules apicales sont quantifiées, en plus de la quantité de microrérix et de la longueur moyenne dans l’image J27 (figure 3 et figure 4E-H).

L’analyse de la microridge est effectuée à l’aide de la fonction Skeleton (modifiée à partir de van Loon et de ses collègues33). Une comparaison entre les deux régions périphériques (figure 4A (régions C et D), figure 4C et figure 4D) révèle que les cellules de la figure 4D sont plus allongées (indiquant des réarrangements cellulaires en réaction à une blessure) et ont des microrébits moyennes plus courtes que les cellules de la figure 4C. Ce résultat suggère que le changement de forme cellulaire est en corrélation avec la modification de la microrix et souligne l’hétérogénéité dans l’épithélium cornéen dans la réponse de la plaie.

La mesure de la surface et de la rondeur des cellules apicales sur des images SEM est un moyen simple et reproductible d’obtenir des données quantitatives sur l’apparence cellulaire dans différentes régions de la cornée. Bien que limitée à la 2D, cette approche permet d’acquérir une compréhension globale de la dynamique et de la vitesse des réarrangements cellulaires lors de la fermeture de la plaie. Les images SEM sont utilisées pour analyser les modèles de micro-bouillie à la surface de la cellule apicale. Le traitement d’image décrit ici donne une approximation des changements dans les paramètres de la microgravure, ce qui serait fastidieux à mesurer à la main.

Figure 1
Figure 1: La configuration pour l’abrasion cornéenne. (A) Un microscope à dissection est nécessaire pour l’abrasion contrôlée sur le petit œil de poisson zèbre. (B) L’éponge aide à stabiliser les poissons anesthésiés pendant la procédure. (C) Le poisson est anesthésié sur une boîte de Pétri et l’animal anesthésié est transféré à l’éponge avec une petite cuillère. Une bavure oculaire avec une pointe de 0,5 mm est utilisée pour abraser la cornée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Visualisation de la cornée blessée par microscopie électronique à balayage. Vue d’ensemble de la cornée abrasée recueillie à 0, 1, 2 ou 3 h après la plaie (HPW). Le contour en pointillés indique la bordure de la plaie. Barres d’échelle = 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Exemple de modification de l’image avant la mesure du microridge. Bien qu’il ne s’agisse pas d’une réplique exacte de la surface cellulaire d’origine, le motif squeletté final capture les différences entre le centre cellulaire et la périphérie. Barre d’échelle = 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Comparaison de la surface des cellules apicales, de la rondeur et des valeurs de microrix entre deux régions périphériques après abrasion cornéenne. (A) Un aperçu de l’œil blessé. Les cases indiquent l’emplacement des images à grossissement plus élevé (en B, C et D). (C, D) Les cellules sélectionnées pour l’analyse du descripteur de forme sont marquées d’un contour vert. (E, F) Valeurs de l’aire cellulaire apicale (E) et de la rondeur (F) des cellules sélectionnées. (G, H) Microridge longueur totale (G) et longueur moyenne (H) des mêmes cellules. Les groupes ont été statistiquement comparés à un test t à deux queues (*p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01) Barres d’échelle = 500 μm en A, 50 μm en B, C et D. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Les blessures physiques cornéennes sont la cause la plus fréquente de visites de patients en ophtalmologie à l’hôpital. Par conséquent, il est important d’établir des modèles pertinents pour l’étude de différents aspects de la physiopathologie cornéenne. Jusqu’à présent, la souris est le modèle le plus couramment utilisé pour l’étude de la cicatrisation des plaies cornéennes. Cependant, l’ajout de gouttes oculaires sur les yeux blessés murins pour valider l’impact de médicaments spécifiques sur la cicatrisation des plaies cornéennes peut être difficile. À cet égard, le modèle du poisson-zèbre est particulièrement utile pour le criblage pharmacologique des molécules ayant un impact sur la cicatrisation des plaies cornéennes. La méthode décrite ici est très similaire à celle décrite pour la souris13.

Deux points de différence spécifiques doivent toutefois être gardés à l’esprit. Tout d’abord, l’utilisation d’une bavure ophtalmique nécessite une pratique pour assurer la reproductibilité de la plaie, en particulier en ce qui concerne la pression exercée sur l’œil, ce qui est essentiel pour une abrasion appropriée. De plus, la pointe abrasive doit être changée lorsque l’épithélium n’est plus retiré efficacement. Deuxièmement, alors que la structure et la morphologie de la cornée du poisson-zèbre sont similaires à celles des autres cornées31, cet animal possède des capacités de régénération inégalées chez les organismes mammifères 34,35,36. Alors que la fermeture de la plaie chez la souris dure de 48 à 72 h 11,14,37, un délai de 3 h est rapporté pour le poisson-zèbre. En raison des similitudes structurelles et moléculaires, le comportement cellulaire induit par une plaie physique cornéenne est probablement similaire chez la plupart des vertébrés. Cependant, la réponse rapide chez le poisson-zèbre est probablement guidée par un mécanisme de régénération avancé spécifique à cet animal.

Le protocole décrit utilise le SEM pour suivre la fermeture de la plaie. De nombreuses autres études ont utilisé la microscopie à fluorescence à la place pour suivre ce processus 15,17,38. Cependant, l’utilisation du SEM facilite l’analyse de la modification de la forme cellulaire suite à l’abrasion épithéliale. L’inconvénient de cette technologie est que les étapes de stratification ne peuvent pas être suivies, car le SEM ne permet que l’imagerie de la couche la plus externe. Pour étudier l’épithélium en 3D pendant la cicatrisation complète de la cornée, des modèles fluorescents, tels que Zebrabow39, ou l’immunomarquage doivent être utilisés.

L’utilisation du poisson-zèbre comme modèle de cicatrisation des plaies cornéennes améliore la portée de la recherche car elle permet l’application de nombreux outils moléculaires disponibles, tels que les lignées de poissons génétiquement modifiées, les morpholinos et le criblage chimique, afin d’élargir considérablement la gamme possible d’études sur la cicatrisation des plaies cornéennes. De plus, la taille des yeux du poisson-zèbre permet le développement de nouvelles stratégies d’imagerie pour étudier la dynamique des cellules épithéliales plus en détail que ce qui peut être fait avec les yeux murins.

L’objectif principal de ce rapport n’est pas seulement d’adapter l’approche de la blessure physique de la cornée au modèle du poisson-zèbre, mais aussi de démontrer que l’utilisation de nouveaux modèles permet de poser et de répondre à de nouvelles questions et indique de nouvelles façons d’étudier les phénomènes biologiques fondamentaux. Ces avantages seront finalement bénéfiques pour les patients.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs remercient Pertti Panula pour l’accès à l’unité Zebrafish et Henri Koivula pour les conseils et l’aide pour les expériences sur le poisson-zèbre. Cette recherche a été soutenue par l’Académie de Finlande, la Fondation Jane et Aatos Erkko, la Fondation culturelle finlandaise et le programme ATIP-Avenir. L’imagerie a été réalisée à l’unité de microscopie électronique et à l’unité de microscopie optique de l’Institut de biotechnologie, avec le soutien de HiLIFE et du Biocenter Finland.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4 in-house Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2 HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2 PO4 ).
0.2M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4 in-house Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2 HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2 PO4 ).
0.5mm burr tips Alger Equipment Company BU-5S
1M Tris, pH 8.8 in-house
adhesive tabs Agar Scientific G3347N
Algerbrush burr, Complete instrument Alger Equipment Company BR2-5
Cotton swaps Heinz Herenz Hamburg 1030128
Dissecting plate in-house
Dissecting tools Fine Science Tools
double-distilled water in-house
Eppedorf tubes, 2ml any provider
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt Sigma A5040 Caution: causes irritation.
Glutaraldehyde, 50% aqueous solution, grade I Sigma G7651 Caution: toxic.
Lidocaine hydrochloride Sigma L5647 Caution: toxic.
mounts Agar Scientific G301P
Petri dish Thermo Scientific 101VR20
pH indicator strips Macherey-Nagel 92110
Plastic spoons any provider
Plastic tubes, 15 ml Greiner Bio-One 188271
Plastic tubes, 50 ml Greiner Bio-One 227261
Scanning electron microscope FEI Quanta 250 FEG
Soft sponge any provider
Sputter coater Quorum Technologies GQ150TS
Stereomicroscope Leica

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baden, T., Euler, T., Berens, P. Understanding the retinal basis of vision across species. Nature Reviews.Neuroscience. 21 (1), 5-20 (2020).
  2. Nishida, T., Saika, S., Morishige, N. Cornea and sclera: Anatomy and physiology. Cornea: Fundamentals, diagnosis and management, 4th ed. Manis, M. J., Holland, E. J. , Elsevier. 1-22 (2017).
  3. Wilson, S. E., Liu, J. J., Mohan, R. R. Stromal-epithelial interactions in the cornea. Progress in Retinal and Eye Research. 18 (3), 293-309 (1999).
  4. Wilson, S. E., et al. Epithelial injury induces keratocyte apoptosis: hypothesized role for the interleukin-1 system in the modulation of corneal tissue organization and wound healing. Experimental Eye Research. 62 (4), 325-327 (1996).
  5. Zieske, J. D., Guimaraes, S. R., Hutcheon, A. E. Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement. Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).
  6. West-Mays, J. A., Dwivedi, D. J. The keratocyte: corneal stromal cell with variable repair phenotypes. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 38 (10), 1625-1631 (2006).
  7. Ahmed, F., House, R. J., Feldman, B. H. Corneal abrasions and corneal foreign bodies. Primary Care. 42 (3), 363-375 (2015).
  8. Ben-Eli, H., Erdinest, N., Solomon, A. Pathogenesis and complications of chronic eye rubbing in ocular allergy. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 19 (5), 526-534 (2019).
  9. Wilson, S. A., Last, A. Management of corneal abrasions. American Family Physician. 70 (1), 123-128 (2004).
  10. Nagata, M., et al. JBP485 promotes corneal epithelial wound healing. Scientific Reports. 5, 14776 (2015).
  11. Wang, X., et al. MANF promotes diabetic corneal epithelial wound healing and nerve regeneration by attenuating hyperglycemia-induced endoplasmic reticulum stress. Diabetes. 69 (6), 1264-1278 (2020).
  12. Li, F. J., et al. Evaluation of the AlgerBrush II rotating burr as a tool for inducing ocular surface failure in the New Zealand White rabbit. Experimental Eye Research. 147, 1-11 (2016).
  13. Kalha, S., Kuony, A., Michon, F. Corneal epithelial abrasion with ocular burr as a model for cornea wound healing. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (137), e58071 (2018).
  14. Kalha, S., et al. Bmi1+ progenitor cell dynamics in murine cornea during homeostasis and wound healing. Stem Cells. 36 (4), 562-573 (2018).
  15. Park, M., et al. Visualizing the contribution of keratin-14(+) limbal epithelial precursors in corneal wound healing. Stem Cell Reports. 12 (1), 14-28 (2019).
  16. Kuony, A., et al. Ectodysplasin-A signaling is a key integrator in the lacrimal gland-cornea feedback loop. Development. 146 (14), (2019).
  17. Farrelly, O., et al. Two-photon live imaging of single corneal stem cells reveals compartmentalized organization of the limbal niche. Cell Stem Cell. 28 (7), 1233-1247 (2021).
  18. Ikkala, K., Michon, F., Stratoulias, V. Unilateral Zebrafish corneal injury induces bilateral cell plasticity supporting wound closure. Scientific Reports. , (2021).
  19. Ormerod, L. D., Abelson, M. B., Kenyon, K. R. Standard models of corneal injury using alkali-immersed filter discs. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (10), 2148-2153 (1989).
  20. Anderson, C., Zhou, Q., Wang, S. An alkali-burn injury model of corneal neovascularization in the mouse. Journal of visualized experiments: JoVE. (86), e51159 (2014).
  21. Choi, H., et al. Comprehensive modeling of corneal alkali injury in the rat eye. Current Eye Research. 42 (10), 1348-1357 (2017).
  22. Singh, P., Tyagi, M., Kumar, Y., Gupta, K. K., Sharma, P. D. Ocular chemical injuries and their management. Oman Journal of Ophthalmology. 6 (2), 83-86 (2013).
  23. Pal-Ghosh, S. BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds. Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).
  24. Chen, J. J., Tseng, S. C. Abnormal corneal epithelial wound healing in partial-thickness removal of limbal epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (8), 2219-2233 (1991).
  25. Xeroudaki, M., Peebo, B., Germundsson, J., Fagerholm, P., Lagali, N. RGTA in corneal wound healing after transepithelial laser ablation in a rabbit model: a randomized, blinded, placebo-controlled study. Acta Ophthalmologica. 94 (7), 685-691 (2016).
  26. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio. , Available from: https://zfinorg/zf_info/zfbook/zfbk.html (2000).
  27. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  28. Xu, C., Volkery, S., Siekmann, A. F. Intubation-based anesthesia for long-term time-lapse imaging of adult zebrafish. Nature Protocols. 10 (12), 2064-2073 (2015).
  29. Crosson, C. E., Klyce, S. D., Beuerman, R. W. Epithelial wound closure in the rabbit cornea. A biphasic process. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 27 (4), 464-473 (1986).
  30. Parlanti, P., et al. Axonal debris accumulates in corneal epithelial cells after intraepithelial corneal nerves are damaged: A focused Ion Beam Scanning Electron Microscopy (FIB-SEM) study. Experimental Eye Research. 194, 107998 (2020).
  31. Zhao, X. C., et al. The zebrafish cornea: structure and development. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (10), 4341-4348 (2006).
  32. Richardson, R., et al. Re-epithelialization of cutaneous wounds in adult zebrafish combines mechanisms of wound closure in embryonic and adult mammals. Development. 143 (12), 2077-2088 (2016).
  33. van Loon, A. P., Erofeev, I. S., Maryshev, I. V., Goryachev, A. B., Sagasti, A. Cortical contraction drives the 3D patterning of epithelial cell surfaces. The Journal of Cell Biology. 219 (3), (2020).
  34. Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina. Journal of Neurobiology. 44 (3), 289-307 (2000).
  35. Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).
  36. Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish. The Journal of Comparative Neurology. 377 (4), 577-595 (1997).
  37. Hu, X., et al. Sirt6 deficiency impairs corneal epithelial wound healing. Aging. 10 (8), 1932-1946 (2018).
  38. Ksander, B. R., et al. ABCB5 is a limbal stem cell gene required for corneal development and repair. Nature. 511 (7509), 353-357 (2014).
  39. Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140 (13), 2835-2846 (2013).

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Biologie numéro 181 Cornée épithélium abrasion bavure oculaire fermeture de plaie MEB poisson-zèbre.
Guérison des plaies cornéennes du poisson-zèbre: de l’abrasion à l’analyse d’imagerie de fermeture de plaie
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Ikkala, K., Raatikainen, S., Michon, … More

Ikkala, K., Raatikainen, S., Michon, F. Zebrafish Corneal Wound Healing: From Abrasion to Wound Closure Imaging Analysis. J. Vis. Exp. (181), e63605, doi:10.3791/63605 (2022).

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