Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Изучение наследственного иммунитета в модели caenorhabditis elegans инфекции microsporidia

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63636
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Molecular Genetics, University of Toronto

Summary

Заражение Caenorhabditis elegans микроспоридийным паразитом Nematocida parisii позволяет червям производить потомство, которое обладает высокой устойчивостью к одному и тому же патогену. Это пример унаследованного иммунитета, плохо изученного эпигенетического явления. Настоящий протокол описывает изучение унаследованного иммунитета в генетически податливой модели червя.

Abstract

Наследственный иммунитет описывает, как некоторые животные могут передать «память» о предыдущей инфекции своему потомству. Это может повысить устойчивость патогенов в их потомстве и способствовать выживанию. В то время как наследственный иммунитет был зарегистрирован у многих беспозвоночных, механизмы, лежащие в основе этого эпигенетического явления, в значительной степени неизвестны. Заражение Caenorhabditis elegans естественным микроспоридиевым патогеном Nematocida parisii приводит к тому, что черви производят потомство, которое устойчиво устойчиво к микроспоридиям. Настоящий протокол описывает изучение межпоколенческого иммунитета в простой и генетически поддающейся лечению модели инфекции N. parisii -C. elegans . В настоящей статье описаны методы заражения C. elegans и получения иммуно-праймированного потомства. Также приведены методы анализа устойчивости к микроспоридиозной инфекции путем окрашивания на микроспоридию и визуализации инфекции с помощью микроскопии. В частности, унаследованный иммунитет предотвращает инвазию клеток-хозяев микроспоридиями, а флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) может быть использована для количественной оценки событий инвазии. Относительное количество спор микроспоридии, продуцируемых в иммунно-праймированном потомстве, может быть количественно определено путем окрашивания спор хитин-связывающим красителем. На сегодняшний день эти методы пролили свет на кинетику и патогенную специфичность унаследованного иммунитета, а также на молекулярные механизмы, лежащие в его основе. Эти методы, наряду с обширными инструментами, доступными для исследований C. elegans , позволят сделать важные открытия в области унаследованного иммунитета.

Introduction

Наследственный иммунитет является эпигенетическим явлением, при котором родительское воздействие патогенов может обеспечить производство устойчивого к инфекции потомства. Этот тип иммунной памяти был показан у многих беспозвоночных, у которых отсутствует адаптивная иммунная система и которые могут защитить от вирусных, бактериальных и грибковых заболеваний1. В то время как унаследованный иммунитет имеет важные последствия для понимания как здоровья, так и эволюции, молекулярные механизмы, лежащие в основе этой защиты, в значительной степени неизвестны. Отчасти это связано с тем, что многие животные, у которых был описан унаследованный иммунитет, не являются установленными модельными организмами для исследований. Напротив, исследования прозрачной нематоды Caenorhabditis elegans извлекают выгоду из обширного генетического и биохимического инструментария 2,3, высоко аннотированного генома 4,5 и короткого времени генерации. Действительно, исследования c. elegans позволили добиться фундаментальных успехов в области эпигенетики и врожденного иммунитета 6,7, и в настоящее время это установленная модель для изучения иммунной памяти 8,9.

Микроспоридия являются грибковыми патогенами, которые заражают почти всех животных и вызывают смертельные инфекции у людей с ослабленным иммунитетом10. Инфекция начинается, когда спора микроспоридии вводит или «запускает» свое клеточное содержимое (спороплазму) в клетку-хозяина, используя структуру, называемую полярной трубкой. Внутриклеточная репликация паразита приводит к образованию меронтов, которые в конечном итоге дифференцируются в зрелые споры, которые могут выходить из клетки11,12. Хотя эти паразиты наносят ущерб как здоровью человека, так и продовольственной безопасности, еще многое предстоит узнать об их биологии инфекции12. Nematocida parisii – это естественный микроспоридиальный паразит, который реплицируется исключительно в кишечных клетках червей, что приводит к снижению плодовитости и, в конечном счете, гибели. Модель инфекции N. parisii -C. elegans была использована, чтобы показать: (1) роль аутофагии в клиренсе патогена13, (2) как микроспоридия может выходить из инфицированных клеток нелитически14, (3) как патогены могут распространяться от клетки к клетке, образуя синцитию15, (4) белки, используемые N. parisii для взаимодействия со своим хозяином16, и (5) регуляцию транскрипционного внутриклеточного ответа патогена (IPR)17, 18.

Протоколы заражения C. elegans описаны в текущей работе и могут быть использованы для выявления уникальной биологии микроспоридии и препарирования реакции хозяина на инфекцию. Микроскопия неподвижных червей, окрашенных хитин-связывающим красителем Direct Yellow 96 (DY96), показывает распространение инфекции хитинсодержащими спорами микроспоридий по всему кишечнику. Окрашивание DY96 также позволяет визуализировать хитинсодержащие эмбрионы червей для одновременной оценки гравидности червя (способности производить эмбрионы) в качестве считывания пригодности хозяина.

Недавняя работа показала, что C. elegans , инфицированные N. parisii , производят потомство, которое устойчиво устойчиво к той же инфекции19. Этот унаследованный иммунитет длится одно поколение и зависит от дозы, так как потомство от более сильно инфицированных родителей более устойчиво к микроспоридиям. Интересно, что потомство N. parisii-primed также более устойчиво к бактериальному кишечному патогену Pseudomonas aeruginosa, хотя они не защищены от естественного патогена вируса Orsay19. Настоящая работа также показывает, что иммунно-праймированное потомство ограничивает инвазию клеток хозяина микроспоридиями. Метод также описывает сбор иммунно-праймированного потомства и то, как FISH может быть использован для обнаружения N. parisii RNA в клетках кишечника для анализа инвазии клеток хозяина и сжигания спор20.

Вместе эти протоколы обеспечивают прочную основу для изучения микроспоридии и наследственного иммунитета у C. elegans. Есть надежда, что будущая работа в этой модельной системе позволит сделать важные открытия в зарождающейся области унаследованного иммунитета. Эти методы также, вероятно, станут отправными точками для исследования наследственного иммунитета, вызванного микроспоридией, у других организмов-хозяев.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

В настоящем исследовании используется штамм C. elegans Bristol N2 дикого типа, выращенный при 21 °C.

1. Подготовка СМИ

  1. Подготовка носителей M9 в соответствии с предыдущим отчетом21,22.
  2. Подготовьте питательную среду нематоды (NGM), как указано в предыдущем отчете 21,22. Налейте 12 мл NGM на пластину размером 6 см или 30 мл на пластину размером 10 см.
  3. Приготовьте штамм Escherichia coli OP50-1 согласно предыдущему отчету23.
  4. Подготовьте пластины NGM, посеянные OP50-1, следуя приведенным ниже шагам.
    1. Повторное суспендирование 10x концентрированного OP50-1 путем вихря.
    2. Используйте пипетку-ретранслятор, чтобы засеять пластины в центре. Для пластин размером 6 см и 10 см семена объемом 200 мкл или 500 мкл соответственно.
    3. Для пластин размером 10 см используйте стеклянный распределитель, чтобы распределить OP50-1 и создать газон из бактерий. Не распространяйте бактерии на самый край пластины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этанол погружайте и поджигайте разбрасыватель через каждые пять пластин для обеспечения стерильности. Дайте распределителю остыть в течение нескольких секунд перед распространением, чтобы предотвратить уничтожение бактерий.
    4. Оставьте пластины комнатной температуры на 2 дня для высыхания и обеспечения роста бактериального газона.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Семенные пластины можно хранить при комнатной температуре в течение 2-3 недель или при 4 °C до 1 месяца.

2. Содержание C. elegans

  1. Поддерживайте червей на постоянном бактериальном источнике пищи на op50-1-семенных пластинах NGM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Голодание может привести к фенотипам между поколениями, что может повлиять на результаты. 10-см OP50-1-семенная пластина поддерживает 2 500 L1s (самая ранняя личиночная стадия C. elegans) в течение 72 ч.
  2. Если черви голодают, выращивайте в течение трех поколений на OP50-1, прежде чем использовать червей для экспериментов.

3. Синхронизация популяций C. elegans с использованием гипохлорита натрия (отбеливание)

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг очень чувствителен ко времени, поэтому убедитесь, что центрифуга доступна перед началом. Альтернативные, менее быстрые протоколы отбеливания доступны в литературе и могут быть использованы при желании. Чтобы предотвратить потерю активности 6% гипохлорита натрия с течением времени, храните реагент в темноте при 4 °C и храните его до 1 года.

  1. Готовят 2 мл отбеливающего раствора для каждого образца, смешивая 400 мкл 1 M NaOH, 250 мкл 6% гипохлорита натрия (см. Таблицу материалов) и 1350 мкл дистиллированной воды.
  2. Смывайте взрослых червей (~ 72 ч после вылупления) с пластин в микроцентрифужную трубку, используя 1 мл среды M9.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если на пластинах остается много червей, гранулируйте червей центрифугированием при 1 400 х г в течение 30 с при комнатной температуре, удалите супернатант с помощью наконечника пипетки объемом 1 мл и выполните дополнительные промывки пластин.
  3. Центрифуга при 1 400 х г в течение 30 с при комнатной температуре гранулирует червей, затем промывает 2 раза 1 мл среды M9 для удаления бактерий.
  4. Удалите надосадочное вещество, добавьте 1 мл приготовленного отбеливающего раствора (Шаг 3.1.) и установите таймер на 1 мин. Инвертировать трубки в 3-4 раза.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Под световым микроскопом можно увидеть, как черви перестают метаться.
  5. Через 1 мин центрифугируют при 3000 х г в течение 30 с при комнатной температуре, чтобы гранулировать червей, затем удалить надосадочное вещество и добавить 1 мл свежего раствора отбеливателя.
  6. Внимательно следите за трубкой (трубками) под световым микроскопом, чтобы визуализировать туши червей, расщепляющиеся и высвобождающие эмбрионы. Немедленно переходите к следующему шагу, когда ~ 50%-80% туш раскололись и многие эмбрионы были выпущены.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от количества животных и штамма червя, этот шаг может занять от 15 с до 4 минут. По неизвестным причинам зараженным N. parisii червям часто требуется больше времени для отбеливания, чем неинфицированным животным.
  7. Центрифугу при 3000 х г в течение 30 с при комнатной температуре гранулируют эмбрионы, затем промывают 3 раза в 1 мл среды M9.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Промывки разбавляют остаточный раствор гипохлорита из пробирок и должны быть выполнены быстро, чтобы убедиться, что раствор отбеливателя не повреждает эмбрионы.
  8. Добавьте 1 мл среды M9 к конечной грануле и переложите в коническую трубку 15 мл, содержащую 4 мл среды M9. Приостанавливать эмбрионы в конечном объеме 5 мл.
  9. Вращайте трубки на механическом роторе (см. Таблицу материалов) при 21 °C в течение 18-24 ч, чтобы вылупить эмбрионы в L1s.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку N. parisii заражает кишечник червя и не вторгается в зародышевую линию, инфицированные родители не передают инфекцию своему потомству путем вертикальной передачи19. Обесцвечивание инфицированных взрослых особей синхронизирует животных F1 и уничтожает споры N. parisii , гарантируя, что потомство F1 не заражено спорами, перенесенными от родителей.
  10. Центрифугируйте трубки в течение 1 мин при 1 800 х г при комнатной температуре, чтобы гранулировать L1s, и выбросьте все, кроме 1 мл супернатанта.
  11. Пипетка 1-5 мкл смеси L1 на несеянную пластину NGM и сразу же подсчитывает количество L1s в капле, визуализируя под световым микроскопом. Повторите 3x и усредните подсчеты, чтобы определить концентрацию и общее количество L1s.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство эмбрионов должны быть вылуплены, а L1 должны быстро перемещаться в капле жидкости. Если большая доля невылупившихся эмбрионов и летаргических (медленно движущихся) L1 остается, это указывает на слишком долгое обесцвечивание.

4. Подготовка спор N. parisii

  1. Подготовьте споры N. parisii по ранее опубликованным ссылкам19,24.

5. Заражение C. elegans N. parisii с целью получения иммунно-праймированного потомства

  1. За сутки до планируемых инфекций переместите необходимое количество 10 см несеянных пластин NGM с 4 °C до комнатной температуры.
  2. Непосредственно перед заражением центрифуга ~2 500 синхронизированных червей L1 при 1 400 х г в течение 30 с при комнатной температуре в микроцентрифужной трубке для гранулирования червей. Удалите супернатант кончиком пипетки, чтобы оставить червей в ~ 50 мкл среды M9.
  3. Добавьте 1 мл 10x OP50-1 к спорам L1s и N. parisii к желаемой концентрации (обычно ~2,5 млн спор). В качестве неинфицированного контроля готовят эквивалентную трубку L1s и OP50-1 с объемом среды M9, эквивалентным объему используемого спорового препарата.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы получить потомство с иммунной подготовкой, используйте дозу спор, достаточно высокую, чтобы >90% животных были инфицированы через 72 ч (как измерено окрашиванием DY96, шаг 7), но достаточно низкую, чтобы >80% животных все еще были гравидными. Это гарантирует, что большинство потомства происходит от инфицированных родителей и что отбеливание родителей дает достаточное количество эмбрионов для тестирования F1. Хотя споровые препараты различаются по концентрации и инфекционности, подходящая родительская доза обычно составляет от 5 до 15 мкл спорового препарата (~ 2,5 миллиона спор) на пластину размером 10 см.
  4. Вихрь ненадолго, чтобы смешать и покрыть вышеуказанный 1 мл червей на 10-сантиметровой несеянной пластине NGM. Закрутите, чтобы жидкость растеклась по всей тарелке.
  5. Высушите пластины в чистом шкафу со снятыми крышками в течение 10-20 мин или до полного высыхания, перед инкубацией при 21 °C в течение 72 ч.
  6. Через 72 ч после заражения (hpi) смойте червей с пластин в микроцентрифужную трубку, используя 1 мл среды M9. Если на пластинах остается много червей, гранулируйте червей центрифугированием при 1 400 х г в течение 30 с, удалите супернатант и выполните дополнительные промывки пластин.
  7. Центрифугу при 1 400 х г в течение 30 с при комнатной температуре вымыть гранулированным червям, промыть 2 раза 1 мл среды M9 или до тех пор, пока супернатант не станет прозрачным. Повторное суспендирование в итоговом объеме 1 мл носителя M9.
  8. Пипетка вверх и вниз, чтобы перемешать, затем переложить 100 мкл взвешенных червей в свежую трубку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот образец из ~ 250 взрослых может быть позже исправлен и окрашен для определения пригодности и инфекции родительского червя, как описано в Шаге 7 и начале Шага 3.
  9. Чтобы вскрыть взрослых червей и выпустить эмбрионы F1 для тестирования, отбеливайте оставшиеся 900 мкл взвешенных червей, как описано в Шаге 3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг также уничтожает любые споры N. parisii перед последующими анализами инфекции.

6. Тестирование унаследованного иммунитета к N. parisii у C. elegans

  1. Выполняйте инфекции, как описано в шагах 5.1.-5.6., с изменениями, как указано ниже.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Анализы инфекции на F1 могут быть уменьшены и выполнены на 6 см пластинах NGM с использованием ~ 1000 червей L1 и 400 мкл 10x OP50-1. Также должна быть использована «высокая» доза спор, так что ~ 100% наивных F1 (то есть червей от неинфицированных родителей) инфицированы, и только ~ 10% наивных F1 являются гравидными. Хотя споровые препараты различаются по концентрации и инфекционности, подходящая доза обычно составляет от 5 до 15 мкл (~ 2,5 миллиона спор) на пластину размером 6 см.
  2. При 72 hpi зафиксируйте и окрашивайте, чтобы определить пригодность червя и инфекционный статус, как описано в шаге 7.

7. Окрашивание DY96 C. elegans для визуализации эмбрионов и спор микроспоридий

ПРИМЕЧАНИЕ: DY96 представляет собой зеленый флуоресцентный хитин-связывающий краситель, который окрашивает эмбрионы червей и микроспоридии споровые стенки 19,15,25. Это позволяет одновременно контролировать пригодность и инфекционный статус глистов.

  1. Смойте червей с пластин в микроцентрифужную трубку, используя 1 мл среды M9, содержащей 0,1% Tween-20. Если на пластинах остается много червей, гранулируйте червей центрифугированием при 1 400 х г в течение 30 с при комнатной температуре, удалите супернатант с помощью наконечника пипетки и выполните дополнительные промывки пластин.
  2. Центрифугу при 1 400 х г в течение 30 с при комнатной температуре гранулируют червей и промывают 2 раза 1 мл среды M9, содержащей 0,1% Tween-20 или до тех пор, пока супернатант не станет прозрачным.
  3. Удалите надосадочное вещество, добавьте 700 мкл ацетона и оставьте червей зафиксировать при комнатной температуре в течение 10 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе черви могут храниться при -20 °C для обработки до нескольких месяцев спустя, если это необходимо.
  4. Центрифугу при 10 000 х г в течение 30 с при комнатной температуре гранулируют неподвижных червей и промывают 2 раза 1 мл PBS, содержащим 0,1% Tween-20 (PBST).
  5. Приготовьте 50 мл рабочего раствора DY96: PBST, 0,1% (v/v) додецилсульфата натрия (SDS) и 20 мкг/мл DY96 (из запасного раствора 5 мг/мл в дистиллированной воде) (см. Таблицу материалов). Заверните трубку в фольгу и храните ее в ящике, чтобы предотвратить воздействие света.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Запасы DY96 и рабочие растворы могут храниться в течение >1 года при комнатной температуре при хранении в темноте.
  6. Центрифуга при 10 000 х г в течение 30 с при комнатной температуре гранулирует червей и удаляет надосадочное вещество. Добавьте в гранулу 500 мкл рабочего раствора DY96 и вращайте в течение 30 мин при комнатной температуре.
  7. Центрифуга при 10 000 х г в течение 30 с при комнатной температуре для гранулирования червей. Удалите супернатант и добавьте 15 мкл монтажного носителя с DAPI/без него (см. Таблицу материалов).
  8. Пипетку 10 мкл раствора, содержащего окрашенных червей, на предметное стекло микроскопа и поместите сверху крышку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Слайды и дополнительные образцы могут храниться при температуре 4 °C в темноте для длительного хранения.

8. Визуализация и анализ червей, окрашенных DY96, для оценки пригодности червей и инфекционного статуса

  1. Чтобы проанализировать окрашенных DY96 червей (установленных на слайдах, как в Шаге 7.8.), выполните визуализацию с использованием канала GFP флуоресцентного микроскопа.
  2. Чтобы определить пригодность популяций червей, используйте объектив 5x или 10x для анализа серьезности >100 червей на состояние.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Черви, несущие эмбрион ≥1, считаются гравидными. Механические счетчики клеток могут помочь свести к минимуму человеческую ошибку при подсчете. Эмбрионы червей менее окрашены (менее флуоресцентны), чем споры микроспоридий19. Эмбрионы яйцевидные, ~50 мкм х ~30 мкм, и обнаруживаются в средней части тела здоровых взрослых особей C. elegans . Здоровые, неинфицированные взрослые вынашивают 10-20 эмбрионов, организованных в ряды вдоль их тела длиной26.
  3. Чтобы выявить более тонкие различия в физической форме, выполните подсчет эмбрионов. Для этого вручную подсчитайте количество эмбрионов у 20-30 отдельных глистов на каждое состояние.
  4. Чтобы определить, насколько заражены популяции червей, используйте объектив 5x-40x для оценки инфекционного статуса >100 червей на состояние. Черви, содержащие любое количество внутриклеточных спор кишечника, считаются инфицированными.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Споры microsporidia ярче, чем эмбрионы червей. Бобовидные споры N. parisii составляют ~ 2,2 мкм х ~ 0,8 мкм и производятся в клетках кишечника червя от ~ 48 hpi15. Зараженными не считаются черви, у которых споры видны исключительно в просвете кишечника, а не вдоль стенок кишечника19. Это связано с тем, что эти споры, вероятно, представляют собой вновь проглоченные споры, которые не являются результатом инфекции человека.
  5. Используя программное обеспечение для анализа изображений (см. Таблицу материалов), количественно оцените нагрузку паразитов и размер червя, выполнив следующие действия.
    1. Изображение 20-30 червей, установленных на предметных стеклах микроскопа с помощью флуоресцентного вертикального стереоскопа для каждого образца. Захват изображений в каналах Brightfield, DAPI и GFP. Выберите соответствующее воздействие в канале GFP таким образом, чтобы флуоресценция в наиболее инфицированных образцах не была насыщенной.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Инфекция все еще может быть визуализирована в наименее инфицированных образцах. Изображения обычно делаются с использованием 5-кратного объектива.
    2. Откройте файлы в FIJI/ImageJ. В зависимости от типа файла для открытия изображений в ImageJ может потребоваться плагин Bio-Formats Importer.
    3. Очертите 20–30 отдельных червей на изображениях с помощью изображений brightfield или DAPI и инструмента выделения «Полигоны» на панели инструментов. Сохраните каждый контур с помощью менеджера инструментов анализа > > регионов (ROI) в раскрывающемся меню, нажав кнопку Добавить [t]. Очертите животных, которые полностью видны в кадре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Контуры червей могут быть пересмотрены позже, сохранив файл с контурами в виде Tiff.
    4. Нажмите « Отменить выбор» в менеджере ROI , чтобы удалить все контуры с изображения, и нажмите «Изображение > дубликат » в раскрывающемся меню. Введите число, соответствующее интересующему каналу, в поле «Каналы», чтобы дублировать канал GFP для бремени паразитов (например, 2).
    5. Порог этого канала с помощью Image > Отрегулируйте порог > до уровня, на котором захватывается яркая нагрузка паразитов, а тусклая флуоресценция от эмбрионов червей нет, а затем нажмите «Применить». Обратите внимание на применяемые пороговые значения и используйте их последовательно для всех изображений одного и того же эксперимента.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте пороговое значение как для наименьшего, так и для наиболее зараженного образца, прежде чем анализировать все изображения.
    6. Выберите Анализировать > Устанавливать измерения и установите флажок Фракция площади. Выберите контуры отдельных червей по очереди из менеджера ROI и нажмите на функцию «Анализ > мера ». Окно результатов обеспечит измерение %Area (т.е. % бремени паразитов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если флуоресценция эмбрионов настолько яркая, что она пересекает порог, инструмент Paintbrush в черном цвете на панели инструментов можно использовать для ручного стирания этих областей перед измерением %Area.
    7. Чтобы определить размер червя как показания пригодности, очертите червей, как описано в шаге 8.3. Выберите Анализировать > Задать измерения и установите флажок Область. Выберите контуры отдельных червей по очереди из менеджера ROI и нажмите на функцию «Анализ > измерение ». Окно Результаты предоставит измерение для %Area.

9. Анализ FISH для оценки инвазии C. elegans путем микроспоридии и сжигания спор

ПРИМЕЧАНИЕ: Зонд MicroB FISH распознает законсервированную область микроспоридиальной 18-й рРНК и может быть использован для маркировки внутриклеточных спороплазм (т.е. захваченных клеток-хозяев) и генетического материала в спорах.

  1. Заразить 6000 синхронизированных отбеливателем червей L1 с 4 миллионами спор N. parisii и 10 мкл 10x OP50-1 в конечном объеме 400 мкл, который состоит из среды M9.
  2. Выложить смесь на 6 см несеянную пластину NGM, высушить в чистом шкафу в течение 10-20 мин и поставить при 21 °C.
  3. Через 30 мин смойте животных с пластин 1 мл среды M9, содержащей 0,1% Tween-20.
  4. Гранулируют червей центрифугированием при 1 400 х г в течение 1 мин при комнатной температуре.
  5. Удалите супернатант с помощью наконечника пипетки, добавьте 700 мкл ацетона и дайте ему постоять в течение 10 минут при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе черви могут храниться при -20 °C для обработки в более позднее время.
  6. Выполните ночной анализ FISH с использованием зонда MicroB после ранее опубликованных отчетов27,19.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки распыления спор дополните конечные 500 мкл промывочного буфера 20 мкг/мл DY96 к образцам и вращайте в течение 30 мин при 21 °C, прежде чем продолжить протокол в обычном режиме.
  7. Храните слайды в коробке для слайдов при температуре 4 °C. Для длительного хранения (т.е. несколько месяцев) храните дополнительные образцы в микроцентрифужных трубках при температуре 4 °C в темноте.
  8. Чтобы оценить инвазию у червей, окрашенных FISH, посмотрите на червей, используя красный канал флуоресцентного микроскопа. Визуализируйте инфекционные события при большом увеличении (объектив в 63 раза), поскольку животные L1 маленькие, а спороплазмы будут находиться на ранних стадиях репликации. Чтобы оценить стрельбу спорами, используйте объектив 63x и красные и зеленые флуоресцентные каналы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Споры, в которых сигналы GFP и mCherry колокализуются, считаются необработанными; пустые споры GFP считаются уволенными.
  9. Чтобы проанализировать инвазию или сжигание спор, вручную подсчитайте количество спороплазм (очаги вишни в клетках кишечника) или процент спор, выпущенных у 20-30 червей на состояние. Отрегулируйте фокус в z-плоскости, чтобы захватить все события заражения и споры, которые часто встречаются в разных плоскостях.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Спороплазмы обнаруживаются исключительно в клетках кишечника. Самая высокая концентрация спороплазм обычно обнаруживается сразу после глотки. Если образцы также окрашены DY96, ищите наличие спороплазм, которые не колокализуются со спорой.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В настоящем исследовании родительские популяции C. elegans (P0) были инфицированы на стадии L1 низкой дозой спор N. parisii . Эти инфекционные состояния обычно используются для получения большого количества микроспоридиа-резистентного потомства F1 путем отбеливания родителей. Инфицированные родительские популяции и неинфицированные контрольные группы были зафиксированы на уровне 72 hpi и окрашены DY96 для визуализации эмбрионов червей и спор микроспоридии (рисунок 1A). Инфицированные животные маленькие, содержат много спор микроспоридий и производят меньше эмбрионов, чем здоровые неинфицированные контрольные группы. Оценка червячности показала, что ~95% неинфицированных животных произвели потомство, по сравнению с менее чем 80% инфицированных животных (Рисунок 1B). Количественные оценки показали, что ~ 90% населения, получавшего микроспоридии, были инфицированы, что определяется количеством червей, содержащих споры, окрашенные DY96 (рисунок 1C). Чтобы получить иммунозагрунтованное потомство F1, важно использовать дозу микроспоридии, которая достаточно высока, чтобы обеспечить инфицирование большинства родителей, но достаточно низка, чтобы гарантировать, что популяция все еще может производить потомство. Приведена таблица доз микроспоридий, используемых для получения данных в данном исследовании (таблица 1).

Неинфицированные и инфицированные родительские популяции (рисунок 1) обрабатывали гипохлоритом натрия при 72 hpi для получения наивных и иммунозагрунтованных потомков F1. Животные F1 подвергались воздействию высокой дозы спор N. parisii на стадии L1 для проверки унаследованного иммунитета к микроспоридиям. При 72 hpi животных F1 фиксировали и окрашивали DY96 для оценки устойчивости к микроспоридиям (рисунок 2A). Количественная оценка этих фиксированных животных показала, что праймированные черви содержали значительно больше эмбрионов, чем их наивные собратья, что указывает на большую приспособленность перед лицом инфекции (рисунок 2B). FIJI/ImageJ использовался для определения паразитарной нагрузки отдельных наивных и иммунных червей (т.е. процента тела, заполненного флуоресцентными спорами N. parisii ) (рисунок 2C). Количественные оценки показали резкое снижение бремени паразитов червей, которые пришли от инфицированных родителей (рисунок 2D). Кроме того, расчеты размера отдельных червей показали, что праймированные черви имели значительное преимущество роста перед наивными животными перед лицом инфекции N. parisii (рисунок 2E). Эти данные показывают, что родители, инфицированные N. parisii, производят потомство с высоким уровнем устойчивости к микроспоридиям.

Предыдущая работа показала, что наследственный иммунитет к микроспоридиям уменьшает инвазию кишечных клеток N. parisii19. Чтобы визуализировать различия в инвазии клеток хозяина, наивные и иммунные животные (полученные от неинфицированных или инфицированных родителей, как указано выше) подвергались воздействию максимальной дозы N. parisii на стадии L1. При 30 dpi черви были зафиксированы и окрашены совместно, используя зонд FISH для обнаружения РНК N. parisii и DY96 для обнаружения споровых стенок N. parisii . Визуализация показала, что, в то время как наивные животные обычно содержали несколько спор и несколько инфицированных клеток (спороплазм), у праймированных животных было гораздо меньше (или нет) спор и, как правило, нет спороплазм (рисунок 3).

Figure 1
Рисунок 1: Прямое желтое окрашивание 96 (DY96) неинфицированных и инфицированных N. parisii C. elegans выявляет гравидность червя и инфекционный статус. (А-С) N2 C. elegans не были инфицированы или инфицированы низкой дозой N. parisii на стадии L1. При 72 hpi черви были зафиксированы, окрашены DY96 и сфотографированы для оценки серьезности червя и инфекционного статуса. (A) Показаны репрезентативные изображения. DY96 позволяет визуализировать эмбрионы червей и споры микроспоридий (хитин). На правой стороне показано вставное изображение зараженного червя. Эмбрионы помечены буквой «Е»; N. parisii инфекция кишечника помечена как 'Np'. Шкала для левого и среднего изображений = 500 мкм. Шкала для правильного изображения = 100 мкм. (B) Черви, несущие один или несколько эмбрионов, были оценены как гравид и отобразились на графике. (C) Черви, несущие любое количество спор N. parisii в клетках кишечника, были оценены как инфицированные и нанесены на график. (Б-С) Данные объединены из 5 независимых экспериментов с использованием n = 100 червей на условие в эксперименте. Показано среднее ± SEM. Значения p были определены непарным двуххвостым t-тестом студента. Значимость определялась как: *p < 0,05; p < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Прямое окрашивание желтым цветом 96 (DY96) наивных и иммунных C. elegans для определения эмбрионов на червя, бремени микроспоридий и размера червя. (A) N2 C. elegans были инфицированы или не инфицированы низкой дозой N. parisii на стадии L1. При 72 hpi червей обрабатывали гипохлоритом натрия для высвобождения эмбрионов. Полученное наивное и иммунно-праймированное потомство было инфицировано высокой дозой N. parisii на стадии L1. При 72 hpi черви были зафиксированы, окрашены DY96 и изображены для визуализации эмбрионов червей и бремени паразитов. Показаны репрезентативные изображения. Шкала = 200 мкм.(B) Количество эмбрионов на червя было подсчитано и отображено на графике от (A). (C) На снимке экрана fiji/ImageJ показаны наивные черви с панели A , которые были пороговыми для визуализации бремени паразитов (показаны белым цветом) с помощью окна Thresholding в правом нижнем углу. Здесь отдельные черви были выделены с помощью инструмента «Выбор полигонов», выделенного красным цветом и определенного как «Регион интересов» (ROI) с помощью окна ROI в правом верхнем углу. Функция «Анализ > мера > площади » была использована для количественной оценки бремени паразитов двух примеров червей, которое, как было показано, составляет 25,02% и 13,49%. (D) Бремя паразитов на червя было определено и отображено на графике из пункта (A). (E) На основе приведенных выше изображений отдельный размер червя был рассчитан по животным, изображенным на панели C , с использованием функции «Анализ > измерение > площади ». (B, D и E) Показано среднее ± SEM. Значения p определялись непарным двуххвостым t-тестом Стьюдента. Значимость определялась как: *p < 0,05. **p < 0,01, ***p < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) против N. parisii 18S рРНК выявляет паразитарную инвазию клеток кишечника C. elegans у наивных, но не праймированных животных. N2 C. elegans были инфицированы или не инфицированы низкой дозой N. parisii на стадии L1. При 72 hpi червей обрабатывали гипохлоритом натрия для высвобождения эмбрионов. Полученное наивное и иммунно-праймированное потомство было заражено максимальной дозой N. parisii на стадии L1. При 30 mpi черви были зафиксированы, подвергнуты FISH для обнаружения спороплазм, окрашены DY96 для обнаружения микроспоридийных споровых стенок и визуализированы. Показаны репрезентативные изображения. На снимках вставок для наивного червя показаны спороплазмы (красный, звездочки), запущенные споры (зеленый, наконечники стрел) и необожженная спора (желтый, стрела). Показанный наивный зараженный червь отображает 4 спороплазмы. Шкала = 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

N. parisii доза Пластинчатая концентрация (спор/см2) Миллионы спор на пластину размером 6 см Миллионы спор на пластину размером 10 см
Низкий 35,400 - 2.7
Высокий 88,400 2.5 -
Максимальный 2,12,000 6 -

Таблица 1: Дозы N. parisii , используемые в исследовании.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Настоящий протокол описывает изучение микроспоридии и наследственного иммунитета в простой и генетически поддающейся лечению модели инфекции N. parisii -C. elegans .

Подготовка спор представляет собой интенсивный протокол, который обычно дает достаточно спор в течение 6 месяцев экспериментов, в зависимости от продуктивности24. Важно отметить, что инфекционность должна быть определена для каждой новой споровой «партии», прежде чем использовать ее для экспериментов. Из-за изменчивости инфекционности между споровыми препаратами для всех повторов эксперимента необходимо последовательно использовать одну партию. Отдельные аликвоты не следует размораживать и повторно замораживать, так как оттаивание может привести к возгоранию спор и снижению инфекционности. Таким образом, споры должны быть удалены из морозильной камеры при температуре -80 ° C непосредственно перед заражением и сохранены на льду во время скамьи.

На шагах 5-6 были описаны анализы инфекции. Во время анализов на инфекцию важно избегать загрязнения или голодания животных, так как это может привести к дополнительным эффектам между поколениями, которые мешают иммунитету у F1s. Важным ограничением анализа унаследованного иммунитета является то, что более инфицированные родители производят меньше потомства F1. Поэтому важно соблюдать тщательный баланс между родительским поколением, достаточно инфицированным, чтобы передать иммунитет, и достаточно здоровым, чтобы произвести потомство для тестирования. Хотя текущий протокол описывал анализы инфекции для животных L1, протокол может быть изменен для проверки влияния инфекции микроспоридии на по-разному стадийных родителей и сохранения иммунитета у старшего потомства. Методы также могут быть модифицированы для проверки воздействия множественных или различных напряжений (например, осмотический стресс, стресс тяжелых металлов, коинфекция с другим патогеном) на унаследованный иммунитет. В то время как унаследованный иммунитет к N. parisii у C. elegans является межпоколенческим (т. е. длится одно поколение)19, протокол может быть адаптирован для изучения дальнейших поколений для проверки трансгенерационных эффектов. В то время как предоставленные протоколы специфичны для инфекции N. parisii, существует много других видов микроспоридий, заражающих нематоды,28. Протоколы могут быть адаптированы для изучения унаследованного иммунитета к другим инфицирующим кишечник (например, Nematocida ausubeli) и эпидермально- и мышечным инфекциям (например, Nematocida displodere) микроспоридиям29,30. C. elegans также заражены многими другими природными и человеческими патогенами (бактериальными, грибковыми и вирусными). Методы, описанные здесь, могут быть использованы для проверки унаследованного иммунитета к другим патогенам у C. elegans и патогенной специфичности унаследованного иммунного ответа на N. parisii. C. elegans является устоявшимся модельным организмом. Однако другие представители рода Caenorhabditis, включая гермафродитные виды C. tropicalis и C. briggsae и мужско-женский вид C. kamaaina, также заражены в той или иной степени N. parisii31. Внося небольшие изменения в предоставленные протоколы, наследственный иммунитет также может быть проверен на этих животных.

На этапе 8 были приведены быстрые и простые методы определения различий в восприимчивости к микроспоридии у червей, окрашенных DY96 (т.е. % инфицированных животных, % животных). Однако иногда эти методы недостаточно чувствительны, чтобы обнаружить небольшие изменения в иммунитете и приспособленности. Это связано с тем, что червь с одним эмбрионом и многими инфицированными клетками будет рассматриваться так же, как червь с 10 эмбрионами и одной инфицированной клеткой. Таким образом, методы с более тонким разрешением также были предоставлены для определения исходов инфекции у этих животных (т. Е. % бремени паразитов, количество эмбрионов, размер червя). Хотя оба метода могут быть использованы, фенотипические различия, как правило, более выражены с последним, что облегчает обнаружение значительных различий. Будущие адаптации к этому методу могут включать использование машинного обучения для автоматизации анализа.

На шаге 9 были предложены методы анализа инвазии клеток хозяина с помощью микроспоридии и сжигания спор с использованием FISH. В то время как DY96 маркирует микроспоридию сильным флуоресцентным зеленым сигналом, другие красители, включая липофильное пятно Nile Red и хитин-связывающий Calcofluor White, также могут быть использованы для окрашивания N. parisii 30,32,33. Настоящий протокол описывает фиксацию с использованием ацетона и хорошо работает для обнаружения микроспоридии с окрашиванием DY96 и FISH. Однако фиксация 4% параформальдегидом может помочь сохранить морфологию тканей и улучшить сигнал в некоторых протоколах визуализации.

Микроспоридия является недостаточно изученным патогеном, и большая часть клеточной биологии инфекции остается неизвестной. C. elegans является простым модельным организмом, и эти протоколы могут служить платформой для понимания ключевых процессов, связанных с инфекцией и защитой хозяина от этого паразита. Унаследованный иммунитет является новой областью, и многие вопросы остаются нерешенными1. Как инфицированные родители передают иммунитет потомству (материнское обеспечение или измененная транскрипционная регуляция в потомстве)? Что опосредует иммунитет у потомства (антимикробные пептиды или другие иммунные белки)? Насколько патогенно-специфическими являются унаследованные иммунные реакции, и насколько сохраняется унаследованный иммунитет между видами? Учитывая обширные инструменты, доступные с C. elegans, исследования, основанные на описанном здесь протоколе, вполне готовы ответить на эти фундаментальные вопросы наследственного иммунитета.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы благодарны Винни Чжао и Инь Чэнь Вану за полезные комментарии к рукописи. Эта работа была поддержана Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (грант No 522691522691).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.0 mm zirconia beads Biospec Products Inc. 11079124ZX
10 mL syringe Fisher Scientific 1482613
5 μm filter Millipore Sigma SLSV025LS
Axio Imager 2 Zeiss - Fluorescent microscope for imaging of DY96- and FISH- stained worms on microscope slides
Axio Zoom V.16 Fluorescence Stereo Zoom Microscope Zeiss - For live imaging of fluorescent transgenic animals to visualize the IPR
Baked EdgeGARD Horizontal Flow Clean Bench Baker -
Bead disruptor, Genie SI-D238 Analog Disruptor Genie Cell Disruptor, 120 V Global Industrial T9FB893150
Cell-VU slide, Millennium Sciences Disposable Sperm Count Cytometers Fisher Scientific DRM600
Direct Yellow 96 Sigma-Aldrich S472409-1G
EverBrite Mounting Medium with DAPI Biotium 23001
EverBrite Mounting Medium without DAPI Biotium 23002
Fiji/ImageJ software ImageJ https://imagej.net/software/fiji/downloads
Mechanical rotor Thermo Sceintific 415110 / 1834090806873 Used to spin tubes of bleached embryos for overnight hatching
MicroB FISH probe Biosearch Technologies Inc. - Synthesized with a Quasar 570 (Cy3) 5' modification and HPLC purified, CTCTCGGCACTCCTTCCTG
N2 Wild-type, Bristol strain Default strain Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich L3771-100G
Sodium hydroxide solution (5 N) Fisher Chemical FLSS256500
Sodium hypochlorite solution (6%) Fisher Chemical SS290-1
Stemi 508 Stereo Microscope Zeiss - For daily maintenance of worms and counting of L1 worms for assay set ups
Tween-20 Sigma-Aldrich P1379-100ML
Vectashield + A16 Biolynx VECTH1500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tetreau, G., Dhinaut, J., Gourbal, B., Moret, Y. Trans-generational immune priming in invertebrates: current knowledge and future prospects. Frontiers in Immunology. 10, 1938 (2019).
  2. Au, V., et al. CRISPR/Cas9 methodology for the generation of knockout deletions in Caenorhabditis elegans. G3 Genes|Genomes|Genetics. 9 (1), 135-144 (2019).
  3. Kamath, R. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
  4. The C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).
  5. Yoshimura, J., et al. Recompleting the Caenorhabditis elegans genome. Genome Research. 29, 1009-1022 (2019).
  6. Weinhouse, C., Truong, L., Meyer, J. N., Allard, P. Caenorhabditis elegans as an emerging model system in environmental epigenetics: C. elegans as an environmental epigenetics model. Environmental and Molecular Mutagenesis. 59 (7), 560-575 (2018).
  7. Ermolaeva, M. A., Schumacher, B. Insights from the worm: the C. elegans model for innate immunity. Seminars in Immunology. 26 (4), 303-309 (2014).
  8. Willis, A. R., Sukhdeo, R., Reinke, A. W. Remembering your enemies: mechanisms of within-generation and multigenerational immune priming in Caenorhabditis elegans. TheFEBS Journal. 288 (6), 1759-1770 (2020).
  9. Burton, N. O., et al. Cysteine synthases CYSL-1 and CYSL-2 mediate C. elegans heritable adaptation to P. vranovensis infection. Nature Communications. 11, 1741 (2020).
  10. Wadi, L., Reinke, A. W. Evolution of microsporidia: an extremely successful group of eukaryotic intracellular parasites. PLoS Pathogens. 16, 1008276 (2020).
  11. Han, B., Takvorian, P. M., Weiss, L. M. Invasion of host cells by microsporidia. Frontiers in Microbiology. 11, 172 (2020).
  12. Tamim El Jarkass, H., Reinke, A. W. The ins and outs of host-microsporidia interactions during invasion, proliferation and exit. Cellular Microbiology. 22 (11), 13247 (2020).
  13. Balla, K. M., Lažetić, V., Troemel, E. R. Natural variation in the roles of C. elegans autophagy components during microsporidia infection. PLoS ONE. 14, 0216011 (2019).
  14. Szumowski, S. C., Estes, K. A., Troemel, E. R. Preparing a discreet escape: Microsporidia reorganize host cytoskeleton prior to non-lytic exit from C. elegans intestinal cells. Worm. 1 (4), 207-211 (2012).
  15. Balla, K. M., Luallen, R. J., Bakowski, M. A., Troemel, E. R. Cell-to-cell spread of microsporidia causes Caenorhabditis elegans organs to form syncytia. Nature Microbiology. 1 (11), 1-6 (2016).
  16. Reinke, A. W., Balla, K. M., Bennett, E. J., Troemel, E. R. Identification of microsporidia host-exposed proteins reveals a repertoire of rapidly evolving proteins. Nature Communications. 8, 14023 (2017).
  17. Bakowski, M. A., et al. Ubiquitin-mediated response to microsporidia and virus infection in C. elegans. PLoS Pathogen. 10, 1004200 (2014).
  18. Reddy, K. C., et al. An intracellular pathogen response pathway promotes proteostasis in C. elegans. Current Biology. 27 (22), 3544-3553 (2017).
  19. Willis, A. R., et al. A parental transcriptional response to microsporidia infection induces inherited immunity in offspring. Science Advances. 7 (19), (2021).
  20. Tamim El Jarkass, H., et al. An intestinally secreted host factor promotes microsporidia invasion of C. elegans. eLife. 11, 72458 (2022).
  21. Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. Journal of Visualized Experiments. 49, 2496 (2011).
  22. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  23. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
  24. Estes, K. A., Szumowski, S. C., Troemel, E. R. Non-lytic, actin-based exit of intracellular parasites from C. elegans intestinal cells. PLOS Pathogens. 7, 1002227 (2011).
  25. Botts, M. R., Cohen, L. B., Probert, C. S., Wu, F., Troemel, E. R. Microsporidia intracellular development relies on myc interaction network transcription factors in the host. G3 Genes|Genomes|Genetics. 6 (9), 2707-2716 (2016).
  26. Corsi, A. K. A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
  27. Rivera, D. E., Lažetić, V., Troemel, E. R., Luallen, R. J. RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize microbial colonization and infection in the Caenorhabditis elegans intestines. bioRxiv. , (2022).
  28. Zhang, G., et al. A large collection of novel nematode-infecting microsporidia and their diverse interactions with Caenorhabditis elegans and other related nematodes. PLoS Pathogens. 12, 1006093 (2016).
  29. Luallen, R. J., et al. Discovery of a natural microsporidian pathogen with a broad tissue tropism in Caenorhabditis elegans. PLoS Pathogens. 12, 1005724 (2016).
  30. Troemel, E. R., Félix, M. -A., Whiteman, N. K., Barrière, A., Ausubel, F. M. Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 6, 309 (2008).
  31. Burton, N. O., et al. Intergenerational adaptations to stress are evolutionarily conserved, stress-specific, and have deleterious trade-offs. eLife. 10, 73425 (2021).
  32. Jaroenlak, P., et al. 3-Dimensional organization and dynamics of the microsporidian polar tube invasion machinery. PLoS Pathogens. 16, 1008738 (2020).
  33. Weidner, E., Manale, S. B., Halonen, S. K., Lynn, J. W. Protein-membrane interaction is essential to normal assembly of the microsporidian spore invasion tube. The Biological Bulletin. 188 (2), 128-135 (1995).

Tags

Иммунология и инфекция выпуск 182 Caenorhabditis elegans беспозвоночные нематоды инфекция патоген паразит микроспоридия наследственный иммунитет иммунная память эпигенетическое наследование микроскопия межпоколенческие
Изучение наследственного иммунитета в <em>модели caenorhabditis elegans</em> инфекции microsporidia
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Willis, A. R., Tamim El Jarkass, H., … More

Willis, A. R., Tamim El Jarkass, H., Reinke, A. W. Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection. J. Vis. Exp. (182), e63636, doi:10.3791/63636 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter