Summary
微胞子虫寄生虫ネマトシダ・パリシイによるCaenorhabditis elegansの感染は、ワームが同じ病原体に対して非常に耐性のある子孫を産むことを可能にする。これは遺伝性免疫の一例であり、り理解されていないエピジェネティック現象である。本プロトコールは、遺伝的に扱いやすいワームモデルにおける遺伝性免疫の研究を記述している。
Abstract
遺伝性免疫は、いくつかの動物が以前の感染の「記憶」を子孫にどのように渡すことができるかを表しています。これは、子孫の病原体耐性を高め、生存を促進することができる。遺伝性免疫は多くの無脊椎動物で報告されているが、このエピジェネティック現象の根底にあるメカニズムはほとんど知られていない。天然の微胞子虫病原体ネマトシダ・パリシイによるカエノラブディティス・エレガンスの感染は、微胞子虫に対して頑丈に耐性のある子孫を産生するワームをもたらす。本プロトコールは、単純かつ遺伝的に扱いやすいN. parisii-C. elegans感染モデルにおける世代間免疫の研究を記載する。現在の記事では、C. elegansに感染し、免疫プライムされた子孫を生成する方法について説明します。微胞子虫の染色および顕微鏡による感染の可視化による微胞子虫感染に対する耐性をアッセイするための方法も与えられる。特に、遺伝性免疫は微胞子虫による宿主細胞の侵入を防ぎ、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)を用いて浸潤事象を定量化することができる。免疫プライミングされた子孫において産生される微胞子虫胞子の相対量は、胞子をキチン結合色素で染色することによって定量することができる。今日まで、これらの方法は、遺伝性免疫の動態および病原体特異性、ならびにその根底にある分子メカニズムに光を当ててきた。これらの技術は、C. elegansの研究に利用可能な広範なツールとともに、遺伝性免疫の分野における重要な発見を可能にするでしょう。
Introduction
遺伝性免疫はエピジェネティックな現象であり、それによって親が病原体にさらされ、感染抵抗性の子孫の産生を可能にすることができる。このタイプの免疫記憶は、適応免疫系を欠いており、ウイルス性、細菌性、および真菌性の疾患から保護することができる多くの無脊椎動物で示されている1。遺伝性免疫は健康と進化の両方を理解する上で重要な意味を持つが、この保護の根底にある分子メカニズムはほとんど知られていない。これは、遺伝性免疫が記載されている動物の多くが、研究のためのモデル生物として確立されていないことも一因である。対照的に、透明な線虫Caenorhabditis elegansにおける研究は、広範な遺伝的および生化学的ツールキット2,3、高度に注釈付きゲノム4,5、および短い生成時間から利益を得る。実際、C. elegansの研究は、エピジェネティクスと自然免疫6,7の分野における根本的な進歩を可能にし、現在は免疫記憶8,9を研究するための確立されたモデルです。
微胞子虫は、ほぼすべての動物に感染し、免疫不全のヒトに致死的な感染症を引き起こす真菌病原体です10。感染は、微胞子虫胞子が極性管と呼ばれる構造を使用して宿主細胞にその細胞内容物(スポロプラズム)を注入または「発火」したときに始まります。寄生虫の細胞内複製は、メロントの形成をもたらし、これは最終的に細胞11、12を出ることができる成熟胞子に分化する。これらの寄生虫は人間の健康と食料安全保障の両方に有害ですが、感染生物学についてはまだ学ぶべきことがたくさんあります12。線虫パリシイは、ワームの腸細胞内で排他的に複製する天然のマイクロスポリジウム寄生虫であり、繁殖力の低下、そして最終的には死をもたらす。N. parisii-C. elegans感染モデルは、(1)病原体クリアランスにおけるオートファジーの役割13、(2)微胞子虫が感染細胞から非溶解的にどのように出ることができるか14、(3)病原体が合胞体15を形成することによって細胞から細胞へとどのように広がることができるか、(4)N. parisiiが宿主16と界面するために用いるタンパク質、および(5)転写細胞内病原体応答(IPR)17の調節、18。
C. elegansの感染に関するプロトコルは、現在の研究に記載されており、ユニークな微胞子虫生物学を明らかにし、感染に対する宿主の応答を解剖するために使用することができる。キチン結合色素Direct Yellow 96(DY96)で染色された固定ワームの顕微鏡観察は、キチン含有微胞子虫胞子の腸全体に感染が広がることを示している。DY96染色はまた、宿主の適応度の読み出しとしてワームの重力(胚を産生する能力)の同時評価のために、キチン含有ワーム胚の視覚化を可能にする。
最近の研究により、N. parisiiに感染したC. elegansは、同じ感染に対して頑丈に耐性のある子孫を産むことが明らかになりました19。この遺伝性免疫は単一世代持続し、より重度に感染した両親からの子孫が微胞子虫に対してより耐性であるため、用量依存的である。興味深いことに、N. parisii-primedの子孫はまた、細菌の腸内病原体緑膿菌に対してより耐性があるが、天然の病原体オルセーウイルス19に対して保護されていない。本研究はまた、免疫プライムされた子孫が微胞子虫による宿主細胞の侵入を制限することを示している。この方法はまた、免疫プライミングされた子孫の収集と、FISHを使用して腸細胞中のN. parisii RNAを検出し、宿主細胞の侵入および胞子の発火をアッセイする方法についても説明しています20。
これらのプロトコルは、 C. elegansにおける微胞子虫および遺伝性免疫を研究するための強固な基盤を提供する。このモデルシステムにおける今後の研究により、遺伝性免疫の新生領域における重要な発見が可能になることが期待されます。これらの技術は、他の宿主生物における微胞子虫誘発遺伝性免疫を調査するための出発点となる可能性もある。
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Protocol
本研究は、21°Cで生育させた野生型 C.エレガンス ・ブリストルN2株を用いる。
1. 培地の準備
- 前のレポート21,22に従ってM9メディアを準備します。
- 線虫増殖培地(NGM)を前回の報告21、22に従って調製した。6 cmプレートあたり12 mLのNGMまたは10 cmプレートあたり30 mLのNGMを注ぎます。
- 前回の報告23に従ってエシェリヒア・コリ株OP50-1を作製した。
- OP50-1播種NGMプレートを以下の手順に従って調製する。
- ボルテックスにより10倍濃縮OP50-1を再懸濁する。
- リピーターピペットを使用して、プレートを中央に播種します。6cmおよび10cmプレートの場合、それぞれ200μLまたは500μLの容量で種子を投与する。
- 10cmプレートの場合は、ガラススプレッダーを使用してOP50-1を広げ、細菌の芝生を作成します。プレートの端に細菌を広げないでください。
注:エタノール浸漬し、無菌性を確保するために、5プレートごとにスプレッダーを炎上させます。細菌を殺すのを防ぐために、広げる前にスプレッダーを数秒間冷まします。 - プレートを室温で2日間放置して乾燥させ、細菌芝生の増殖を確実にする。
注:播種されたプレートは、室温で2〜3週間、または4°Cで最大1ヶ月間保存することができます。
2. C. elegansのメンテナンス
- OP50-1シードNGMプレート上の一定の細菌食物源にワームを維持する。
注:飢餓は世代間の表現型をもたらし、結果に影響を与える可能性があります。10 cm OP50-1 種をまいたプレートは、2,500 L1 ( C. elegans の最も初期の幼虫期) を最大 72 時間サポートします。 - ワームが飢えている場合は、実験にワームを使用する前に、OP50-1で3世代にわたって成長してください。
3. 次亜塩素酸ナトリウムを用いたC.エレガンス 集団の同期(漂白)
メモ:この手順は非常に時間がかかるため、開始する前に遠心分離機が使用可能であることを確認してください。代替として、より迅速でない漂白プロトコルが文献に利用可能であり、好ましい場合にも使用され得る。6%次亜塩素酸ナトリウムが時間の経過とともに活性を失うのを防ぐために、試薬を4°Cの暗闇に保管し、最大1年間保管してください。
- 400 μLの1 M NaOH、250 μLの6%次亜塩素酸ナトリウム( 材料表を参照)、および1350 μLの蒸留水を混合して、各サンプルに対して2 mLの漂白剤溶液を調製する。
- 成虫(ハッチ後約72時間)をプレートから1mLのM9培地を用いて微量遠心チューブに洗浄する。
注:プレート上に多くのワームが残っている場合は、1,400 x g で室温で30秒間遠心分離してワームをペレット化し、1 mLピペットチップを使用して上清を除去し、追加のプレート洗浄を行います。 - 1,400 x g で室温で30秒間遠心分離してワームをペレット化し、その後、1 mLのM9培地で2xを洗浄して細菌を除去します。
- 上清を除去し、調製した漂白剤溶液1 mLを加え(工程3.1)、タイマーを1分間セットした。チューブを3〜4倍に反転させます。
注:光学顕微鏡下では、ワームがスラッシングを止めるのを見ることができます。 - 1分後、3,000 x g で室温で30秒間遠心分離してワームをペレット化し、上清を除去し、1mLの新鮮な漂白剤溶液を加える。
- チューブを光学顕微鏡で注意深く監視して、ワームの死骸が分裂して胚を放出するのを視覚化します。死体の約50%〜80%が開き、多くの胚が放出されたら、すぐに次のステップに進みます。
注:動物の数とワームの系統に応じて、このステップは15秒から4分かかることがあります。未知の理由により、 N. parisiiに感染したワームは、感染していない動物よりも漂白に時間がかかることがよくあります。 - 3,000 x g で室温で30秒間遠心分離して胚をペレット化し、その後、1 mLのM9培地で3xを洗浄します。
注:洗浄はチューブから残留した次亜塩素酸塩溶液を希釈し、漂白剤溶液が胚に損傷を与えないように迅速に行う必要があります。 - 最終ペレットに1 mLのM9培地を加え、4 mLのM9培地を含む15 mLの円錐管に移す。胚を5mLの最終容量に懸濁する。
- チューブを機械式ローター( 材料表を参照)で21°Cで18〜24時間回転させ、胚をL1に孵化させる。
注: N. parisii はワーム腸に感染し、生殖細胞系列に侵入しないので、感染した両親は垂直感染によって子孫に感染を渡すことはありません19。感染した成虫の漂白は、F1動物を同期させ、 N. parisii 胞子を破壊し、F1子孫が両親から引き継がれた胞子に感染しないようにする。 - チューブを室温で1,800 x g で1分間遠心分離してL1sをペレット化し、上清1 mLを除くすべてを廃棄する。
- 1〜5μLのL1混合物をピペットで播種していないNGMプレート上に、光学顕微鏡下で可視化することによって液滴中のL1sの数を直ちにカウントした。3xを繰り返してカウントを平均し、L1の濃度と総数を決定します。
注:胚の大部分は孵化させる必要があり、L1は液滴内で急速に移動している必要があります。孵化していない胚と嗜眠性(動きが遅い)L1の大部分が残っている場合、これは漂白が長すぎることを示しています。
4. N. parisii胞 子の調製
- 以前に公開された参考文献19,24に従ってN.パリシイ胞子を準備する。
5.免疫プライムの子孫を産むためのN.パリシイによるC.エレガンスの感染
- 計画された感染の1日前に、必要な数の10cmの播種されていないNGMプレートを4°Cから室温に移動する。
- 感染の直前に、微量遠心チューブ内で室温で30秒間、1,400 x g で約2,500匹の同期したL1ワームを遠心分離し、ワームをペレット化します。上清をピペットチップで除去し、約50 μLのM9培地にワームを残します。
- 1mLの10x OP50-1をL1sおよび N.パリシイ 胞子に所望の濃度(典型的には〜250万胞子)まで加える。非感染対照として、使用した胞子調製物の体積と同等の量のM9培地を有するL1sおよびOP50−1の同等のチューブを調製する。
注:免疫プライムされた子孫を得るには、動物の>90%が72時間(DY96染色、ステップ7で測定)感染するが、動物の>80%がまだ重篤であるように十分に低い程度に十分に高い胞子用量を使用する。これにより、ほとんどの子孫が感染した両親から来ており、両親の漂白がF1検査に十分な胚をもたらすことを保証します。胞子調製物は濃度および感染力において異なるが、適切な親用量は、典型的には、10cmプレート当たり5〜15μLの胞子調製物(〜250万胞子)である。 - 渦を短時間混合し、上記の1mLのワームを10cmの播種されていないNGMプレート上にプレート化する。液体がプレート全体に広がるように渦巻きます。
- 蓋を外した状態でプレートを清潔なキャビネットで10〜20分間、または完全に乾くまで乾燥させてから、21°Cで72時間インキュベートします。
- 感染後72時間(hpi)で、1 mLのM9培地を使用して、プレートからワームをマイクロ遠心分離管に洗浄します。プレート上に多くのワームが残っている場合は、1,400 x g で30秒間遠心分離してワームをペレット化し、上清を除去し、追加のプレート洗浄を行います。
- ペレットワームを室温で30秒間、1,400 x g で遠心分離し、1 mLのM9培地で2xを洗浄するか、上清が透明になるまで洗浄する。1mLのM9媒体の最終容量で再懸濁する。
- ピペットを上下にして混合し、懸濁したワーム100 μLを新鮮なチューブに移します。
注:〜250人の成虫のこのサンプルは、ステップ7およびステップ3の冒頭で説明されているように、後で固定および染色して、親のワームの適応度および感染状態を判断することができます。 - 成虫を分解し、試験のためにF1胚を放出するには、ステップ3で説明するように、残りの900μLの懸濁したワームを漂白する。
注:このステップはまた、その後の感染アッセイの前に、任意の N. parisii 胞子を破壊する。
6. C. elegansにおけるN. parisiiに対する遺伝性免疫の試験
- 手順 5.1.-5.6 の説明に従って感染を実行し、以下に説明するように変更します。
注: F1 の感染アッセイはスケールダウンし、約 1,000 L1 ワームと 400 μL の 10x OP50-1 を使用して 6 cm NGM プレートで実行できます。素朴なF1(すなわち、感染していない両親からのワーム)の〜100%が感染し、素朴なF1の〜10%のみがグラビッドであるように、胞子の「高」用量も使用しなければならない。胞子製剤は濃度および感染力において異なるが、適切な用量は、典型的には、6cmプレート当たり5〜15μL(〜250万胞子)の間である。 - 72 hpi で、ステップ 7 で説明したように、修正して汚れをつけて、ワームの適応度と感染状態を判断します。
7. 胚および微胞子虫胞子を可視化するためのC. elegans のDY96染色
注:DY96は、ワーム胚および微胞子虫胞子壁19、15、25を染色する緑色蛍光キチン結合色素である。これにより、ワームのフィットネスと感染状態を同時に監視できます。
- 0.1% Tween-20 を含む 1 mL の M9 培地を使用して、プレートからワームをマイクロ遠心チューブに洗い流します。プレート上に多くのワームが残っている場合は、室温で30秒間1,400 x g で遠心分離してワームをペレット化し、ピペットチップを使用して上清を除去し、追加のプレート洗浄を行います。
- 1,400 x g で室温で30秒間遠心分離してワームをペレット化し、0.1% Tween-20を含む1 mLのM9培地で2xを洗浄するか、上清が透明になるまで洗浄します。
- 上清を除去し、アセトン700μLを加え、ワームを室温で10分間固定したままにする。
注:この時点で、ワームは必要に応じて数ヶ月後まで処理するために-20°Cで保存することができます。 - 固定ワームをペレット化するために室温で10,000 x g で30秒間遠心分離し、0.1% Tween-20(PBST)を含む1 mLのPBSで2xを洗浄した。
- 50 mL の DY96 作業溶液を調製します: PBST、0.1% (v/v) ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)、および 20 μg/mL DY96 (蒸留水中の 5 mg/mL ストック溶液から) ( 材料表を参照)。チューブをホイルで包み、引き出しに保管して光にさらさないようにします。
注:DY96ストックおよび作業溶液は、暗闇に保管すれば室温で>1年間保管することができます。 - 10,000 x g で室温で30秒間遠心分離して、ワームをペレット化し、上清を除去します。500 μLのDY96作業溶液をペレットに加え、室温で30分間回転させる。
- 10,000 x g で室温で30秒間遠心分離し、ワームをペレット化する。上清を除去し、DAPIの有無にかかわらず15 μLのマウント培地を添加する( 材料表を参照)。
- 染色されたワームを含む溶液10 μLを顕微鏡スライド上にピペットし、その上にカバースリップを置きます。
注:スライドと追加のサンプルは、長期保存のために暗所で4°Cで保存することができます。
8. DY96染色ワームのイメージングと分析により、ワームの適応度と感染状況を評価する
- DY96染色されたワーム(ステップ7.8のようにスライドに装着)を分析するには、蛍光顕微鏡のGFPチャネルを用いてイメージングを行う。
- ワーム集団の適合性を判断するには、5倍または10倍の目標を使用して、条件ごとに>100匹のワームの重力をアッセイします。
注:≥1胚を運ぶワームは、グラビッドと見なされます。機械式セルカウンタは、カウント時の人為的ミスを最小限に抑えるのに役立ちます。ワーム胚は、微胞子虫胞子19よりも染色が少ない(蛍光が少ない)。胚は卵形であり、〜50μm x 〜30μmであり、健康な C. elegans 成虫の中間体に見られる。健康で感染していない成人は、体長に沿って10〜20個の胚を一列に並べて運びます26。 - フィットネスのより微妙な違いを明らかにするには、胚カウントを実行します。このために、条件ごとに20〜30個の個々のワームの胚の数を手動でカウントします。
- ワーム集団の感染状況を判断するには、5 倍から 40 倍の目標を使用して、条件ごとに >100 匹のワームの感染状態を評価します。任意の数の細胞内腸胞子を含むワームが感染していると考えられる。
注:微胞子虫の胞子はワームの胚よりも明るいです。 N. parisii の豆形の胞子は〜2.2μm x 〜0.8μmであり、〜48hpi15からワームの腸細胞で産生される。胞子が腸壁に沿ってではなく腸管腔にのみ見られるワームは、感染したとは見なされません19。なぜなら、これらの胞子は、個体の感染から生じない新たに摂取された胞子を表す可能性が高いからである。 - 画像解析ソフトウェア( 材料表を参照)を使用して、以下の手順に従って寄生虫の負担とワームのサイズを定量化します。
- 各サンプルについて蛍光直立立体視鏡を用いて顕微鏡スライドに取り付けられた20〜30匹のワームを画像化する。ブライトフィールド、DAPI、GFPチャンネルで画像をキャプチャします。最も感染したサンプルの蛍光が飽和しないように、GFPチャネルで適切な露光を選択します。
注:感染は、最も感染していないサンプルで視覚化できます。画像は通常、5倍の対物レンズを使用して撮影されます。 - FIJI/ImageJ でファイルを開きます。ファイルの種類によっては、ImageJ で画像を開くためにバイオフォーマットータープラグインが必要になる場合があります。
- 明視野またはDAPI画像とツールバーの ポリゴン選択 ツールを使用して、画像内の20〜30個の個々のワームを概説します。ドロップダウン メニューの[>ツール>関心領域(ROI)マネージャの分析 ]で各アウトラインを保存し 、[t]の追加をクリックします。フレーム内で完全に見える動物の輪郭を描きます。
メモ: ワームのアウトラインは、アウトライン付きのファイルを Tiff として保存することで、後で再確認できます。 - ROIマネージャで[選択解除]をクリックして画像からすべてのアウトラインを削除し、ドロップダウンメニューの[画像>複製]をクリックします。目的のチャネルに対応する番号を「チャネル」ボックスに入力して、寄生虫の負担のためにGFPチャネルを複製します(例:2)。
- Image >を使用してこのチャンネルをしきい値 明るい寄生虫の負担が捕捉されるが、ワーム胚からの調光蛍光が捕捉されないレベルに >のしきい値を調整し 、[ 適用]をクリックします。適用されたしきい値をメモし、同じ実験のすべての画像に一貫して使用します。
メモ: すべての画像を分析する前に、感染が最も少ないサンプルと最も感染したサンプルの両方にしきい値が適切な値であることを確認してください。 - [解析]>[測定値の設定]を選択し、[面積率]のチェックボックスをオンにします。ROIマネージャから単一のワームアウトラインを順番に選択し、[>測定の分析]機能をクリックします。結果ウィンドウには、%面積(すなわち、寄生虫負担率)の測定が表示されます。
注: 胚からの蛍光が閾値を超えるほど明るい場合は、ツールバーの黒の ペイントブラシツールを使用して 、%Area を測定する前にこれらの領域を手動で消去できます。 - 適合度の読み出しとしてワームのサイズを決定するには、ステップ 8.3 の説明に従ってワームの概要を説明します。 [解析]>[測定値の設定] を選択し、[ 面積]のチェックボックスをオンにします。 ROIマネージャ から単一のワームアウトラインを順番に選択し、[ 分析>測定] 機能をクリックします。 [結果 ] ウィンドウに %Area の測定値が表示されます。
- 各サンプルについて蛍光直立立体視鏡を用いて顕微鏡スライドに取り付けられた20〜30匹のワームを画像化する。ブライトフィールド、DAPI、GFPチャンネルで画像をキャプチャします。最も感染したサンプルの蛍光が飽和しないように、GFPチャネルで適切な露光を選択します。
9. 微胞子虫および胞子の発火によるC.エレガンスの 侵入を評価するためのFISHアッセイ
注:MicroB FISHプローブは、マイクロスポリジウム18s rRNAの保存領域を認識し、細胞内スポロプラズム(すなわち、侵入した宿主細胞)および胞子内の遺伝物質を標識するために使用することができる。
- 6,000個の漂白剤同期L1ワームを、M9培地で構成された400μLの最終容量で 、400万個のパリシイ の胞子および10個のOP50-1の10 μLに感染させる。
- この混合物を6cmの播種していないNGMプレート上にプレートし、クリーンなキャビネット中で10〜20分間乾燥させ、21°Cで置いた。
- 30分後、0.1% Tween-20を含む1mLのM9培地で動物をプレートから洗い流した。
- 室温で1,400 x g で1分間遠心分離することによってワームをペレット化する。
- ピペットチップを用いて上清を除去し、アセトン700μLを加え、室温で10分間座らせる。
注:この時点で、ワームは後で処理するために-20°Cで保存することができます。 - 以前に公開された報告27、19に続くMicroBプローブを用いて一晩FISHアッセイを行う。
注: 胞子の発火を評価するには、最後の 500 μL の洗浄バッファーに 20 μg/mL の DY96 をサンプルに加え、21 °C で 30 分間回転させてから、通常どおりプロトコルを続行します。 - スライドを4°Cのスライドボックスに保管する。 長期保存(すなわち、数ヶ月)のために、追加のサンプルを暗所で4°Cの微量遠心チューブに保管する。
- FISH染色されたワームの侵入を評価するには、蛍光顕微鏡の赤チャネルを使用してワームを見てください。L1動物は小さく、スポロプラズムは複製の初期段階にあるため、感染イベントを高倍率(63倍の目標)で視覚化します。胞子の発火を評価するには、63倍の対物レンズと赤と緑の両方の蛍光チャンネルを使用します。
注: GFP シグナルと mCherry シグナルが共局在する胞子は、未発火と見なされます。空のGFP胞子ケースは解雇されたとみなされます。 - 侵入または胞子の発火をアッセイするには、スポロプラズムの数(腸細胞内のmCherry病巣)または条件ごとに20〜30匹のワームで発火した胞子の割合を手動でカウントします。z平面のフォーカスを調整して、異なる平面でよく見られるすべての感染イベントと胞子をキャプチャします。
注:スポロプラズマは腸細胞内にのみ見出される。スポロプラズマの最高濃度は、典型的には咽頭の直後に見出される。サンプルもDY96で染色されている場合は、胞子と共局在しないスポロプラズムの存在を探します。
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Representative Results
本研究では、 C. elegans (P0)の親集団は、低用量の N. parisii 胞子でL1段階で感染した。これらの感染状態は、典型的には、両親の漂白を通じて多数の微胞子虫耐性F1子孫を得るために使用される。感染した親集団および非感染対照を72hpiで固定し、DY96で染色して、ワーム胚および微胞子虫胞子を視覚化した(図1A)。感染した動物は小さく、多くの微胞子虫胞子を含み、健康な非感染対照よりも少ない胚を産生する。ワームの重力の評価は、感染していない動物の〜95%が子孫を産んだのに対し、感染した動物の80%未満であることを示した(図1B)。定量は、DY96染色胞子を含むワームの数によって決定されるように、微胞子虫処理集団の約90%が感染していることを明らかにした(図1C)。免疫プライムF1子孫を得るためには、ほとんどの親が感染していることを保証するのに十分高いが、集団がまだ子孫を産生できることを保証するのに十分低い微胞子虫の用量を使用することが重要です。この研究におけるデータを得るために使用された微胞子虫用量の表が提供される(表1)。
非感染および感染した親集団(図1)を72hpiの次亜塩素酸ナトリウムで処理し、ナイーブで免疫プライムされたF1子孫を得た。F1動物は、微胞子虫に対する遺伝性免疫を試験するために、L1段階で高用量の N. parisii 胞子に曝露された。72hpiで、F1動物を固定し、DY96で染色して、微胞子虫耐性を評価した(図2A)。これらの固定動物の定量化により、プライミングされたワームは、素朴な対応物よりも有意に多くの胚を含んでおり、感染に直面したときの適応度が高いことが明らかになった(図2B)。FIJI/ImageJは、個々のナイーブおよび免疫プライムワームの寄生虫負荷(すなわち、蛍光 N.パリシイ 胞子で満たされた体の割合)を決定するために使用された(図2C)。定量化により、感染した親から来たワームの寄生虫の負担が劇的に減少したことが明らかになりました(図2D)。さらに、個々のワームサイズの計算により、N . parisii 感染に直面して、プライミングワームがナイーブ動物よりも有意な成長優位性を有することが明らかになった(図2E)。これらのデータは、 N.パリシイに感染した両親が高レベルの微胞子虫耐性を有する子孫を産むことを示している。
これまでの研究は、微胞子虫に対する遺伝性免疫が N. parisii19による腸細胞の浸潤を減少させることを明らかにしている。宿主細胞の侵入の違いを視覚化するために、ナイーブおよび免疫プライム動物(上記のように、感染していないまたは感染した両親から得られた)を、L1段階で最大用量の N. parisii に曝露した。30dpiで、ワームを固定し、共染色し、 FISH プローブを使用してN.パリシイRNAを検出し、DY96を使用して N.パリシイ 胞子壁を検出した。画像化により、素朴な動物は典型的には複数の胞子といくつかの感染細胞(スポロプラズム)を含んでいたが、プライミングされた動物は胞子がはるかに少ない(またはまったくない)し、典型的にはスポロプラズムを持たないことが明らかになった(図3)。
図1:感染していないC.エリガンスとN.パリシイに感染したC.エレガンスの直接黄色96(DY96)染色は、ワームの重大度と感染状態を明らかにします。 (A-C)N2 C. elegansは、L1段階で低用量のN. parisiiに感染していないか、または感染していた。72hpiで、ワームを固定し、DY96で染色し、画像化してワームの重力と感染状態を評価した。(A)代表的な画像を示す。DY96は、ワーム胚および微胞子虫胞子(キチン)の可視化を可能にする。感染したワームの差し込み画像が右側に表示されます。胚は「E」とラベル付けされています。腸のN.パリシイ感染は「Np」とラベル付けされている。左と中央の画像のスケールバー = 500 μm。右の画像のスケールバー=100μm(B)1つ以上の胚を運ぶワームをグラビッドとしてスコアリングし、グラフ化した。(c)腸細胞内に任意の数のN. parisii胞子を保有するワームを感染としてスコア化し、グラフ化した。(B-C)データは、実験ごとに条件ごとにn = 100匹のワームを使用した5つの独立した実験からプールされた。SEM±平均が示されている。p値は、不対の両側スチューデントのt検定によって決定された。有意性は次のように定義されました: *p < 0.05;p<0.001。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ナイーブおよび免疫プライミングされたC. elegansの黄色96(DY96)直接染色により、ワームあたりの胚、微胞子虫の負担、およびワームのサイズを決定した。 (A)N2 C. elegansは、L1段階で低用量のN. parisiiに感染していたか、または感染していなかった。72hpiで、ワームを次亜塩素酸ナトリウムで処理して胚を放出させた。得られたナイーブおよび免疫プライムされた子孫は、L1段階で高用量のN. parisiiに感染した。72hpiで、ワームを固定し、DY96で染色し、画像化してワームの胚および寄生虫の負担を視覚化した。代表的な画像が示されています。スケールバー=200μm(B)虫1匹あたりの胚数をカウントし、(A)からグラフ化した。(C) FIJI/ImageJのスクリーンショットは、右下の閾値ウィンドウを使用して寄生虫の負担(白で表示)を視覚化するために閾値化されたパネルAの素朴なワームを示しています。ここでは、個々のワームは、赤で強調表示された「ポリゴン選択」ツールを使用して概説され、右上のROIウィンドウを使用して「関心領域」(ROI)として定義されました。Analyze > Measure > Area 関数を使用して、25.02% と 13.49% の 2 つのワーム例の寄生虫の負担を定量化しました。(D)ワーム1匹当たりの寄生虫負担量を求め、(A)からグラフ化した。(E)上記の画像から、個々のワームのサイズは、パネルCのように概説された動物から、分析>測定>面積関数を使用して計算した。(B、D、 E)SEM±平均が示されている。p値は、不対の両側スチューデントのt検定によって決定された。有意性は次のように定義されました: *p < 0.05。**p < 0.01、***p < 0.001 です。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:N. parisii 18S rRNAに対する蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)は、素朴ではあるがプライミングされていない動物におけるC. elegans腸細胞の寄生虫侵入を明らかにする。 N2 C. elegansは、L1段階で低用量のN. parisiiに感染していたか、または感染していなかった。72hpiで、ワームを次亜塩素酸ナトリウムで処理して胚を放出させた。得られたナイーブおよび免疫プライムされた子孫は、L1段階で最大用量のN. parisiiに感染した。30mpiで、ワームを固定し、スポロプラズムを検出するためにFISHを行い、DY96で染色して微胞子胞子壁を検出し、画像化した。代表的な画像が示されています。素朴なワームの差し込み画像は、胞子質(赤、アスタリスク)、発火胞子(緑、矢じり)、および未焼成胞子(黄色、矢印)を示しています。示されている素朴な感染したワームは、4つのスポロプラズムを表示します。スケール バー = 20 μm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| N.パリシイ 線量 | プレート濃度(胞子/cm2) | 6cmプレートあたり数百万の胞子 | 10cmプレートあたり数百万の胞子 |
| 低い | 35,400 | - | 2.7 |
| 高い | 88,400 | 2.5 | - |
| 最大 | 2,12,000 | 6 | - |
表1:研究で採用したN.パリシイ用量。
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Discussion
本プロトコールは、単純で遺伝的に扱いやすいN. parisii-C. elegans感染モデルにおける微胞子虫および遺伝性免疫の研究を記載する。
胞子調製は、生産性に応じて、典型的には6ヶ月間の実験に十分な胞子を生じる集中的なプロトコールである24。重要なことに、感染力は、実験に使用する前に、新しい胞子「ロット」ごとに決定されなければならない。胞子調製物間の感染力のばらつきのために、単一のロットは、実験のすべての反復に対して一貫して使用されなければならない。個々のアリコートは、融解が胞子を発火させ、感染力を低下させる可能性があるため、解凍して再凍結すべきではありません。そのため、胞子は感染直前に-80°Cの冷凍庫から取り出し、ベンチにいる間は氷上で維持する必要があります。
ステップ5〜6において、感染アッセイを概説した。感染アッセイ中は、動物の汚染や飢餓を避けることが重要であり、これはF1の免疫を混乱させる追加の世代間効果をもたらす可能性があるためです。遺伝性免疫アッセイの重要な制限は、感染した親が多いほどF1の子孫が産まれないことです。したがって、親の世代が免疫を渡すのに十分なほど感染しているのと、検査のために子孫を産むのに十分な健康であることとの間の慎重なバランスをとることが重要です。現在のプロトコルではL1動物の感染アッセイが記載されているが、このプロトコルを変更して、微胞子虫感染が異なる段階の親に与える影響と、高齢の子孫における免疫の持続性をテストすることができる。この方法はまた、遺伝性免疫に対する複数のまたは別個のストレス(例えば、浸透圧ストレス、重金属ストレス、別の病原体との共感染)の影響を試験するように修正することもできる。C. elegansにおけるN. parisiiに対する遺伝性免疫は世代間(すなわち、単一世代持続)19であるが、このプロトコルは、世代間効果をテストするためにさらなる世代を研究するために適合させることができる。提供されたプロトコルはパリシイ菌感染に特異的であるが、他の多くの線虫感染種の微胞子虫が存在する28。プロトコールは、他の腸内感染(例えば、線虫アウスベリ)および表皮および筋肉感染(例えば、線虫ジプロデア)微胞子虫29、30に対する遺伝性免疫を研究するために適合させることができる。C.エレガンスは、他の多くの天然およびヒト病原体(細菌性、真菌性、およびウイルス性)にも感染している。ここで記載された方法は、C. elegansにおける他の病原体に対する遺伝性免疫およびN. parisiiに対する遺伝性免疫応答の病原体特異性を試験するために使用することができる。C. elegansは十分に確立されたモデル生物です。しかし、雌雄同体種C. tropicalisおよびC. briggsaeおよび雄雌種C. kamaainaを含むCaenorhabditis属の他のメンバーも、N. parisii31に様々な程度に感染している。提供されたプロトコルに小さな変更を加えることによって、遺伝性免疫もこれらの動物で試験することができる。
ステップ8において、DY96染色ワーム(すなわち、感染した動物の割合、グレービッドの動物の割合)における微胞子虫感受性の違いを決定するための迅速かつ簡単な方法が与えられた。しかし、これらの方法は、免疫力とフィットネスの小さな変化を検出するのに十分な感度がない場合があります。これは、1つの胚と多くの感染細胞を持つワームは、10個の胚と1つの感染細胞を持つワームと同じように扱われるためです。そのため、これらの動物における感染転帰(すなわち、寄生虫負担率、胚数、ワームサイズ)を決定するための、より詳細な分解能を有する方法も提供されている。どちらの方法も使用できますが、表現型の違いは通常、後者の方がより顕著であり、有意差の検出が容易になります。この方法への将来の適応には、機械学習を使用して分析を自動化することが含まれる可能性があります。
ステップ9において、FISHを用いて微胞子虫および胞子発火による宿主細胞浸潤をアッセイするための技術が提供された。DY96は微胞子虫症を強い蛍光緑色シグナルでマークするが、親油性染色ナイルレッドおよびキチン結合カルコフルアホワイトを含む他の色素も、N. parisii30、32、33を染色するために使用することができる。本プロトコールは、アセトンを用いた固定を記載しており、DY96およびFISH染色による微胞子虫の検出に良好に機能する。しかし、4%パラホルムアルデヒドによる固定は、組織形態を維持し、いくつかのイメージングプロトコルにおけるシグナルを改善するのに役立ちます。
微胞子虫は研究が不十分な病原体であり、感染の細胞生物学の多くは不明のままである。 C. elegans は単純なモデル生物であり、これらのプロトコルは、この寄生虫に対する感染および宿主防御に関与する重要なプロセスを理解するためのプラットフォームとして役立つことができる。遺伝性免疫は新たな分野であり、多くの疑問が残っています1.感染した親はどのようにして子孫に免疫を伝達するのですか(母親のプロビジョニングまたは子孫の転写調節の変更)?何が子孫の免疫を媒介するのか(抗菌ペプチドまたは他の免疫タンパク質)?病原体特異的な遺伝性免疫応答はどの程度であり、種間で遺伝性免疫はどの程度保存されているか? C. elegansで利用可能な広範なツールを考えると、ここで説明するプロトコルに基づいて構築された研究は、遺伝性免疫のこれらの基本的な質問に答える準備ができています。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もありません。
Acknowledgments
ウィニー・ジャオとイン・チェン・ワンが原稿について有益なコメントをくれたことに感謝しています。この研究は、カナダ自然科学工学研究評議会(Grant #522691522691)の支援を受けた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.0 mm zirconia beads | Biospec Products Inc. | 11079124ZX | |
| 10 mL syringe | Fisher Scientific | 1482613 | |
| 5 μm filter | Millipore Sigma | SLSV025LS | |
| Axio Imager 2 | Zeiss | - | Fluorescent microscope for imaging of DY96- and FISH- stained worms on microscope slides |
| Axio Zoom V.16 Fluorescence Stereo Zoom Microscope | Zeiss | - | For live imaging of fluorescent transgenic animals to visualize the IPR |
| Baked EdgeGARD Horizontal Flow Clean Bench | Baker | - | |
| Bead disruptor, Genie SI-D238 Analog Disruptor Genie Cell Disruptor, 120 V | Global Industrial | T9FB893150 | |
| Cell-VU slide, Millennium Sciences Disposable Sperm Count Cytometers | Fisher Scientific | DRM600 | |
| Direct Yellow 96 | Sigma-Aldrich | S472409-1G | |
| EverBrite Mounting Medium with DAPI | Biotium | 23001 | |
| EverBrite Mounting Medium without DAPI | Biotium | 23002 | |
| Fiji/ImageJ software | ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | |
| Mechanical rotor | Thermo Sceintific | 415110 / 1834090806873 | Used to spin tubes of bleached embryos for overnight hatching |
| MicroB FISH probe | Biosearch Technologies Inc. | - | Synthesized with a Quasar 570 (Cy3) 5' modification and HPLC purified, CTCTCGGCACTCCTTCCTG |
| N2 | Wild-type, Bristol strain | Default strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771-100G | |
| Sodium hydroxide solution (5 N) | Fisher Chemical | FLSS256500 | |
| Sodium hypochlorite solution (6%) | Fisher Chemical | SS290-1 | |
| Stemi 508 Stereo Microscope | Zeiss | - | For daily maintenance of worms and counting of L1 worms for assay set ups |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379-100ML | |
| Vectashield + A16 | Biolynx | VECTH1500 |
References
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