Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Zebrafisk hornhinde sårheling: Fra slid til sårlukning billeddannelsesanalyse

Published: March 1, 2022 doi: 10.3791/63605
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Institute of Biotechnology, HiLIFE, University of Helsinki, 2Institute for Neurosciences of Montpellier, Univ Montpellier

Summary

Denne protokol fokuserer på at beskadige zebrafiskens okulære overflade gennem slid for at vurdere den efterfølgende sårlukning på celleniveau. Denne tilgang udnytter en okulær burr til delvist at fjerne hornhindeepitelet og bruger scanningselektronmikroskopi til at spore ændringer i cellemorfologi under sårlukning.

Abstract

Som øjets gennemsigtige overflade er hornhinden medvirkende til klart syn. På grund af sin placering er dette væv tilbøjeligt til miljømæssige fornærmelser. Faktisk er de øjenskader, der oftest opstår klinisk, dem til hornhinden. Mens hornhindesårheling er blevet grundigt undersøgt hos små pattedyr (dvs. mus, rotter og kaniner), har hornhindefysiologistudier forsømt andre arter, herunder zebrafisk, på trods af at zebrafisk er en klassisk forskningsmodel.

Denne rapport beskriver en metode til at udføre en hornhinde slid på zebrafisk. Såret udføres in vivo på anæstesiiseret fisk ved hjælp af en okulær burr. Denne metode giver mulighed for et reproducerbart epitelsår, der efterlader resten af øjet intakt. Efter slid overvåges sårlukning i løbet af 3 timer, hvorefter såret reepitheialiseres. Ved hjælp af scanning elektronmikroskopi, efterfulgt af billedbehandling, kan epitelcelleformen og apikale fremspring undersøges for at studere de forskellige trin under hornhindeepitelsårlukning.

Zebrafiskmodellens karakteristika gør det muligt at studere epitelvævets fysiologi og epitelcellernes kollektive opførsel, når vævet udfordres. Desuden kan brugen af en model, der er berøvet tårefilmens indflydelse, give nye svar vedrørende hornhinderespons på stress. Endelig tillader denne model også afgrænsning af de cellulære og molekylære hændelser, der er involveret i ethvert epitelvæv, der udsættes for et fysisk sår. Denne metode kan anvendes til evaluering af lægemiddeleffektivitet i præklinisk testning.

Introduction

Da de fleste epiteler er i kontakt med det ydre miljø, er de tilbøjelige til fysisk skade, hvilket gør dem velegnede til undersøgelse af sårhelingsprocesser. Blandt de velundersøgte væv er hornhinden en yderst nyttig model i undersøgelsen af de cellulære og molekylære aspekter af sårheling. Som en gennemsigtig ydre overflade giver den fysisk beskyttelse til øjet og er det første element, der fokuserer lyset på nethinden. Mens nethindens struktur og cellesammensætning varierer mellem art1, er disse elementer i hornhinden generelt ens i alle kamera-type øjne, uanset art.

Hornhinden består af tre hovedlag2. Det første og yderste lag er epitelet, som konstant fornyes for at sikre dets gennemsigtighed. Det andet lag er stroma, som indeholder spredte celler, kaldet keratocytter, inden for et tykt lag af strengt organiserede kollagenfibre. Det tredje og inderste lag er endotelet, som tillader næringsstof- og væskediffusion fra det forreste kammer til de ydre lag. Epitel- og stromalcellerne interagerer via vækstfaktorer og cytokiner3. Denne interaktion fremhæves af den hurtige apoptose og efterfølgende spredning af keratocytter efter epitelskade 4,5. I tilfælde af et dybere sår, såsom en punktering, tager keratocytter en aktiv rolle i helingsprocessen6.

At være i kontakt med det ydre miljø er hornhinde fysiske skader almindelige. Mange af dem er forårsaget af små fremmedlegemer7, såsom sand eller støv. Refleksen af øjengnidning kan føre til omfattende epitelafskrabninger og hornhinde ombygning8. Ifølge sårstørrelse og dybde er disse fysiske skader smertefulde og tager flere dage at helbrede9. De optimale sårhelingsegenskaber ved en model letter forståelsen af de cellulære og molekylære aspekter af sårlukning. Desuden har sådanne modeller også vist sig nyttige til test af nye molekyler med potentiale til at fremskynde hornhindeheling, som tidligere påvist10,11.

Protokollen beskrevet her har til formål at bruge zebrafisk som en relevant model til at studere hornhinde fysisk skade. Denne model er yderst praktisk til farmakologiske screeningsundersøgelser, da den gør det muligt at tilsætte molekyler direkte til tankvandet og derfor komme i kontakt med en helbredende hornhinde. Detaljerne her vil hjælpe forskere med at udføre deres undersøgelser af zebrafiskmodellen. In vivo-skaden udføres med en sløvet okulær burr. Virkningen på epitelceller, der støder op til eller i en afstand fra den, kan analyseres ved specifikt at fjerne det centrale hornhindeepitel. I de senere år har talrige rapporter fokuseret på en sådan metode på gnaverhornhinde 12,13,14,15,16,17; Indtil videre har kun en enkelt rapport imidlertid anvendt denne metode på zebrafisk18.

På grund af sin enkelhed er det fysiske sår nyttigt til at afgrænse epitelcellernes rolle i sårlukning. En anden veletableret model af hornhindeskade er den kemiske forbrænding, især alkaliforbrændingen 19,20,21. En sådan tilgang beskadiger imidlertid indirekte hele øjenoverfladen, herunder den perifere hornhinde og hornhinde stroma19. Faktisk inducerer alkaliforbrændinger potentielt hornhindesår, perforeringer, epiteloacificering og hurtig neovaskularisering22, og det ukontrollable resultat af alkaliforbrændinger diskvalificerer denne tilgang til generelle sårhelingsundersøgelser. Talrige andre metoder anvendes også til at undersøge hornhindesårheling i henhold til det pågældende undersøgelses særlige fokus (f.eks. Fuldstændig epiteldebridering23, kombinationen af kemisk og mekanisk skade for delvis tykkelse sår24, excimerlaserablation for sår, der strækker sig til stroma25). Brugen af en okulær burr begrænser fokuspunktet til epitelresponset på såret og giver et meget reproducerbart sår.

Som med hver metode til sårpåføring har brugen af en okulær burr fordele og ulemper. Den største ulempe er, at responsen for det meste er epitel, det afspejler ikke perfekt de slid, der ses i den kliniske indstilling. Denne metode har imidlertid mange fordele, herunder den lethed, hvormed den kan oprettes og udføres, dens præcision, dens reproducerbarhed og det faktum, at den er ikke-invasiv, hvilket gør den til en metode, der tolereres godt af dyr.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle forsøg blev godkendt af det nationale dyreforsøgsråd.

1. Præparater

  1. Forbered tricain-stamopløsningen, der anvendes til anæstesi26 på forhånd (0,4% stamopløsning anvendt i denne protokol). Brug handsker og opbevar materialerne i en stinkhætte, når det er muligt.
    1. For 50 ml af en 0,4% opløsning vejes 200 mg tricainpulver i et 50 ml rør. Pulveret opløses i ca. 45 ml dobbeltdestilleret vand.
    2. Juster pH-værdien i trikainstrumopløsningen til 7 med 1 M Tris (pH 8,8, ~1,25 ml). Tilsæt Tris-opløsningen til tricainbestanden i alikvoter, bland bestanden grundigt efter hver alikvote, og kontroller pH-værdien efter hver tilsætning af Tris.
  2. Før eksperimentet skal du forberede en 0,02% arbejdsløsning af tricain.
    1. Optø 2 ml 0,4% stamopløsning og tilsæt til 40 ml systemvand (endelig koncentration 0,02%). Anbring opløsningen i en lille beholder.
  3. Før eksperimentet skal du forberede genopretningsvandet indeholdende smertestillende. Brug handsker og opbevar materialerne i stinkhætte, når det er muligt.
    1. For en liter genvindingsvand vejes 2,5 mg lidokainhydrochloridpulver og opløses i frisk systemvand. Kontroller pH-værdien, og juster om nødvendigt til 7.
  4. Før forsøget fremstilles fikseringsopløsningen (2,5% glutaraldehyd i 0,1 M natriumphosphat (Na-PO4) opløsning ved pH 7,4). Brug handsker og opbevar materialerne i en stinkhætte.
    1. For 10 ml af fastgørelsesopløsningen pipette 5 ml 0,2 M Na-PO4 i et rør. Tilsæt 0,5 ml 50% glutaraldehyd, og tilsæt dobbeltdestilleret vand for at opnå det endelige volumen på 10 ml. Beskyt opløsningen mod lys, og opbevar den på is eller i køleskabet inden brug.
      BEMÆRK: Hvis prøver skal indsamles i flere timer efter såring, skal du forberede fikseringsopløsningen lige før brug.
  5. Forbered udstyret til såring (figur 1).
    1. Fyld genvindingstankene eller mindre beholdere med systemvand.
    2. Hav den oftalmiske burr klar. Kontroller, at gratspidsen er ren. Fjern om nødvendigt celleaffald med en fugtig vatpind.
    3. Lav et snit på siden af en blød svamp, og fugt svampen med systemvand. Placer svampen på bunden/scenen af et dissekerende mikroskop. Sørg for tilstrækkelig arbejdsplads til brug af graten og tilstrækkelig belysning fra siderne og / eller derover til at se øjenoverfladen korrekt.

2. Anæstesi

  1. Overfør en fisk fra tanken til 0,02% tricainopløsningen med et net så forsigtigt som muligt.
  2. Overvåg anæstesien, kontroller for manglende reaktion på let mekanisk stimulus.
    BEMÆRK: For konsekvent anæstesi anvendes en 2 minutters eksponering for tricain før slid med voksne vildtype AB-fisk. Med fisk med anden genetisk baggrund kan der være behov for en anden varighed.

3. Slid

  1. Placer forsigtigt den bedøvelsesfulde fisk med en ske i snittet på svampen, hovedet stikker ud fra svampeoverfladen.
  2. Tænd for burren, og fokuser mikroskopvisningen på øjenoverfladen.
  3. Gå forsigtigt hen til øjenoverfladen med burrspidsen. Når du rører ved øjenoverfladen, skal du begynde at flytte burrspidsen på øjenoverfladen med cirkulær bevægelse. Undgå pludselig bevægelse, da det kan føre til, at øjet vipper i soklen og gratspidsen glider.
  4. Når sliddet er færdigt, skal du forsigtigt placere fisken i systemvand, der indeholder smertestillende middel til genopretning.
  5. Rengør graten lige efter brug med en fugtig vatpind.

4. Indsamling af prøver

  1. På det ønskede tidspunkt skal du samle fisken op med et net og placere den i 0,02% tricainopløsning. Hold dyret i opløsningen, indtil den operkulære bevægelse er ophørt fuldstændigt, og fisken reagerer ikke på berøring.
  2. Læg fisken på en petriskål med en ske, og hold den med en pincet. Halshug fisken med dissekerende saks. Undgå at lave ridser på øjenoverfladen, når du håndterer prøven.
  3. Vævet kom i et prøverør indeholdende 0,1 M Na-PO4.
    1. Skyl vævet ved at erstatte 0,1 M Na-PO4 med ren buffer, så der ikke er blod tilbage i opløsningen.

5. Prøvebehandling til elektronmikroskopi

  1. Fastgør vævet i 2,5% glutaraldehyd/0,1 MNa-PO4 (pH 7,4) i ~24 timer ved +4 °C. Opbevar prøven på en roterende/rystende prøveholder for at sikre korrekt fiksering.
  2. Fjern fikseringsopløsningen, og skyl prøven flere gange med 0,1 M Na-PO4.
  3. Dissekere prøven på dette tidspunkt.
    1. Anbring prøven på en dråbe på 0,1 M Na-PO4 på en dissekeringsplade. Hvis begge øjne fra samme fisk skal afbildes, skæres hovedprøven i to med fin dissekerende saks.
    2. Alternativt kan du kun samle øjnene ved forsigtigt at placere spidserne af fine pincet i øjenhulen fra siden af øjet, og pas ekstra på ikke at ridse øjenoverfladen. Træk derefter øjet ud af stikkontakten.
    3. Overfør den dissekerede prøve til et rør indeholdende 0,1 M Na-PO4. Sørg for, at der ikke er ekstra væv i prøverøret, da det kan klæbe til toppen af øjet under prøvebehandlingen.
  4. Prøven opbevares i 0,1 M Na-PO4 (højst en uge) ved +4 °C.
  5. Behandle prøverne til elektronmikroskopi billeddannelse.
    1. Efterfiksere prøverne i 2 % osmiumtetroxid i 0,1 M Na-PO4-buffer i 1 time ved stuetemperatur (RT).
    2. Prøverne vaskes 3 gange i 5 minutter hver vask i 0,1 M Na-PO4 ved RT.
    3. Dehydrer prøverne successivt i 30%, 50% og 70% ethanol i 1 time i hver opløsning ved RT.
    4. Prøverne nedsænkes i 96% ethanol i 2-3 timer ved RT.
    5. Derefter inkuberes prøverne to gange i 100% ethanol, først i 1 time og derefter i frisk 100% ethanol natten over ved +4 ° C.
    6. Prøverne udsættes for 30 cyklusser i en automatiseret kritisk punkttørrer.
  6. Integrer og platin-coat prøverne.
    1. Anbring en selvklæbende fane på et beslag. Hvis prøven skal mærkes oven på holderen, skal du efterlade et stykke faneblad på fanen og skrive prøve-id'et på papiret.
    2. Placer holderen med tappen på bunden af et dissekerende mikroskop.
    3. Læg forsigtigt vævsprøven på holderen med en fin pincet, hornhinden vender op.
    4. Belæg prøven med platin ved hjælp af den relevante anordning. Efter belægning opbevares prøverne ved stuetemperatur indtil billeddannelse.

6. Billeddannelse (figur 2)

  1. Betjen enhederne som anbefalet i brugervejledningen og af billedbehandlingseksperter.
  2. Hent billeder af den ønskede forstørrelse, og brug 2.000-2.500x billeder til analyse.
  3. Juster lysstyrken og kontrasten, så der ikke er overeksponerede områder i billedet, og cellekanter og mikrohøns ses så tydeligt som muligt.
    BEMÆRK: Vævets position og vinkel påvirker lysstyrken og kontrastindstillingerne. Det kan være nødvendigt at justere dem fra prøve til prøve og mellem forskellige områder af vævet.

7. Måling af celleform, størrelse og mikroridge mønster

  1. Åbn TIFF-billedet i Fiji ImageJ 1.5327. Indstil skalaen ved hjælp af billedets skalalinje: Opret en linje, der er lige så stor som skalalinjen med linjeværktøjet . Vælg Analysér | Indstil skala, og indtast den kendte afstand. Åbn ROI-manageren fra | Menuen Værktøjer .
  2. For cellestørrelse og rundhed skal du vælge Analysér | Indstil målinger | Form deskriptorer. Brug værktøjet Forstørrelsesglas til at se cellerne under forstørrelse. Markér celler med Polygon-værktøjet , og føj hver markering til ROI-manageren. Til sidst skal du måle de valgte celler og gemme målingen.
  3. Microridge analyse (figur 3 og figur 4)
    1. Sørg for, at billedet er i 8-bit format fra | Skriv menuen.
    2. Vælg en celle med Polygon-værktøjet , og ryd baggrunden fra Rediger | Ryd udenfor.
    3. Udjævn billedet en til tre gange ved at vælge Proces | Glat, og juster lysstyrken og kontrasten fra | Juster | Lysstyrke/kontrast , så mikrohønsene skiller sig ud så tydeligt som muligt.
    4. Indvikle billedet fra Process | Filtre | Convolve, blive til binær fra Process | Binær | Gør binært, og skeletter det sort-hvide billede ved at vælge Proces | Binær | Skelet.
    5. Brug funktionen Analysér skelet i | Skeletmenu til måling af mikroridgeparametrene og gemme værdierne.
      BEMÆRK: I SEM kan individuelle billeder variere i lysstyrke og kontrast. Trinnene i analysen kan således have brug for justeringer fra billede til billede.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne undersøgelse beskriver en metode ved hjælp af en oftalmisk burr i zebrafisk hornhinde sårheling eksperimenter. Metoden er modificeret fra tidligere studier på mus, hvor graten viste sig at fjerne epitelcellelagene effektivt13. Udfordringerne ved zebrafisk hornhindesår omfatter øjets relativt lille størrelse og i tilfælde af tidskrævende eksperimenter behovet for at opretholde en konstant vandstrøm gennem gællerne (som beskrevet af Xu og kolleger28). De vigtigste fordele ved denne metode er dens enkelhed og hastighed. Et standard dissekeringsmikroskop anvendes til kontrolleret brug af graten (figur 1). Da proceduren er af kort varighed (ca. 3 minutter fra anæstesiens start), kommer fisken sig godt efter håndteringen, og der er ikke behov for ekstra udstyr til vedligeholdelse af anæstesi og ilttilførsel.

Der er flere måder at visualisere hornhindesåret på. Denne protokol bruger scanningselektronmikroskopi (SEM, figur 2), som har en lang historie med brug i hornhindeundersøgelser29,30. Selvom denne tilgang ikke tillader en vurdering af epitelets nedre lag, giver den en nem metode til at estimere sårhelingshastigheden og sammenligne hornhindeoverfladerne i forskellige områder af øjet. Ved 3 timer efter såret, mens sårområdet er lukket (figur 2), forbliver det sted, hvor sårgrænserne er forbundet, synligt (figur 2).

De overfladiske celler på zebrafiskens hornhinde indeholder udtalte mikrokoge31. For nylig rapporterede en undersøgelse, at disse strukturer gik tabt i aflange celler, der støder op til sår på zebrafiskens hud32. De præsenterede resultater viser imidlertid, at der på slibet hornhindeepitel kan observeres mikroridges i nogle aflange celler ved siden af sårstedet (figur 4B). I nogle perifere områder går mikroridges tabt fra midten af cellen (figur 4C,D). For en mere detaljeret analyse kvantificeres apikalt celleareal og rundhed ud over mikroridgemængde og gennemsnitlig længde i ImageJ27 (figur 3 og figur 4E-H).

Mikroridge-analysen udføres ved hjælp af skeleton-funktionen (modificeret fra van Loon og kolleger33). En sammenligning mellem de to perifere regioner (figur 4A (region C og D), figur 4C og figur 4D) afslører, at cellerne i figur 4D er mere aflange (hvilket indikerer celleomlejringer som en reaktion på såring) og har kortere gennemsnitlige mikrokoger end celler i figur 4C. Dette resultat tyder på, at ændringen i celleform korrelerer med mikroridge-modifikationen og understreger heterogeniteten i hornhindeepitelet i sårrespons.

Måling af det apikale celleområde og rundhed på SEM-billeder er en enkel og reproducerbar måde at opnå kvantitative data om celleudseende i forskellige områder af hornhinden. Selvom det er begrænset til 2D, hjælper denne tilgang med at opnå en samlet forståelse af dynamikken og hastigheden af celleomlejringer under sårlukning. SEM-billederne bruges til at analysere mikroridge-mønstrene på den apikale celleoverflade. Billedbehandlingen, der er beskrevet her, giver en tilnærmelse af ændringerne i mikroridgeparametrene, hvilket ville være kedeligt at måle manuelt.

Figure 1
Figur 1: Opsætningen til hornhindeafskrabning. (A) Et dissekeringsmikroskop er nødvendigt for den kontrollerede slid på det lille zebrafiskeøje. (B) Svampen hjælper med at stabilisere den bedøvende fisk under proceduren. (C) Fisken anæstesis på en petriskål, og det anæstetiserede dyr overføres til svampen med en lille ske. En okulær burr med en 0,5 mm spids bruges til at nedbryde hornhinden. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Visualisering af den sårede hornhinde med scanningselektronmikroskopi. Oversigten over den slibede hornhinde indsamlet ved 0, 1, 2 eller 3 timer efter såret (HPW). Den stiplede kontur angiver sårgrænsen. Skalabjælker = 500 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Et eksempel på billedmodifikationen forud for mikroridge-måling. Selvom det ikke er en nøjagtig kopi af den oprindelige celleoverflade, fanger det endelige skeleterede mønster forskellene mellem cellecentret og periferien. Skalabjælke = 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: En sammenligning af apikalt celleareal, rundhed og mikroridge værdier mellem to perifere regioner efter hornhinde slid. (A) En oversigt over det sårede øje. Felterne angiver placeringen af de højere forstørrelsesbilleder (i B, C og D). (C, D) Celler, der er valgt til formbeskrivelsesanalyse, er markeret med en grøn kontur. (E, F) Apikale celleområde (E) og rundhed (F) værdier af udvalgte celler. (G, H) Microridge total længde (G) og gennemsnitlig længde (H) af de samme celler. Grupper blev statistisk sammenlignet med en to-halet t-test (*p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01) Skalastænger = 500 μm i A, 50 μm i B, C og D. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hornhinde fysiske skader er den mest almindelige årsag til oftalmologi patientbesøg på hospitalet. Derfor er det vigtigt at etablere relevante modeller til undersøgelse af forskellige aspekter af hornhindepatofysiologi. Indtil videre er musen den mest anvendte model til undersøgelse af hornhindesårheling. Det kan dog være svært at tilføje øjendråber på murine sårede øjne for at validere virkningen af specifikke lægemidler på hornhindesårheling. I den forbindelse er zebrafiskemodellen særlig nyttig til farmakologisk screening af molekyler, der påvirker hornhindesårheling. Metoden beskrevet her ligner meget den, der er beskrevet for mus13.

To specifikke forskelle skal dog tages i betragtning. For det første kræver brugen af en oftalmisk burr praksis for at sikre sårreproducerbarhed, især med hensyn til det tryk, der udøves på øjet, hvilket er afgørende for korrekt slid. Derudover bør slibespidsen ændres, når epitelet ikke længere fjernes effektivt. For det andet, mens zebrafiskens hornhindes struktur og morfologi ligner andre hornhinden31, besidder dette dyr regenerative kapaciteter, der er uden sidestykke i pattedyrsorganismer 34,35,36. Mens sårlukning i mus varer i 48-72 timer 11,14,37, rapporteres en tidslinje på 3 timer for zebrafisk. På grund af strukturelle og molekylære ligheder er den cellulære adfærd induceret af et hornhinde fysisk sår sandsynligvis ens hos de fleste hvirveldyr. Imidlertid er den hurtige reaktion i zebrafisk sandsynligvis styret af en avanceret regenerativ mekanisme, der er specifik for det pågældende dyr.

Den beskrevne protokol bruger SEM til at spore sårlukning. Talrige andre undersøgelser har brugt fluorescensmikroskopi i stedet for at spore denne proces 15,17,38. Anvendelsen af SEM letter imidlertid analysen af celleformmodifikation efter epitelslibning. Ulempen ved denne teknologi er, at stratificeringstrinnene ikke kan spores, da SEM kun tillader billeddannelse af det mest eksterne lag. For at studere epitelet i 3D under fuld hornhindeheling bør fluorescerende modeller, såsom Zebrabow39 eller immunolabeling anvendes.

Anvendelsen af zebrafisk som en hornhindesårhelingsmodel forbedrer undersøgelsesomfanget, da det gør det muligt at anvende adskillige molekylære værktøjer til rådighed, såsom genetisk modificerede fiskelinjer, morpholinos og kemisk screening, for betydeligt at udvide det mulige udvalg af hornhindesårhelingsundersøgelser. Desuden giver zebrafiskens øjnes størrelse mulighed for at udvikle nye billeddannelsesstrategier til at studere epitelcelledynamikken mere detaljeret, end man kan gøre med murine øjne.

Hovedformålet med denne rapport er ikke kun at tilpasse den fysiske hornhindesårstilgang til zebrafiskemodellen, men også at vise, at brugen af nye modeller gør det muligt at stille og besvare nye spørgsmål og pege på nye måder at undersøge grundlæggende biologiske fænomener på. Disse fordele vil i sidste ende være til gavn for patienterne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne takker Pertti Panula for adgangen til Zebrafish-enheden og Henri Koivula for vejledning og hjælp til zebrafiskforsøgene. Denne forskning blev støttet af Finlands Akademi, Jane og Aatos Erkko Foundation, den finske kulturfond og ATIP-Avenir-programmet. Billeddannelse blev udført på Electron Microscopy Unit og Light Microscopy Unit, Institute of Biotechnology, støttet af HiLIFE og Biocenter Finland.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4 in-house Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2 HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2 PO4 ).
0.2M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4 in-house Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2 HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2 PO4 ).
0.5mm burr tips Alger Equipment Company BU-5S
1M Tris, pH 8.8 in-house
adhesive tabs Agar Scientific G3347N
Algerbrush burr, Complete instrument Alger Equipment Company BR2-5
Cotton swaps Heinz Herenz Hamburg 1030128
Dissecting plate in-house
Dissecting tools Fine Science Tools
double-distilled water in-house
Eppedorf tubes, 2ml any provider
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt Sigma A5040 Caution: causes irritation.
Glutaraldehyde, 50% aqueous solution, grade I Sigma G7651 Caution: toxic.
Lidocaine hydrochloride Sigma L5647 Caution: toxic.
mounts Agar Scientific G301P
Petri dish Thermo Scientific 101VR20
pH indicator strips Macherey-Nagel 92110
Plastic spoons any provider
Plastic tubes, 15 ml Greiner Bio-One 188271
Plastic tubes, 50 ml Greiner Bio-One 227261
Scanning electron microscope FEI Quanta 250 FEG
Soft sponge any provider
Sputter coater Quorum Technologies GQ150TS
Stereomicroscope Leica

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baden, T., Euler, T., Berens, P. Understanding the retinal basis of vision across species. Nature Reviews.Neuroscience. 21 (1), 5-20 (2020).
  2. Nishida, T., Saika, S., Morishige, N. Cornea and sclera: Anatomy and physiology. Cornea: Fundamentals, diagnosis and management, 4th ed. Manis, M. J., Holland, E. J. , Elsevier. 1-22 (2017).
  3. Wilson, S. E., Liu, J. J., Mohan, R. R. Stromal-epithelial interactions in the cornea. Progress in Retinal and Eye Research. 18 (3), 293-309 (1999).
  4. Wilson, S. E., et al. Epithelial injury induces keratocyte apoptosis: hypothesized role for the interleukin-1 system in the modulation of corneal tissue organization and wound healing. Experimental Eye Research. 62 (4), 325-327 (1996).
  5. Zieske, J. D., Guimaraes, S. R., Hutcheon, A. E. Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement. Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).
  6. West-Mays, J. A., Dwivedi, D. J. The keratocyte: corneal stromal cell with variable repair phenotypes. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 38 (10), 1625-1631 (2006).
  7. Ahmed, F., House, R. J., Feldman, B. H. Corneal abrasions and corneal foreign bodies. Primary Care. 42 (3), 363-375 (2015).
  8. Ben-Eli, H., Erdinest, N., Solomon, A. Pathogenesis and complications of chronic eye rubbing in ocular allergy. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 19 (5), 526-534 (2019).
  9. Wilson, S. A., Last, A. Management of corneal abrasions. American Family Physician. 70 (1), 123-128 (2004).
  10. Nagata, M., et al. JBP485 promotes corneal epithelial wound healing. Scientific Reports. 5, 14776 (2015).
  11. Wang, X., et al. MANF promotes diabetic corneal epithelial wound healing and nerve regeneration by attenuating hyperglycemia-induced endoplasmic reticulum stress. Diabetes. 69 (6), 1264-1278 (2020).
  12. Li, F. J., et al. Evaluation of the AlgerBrush II rotating burr as a tool for inducing ocular surface failure in the New Zealand White rabbit. Experimental Eye Research. 147, 1-11 (2016).
  13. Kalha, S., Kuony, A., Michon, F. Corneal epithelial abrasion with ocular burr as a model for cornea wound healing. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (137), e58071 (2018).
  14. Kalha, S., et al. Bmi1+ progenitor cell dynamics in murine cornea during homeostasis and wound healing. Stem Cells. 36 (4), 562-573 (2018).
  15. Park, M., et al. Visualizing the contribution of keratin-14(+) limbal epithelial precursors in corneal wound healing. Stem Cell Reports. 12 (1), 14-28 (2019).
  16. Kuony, A., et al. Ectodysplasin-A signaling is a key integrator in the lacrimal gland-cornea feedback loop. Development. 146 (14), (2019).
  17. Farrelly, O., et al. Two-photon live imaging of single corneal stem cells reveals compartmentalized organization of the limbal niche. Cell Stem Cell. 28 (7), 1233-1247 (2021).
  18. Ikkala, K., Michon, F., Stratoulias, V. Unilateral Zebrafish corneal injury induces bilateral cell plasticity supporting wound closure. Scientific Reports. , (2021).
  19. Ormerod, L. D., Abelson, M. B., Kenyon, K. R. Standard models of corneal injury using alkali-immersed filter discs. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (10), 2148-2153 (1989).
  20. Anderson, C., Zhou, Q., Wang, S. An alkali-burn injury model of corneal neovascularization in the mouse. Journal of visualized experiments: JoVE. (86), e51159 (2014).
  21. Choi, H., et al. Comprehensive modeling of corneal alkali injury in the rat eye. Current Eye Research. 42 (10), 1348-1357 (2017).
  22. Singh, P., Tyagi, M., Kumar, Y., Gupta, K. K., Sharma, P. D. Ocular chemical injuries and their management. Oman Journal of Ophthalmology. 6 (2), 83-86 (2013).
  23. Pal-Ghosh, S. BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds. Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).
  24. Chen, J. J., Tseng, S. C. Abnormal corneal epithelial wound healing in partial-thickness removal of limbal epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (8), 2219-2233 (1991).
  25. Xeroudaki, M., Peebo, B., Germundsson, J., Fagerholm, P., Lagali, N. RGTA in corneal wound healing after transepithelial laser ablation in a rabbit model: a randomized, blinded, placebo-controlled study. Acta Ophthalmologica. 94 (7), 685-691 (2016).
  26. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio. , Available from: https://zfinorg/zf_info/zfbook/zfbk.html (2000).
  27. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  28. Xu, C., Volkery, S., Siekmann, A. F. Intubation-based anesthesia for long-term time-lapse imaging of adult zebrafish. Nature Protocols. 10 (12), 2064-2073 (2015).
  29. Crosson, C. E., Klyce, S. D., Beuerman, R. W. Epithelial wound closure in the rabbit cornea. A biphasic process. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 27 (4), 464-473 (1986).
  30. Parlanti, P., et al. Axonal debris accumulates in corneal epithelial cells after intraepithelial corneal nerves are damaged: A focused Ion Beam Scanning Electron Microscopy (FIB-SEM) study. Experimental Eye Research. 194, 107998 (2020).
  31. Zhao, X. C., et al. The zebrafish cornea: structure and development. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (10), 4341-4348 (2006).
  32. Richardson, R., et al. Re-epithelialization of cutaneous wounds in adult zebrafish combines mechanisms of wound closure in embryonic and adult mammals. Development. 143 (12), 2077-2088 (2016).
  33. van Loon, A. P., Erofeev, I. S., Maryshev, I. V., Goryachev, A. B., Sagasti, A. Cortical contraction drives the 3D patterning of epithelial cell surfaces. The Journal of Cell Biology. 219 (3), (2020).
  34. Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina. Journal of Neurobiology. 44 (3), 289-307 (2000).
  35. Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).
  36. Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish. The Journal of Comparative Neurology. 377 (4), 577-595 (1997).
  37. Hu, X., et al. Sirt6 deficiency impairs corneal epithelial wound healing. Aging. 10 (8), 1932-1946 (2018).
  38. Ksander, B. R., et al. ABCB5 is a limbal stem cell gene required for corneal development and repair. Nature. 511 (7509), 353-357 (2014).
  39. Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140 (13), 2835-2846 (2013).

Tags

Biologi udgave 181 hornhinde epitel slid okulær burr sårlukning SEM zebrafisk.
Zebrafisk hornhinde sårheling: Fra slid til sårlukning billeddannelsesanalyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ikkala, K., Raatikainen, S., Michon, … More

Ikkala, K., Raatikainen, S., Michon, F. Zebrafish Corneal Wound Healing: From Abrasion to Wound Closure Imaging Analysis. J. Vis. Exp. (181), e63605, doi:10.3791/63605 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter