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Biology

Zebrafish कॉर्नियल घाव हीलिंग: घर्षण से घाव बंद इमेजिंग विश्लेषण करने के लिए

Published: March 1, 2022 doi: 10.3791/63605
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Institute of Biotechnology, HiLIFE, University of Helsinki, 2Institute for Neurosciences of Montpellier, Univ Montpellier

Summary

यह प्रोटोकॉल सेलुलर स्तर पर बाद के घाव के बंद होने का आकलन करने के लिए घर्षण के माध्यम से ज़ेब्राफ़िश की ओकुलर सतह को नुकसान पहुंचाने पर केंद्रित है। यह दृष्टिकोण आंशिक रूप से कॉर्नियल एपिथेलियम को हटाने के लिए एक ओकुलर का शोषण करता है और घाव बंद होने के दौरान सेल आकृति विज्ञान में परिवर्तन को ट्रैक करने के लिए स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करता है।

Abstract

आंख की पारदर्शी सतह के रूप में, कॉर्निया स्पष्ट दृष्टि के लिए महत्वपूर्ण है। अपने स्थान के कारण, यह ऊतक पर्यावरणीय अपमान के लिए प्रवण है। दरअसल, आंखों की चोटों को सबसे अधिक बार नैदानिक रूप से सामना करना पड़ता है, वे कॉर्निया के लिए हैं। जबकि कॉर्नियल घाव भरने का बड़े पैमाने पर छोटे स्तनधारियों (यानी, चूहों, चूहों और खरगोशों) में अध्ययन किया गया है, कॉर्नियल फिजियोलॉजी अध्ययनों ने ज़ेबराफ़िश सहित अन्य प्रजातियों की उपेक्षा की है, ज़ेबराफ़िश एक क्लासिक शोध मॉडल होने के बावजूद।

यह रिपोर्ट ज़ेब्राफ़िश पर कॉर्नियल घर्षण करने की एक विधि का वर्णन करती है। घाव एक ओकुलर burr का उपयोग कर anesthetized मछली पर विवो में प्रदर्शन किया जाता है। यह विधि एक पुनरुत्पादक उपकला घाव के लिए अनुमति देती है, जिससे आंख के बाकी हिस्सों को बरकरार रखा जाता है। घर्षण के बाद, घाव बंद करने की निगरानी 3 घंटे के दौरान की जाती है, जिसके बाद घाव को फिर से मापा जाता है। स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके, छवि प्रसंस्करण के बाद, उपकला सेल आकार, और एपिकल प्रोट्रूशियंस की जांच कॉर्नियल उपकला घाव बंद होने के दौरान विभिन्न चरणों का अध्ययन करने के लिए की जा सकती है।

ज़ेब्राफ़िश मॉडल की विशेषताएं उपकला ऊतक शरीर विज्ञान के अध्ययन और उपकला कोशिकाओं के सामूहिक व्यवहार की अनुमति देती हैं जब ऊतक को चुनौती दी जाती है। इसके अलावा, आंसू फिल्म के प्रभाव से वंचित एक मॉडल का उपयोग तनाव के लिए कॉर्नियल प्रतिक्रिया के बारे में नए जवाब पैदा कर सकता है। अंत में, यह मॉडल किसी भी उपकला ऊतक में शामिल सेलुलर और आणविक घटनाओं के चित्रण की भी अनुमति देता है जो एक भौतिक घाव के अधीन है। इस विधि को प्रीक्लिनिकल परीक्षण में दवा की प्रभावशीलता के मूल्यांकन के लिए लागू किया जा सकता है।

Introduction

जैसा कि अधिकांश एपिथेलिया बाहरी वातावरण के संपर्क में हैं, वे शारीरिक चोट के लिए प्रवण हैं, जिससे उन्हें घाव भरने की प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल बनाया जाता है। अच्छी तरह से अध्ययन किए गए ऊतकों में, कॉर्निया घाव भरने के सेलुलर और आणविक पहलुओं की जांच में एक बेहद उपयोगी मॉडल है। एक पारदर्शी बाहरी सतह के रूप में, यह आंख को शारीरिक सुरक्षा प्रदान करता है और रेटिना पर प्रकाश को केंद्रित करने वाला पहला तत्व है। जबकि रेटिना की संरचना और कोशिका संरचना प्रजातियों1 के बीच भिन्न होती है, कॉर्निया के ये तत्व आमतौर पर प्रजातियों की परवाह किए बिना सभी कैमरा-प्रकार की आंखों में समान होते हैं।

कॉर्निया तीन मुख्य परतों से बना है2। पहली और सबसे बाहरी परत उपकला है, जिसे इसकी पारदर्शिता सुनिश्चित करने के लिए लगातार नवीनीकृत किया जाता है। दूसरी परत स्ट्रोमा है, जिसमें बिखरे हुए कोशिकाएं होती हैं, जिन्हें केराटोसाइट्स कहा जाता है, सख्ती से संगठित कोलेजन फाइबर की मोटी परत के भीतर। तीसरी और सबसे भीतरी परत एंडोथेलियम है, जो पूर्वकाल कक्ष से बाहरी परतों तक पोषक तत्व और तरल प्रसार की अनुमति देती है। उपकला और स्ट्रोमल कोशिकाएं विकास कारकों और साइटोकिन्स3 के माध्यम से बातचीत करती हैं। इस बातचीत को तेजी से एपोप्टोसिस और उपकला चोट 4,5 के बाद केराटोसाइट्स के बाद के प्रसार द्वारा उजागर किया गया है। एक गहरे घाव के मामले में, जैसे कि एक पंचर, केराटोसाइट्स उपचार प्रक्रिया में एक सक्रिय भाग लेतेहैं 6।

बाहरी वातावरण के संपर्क में होने के नाते, कॉर्नियल शारीरिक चोटें आम हैं। उनमें से कई छोटे विदेशी वस्तुओं के कारण होते हैं7, जैसे कि रेत या धूल। आंख रगड़ के पलटा व्यापक उपकला घर्षण और कॉर्नियल remodeling8 करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। घाव के आकार और गहराई के अनुसार, ये शारीरिक चोटें दर्दनाक होती हैं और 9 को ठीक करने में कई दिन लगतेहैं। एक मॉडल की इष्टतम घाव भरने की विशेषताएं घाव बंद होने के सेलुलर और आणविक पहलुओं की समझ की सुविधा प्रदान करती हैं। इसके अलावा, इस तरह के मॉडल कॉर्नियल उपचार में तेजी लाने की क्षमता के साथ नए अणुओं के परीक्षण के लिए भी उपयोगी साबित हुए हैं, जैसा कि पहले10,11 का प्रदर्शन किया गया था।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उद्देश्य कॉर्नियल शारीरिक चोट का अध्ययन करने के लिए एक प्रासंगिक मॉडल के रूप में ज़ेब्राफ़िश का उपयोग करना है। यह मॉडल औषधीय स्क्रीनिंग अध्ययनों के लिए अत्यधिक सुविधाजनक है क्योंकि यह अणुओं को सीधे टैंक के पानी में जोड़ने की अनुमति देता है और इसलिए, एक उपचार कॉर्निया के संपर्क में आने की अनुमति देता है। यहां दिए गए विवरण वैज्ञानिकों को ज़ेबराफ़िश मॉडल पर अपना अध्ययन करने में मदद करेंगे। इन विवो चोट एक सुस्त ओकुलर के साथ किया जाता है। उपकला कोशिकाओं से सटे या उससे दूरी पर प्रभाव का विश्लेषण विशेष रूप से केंद्रीय कॉर्नियल उपकला को हटाकर किया जा सकता है। हाल के वर्षों में, कई रिपोर्टों ने कृंतक कॉर्निया 12,13,14,15,16,17 पर इस तरह की विधि पर ध्यान केंद्रित किया; हालांकि, आज तक, केवल एक ही रिपोर्ट ने इस विधि को ज़ेबराफ़िश18 पर लागू किया है।

इसकी सादगी के कारण, शारीरिक घाव घाव बंद करने में उपकला कोशिकाओं की भूमिका को चित्रित करने में उपयोगी है। कॉर्नियल चोट का एक और अच्छी तरह से स्थापित मॉडल रासायनिक जला है, विशेष रूप से क्षार 19,20,21 जलाता है। हालांकि, इस तरह का दृष्टिकोण अप्रत्यक्ष रूप से परिधीय कॉर्निया और कॉर्नियल स्ट्रोमा19 सहित पूरी आंख की सतह को नुकसान पहुंचाता है। दरअसल, क्षार जलता है संभावित रूप से कॉर्नियल अल्सर, छिद्र, उपकला opacification, और तेजी से neovascularization22 को प्रेरित करता है, और क्षार जलने का बेकाबू परिणाम सामान्य घाव भरने के अध्ययन के लिए उस दृष्टिकोण को अयोग्य घोषित करता है। कई अन्य तरीकों का उपयोग प्रश्न में अध्ययन के विशेष फोकस के अनुसार कॉर्नियल घाव भरने की जांच करने के लिए भी किया जाता है (उदाहरण के लिए, पूर्ण उपकला डिब्रिडमेंट23, आंशिक-मोटाई घाव24 के लिए रासायनिक और यांत्रिक चोट का संयोजन, स्ट्रोमा25 तक विस्तारित घावों के लिए एक्सिमर लेजर एब्लेशन)। एक ओकुलर बुर का उपयोग घाव के लिए उपकला प्रतिक्रिया के लिए केंद्र बिंदु को प्रतिबंधित करता है और एक अत्यधिक पुन: प्रस्तुत करने योग्य घाव प्रदान करता है।

घाव की प्रत्येक विधि के साथ के रूप में, एक ओकुलर burr के उपयोग के फायदे और नुकसान है. मुख्य नुकसान यह है कि प्रतिक्रिया ज्यादातर उपकला होने के नाते, यह नैदानिक सेटिंग में देखे गए घर्षण को पूरी तरह से प्रतिबिंबित नहीं करती है। हालांकि, इस विधि के कई फायदे हैं, जिसमें आसानी से इसे स्थापित और निष्पादित किया जा सकता है, इसकी सटीकता, इसकी पुनरुत्पादकता, और तथ्य यह है कि यह noninvasive है, जिससे यह जानवरों द्वारा अच्छी तरह से सहन की जाने वाली विधि बन जाती है।

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Protocol

सभी प्रयोगों को राष्ट्रीय पशु प्रयोग बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. तैयारी

  1. पहले से संज्ञाहरण26 के लिए उपयोग किए जाने वाले ट्राइकेन स्टॉक समाधान तैयार करें (इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले 0.4% स्टॉक समाधान)। दस्ताने का उपयोग करें और जब भी संभव हो सामग्री को धुएं के हुड में रखें।
    1. 0.4% समाधान के 50 मिलीलीटर के लिए, 50 मिलीलीटर ट्यूब में 200 मिलीग्राम ट्राइकेन पाउडर का वजन करें। पाउडर को लगभग 45 मिलीलीटर डबल-आसुत पानी में भंग करें।
    2. 1 M Tris (pH 8.8, ~ 1.25 mL) के साथ 7 करने के लिए tricaine स्टॉक समाधान के पीएच समायोजित करें। एलीकोट में ट्राइकेन स्टॉक में ट्राइस समाधान जोड़ें, प्रत्येक एलीकोट के बाद स्टॉक को अच्छी तरह से मिलाएं, और ट्राइस के प्रत्येक अतिरिक्त के बाद पीएच की जांच करें।
  2. प्रयोग से पहले, ट्राइकेन का 0.02% काम करने वाला समाधान तैयार करें।
    1. 0.4% स्टॉक समाधान के 2 मिलीलीटर पिघलना और सिस्टम पानी के 40 मिलीलीटर (अंतिम एकाग्रता 0.02%) में जोड़ें। समाधान को एक छोटे कंटेनर में रखें।
  3. प्रयोग से पहले, एनाल्जेसिक युक्त वसूली पानी तैयार करें। दस्ताने का उपयोग करें और जब भी संभव हो धुएं हुड में सामग्री रखें।
    1. रिकवरी पानी के एक लीटर के लिए, 2.5 मिलीग्राम लिडोकेन हाइड्रोक्लोराइड पाउडर का वजन करें और इसे ताजा सिस्टम पानी में भंग करें। पीएच की जांच करें और यदि आवश्यक हो तो 7 को समायोजित करें।
  4. प्रयोग से पहले, फिक्सिंग समाधान तैयार करें (पीएच7.4 पर 0.1 एम सोडियम फॉस्फेट (Na-PO 4) समाधान में 2.5% ग्लूटाराल्डिहाइड)। दस्ताने का उपयोग करें और एक धुएं हुड में सामग्री रखें।
    1. फिक्सिंग समाधान के 10 मिलीलीटर के लिए, पिपेट 5 मिलीलीटर 0.2 M Na-PO4 को एक ट्यूब में। 50% ग्लूटाराल्डिहाइड के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें, और 10 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए डबल-आसुत पानी जोड़ें। समाधान को प्रकाश से बचाएं, और उपयोग करने से पहले इसे बर्फ पर या फ्रिज में रखें।
      नोट: यदि नमूने घायल होने के बाद कई घंटों के लिए एकत्र किए जाने चाहिए, तो उपयोग करने से ठीक पहले फिक्सिंग समाधान तैयार करें।
  5. घायल करने के लिए उपकरण तैयार करें (चित्र1)।
    1. सिस्टम पानी के साथ वसूली टैंक या छोटे कंटेनरों को भरें।
    2. नेत्र बुर तैयार है. जांचें कि बुर टिप साफ है। यदि आवश्यक हो, तो एक नम कपास झाड़ू के साथ सेल मलबे को हटा दें।
    3. एक नरम स्पंज के पक्ष में एक चीरा बनाओ, और सिस्टम पानी के साथ स्पंज को नम करें। स्पंज को विच्छेदन माइक्रोस्कोप के आधार/चरण पर रखें। आंखों की सतह को ठीक से देखने के लिए किनारों और / या ऊपर से बुर और पर्याप्त रोशनी का उपयोग करने के लिए पर्याप्त काम करने की जगह सुनिश्चित करें।

2. संज्ञाहरण

  1. टैंक से एक मछली को 0.02% ट्राइकेन समाधान में स्थानांतरित करें, जिसमें जितना संभव हो उतना धीरे-धीरे नेट के साथ।
  2. संज्ञाहरण की निगरानी, प्रकाश यांत्रिक उत्तेजना के लिए प्रतिक्रिया की कमी के लिए जाँच.
    नोट: लगातार संज्ञाहरण के लिए, ट्राइकेन के लिए 2 मिनट के संपर्क का उपयोग वयस्क जंगली-प्रकार एबी मछली के साथ घर्षण से पहले किया जाता है। अन्य आनुवंशिक पृष्ठभूमि की मछली के साथ, एक अलग अवधि की आवश्यकता हो सकती है।

3. घर्षण

  1. धीरे स्पंज पर चीरा में एक चम्मच के साथ anesthetized मछली जगह, स्पंज सतह से उभरा सिर.
  2. बुर को चालू करें, और आंखों की सतह पर माइक्रोस्कोप दृश्य पर ध्यान केंद्रित करें।
  3. ध्यान से बुर टिप के साथ आंख की सतह से संपर्क करें। आंख की सतह को छूते समय, परिपत्र गति के साथ आंख की सतह पर बुर टिप को स्थानांतरित करना शुरू करें। अचानक आंदोलन से बचें, क्योंकि यह सॉकेट में आंखों को झुकाव और फिसलने के लिए टिप का कारण बन सकता है।
  4. जब घर्षण किया जाता है, तो मछली को वसूली के लिए एनाल्जेसिक युक्त सिस्टम के पानी में सावधानीपूर्वक रखें।
  5. नम कॉटन फाहे से इस्तेमाल के बाद को सही तरीके से साफ करें।

4. नमूने एकत्र करना

  1. वांछित समय बिंदु पर, मछली को एक जाल के साथ उठाएं और इसे 0.02% ट्राइकेन समाधान में रखें। जानवर को समाधान में रखें जब तक कि ऑपरकुलर आंदोलन पूरी तरह से बंद न हो जाए, और मछली छूने के लिए प्रतिक्रिया नहीं करती है।
  2. मछली को एक चम्मच के साथ पेट्री डिश पर रखें, और इसे चिमटी के साथ पकड़ें। विच्छेदन कैंची के साथ मछली decapitate. नमूना संभालते समय आंखों की सतह पर कोई खरोंच बनाने से बचें।
  3. ऊतक को 0.1 M Na-PO4 युक्त एक नमूना ट्यूब में रखें।
    1. 0.1 M Na-PO4 को साफ बफर के साथ बदलकर ऊतक को कुल्ला करें ताकि समाधान में कोई रक्त न रहे।

5. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए नमूना प्रसंस्करण

  1. 2.5% glutaraldehyde / 0.1 M Na-PO 4 (pH7.4 ) में ऊतक को +4 °C पर ~ 24 h के लिए ठीक करें। उचित निर्धारण सुनिश्चित करने के लिए नमूना को घूर्णन / मिलाते हुए नमूना धारक पर रखें।
  2. फिक्सिंग समाधान निकालें और 0.1 एम ना-पीओ4 के साथ कई बार नमूना कुल्ला।
  3. इस बिंदु पर नमूने को विच्छेदित करें।
    1. एक विच्छेदन प्लेट पर 0.1 M Na-PO4 की एक बूंद पर नमूना रखें। यदि एक ही मछली से दोनों आंखों को चित्रित किया जाना चाहिए, तो ठीक विच्छेदन कैंची के साथ सिर के नमूने को दो में काट दें।
    2. वैकल्पिक रूप से, आंखों को केवल आंखों की तरफ से आंखों के सॉकेट में ठीक चिमटी की युक्तियों को ध्यान से रखकर आंखों को इकट्ठा करें, आंखों की सतह को खरोंच न करने के लिए अतिरिक्त देखभाल करें। फिर, आंख को सॉकेट से बाहर निकालें।
    3. विच्छेदित नमूने को 0.1 M Na-PO4 युक्त एक ट्यूब में स्थानांतरित करें। सुनिश्चित करें कि नमूना ट्यूब में कोई अतिरिक्त ऊतक नहीं है, क्योंकि यह नमूना प्रसंस्करण के दौरान आंख के शीर्ष का पालन कर सकता है।
  4. नमूने को +4 °C पर 0.1 M Na-PO4 (अधिकतम एक सप्ताह) में संग्रहीत करें.
  5. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए नमूनों को संसाधित करें।
    1. पोस्टफिक्स 2% ऑस्मियम tetroxide में नमूने 0.1 M Na-PO4 कमरे के तापमान (RT) पर 1 ज के लिए बफर में.
    2. 5 मिनट के लिए नमूनों को 3 बार धोएं प्रत्येक आरटी पर 0.1 एम ना-पीओ4 में धोएं।
    3. आरटी पर प्रत्येक समाधान में 1 घंटे के लिए 30%, 50%, और 70% इथेनॉल में नमूनों को क्रमिक रूप से निर्जलित करें।
    4. आरटी में 2-3 ज के लिए 96% इथेनॉल में नमूनों को विसर्जित करें।
    5. इसके बाद, नमूनों को 100% इथेनॉल में दो बार इनक्यूबेट करें, पहले 1 घंटे के लिए और फिर +4 डिग्री सेल्सियस पर रातभर ताजा 100% इथेनॉल में।
    6. एक स्वचालित महत्वपूर्ण बिंदु ड्रायर में 30 चक्रों के लिए नमूनों के विषय.
  6. एम्बेड और प्लैटिनम-नमूनों कोट.
    1. एक माउंट पर एक चिपकने वाला टैब रखें। यदि नमूने को माउंट के शीर्ष पर चिह्नित किया जाना चाहिए, तो टैब पर टैब कवर पेपर का एक टुकड़ा छोड़ दें और पेपर पर नमूना आईडी लिखें।
    2. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के आधार पर टैब के साथ माउंट रखें।
    3. धीरे ठीक चिमटी, कॉर्निया का सामना करना पड़ रहा है के साथ माउंट पर ऊतक के नमूने जगह.
    4. उपयुक्त उपकरण का उपयोग करके प्लैटिनम के साथ नमूने को कोट करें। कोटिंग के बाद, नमूने को इमेजिंग तक कमरे के तापमान पर स्टोर करें।

6. इमेजिंग (चित्रा 2)

  1. उपयोगकर्ता के मैनुअल में सलाह के अनुसार और इमेजिंग विशेषज्ञों द्वारा उपकरणों को संचालित करें।
  2. वांछित आवर्धन की छवियों को प्राप्त करें, और विश्लेषण के लिए 2,000-2,500x छवियों का उपयोग करें।
  3. चमक और इसके विपरीत समायोजित करें ताकि छवि में कोई overexposed क्षेत्र न हों, और सेल सीमाओं और माइक्रोरिज को यथासंभव स्पष्ट रूप से देखा जा सके।
    नोट:: स्थिति और ऊतक के कोण चमक और कंट्रास्ट सेटिंग्स को प्रभावित करते हैं। उन्हें नमूने से नमूने तक और ऊतक के विभिन्न क्षेत्रों के बीच समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है।

7. सेल आकार, आकार, और माइक्रोरिज पैटर्न को मापने

  1. फिजी ImageJ 1.5327 में TIFF छवि खोलें। छवि के स्केल बार का उपयोग करके स्केल सेट करें: लाइन टूल के साथ स्केल बार के आकार के बराबर एक पंक्ति बनाएँ। विश्लेषण | का चयन करें स्केल सेट करें, और ज्ञात दूरी में लिखें. विश्लेषण | से ROI प्रबंधक खोलें उपकरण मेनू.
  2. कक्ष आकार और गोलाई के लिए, विश्लेषण | का चयन करें माप | सेट करें आकृति वर्णनकर्ता. आवर्धन के तहत कोशिकाओं को देखने के लिए आवर्धक कांच उपकरण का उपयोग करें। बहुभुज उपकरण के साथ कक्षों का चयन करें, और ROI प्रबंधक के लिए प्रत्येक चयन जोड़ें। अंत में, चयनित कक्षों को मापें, और माप को सहेजें.
  3. माइक्रोरिज विश्लेषण (चित्रा 3 और चित्रा 4)
    1. सुनिश्चित करें कि छवि छवि | से 8-बिट स्वरूप में है मेनू लिखें .
    2. बहुभुज उपकरण के साथ किसी कक्ष का चयन करें, और संपादन | से पृष्ठभूमि साफ़ करें बाहर साफ़ करें।
    3. प्रक्रिया | का चयन करके छवि को एक से तीन बार चिकना करें चिकनी, और छवि | से चमक और इसके विपरीत समायोजित | समायोजित करें चमक / कंट्रास्ट ताकि माइक्रोरिज जितना संभव हो उतना स्पष्ट रूप से खड़े हों।
    4. प्रक्रिया | से छवि convolve फ़िल्टर | Convolve, प्रक्रिया | से बाइनरी में बारी द्विआधारी | बाइनरी बनाएँ, और प्रक्रिया | का चयन करके काले और सफेद छवि को कंकालीकृत करें द्विआधारी | कंकालीकरण.
    5. विश्लेषण | में कंकाल का विश्लेषण करें फ़ंक्शन का उपयोग करें कंकाल मेनू microridge पैरामीटर को मापने और मूल्यों को बचाने के लिए।
      नोट:: SEM में, अलग-अलग छवियाँ चमक और कंट्रास्ट में भिन्न हो सकती हैं. इस प्रकार, विश्लेषण में चरणों को छवि से छवि में समायोजन की आवश्यकता हो सकती है।

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Representative Results

यह अध्ययन ज़ेबराफ़िश कॉर्नियल घाव भरने के प्रयोगों में एक नेत्र बुर का उपयोग करके एक विधि का वर्णन करता है। इस विधि को चूहों पर पिछले अध्ययनों से संशोधित किया गया है, जहां को उपकला कोशिका परतों को कुशलतापूर्वक हटाने के लिए दिखाया गया था13। ज़ेब्राफ़िश कॉर्नियल घाव में चुनौतियों में आंख का अपेक्षाकृत छोटा आकार शामिल है, और समय लेने वाले प्रयोगों के मामले में, गिल्स के माध्यम से निरंतर पानी के प्रवाह को बनाए रखने की आवश्यकता (जैसा कि जू और सहकर्मियोंद्वारा वर्णित है 28)। इस विधि के मुख्य लाभ इसकी सादगी और गति हैं। एक मानक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग बुर के नियंत्रित उपयोग के लिए किया जाता है (चित्र1)। चूंकि प्रक्रिया कम अवधि की है (संज्ञाहरण की शुरुआत से लगभग 3 मिनट), मछली हैंडलिंग से अच्छी तरह से ठीक हो जाती है, और संज्ञाहरण और ऑक्सीजन वितरण के रखरखाव के लिए किसी अतिरिक्त उपकरण की आवश्यकता नहीं होती है।

कॉर्नियल घाव की कल्पना करने के कई तरीके हैं। यह प्रोटोकॉल स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM, चित्रा 2) का उपयोग करता है, जिसका कॉर्नियल अध्ययन29,30 में उपयोग का लंबा इतिहास है। यद्यपि यह दृष्टिकोण उपकला की निचली परतों के मूल्यांकन की अनुमति नहीं देता है, यह घाव भरने की गति का अनुमान लगाने और आंखों के विभिन्न क्षेत्रों की कॉर्नियल सतहों की तुलना करने का एक आसान तरीका प्रदान करता है। घाव के बाद 3 घंटे पर, जबकि घाव क्षेत्र बंद हो जाता है (चित्रा 2), वह साइट जहां घाव की सीमाएं शामिल होती हैं, दिखाई देती है (चित्रा 2)।

ज़ेब्राफ़िश कॉर्निया पर सतही कोशिकाओं में स्पष्ट माइक्रोरिज31 होते हैं। हाल ही में, एक अध्ययन ने इन संरचनाओं को ज़ेब्राफ़िश त्वचा32 पर घावों से सटे लम्बी कोशिकाओं में खोने के रूप में रिपोर्ट किया। हालांकि, प्रस्तुत परिणामों से पता चलता है कि एब्राडेड कॉर्नियल एपिथेलियम पर, घाव स्थल (चित्रा 4 बी) के बगल में कुछ लम्बी कोशिकाओं में माइक्रोरिज देखे जा सकते हैं। कुछ परिधीय क्षेत्रों में, माइक्रोरिज सेल के केंद्र से खो जाते हैं (चित्रा 4 सी, डी)। अधिक विस्तृत विश्लेषण के लिए, एपिकल सेल क्षेत्र और गोलाई को माइक्रोरिज राशि और इमेजजे27 (चित्रा 3 और चित्रा 4ई-एच) में औसत लंबाई के अलावा, परिमाणित किया जाता है।

माइक्रोरिज विश्लेषण कंकाल समारोह का उपयोग करके किया जाता है (वैन लून और सहकर्मियों33 से संशोधित)। दो परिधीय क्षेत्रों (चित्रा 4A (क्षेत्र C और D), चित्रा 4C, और चित्रा 4D) के बीच तुलना से पता चलता है कि चित्र4D में कोशिकाएं अधिक लम्बी हैं (घाव की प्रतिक्रिया के रूप में सेल पुनर्व्यवस्था को इंगित करती हैं) और चित्र 4C में कोशिकाओं की तुलना में कम औसत माइक्रोरिज हैं। इस परिणाम से पता चलता है कि सेल आकार में परिवर्तन माइक्रोरिज संशोधन के साथ सहसंबंधित है और घाव की प्रतिक्रिया में कॉर्नियल उपकला के भीतर विषमता पर जोर देता है।

एसईएम छवियों पर एपिकल सेल क्षेत्र और गोलाई को मापना कॉर्निया के विभिन्न क्षेत्रों में सेल उपस्थिति पर मात्रात्मक डेटा प्राप्त करने का एक सरल और पुनरुत्पादन योग्य तरीका है। हालांकि 2 डी तक सीमित है, यह दृष्टिकोण घाव बंद होने के दौरान कोशिका पुनर्व्यवस्था की गतिशीलता और गति की समग्र समझ प्राप्त करने में मदद करता है। एसईएम छवियों का उपयोग एपिकल सेल सतह पर माइक्रोरिज पैटर्न का विश्लेषण करने के लिए किया जाता है। यहां वर्णित छवि प्रसंस्करण माइक्रोरिज पैरामीटर में परिवर्तनों का एक सन्निकटन देता है, जो हाथ से मापने के लिए थकाऊ होगा।

Figure 1
चित्र 1: कॉर्नियल घर्षण के लिए सेटअप। (ए) छोटे ज़ेबराफ़िश आंख पर नियंत्रित घर्षण के लिए एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप आवश्यक है। (बी) स्पंज प्रक्रिया के दौरान एनेस्थेटिक मछली को स्थिर करने में मदद करता है। (सी) मछली को एक पेट्री डिश पर एनेस्थेटिक किया जाता है, और एनेस्थेटिक जानवर को एक छोटे चम्मच के साथ स्पंज में स्थानांतरित कर दिया जाता है। कॉर्निया को एब्राड करने के लिए 0.5 मिमी टिप के साथ एक ओकुलर का उपयोग किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ घायल कॉर्निया का विज़ुअलाइज़ेशन। 0, 1, 2, या 3 ज पोस्ट घाव (HPW) पर एकत्र किए गए एब्राडेड कॉर्निया का अवलोकन। धराशायी रूपरेखा घाव सीमा को इंगित करती है। स्केल बार = 500 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: माइक्रोरिज माप से पहले छवि संशोधन का एक उदाहरण। हालांकि मूल सेल सतह की सटीक प्रतिकृति नहीं है, अंतिम कंकालीकृत पैटर्न सेल केंद्र और परिधि के बीच के अंतर को कैप्चर करता है। स्केल बार = 10 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: कॉर्नियल घर्षण के बाद दो परिधीय क्षेत्रों के बीच एपिकल सेल क्षेत्र, गोलाई और माइक्रोरिज मूल्यों की तुलना। (ए) घायल आंख का एक सिंहावलोकन। बक्से उच्च आवर्धन छवियों ( बी, सी, और डी में) के स्थान को इंगित करते हैं। (C, D) आकृति डिस्क्रिप्टर विश्लेषण के लिए चयनित कक्षों को हरे रंग की बाह्यरेखा के साथ चिह्नित किया जाता है. (E, F) चयनित कक्षों के एपिकल सेल क्षेत्र (E) और गोलाई (F) मान. (G, H) माइक्रोरिज की कुल लंबाई (जी) और एक ही कोशिकाओं की औसत लंबाई (एच)। समूहों की तुलना सांख्यिकीय रूप से दो-पूंछ वाले टी-टेस्ट (* पी ≤ 0.05, ** पी ≤ 0.01) स्केल बार = 500 μm में A, B, C और D में 50 μm के साथ की गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

कॉर्नियल शारीरिक चोटें अस्पताल में नेत्र विज्ञान रोगी के दौरे का सबसे आम कारण हैं। इसलिए, कॉर्नियल पैथोफिजियोलॉजी के विभिन्न पहलुओं के अध्ययन के लिए प्रासंगिक मॉडल स्थापित करना महत्वपूर्ण है। अब तक, माउस कॉर्नियल घाव भरने के अध्ययन के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला मॉडल है। हालांकि, कॉर्नियल घाव भरने पर विशिष्ट दवाओं के प्रभाव को मान्य करने के लिए मुरीन घायल आंखों पर आईड्रॉप जोड़ना मुश्किल हो सकता है। इस संबंध में, ज़ेब्राफ़िश मॉडल कॉर्नियल घाव भरने को प्रभावित करने वाले अणुओं की औषधीय स्क्रीनिंग के लिए विशेष रूप से उपयोगी है। यहां वर्णित विधि माउस13 के लिए वर्णित के समान है।

हालांकि, अंतर के दो विशिष्ट बिंदुओं को ध्यान में रखा जाना चाहिए। सबसे पहले, एक नेत्र बुर के उपयोग के लिए घाव पुनरुत्पादन सुनिश्चित करने के लिए अभ्यास की आवश्यकता होती है, विशेष रूप से आंख पर लगाए गए दबाव के संबंध में, जो उचित घर्षण के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, अपघर्षक टिप को तब बदला जाना चाहिए जब उपकला को अब कुशलतापूर्वक नहीं हटाया जाता है। दूसरा, जबकि ज़ेब्राफ़िश कॉर्निया की संरचना और आकृति विज्ञान अन्य कॉर्निया31 के समान हैं, इस जानवर में पुनर्योजी क्षमताएं हैं जो स्तनधारी जीवोंमें अद्वितीय हैं 34,35,36। जबकि माउस में घाव बंद होने 48-72 ज11,14,37 के लिए रहता है, ज़ेबराफ़िश के लिए 3 घंटे की समयरेखा की सूचना दी जाती है। संरचनात्मक और आणविक समानताओं के कारण, कॉर्नियल भौतिक घाव से प्रेरित सेलुलर व्यवहार संभवतः अधिकांश कशेरुकियों में समान है। हालांकि, ज़ेब्राफ़िश में तेज प्रतिक्रिया शायद एक उन्नत पुनर्योजी तंत्र द्वारा निर्देशित होती है जो उस जानवर के लिए विशिष्ट है।

वर्णित प्रोटोकॉल घाव बंद करने को ट्रैक करने के लिए SEM का उपयोग करता है। कई अन्य अध्ययनों ने इस प्रक्रिया को15,17,38 ट्रैक करने के बजाय प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया है। हालांकि, SEM का उपयोग उपकला घर्षण के बाद सेल आकार संशोधन के विश्लेषण की सुविधा प्रदान करता है। उस तकनीक का नकारात्मक पक्ष यह है कि स्तरीकरण चरणों को ट्रैक नहीं किया जा सकता है, क्योंकि SEM केवल सबसे बाहरी परत की इमेजिंग की अनुमति देता है। पूर्ण कॉर्नियल उपचार के दौरान 3 डी में उपकला का अध्ययन करने के लिए, फ्लोरोसेंट मॉडल, जैसे कि ज़ेबराबो39, या इम्युनोलेबलिंग का उपयोग किया जाना चाहिए।

कॉर्नियल घाव भरने के मॉडल के रूप में ज़ेब्राफ़िश का उपयोग जांच के दायरे को बढ़ाता है क्योंकि यह उपलब्ध कई आणविक उपकरणों के आवेदन की अनुमति देता है, जैसे कि आनुवंशिक रूप से संशोधित मछली लाइनों, मॉर्फोलिनोस, और रासायनिक स्क्रीनिंग, कॉर्नियल घाव भरने के अध्ययन की संभावित सीमा का काफी विस्तार करने के लिए। इसके अलावा, ज़ेब्राफ़िश आंखों का आकार उपकला सेल गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए नई इमेजिंग रणनीतियों के विकास की अनुमति देता है, जो कि मुरीन आंखों के साथ किया जा सकता है।

इस रिपोर्ट का मुख्य उद्देश्य न केवल ज़ेब्राफ़िश मॉडल के लिए भौतिक कॉर्नियल घाव दृष्टिकोण को अनुकूलित करना है, बल्कि यह भी प्रदर्शित करना है कि नए मॉडल का उपयोग नए प्रश्नों को पूछने और उत्तर देने की अनुमति देता है और मौलिक जैविक घटनाओं की जांच के नए तरीकों को इंगित करता है। ये फायदे अंततः रोगियों के लिए फायदेमंद होंगे।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों ने ज़ेबराफ़िश इकाई तक पहुंच के लिए Pertti Panula और मार्गदर्शन और ज़ेब्राफ़िश प्रयोगों के साथ मदद के लिए हेनरी कोइवुला को धन्यवाद दिया। इस शोध को फिनलैंड की अकादमी, जेन और एटोस एर्को फाउंडेशन, फिनिश सांस्कृतिक फाउंडेशन और एटीआईपी-एवेनिर कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था। इमेजिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इकाई और लाइट माइक्रोस्कोपी यूनिट, जैव प्रौद्योगिकी संस्थान में किया गया था, जो HiLIFE और Biocenter Finland द्वारा समर्थित था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4 in-house Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2 HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2 PO4 ).
0.2M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4 in-house Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2 HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2 PO4 ).
0.5mm burr tips Alger Equipment Company BU-5S
1M Tris, pH 8.8 in-house
adhesive tabs Agar Scientific G3347N
Algerbrush burr, Complete instrument Alger Equipment Company BR2-5
Cotton swaps Heinz Herenz Hamburg 1030128
Dissecting plate in-house
Dissecting tools Fine Science Tools
double-distilled water in-house
Eppedorf tubes, 2ml any provider
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt Sigma A5040 Caution: causes irritation.
Glutaraldehyde, 50% aqueous solution, grade I Sigma G7651 Caution: toxic.
Lidocaine hydrochloride Sigma L5647 Caution: toxic.
mounts Agar Scientific G301P
Petri dish Thermo Scientific 101VR20
pH indicator strips Macherey-Nagel 92110
Plastic spoons any provider
Plastic tubes, 15 ml Greiner Bio-One 188271
Plastic tubes, 50 ml Greiner Bio-One 227261
Scanning electron microscope FEI Quanta 250 FEG
Soft sponge any provider
Sputter coater Quorum Technologies GQ150TS
Stereomicroscope Leica

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References

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जीव विज्ञान अंक 181 कॉर्निया उपकला घर्षण ओकुलर burr घाव बंद करने SEM zebrafish.
Zebrafish कॉर्नियल घाव हीलिंग: घर्षण से घाव बंद इमेजिंग विश्लेषण करने के लिए
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Ikkala, K., Raatikainen, S., Michon, … More

Ikkala, K., Raatikainen, S., Michon, F. Zebrafish Corneal Wound Healing: From Abrasion to Wound Closure Imaging Analysis. J. Vis. Exp. (181), e63605, doi:10.3791/63605 (2022).

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