Summary
이 프로토콜은 세포 수준에서 후속 상처 폐쇄를 평가하기 위해 마모를 통해 제브라 피쉬의 안구 표면을 손상시키는 데 중점을 둡니다. 이 접근법은 안구 버를 이용하여 각막 상피를 부분적으로 제거하고 주사 전자 현미경을 사용하여 상처 폐쇄 중 세포 형태의 변화를 추적합니다.
Abstract
눈의 투명한 표면으로서 각막은 맑은 시력을 위해 도움이됩니다. 그것의 위치 때문에,이 조직은 환경 모욕을 받기 쉽습니다. 사실, 임상적으로 가장 자주 발생하는 눈 부상은 각막에 대한 부상입니다. 각막 상처 치유는 작은 포유류 (즉, 생쥐, 쥐 및 토끼)에서 광범위하게 연구되었지만 각막 생리학 연구는 제브라 피쉬가 고전적인 연구 모델임에도 불구하고 제브라 피쉬를 포함한 다른 종을 무시했습니다.
이 보고서는 제브라 피쉬에서 각막 찰과상을 수행하는 방법을 설명합니다. 상처는 안구 버를 사용하여 마취 된 물고기에서 생체 내에서 수행됩니다. 이 방법은 재현 가능한 상피 상처를 허용하여 나머지 눈을 그대로 유지합니다. 찰과상 후, 상처 폐쇄는 3 시간 동안 모니터링되고, 그 후에 상처는 재상피화됩니다. 주사 전자 현미경을 사용하여, 화상 처리, 상피 세포 형상, 및 정점 돌출부를 조사하여 각막 상피 상처 폐쇄 동안 다양한 단계를 연구할 수 있다.
제브라 피쉬 모델의 특성은 조직이 도전받을 때 상피 조직 생리학 및 상피 세포의 집단 행동에 대한 연구를 허용합니다. 또한, 눈물막의 영향을 박탈당한 모델을 사용하면 스트레스에 대한 각막 반응에 관한 새로운 해답을 얻을 수 있습니다. 마지막으로, 이 모델은 또한 물리적 상처를 입은 임의의 상피 조직에 관여하는 세포 및 분자 사건의 묘사를 허용한다. 이 방법은 전임상 시험에서 약물 효과의 평가에 적용될 수 있다.
Introduction
대부분의 상피는 외부 환경과 접촉하기 때문에 신체적 상해가 발생하기 쉽기 때문에 상처 치유 과정 연구에 매우 적합합니다. 잘 연구 된 조직 중에서 각막은 상처 치유의 세포 및 분자 측면을 조사하는 데 매우 유용한 모델입니다. 투명한 외부 표면으로서, 그것은 눈에 물리적 보호를 제공하고 망막에 빛을 집중시키는 첫 번째 요소입니다. 망막의 구조와 세포 구성은 종1에 따라 다르지만, 각막의 이러한 요소는 종에 관계없이 모든 카메라 형 눈에서 일반적으로 유사합니다.
각막은 세 개의 주요 층2로 구성되어 있습니다. 첫 번째와 가장 바깥 쪽 층은 상피이며, 상피는 투명성을 보장하기 위해 끊임없이 갱신됩니다. 두 번째 층은 엄격하게 조직 된 콜라겐 섬유의 두꺼운 층 내에 각질 세포라고 불리는 흩어져있는 세포를 포함하는 스트로마입니다. 세 번째이자 가장 안쪽에있는 층은 내피이며, 이는 영양소와 액체가 전방 챔버에서 바깥 층으로 확산 될 수있게합니다. 상피 및 기질 세포는 성장 인자 및 사이토카인을 통해 상호작용한다3. 이러한 상호작용은 상피 손상 후 각질세포의 신속한 아폽토시스 및 후속 증식에 의해 강조된다4,5. 펑크와 같은 더 깊은 상처의 경우, 각질세포는 치유 과정6에서 적극적으로 참여합니다.
외부 환경과 접촉하기 때문에 각막의 신체적 부상이 흔합니다. 이들 중 다수는 모래나 먼지와 같은 작은 이물질(7)에 의해 발생한다. 눈 마찰의 반사는 광범위한 상피 찰과상과 각막 리모델링으로 이어질 수 있습니다8. 상처의 크기와 깊이에 따르면, 이러한 신체적 상해는 고통스럽고 치유하는 데 며칠이 걸립니다9. 모델의 최적 상처 치유 특성은 상처 폐쇄의 세포 및 분자 측면에 대한 이해를 촉진한다. 또한, 이러한 모델은 이전에 입증 된 바와 같이 각막 치유를 가속화 할 수있는 잠재력을 가진 새로운 분자를 테스트하는 데 유용하다는 것이 입증되었습니다10,11.
여기에 설명 된 프로토콜은 각막 신체 손상을 연구하기위한 관련 모델로 제브라 피쉬를 사용하는 것을 목표로합니다. 이 모델은 분자를 탱크 물에 직접 첨가 할 수 있으므로 치유 각막과 접촉 할 수 있으므로 약리학 적 스크리닝 연구에 매우 편리합니다. 여기에 제공된 세부 사항은 과학자들이 제브라 피쉬 모델에 대한 연구를 수행하는 데 도움이 될 것입니다. 생체내 손상은 둔화된 안구 버로 수행된다. 인접한 상피 세포에 대한 영향 또는 그것으로부터 멀리 떨어진 곳에서 중앙 각막 상피를 특이적으로 제거함으로써 분석될 수 있다. 최근 몇 년 동안, 설치류 각막 12,13,14,15,16,17에 대한 그러한 방법에 초점을 맞춘 수많은 보고서; 그러나 현재까지 단 하나의 보고서 만이 제브라 피쉬18에이 방법을 적용했습니다.
그것의 단순성 때문에, 육체적 상처는 상처 폐쇄에서 상피 세포의 역할을 묘사하는데 유용하다. 각막 손상의 또 다른 잘 정립 된 모델은 화학 화상, 특히 알칼리 화상 19,20,21입니다. 그러나, 이러한 접근법은 말초 각막 및 각막 스트로마(19)를 포함하는 전체 눈 표면을 간접적으로 손상시킨다. 실제로, 알칼리 화상은 잠재적으로 각막 궤양, 천공, 상피 혼탁 및 신속한 신생혈관화22를 유도하며, 알칼리 화상의 통제 할 수없는 결과는 일반적인 상처 치유 연구를위한 접근 방식을 실격시킵니다. 문제의 연구의 특정 초점에 따라 각막 상처 치유를 조사하기 위해 수많은 다른 방법들이 또한 사용된다(예를 들어, 완전한 상피 탈지23, 부분-두께 상처(24)에 대한 화학적 및 기계적 손상의 조합, 스트로마(25)로 연장되는 상처에 대한 엑시머 레이저 절제). 안구 버의 사용은 상처에 대한 상피 반응에 초점을 제한하고 재현성이 높은 상처를 제공합니다.
상처 가해의 각 방법과 마찬가지로, 안구 버의 사용은 장단점이 있습니다. 가장 큰 단점은 반응이 대부분 상피적이며, 임상 환경에서 볼 수있는 찰과상을 완벽하게 반영하지 못한다는 것입니다. 그러나이 방법은 설정 및 수행 할 수있는 용이성, 정밀도, 재현성 및 비 침습적이라는 사실을 포함하여 많은 장점을 가지고 있으므로 동물이 잘 견딜 수있는 방법입니다.
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Protocol
모든 실험은 국가 동물 실험위원회에 의해 승인되었다.
1. 준비
- 마취26 에 사용되는 트리카인 원액을 미리 준비하십시오 (이 프로토콜에 사용 된 0.4 % 원액). 가능한 한 장갑을 착용하고 재료를 흄 후드에 보관하십시오.
- 0.4% 용액 50 mL의 경우, 트리카인 분말 200 mg을 50 mL 튜브에 넣었다. 분말을 약 45 mL의 이중 증류수에 녹인다.
- 트리카인 원액의 pH를 1 M 트리스(pH 8.8, ∼1.25 mL)로 7로 조정하였다. 분취량의 트리카인 스톡에 트리스 용액을 첨가하고, 각 분취량 후에 스톡을 완전히 혼합하고, 트리스를 첨가 할 때마다 pH를 확인하십시오.
- 실험 전에 트리카인의 0.02 % 작업 용액을 준비하십시오.
- 0.4% 원액 2 mL를 해동하고 시스템 물 40 mL(최종 농도 0.02%)를 첨가한다. 용액을 작은 용기에 넣으십시오.
- 실험 전에, 진통제를 함유하는 회수수를 준비한다. 가능한 경우 장갑을 착용하고 재료를 흄 후드에 보관하십시오.
- 회수 물 한 리터의 경우, 리도카인 염산염 분말 2.5mg의 무게를 측정하여 신선한 시스템 물에 녹입니다. pH를 확인하고 필요한 경우 7로 조정하십시오.
- 실험 전에, 고정 용액(pH 7.4에서 0.1 M 인산나트륨(Na-PO4) 용액 중의 2.5% 글루타르알데히드)을 준비하였다. 장갑을 착용하고 재료를 흄 후드에 보관하십시오.
- 고정 용액 10 mL에 대해, 5 mL의 0.2 M Na-PO4를 튜브에 피펫팅하였다. 50% 글루타르알데히드 0.5 mL를 첨가하고, 이중 증류수를 첨가하여 최종 부피 10 mL를 얻었다. 용액은 빛으로부터 보호하고 사용하기 전에 얼음이나 냉장고에 보관하십시오.
참고: 상처 입은 후 몇 시간 동안 샘플을 수집해야 하는 경우 사용 직전에 고정 용액을 준비하십시오.
- 고정 용액 10 mL에 대해, 5 mL의 0.2 M Na-PO4를 튜브에 피펫팅하였다. 50% 글루타르알데히드 0.5 mL를 첨가하고, 이중 증류수를 첨가하여 최종 부피 10 mL를 얻었다. 용액은 빛으로부터 보호하고 사용하기 전에 얼음이나 냉장고에 보관하십시오.
- 상처 입을 장비를 준비합니다(그림 1).
- 회수 탱크 또는 더 작은 용기에 시스템 물을 채 웁니다.
- 안과 버를 준비하십시오. 버 팁이 깨끗한지 확인하십시오. 필요한 경우 촉촉한 면봉으로 세포 파편을 제거하십시오.
- 부드러운 스폰지의 측면을 절개하고 스폰지를 시스템 물로 적셔주십시오. 스폰지를 해부 현미경의 바닥 / 무대에 놓습니다. 버 사용을위한 충분한 작업 공간과 눈 표면을 제대로 볼 수 있도록 측면 및 / 또는 위의 충분한 조명을 확보하십시오.
2. 마취
- 가능한 한 부드럽게 그물을 가진 0.02 % 트리카인 용액으로 탱크에서 물고기를 옮기십시오.
- 마취를 모니터하고 가벼운 기계적 자극에 대한 반응이 부족한지 확인합니다.
참고 : 일관된 마취를 위해, 트리카인에 2 분 노출은 성인 야생형 AB 물고기로 마모되기 전에 사용됩니다. 다른 유전 적 배경을 가진 물고기의 경우, 다른 기간이 필요할 수 있습니다.
3. 마모
- 스폰지 표면에서 튀어 나온 머리, 스폰지의 절개에 숟가락으로 마취 된 생선을 부드럽게 놓습니다.
- 버를 켜고 현미경 뷰를 눈 표면에 집중시킵니다.
- 버 팁으로 눈 표면에 조심스럽게 접근하십시오. 눈 표면을 만질 때 눈 표면의 버 팁을 원형 동작으로 움직이기 시작하십시오. 갑작스런 움직임은 소켓에서 눈이 기울어지고 버 팁이 미끄러 질 수 있으므로 피하십시오.
- 찰과상이 끝나면 회복을 위해 진통제가 들어있는 시스템 물에 물고기를 조심스럽게 넣으십시오.
- 촉촉한 면봉으로 사용한 직후에 버를 청소하십시오.
4. 샘플 수집
- 원하는 시점에서 그물로 물고기를 집어 들고 0.02 % 트리카인 용액에 넣으십시오. 난관 운동이 완전히 멈추고 물고기가 만지는 것에 반응하지 않을 때까지 동물을 용액에 보관하십시오.
- 숟가락으로 페트리 접시에 물고기를 놓고 핀셋으로 잡으십시오. 해부하는 가위로 물고기를 감금하십시오. 샘플을 취급 할 때 눈 표면에 긁힌 자국을 피하십시오.
- 조직을 0.1 M Na-PO4를 함유하는 샘플 튜브에 넣는다.
- 0.1 M Na-PO4를 깨끗한 완충액으로 교체하여 용액을 혈액이 남지 않도록 조직을 헹구십시오.
5. 전자 현미경을 위한 표본 가공
- 조직을 +4°C에서 ~24시간 동안 2.5% 글루타르알데히드/0.1 M Na-PO4 (pH 7.4)에 고정시킨다. 적절한 고정을 위해 샘플을 회전/흔들기 샘플 홀더에 보관하십시오.
- 고정 용액을 제거하고 0.1 M Na-PO4로 샘플을 여러 번 헹구십시오.
- 이 시점에서 샘플을 해부합니다.
- 샘플을 해부 플레이트 상에 0.1 M Na-PO4의 방울 상에 놓는다. 같은 물고기의 두 눈을 모두 이미지화해야하는 경우 미세 해부 가위로 머리 샘플을 두 개로 자릅니다.
- 또는 미세한 핀셋의 끝을 눈의 측면에서 눈 소켓에 조심스럽게 배치하여 눈 표면을 긁지 않도록 특별한주의를 기울여 눈을 모으십시오. 그런 다음 소켓에서 눈을 뽑습니다.
- 해부된 샘플을 0.1 M Na-PO4를 함유하는 튜브로 옮긴다. 샘플 처리 중에 눈 꼭대기에 부착 될 수 있으므로 샘플 튜브에 여분의 조직이 없는지 확인하십시오.
- 샘플을 +4°C에서 0.1 MNa-PO4 (최대 1주일)에 보관한다.
- 전자 현미경 이미징을 위해 샘플을 처리합니다.
- 샘플을 실온에서 1 h 동안 0.1 M Na-PO4 완충액 중의 2% 오스뮴 테트록사이드에 고정시킨다 (RT).
- 샘플을 RT에서 0.1 M Na-PO4로 각각 세척하여 5분 동안 3회 세척한다.
- 샘플을 RT에서 각 용액에서 1시간 동안 30%, 50% 및 70% 에탄올에서 연속적으로 탈수시킨다.
- 샘플을 RT에서 2-3시간 동안 96% 에탄올에 담그었다.
- 다음으로, 샘플을 100% 에탄올에서 두 번 인큐베이션하고, 먼저 1시간 동안 이어서 +4°C에서 하룻밤 동안 신선한 100% 에탄올 중에서 인큐베이션한다.
- 샘플을 자동화된 임계점 건조기에서 30 사이클까지 실시합니다.
- 샘플을 임베드하고 백금-코팅한다.
- 접착제 탭을 마운트에 놓습니다. 샘플이 마운트 상단에 표시되어야 하는 경우 탭 덮개 용지 조각을 탭에 두고 용지에 샘플 ID를 씁니다.
- 탭이있는 마운트를 해부 현미경의 바닥에 놓습니다.
- 미세한 핀셋으로 조직 샘플을 마운트에 부드럽게 올려 놓고 각막이 위를 향하게하십시오.
- 적절한 장치를 사용하여 시편을 백금으로 코팅하십시오. 코팅 후, 이미징될 때까지 샘플을 실온에서 저장한다.
6. 이미징(그림 2)
- 사용자 설명서 및 이미징 전문가의 조언에 따라 장치를 작동하십시오.
- 원하는 배율의 이미지를 획득하고 분석을 위해 2,000-2,500x 이미지를 사용합니다.
- 이미지에 과다 노출 영역이 없도록 밝기와 대비를 조정하고 셀 테두리와 마이크로리지가 가능한 한 명확하게 표시되도록 합니다.
참고: 조직의 위치와 각도는 밝기 및 대비 설정에 영향을 줍니다. 그들은 샘플에서 샘플로, 그리고 조직의 다른 영역 사이에서 조정해야 할 수도 있습니다.
7. 세포 모양, 크기 및 마이크로리지 패턴 측정
- 피지 이미지J 1.5327에서 TIFF 이미지를 엽니다. 이미지의 배율 표시줄을 사용하여 배율을 설정합니다. [선] 도구를 사용하여 배율 표시줄과 크기가 같은 선을 만듭니다. | 분석 선택 배율을 설정하고 알려진 거리를 입력합니다. 분석 |에서 ROI 관리자를 엽니다 . 도구 메뉴.
- 셀 크기와 원형의 경우 | 분석을 선택합니다. 측정 | 설정 셰이프 설명자입니다. 돋보기 도구를 사용하여 배율 아래 세포를 볼 수 있습니다. Polygon 도구를 사용하여 셀을 선택하고 각 선택 항목을 ROI 관리자에 추가합니다. 마지막으로, 선택된 세포를 측정하고, 측정을 저장한다.
- 마이크로리지 분석(그림 3 및 그림 4)
- 이미지가 Image |에서 8비트 형식인지 확인 메뉴를 입력합니다 .
- 다각형 도구로 셀을 선택하고 편집 |에서 배경을 지웁니다. 바깥 쪽이 맑아집니다.
- [프로세스]를 선택하여 이미지를 한 세 번 매끄럽게 | 부드럽게, 그리고 이미지 |에서 밝기와 대비를 조정 | 조정 밝기 / 대비로 마이크로 리지가 가능한 한 명확하게 눈에 띄도록하십시오.
- 프로세스 |에서 이미지 컨볼브 필터 | Convolve, 프로세스 |에서 바이너리로 변환 이진 | 바이너리를 만들고 프로세스 |을 선택하여 흑백 이미지를 골격화합니다 . 이진 | 골격화.
- 분석 |에서 뼈대 분석 기능 사용 스켈레톤 메뉴는 마이크로리지 파라미터를 측정하고 값을 저장합니다.
참고: SEM에서 개별 이미지는 밝기와 대비가 다를 수 있습니다. 따라서, 분석의 단계들은 이미지에서 이미지로의 조정이 필요할 수 있다.
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Representative Results
본 연구는 제브라피쉬 각막 상처 치유 실험에서 안과 버를 사용하는 방법을 설명한다. 이 방법은 마우스에 대한 이전의 연구로부터 변형되었으며, 여기서 버는 상피 세포층을 효율적으로 제거하는 것으로 나타났다13. 제브라피쉬 각막 상처의 문제점은 눈의 비교적 작은 크기를 포함하며, 시간이 많이 걸리는 실험의 경우, 아가미를 통한 일정한 물 흐름을 유지할 필요가 있습니다 (Xu 및 동료28에 의해 설명 된대로). 이 방법의 주요 이점은 단순성과 속도입니다. 표준 해부 현미경은 버의 제어된 사용을 위해 사용됩니다(그림 1). 절차가 짧은 기간 (마취 시작일로부터 약 3 분)이기 때문에 물고기는 취급에서 잘 회복되며 마취 및 산소 전달의 유지 보수를 위해 추가 장비가 필요하지 않습니다.
각막 상처를 시각화하는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 이 프로토콜은 주사 전자 현미경 (SEM, 그림 2)을 사용하며, 각막 연구29,30에서 오랜 역사를 가지고 있습니다. 이 접근법은 상피의 하층에 대한 평가를 허용하지 않지만 상처 치유 속도를 추정하고 눈의 다른 영역의 각막 표면을 비교하는 쉬운 방법을 제공합니다. 상처 후 3시간 동안 상처 부위가 닫히는 동안(그림 2), 상처 경계가 접합된 부위는 계속 표시됩니다(그림 2).
제브라피쉬 각막상의 표면 세포는 뚜렷한 마이크로리지(microridges)(31)를 함유한다. 최근에, 한 연구는 제브라피쉬 피부(32)의 상처에 인접한 길쭉한 세포에서 이러한 구조가 손실된 것으로 보고되었다. 그러나, 제시된 결과는 절제된 각막 상피 상피에서, 마이크로리지가 상처 부위 옆의 일부 길쭉한 세포에서 관찰될 수 있음을 보여준다(도 4B). 일부 주변 영역에서는 마이크로리지가 세포의 중심에서 손실됩니다(그림 4C,D). 보다 상세한 분석을 위해, ImageJ27에서 마이크로리지 양과 평균 길이 이외에 정점 세포 면적 및 둥글림을 정량화한다(도 3 및 도 4E-H).
마이크로리지 분석은 스켈레톤 함수(van Loon과 동료33)로부터 수정됨)를 사용하여 수행된다. 두 주변 영역(도 4A(영역 C 및 D), 도 4C 및 도 4D) 사이의 비교는 도 4D의 세포가 더 길고(상처에 대한 반응으로서 세포 재배열을 나타냄) 도 4C의 세포보다 더 짧은 평균 마이크로리지를 갖는다는 것을 보여준다. 이 결과는 세포 모양의 변화가 마이크로리지 변형과 상관관계가 있고 상처 반응에서 각막 상피 내의 이질성을 강조한다는 것을 시사한다.
SEM 이미지에서 정점 세포 면적 및 원형도를 측정하는 것은 각막의 다른 영역에서의 세포 외관에 대한 정량적 데이터를 얻는 간단하고 재현 가능한 방법입니다. 2D로 제한되지만,이 접근법은 상처 폐쇄 동안 세포 재배열의 역학과 속도에 대한 전반적인 이해를 얻는 데 도움이됩니다. SEM 이미지는 정점 세포 표면 상의 마이크로리지 패턴을 분석하는데 이용된다. 여기에 설명 된 이미지 처리는 마이크로 리지 매개 변수의 변화에 대한 근사치를 제공하며, 이는 손으로 측정하는 것이 지루할 것입니다.
그림 1: 각막 찰과상을 위한 설정 . (A) 작은 제브라피쉬 눈의 제어된 마모를 위해서는 해부 현미경이 필요합니다. (B) 스폰지는 절차 중에 마취 된 물고기를 안정시키는 데 도움이됩니다. (C) 물고기는 페트리 접시에 마취되고, 마취 된 동물은 작은 숟가락으로 스폰지로 옮겨집니다. 0.5mm 팁이있는 안구 버는 각막을 연마하는 데 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 주사전자현미경으로 상처받은 각막의 시각화. 상처 후 0, 1, 2, 또는 3 h에서 수집된 절제된 각막의 개요(HPW). 파선 윤곽선은 상처 테두리를 나타냅니다. 배율 막대 = 500μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 마이크로리지 측정 전의 이미지 수정의 한 예. 원래 셀 표면의 정확한 복제본은 아니지만, 최종 골격화된 패턴은 셀 중심과 주변부 사이의 차이를 포착합니다. 스케일 막대 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 각막 찰과상 후 두 주변 영역 사이의 정점 세포 면적, 둥글음 및 마이크로리지 값의 비교 . (A) 부상당한 눈의 개요. 상자는 더 높은 배율 이미지의 위치( B, C 및 D)를 나타냅니다. (C, D) 형상 설명자 분석을 위해 선택된 셀은 녹색 윤곽선으로 표시됩니다. (E, F) 정수리 세포 영역(E) 및 선택된 세포의 둥글음(F) 값. (G, H) 마이크로리지 동일한 세포의 총 길이(G) 및 평균 길이(H). 그룹은 두 꼬리 t-검정 (*p≤ 0.05, **p≤ 0.01)에서 스케일 바 = A에서 500 μm, B, C 및 D에서 50 μm와 통계적으로 비교하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
각막 신체 상해는 안과 환자가 병원을 방문하는 가장 흔한 원인입니다. 따라서 각막 병리 생리학의 다양한 측면에 대한 연구를위한 관련 모델을 수립하는 것이 중요합니다. 지금까지, 마우스는 각막 상처 치유의 연구에 가장 일반적으로 사용되는 모델이다. 그러나 각막 상처 치유에 대한 특정 약물의 영향을 검증하기 위해 뮤린 상처 입은 눈에 점안액을 추가하는 것은 어려울 수 있습니다. 이러한 점에서, 제브라피쉬 모델은 각막 상처 치유에 영향을 미치는 분자의 약리학적 스크리닝에 특히 유용하다. 여기에 설명된 방법은 마우스(13)에 대해 설명된 것과 매우 유사하다.
그러나 두 가지 구체적인 차이점을 염두에 두어야합니다. 첫째, 안과 용 버를 사용하려면 상처 재현성을 보장하기위한 연습이 필요하며, 특히 눈에 가해지는 압력과 관련하여 적절한 마모에 중요합니다. 또한, 연마 팁은 상피가 더 이상 효율적으로 제거되지 않을 때 변경되어야합니다. 둘째, 제브라피쉬 각막의 구조와 형태학은 다른 각막(31)과 유사하지만, 이 동물은 포유동물 유기체(34,35,36)에서 비교할 수 없는 재생 능력을 갖는다. 마우스의 상처 폐쇄는 48-72 h 11,14,37 동안 지속되지만 제브라 피쉬에 대해서는 3 시간의 타임 라인이보고됩니다. 구조적 및 분자 유사성으로 인해, 각막의 물리적 상처에 의해 유도되는 세포 거동은 아마도 대부분의 척추동물에서 유사할 것이다. 그러나 제브라 피쉬의 신속한 반응은 아마도 그 동물에 특유한 진보 된 재생 메커니즘에 의해 인도 될 것입니다.
기술된 프로토콜은 상처 폐쇄를 추적하기 위해 SEM을 사용한다. 수많은 다른 연구들은이 과정을 추적하기 위해 형광 현미경 검사 (15,17,38)를 대신 사용했습니다. 그러나, SEM의 사용은 상피 마모에 따른 세포 형태 변형의 분석을 용이하게 한다. 이 기술의 단점은 SEM이 가장 외부 층의 이미징 만 허용하기 때문에 계층화 단계를 추적 할 수 없다는 것입니다. 완전한 각막 치유 동안 상피를 3D로 연구하려면 Zebrabow39 또는 면역 표지와 같은 형광 모델을 사용해야합니다.
제브라피쉬를 각막 상처 치유 모델로 사용하면 유전자 변형 어선, 모르폴리노스 및 화학 스크리닝과 같은 수많은 분자 도구를 적용하여 각막 상처 치유 연구의 가능한 범위를 크게 확대 할 수 있으므로 조사 범위가 향상됩니다. 또한, 제브라피쉬 눈의 크기는 뮤린 눈으로 할 수있는 것보다 더 자세하게 상피 세포 역학을 연구하기위한 새로운 이미징 전략의 개발을 가능하게합니다.
이 보고서의 주요 목적은 제브라 피쉬 모델에 대한 물리적 각막 상처 접근법을 적용 할뿐만 아니라 새로운 모델을 사용하면 새로운 질문을하고 대답 할 수 있으며 근본적인 생물학적 현상을 조사하는 새로운 방법을 지적한다는 것을 입증하는 것입니다. 이러한 장점은 궁극적으로 환자에게 유익 할 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
저자들은 Zebrafish 유닛에 대한 접근에 대해 Pertti Panula와 Henri Koivula에게 제브라 피쉬 실험에 대한 지침과 도움을 주신 것에 감사드립니다. 이 연구는 핀란드 아카데미, Jane and Aatos Erkko Foundation, Finnish Cultural Foundation 및 ATIP-Avenir Program의 지원을 받았습니다. 이미징은 HiLIFE 및 Biocenter Finland가 지원하는 Electron Microscopy 유닛과 생명 공학 연구소의 Light Microscopy Unit에서 수행되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4 | in-house | Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2 HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2 PO4 ). | |
| 0.2M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4 | in-house | Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2 HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2 PO4 ). | |
| 0.5mm burr tips | Alger Equipment Company | BU-5S | |
| 1M Tris, pH 8.8 | in-house | ||
| adhesive tabs | Agar Scientific | G3347N | |
| Algerbrush burr, Complete instrument | Alger Equipment Company | BR2-5 | |
| Cotton swaps | Heinz Herenz Hamburg | 1030128 | |
| Dissecting plate | in-house | ||
| Dissecting tools | Fine Science Tools | ||
| double-distilled water | in-house | ||
| Eppedorf tubes, 2ml | any provider | ||
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma | A5040 | Caution: causes irritation. |
| Glutaraldehyde, 50% aqueous solution, grade I | Sigma | G7651 | Caution: toxic. |
| Lidocaine hydrochloride | Sigma | L5647 | Caution: toxic. |
| mounts | Agar Scientific | G301P | |
| Petri dish | Thermo Scientific | 101VR20 | |
| pH indicator strips | Macherey-Nagel | 92110 | |
| Plastic spoons | any provider | ||
| Plastic tubes, 15 ml | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Plastic tubes, 50 ml | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Scanning electron microscope | FEI | Quanta 250 FEG | |
| Soft sponge | any provider | ||
| Sputter coater | Quorum Technologies | GQ150TS | |
| Stereomicroscope | Leica |
References
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