Summary
Die Infektion von Caenorhabditis elegans durch den mikrosporidianen Parasiten Nematocida parisii ermöglicht es den Würmern, Nachkommen zu produzieren, die gegen denselben Erreger sehr resistent sind. Dies ist ein Beispiel für vererbte Immunität, ein wenig verstandenes epigenetisches Phänomen. Das vorliegende Protokoll beschreibt die Untersuchung der vererbten Immunität in einem genetisch handhabbaren Wurmmodell.
Abstract
Vererbte Immunität beschreibt, wie einige Tiere das "Gedächtnis" einer früheren Infektion an ihre Nachkommen weitergeben können. Dies kann die Resistenz von Krankheitserregern in ihren Nachkommen erhöhen und das Überleben fördern. Während bei vielen wirbellosen Tieren eine vererbte Immunität berichtet wurde, sind die Mechanismen, die diesem epigenetischen Phänomen zugrunde liegen, weitgehend unbekannt. Die Infektion von Caenorhabditis elegans durch den natürlichen mikrosporidianen Erreger Nematocida parisii führt dazu, dass die Würmer Nachkommen produzieren, die robust resistent gegen Mikrosporidien sind. Das vorliegende Protokoll beschreibt die Untersuchung der intergenerationellen Immunität im einfachen und genetisch behandelbaren N. parisii-C . elegans Infektionsmodell. Der aktuelle Artikel beschreibt Methoden zur Infektion von C. elegans und zur Erzeugung von immungrundierten Nachkommen. Es werden auch Methoden zur Bestimmung der Resistenz gegen Mikrosporidieninfektionen durch Färbung auf Mikrosporidien und Visualisierung der Infektion durch Mikroskopie gegeben. Insbesondere verhindert die vererbte Immunität die Invasion von Wirtszellen durch Mikrosporidien, und die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) kann zur Quantifizierung von Invasionsereignissen verwendet werden. Die relative Menge an Mikrosporidiensporen, die bei den immungrundierten Nachkommen produziert werden, kann quantifiziert werden, indem die Sporen mit einem Chitin-bindenden Farbstoff gefärbt werden. Bis heute haben diese Methoden Aufschluss über die Kinetik und die Spezifität der vererbten Immunität sowie die ihr zugrunde liegenden molekularen Mechanismen gegeben. Diese Techniken, zusammen mit den umfangreichen Werkzeugen, die für die Forschung von C. elegans zur Verfügung stehen, werden wichtige Entdeckungen auf dem Gebiet der vererbten Immunität ermöglichen.
Introduction
Die vererbte Immunität ist ein epigenetisches Phänomen, bei dem die elterliche Exposition gegenüber Krankheitserregern die Produktion von infektionsresistenten Nachkommen ermöglichen kann. Diese Art von Immungedächtnis wurde bei vielen wirbellosen Tieren gezeigt, denen ein adaptives Immunsystem fehlt und die vor viralen, bakteriellen und Pilzerkrankungen schützen können1. Während die vererbte Immunität wichtige Auswirkungen auf das Verständnis von Gesundheit und Evolution hat, sind die molekularen Mechanismen, die diesem Schutz zugrunde liegen, weitgehend unbekannt. Dies liegt zum Teil daran, dass viele der Tiere, bei denen eine vererbte Immunität beschrieben wurde, keine etablierten Modellorganismen für die Forschung sind. Im Gegensatz dazu profitieren Studien am transparenten Fadenwurm Caenorhabditis elegans von einem umfangreichen genetischen und biochemischen Toolkit2,3, einem stark annotierten Genom 4,5 und einer kurzen Generationszeit. Tatsächlich hat die Forschung in C. elegans grundlegende Fortschritte auf den Gebieten der Epigenetik und der angeborenen Immunitätermöglicht 6,7, und es ist jetzt ein etabliertes Modell für die Untersuchung des Immungedächtnisses 8,9.
Mikrosporidien sind pilzliche Krankheitserreger, die fast alle Tiere infizieren und bei immungeschwächten Menschen tödliche Infektionen verursachen10. Die Infektion beginnt, wenn eine Mikrosporidiensporie ihren Zellinhalt (Sporoplasma) in eine Wirtszelle injiziert oder "feuert", indem sie eine Struktur verwendet, die als Polröhre bezeichnet wird. Die intrazelluläre Replikation des Parasiten führt zur Bildung von Meronten, die sich letztendlich in reife Sporen differenzieren, die die Zelleverlassen können 11,12. Während diese Parasiten sowohl für die menschliche Gesundheit als auch für die Ernährungssicherheit schädlich sind, gibt es noch viel über ihre Infektionsbiologiezu lernen 12. Nematocida parisii ist ein natürlicher mikrosporidianer Parasit, der sich ausschließlich in den Darmzellen von Würmern repliziert, was zu einer verminderten Fruchtbarkeit und letztendlich zum Tod führt. Das N. parisii-C. elegans-Infektionsmodell wurde verwendet, um zu zeigen: (1) die Rolle der Autophagie bei der Pathogen-Clearance 13, (2) wie Mikrosporidien infizierte Zellen nicht-lytisch verlassen können 14, (3) wie sich Krankheitserreger von Zelle zu Zelle ausbreiten können, indem sie Synzytie15 bilden, (4) die Proteine, die N. parisii verwendet, um mit seinem Wirt 16 zu interagieren, und (5) die Regulation der transkriptionellen intrazellulären Pathogenantwort (IPR)17, 18.
Protokolle für die Infektion von C. elegans sind in der aktuellen Arbeit beschrieben und können verwendet werden, um die einzigartige Mikrosporidienbiologie aufzudecken und die Reaktion des Wirts auf eine Infektion zu sezieren. Die Mikroskopie von fixierten Würmern, die mit dem Chitin-bindenden Farbstoff Direct Yellow 96 (DY96) angefärbt sind, zeigt die Infektionsausbreitung von Chitin-haltigen Mikrosporidiensporidien im Darm. Die DY96-Färbung ermöglicht auch die Visualisierung von Chitin-haltigen Wurmembryonen zur gleichzeitigen Beurteilung der Wurmschwerkraft (Fähigkeit, Embryonen zu produzieren) als Auslesung der Wirtsfitness.
Jüngste Arbeiten haben ergeben, dass C. elegans , die mit N. parisii infiziert sind, Nachkommen produzieren, die robust resistent gegen die gleiche Infektionsind 19. Diese vererbte Immunität dauert eine einzige Generation und ist dosisabhängig, da Nachkommen von stärker infizierten Eltern resistenter gegen Mikrosporidien sind. Interessanterweise sind N. parisii-grundierte Nachkommen auch resistenter gegen den bakteriellen Darmpathogen Pseudomonas aeruginosa, obwohl sie nicht gegen den natürlichen Erreger Orsay-Virus19 geschützt sind. Die vorliegende Arbeit zeigt auch, dass immungrundierte Nachkommen die Invasion von Wirtszellen durch Mikrosporidien begrenzen. Die Methode beschreibt auch die Sammlung von immungrundierten Nachkommen und wie FISH verwendet werden kann, um N. parisii-RNA in Darmzellen nachzuweisen, um die Invasion von Wirtszellen und das Abfeuern von Sporen20 zu untersuchen.
Zusammen bieten diese Protokolle eine solide Grundlage für die Untersuchung von Mikrosporidien und vererbter Immunität bei C. elegans. Es ist zu hoffen, dass zukünftige Arbeiten in diesem Modellsystem wichtige Entdeckungen auf dem im Entstehen begriffenen Gebiet der vererbten Immunität ermöglichen werden. Diese Techniken sind wahrscheinlich auch Ansatzpunkte für die Untersuchung der mikrosporidieninduzierten vererbten Immunität in anderen Wirtsorganismen.
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Protocol
Die vorliegende Studie verwendet den Wildtyp-C. elegans Bristol-Stamm N2, der bei 21 °C angebaut wird.
1. Aufbereitung von Medien
- Bereiten Sie M9-Medien gemäß dem vorherigen Bericht21,22 vor.
- Bereiten Sie Nematodenwachstumsmedium (NGM) gemäß vorherigem Bericht21,22 vor. Gießen Sie 12 ml NGM pro 6 cm Platte oder 30 mL pro 10 cm Platte.
- Bereiten Sie den Escherichia coli-Stamm OP50-1 gemäß einem früheren Bericht23 vor.
- Bereiten Sie OP50-1-seeded NGM-Platten vor, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
- Resuspendieren Sie 10x konzentriertes OP50-1 durch Wirbeln.
- Verwenden Sie eine Repeater-Pipette, um die Platten in der Mitte zu säen. Für 6 cm und 10 cm Platten, Samen mit einem Volumen von 200 μL bzw. 500 μL.
- Für 10 cm Platten verwenden Sie einen Glasstreuer, um den OP50-1 zu verteilen und einen Rasen aus Bakterien zu schaffen. Verbreiten Sie die Bakterien nicht bis zum äußersten Rand der Platte.
HINWEIS: Ethanol tauchen und flammen Sie den Streuer alle fünf Platten, um Sterilität zu gewährleisten. Lassen Sie den Streuer einige Sekunden abkühlen, bevor er sich ausbreitet, um zu verhindern, dass Bakterien abgetötet werden. - Lassen Sie die Teller bei Raumtemperatur für 2 Tage trocknen und das Wachstum des Bakterienrasens sicherstellen.
HINWEIS: Aussaatplatten können bei Raumtemperatur für 2-3 Wochen oder bei 4 °C für bis zu 1 Monat gelagert werden.
2. Aufrechterhaltung von C. elegans
- Pflegen Sie Würmer auf einer konstanten bakteriellen Nahrungsquelle auf OP50-1-seeded NGM-Platten.
HINWEIS: Hunger kann zu generationenübergreifenden Phänotypen führen, die die Ergebnisse beeinflussen können. Eine 10 cm große OP50-1-säte Platte unterstützt 2.500 L1s (das früheste Larvenstadium von C. elegans) für bis zu 72 h. - Wenn die Würmer verhungern, wachsen Sie drei Generationen lang auf OP50-1, bevor Sie die Würmer für Experimente verwenden.
3. Synchronisation von C. elegans-Populationen unter Verwendung von Natriumhypochlorit (Bleichen)
HINWEIS: Dieser Schritt ist sehr zeitkritisch, also stellen Sie sicher, dass die Zentrifuge verfügbar ist, bevor Sie beginnen. Alternative, weniger schnelle Bleichprotokolle sind in der Literatur verfügbar und können verwendet werden, wenn gewünscht. Um zu verhindern, dass 6% Natriumhypochlorit im Laufe der Zeit an Aktivität verliert, lagern Sie das Reagenz im Dunkeln bei 4 ° C und bewahren Sie es bis zu 1 Jahr auf.
- Bereiten Sie 2 ml Bleichlösung für jede Probe vor, indem Sie 400 μL 1 M NaOH, 250 μL 6% Natriumhypochlorit (siehe Materialtabelle) und 1350 μL destilliertes Wasser mischen.
- Waschen Sie erwachsene Würmer (~ 72 h nach dem Schlüpfen) von den Platten in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ml M9-Medien.
HINWEIS: Wenn viele Würmer auf den Platten verbleiben, pelletieren Sie die Würmer durch Zentrifugation bei 1.400 x g für 30 s bei Raumtemperatur, entfernen Sie den Überstand mit einer 1 ml Pipettenspitze und führen Sie zusätzliche Plattenwäschen durch. - Zentrifugieren Sie bei 1.400 x g für 30 s bei Raumtemperatur, um die Würmer zu pelletieren, und waschen Sie dann 2x mit 1 ml M9-Medien, um Bakterien zu entfernen.
- Entfernen Sie den Überstand, fügen Sie 1 ml der vorbereiteten Bleichlösung hinzu (Schritt 3.1.) und stellen Sie einen Timer auf 1 Minute ein. Drehen Sie die Röhren 3-4x um.
HINWEIS: Unter einem Lichtmikroskop können die Würmer gesehen werden, um das Schlagen zu stoppen. - Nach 1 min bei 3.000 x g für 30 s bei Raumtemperatur zentrifugieren, um die Würmer zu pelletieren, dann den Überstand entfernen und 1 ml frische Bleichlösung hinzufügen.
- Überwachen Sie die Röhre(n) genau unter einem Lichtmikroskop, um die Wurmkadaver zu visualisieren, die sich aufspalten und Embryonen freisetzen. Fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort, wenn ~ 50% -80% der Kadaver aufgebrochen sind und viele Embryonen freigesetzt wurden.
HINWEIS: Abhängig von der Anzahl der Tiere und dem Wurmstamm kann dieser Schritt 15 s bis 4 Minuten dauern. Aus unbekannten Gründen brauchen N. parisii-infizierte Würmer oft länger zum Bleichen als nicht infizierte Tiere. - Zentrifugieren Sie bei 3.000 x g für 30 s bei Raumtemperatur, um die Embryonen zu pelletieren, und waschen Sie dann 3x in 1 ml M9-Medien.
HINWEIS: Waschungen verdünnen die restliche Hypochloritlösung aus den Röhrchen und müssen schnell durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass die Bleichlösung die Embryonen nicht schädigt. - Geben Sie 1 ml M9-Medien in das endgültige Pellet und geben Sie es in ein 15 ml konisches Röhrchen, das 4 ml M9-Medien enthält. Suspendieren Sie die Embryonen in einem Endvolumen von 5 ml.
- Drehen Sie die Rohre auf einem mechanischen Rotor (siehe Materialtabelle) bei 21 °C für 18-24 h, um die Embryonen zu L1s zu schlüpfen.
HINWEIS: Da N. parisii den Wurmdarm infiziert und nicht in die Keimbahn eindringt, geben infizierte Eltern die Infektion nicht durch vertikale Übertragung an ihre Nachkommenweiter 19. Das Bleichen infizierter Erwachsener synchronisiert F1-Tiere und zerstört N. parisii-Sporen , wodurch sichergestellt wird, dass F1-Nachkommen nicht mit Sporen infiziert werden, die von den Eltern übertragen wurden. - Zentrifugieren Sie die Röhrchen für 1 min bei 1.800 x g bei Raumtemperatur, um die L1s zu pelletieren, und entsorgen Sie alle bis auf 1 ml des Überstands.
- Pipettieren Sie 1-5 μL L1-Mischung auf eine ungesäte NGM-Platte und zählen Sie sofort die Anzahl der L1s im Tröpfchen, indem Sie unter einem Lichtmikroskop visualisieren. Wiederholen Sie 3x und mitteln Sie die Zählungen, um die Konzentration und Gesamtzahl der L1s zu bestimmen.
HINWEIS: Die Mehrheit der Embryonen sollte geschlüpft sein, und die L1s sollten sich schnell im flüssigen Tröpfchen bewegen. Wenn ein großer Teil der nicht geschlüpften Embryonen und lethargischen (sich langsam bewegenden) L1s verbleibt, deutet dies auf eine zu lange Bleiche hin.
4. Herstellung von N. parisii Sporen
- Bereiten Sie N. parisii-Sporen nach zuvor veröffentlichten Referenzenvor 19,24.
5. Infektion von C. elegans mit N. parisii zur Erzielung immungrundierter Nachkommen
- Bewegen Sie einen Tag vor geplanten Infektionen die erforderliche Anzahl von 10 cm ungesäten NGM-Platten von 4 °C auf Raumtemperatur.
- Unmittelbar vor der Infektion zentrifugieren ~ 2.500 synchronisierte L1-Würmer bei 1.400 x g für 30 s bei Raumtemperatur in einem Mikrozentrifugenröhrchen, um die Würmer zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipettenspitze, um Würmer in ~ 50 μL M9-Medien zu belassen.
- Fügen Sie 1 ml 10x OP50-1 zu den L1s und N. parisii Sporen zur gewünschten Konzentration hinzu (typischerweise ~ 2,5 Millionen Sporen). Als nicht infizierte Kontrolle ist ein äquivalentes Röhrchen L1s und OP50-1 mit einem Volumen von M9-Medien herzustellen, das dem Volumen der verwendeten Sporenzubereitung entspricht.
HINWEIS: Um immunisierte Nachkommen zu erhalten, verwenden Sie eine Sporendosis, die hoch genug ist, so dass >90% der Tiere mit 72 h infiziert sind (gemessen durch DY96-Färbung, Schritt 7), aber niedrig genug, so dass >80% der Tiere immer noch gravid sind. Dies stellt sicher, dass die meisten Nachkommen von infizierten Eltern stammen und dass das Ausbleichen der Eltern genügend Embryonen für F1-Tests liefert. Obwohl Sporenpräparate in Konzentration und Infektiosität variieren, liegt eine geeignete elterliche Dosis typischerweise zwischen 5-15 μL Sporenpräparation (~ 2,5 Millionen Sporen) pro 10 cm Platte. - Wirbeln Sie kurz, um die oben genannten 1 ml Würmer zu mischen und auf eine 10 cm lange ungesäte NGM-Platte zu legen. Schwenken, um sicherzustellen, dass sich die Flüssigkeit über die gesamte Platte verteilt.
- Trocknen Sie die Platten in einem sauberen Schrank mit abgenommenen Deckeln für 10-20 min oder bis sie vollständig trocken sind, bevor Sie bei 21 °C für 72 h inkubieren.
- Bei 72 h nach der Infektion (hpi) waschen Sie die Würmer von den Platten in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ml M9-Medien. Wenn viele Würmer auf den Platten verbleiben, pelletieren Sie die Würmer durch Zentrifugation bei 1.400 x g für 30 s, entfernen Sie den Überstand und führen Sie zusätzliche Plattenwäschen durch.
- Zentrifen Sie bei 1.400 x g für 30 s bei Raumtemperatur zu Pelletwürmern, waschen Sie 2x mit 1 ml M9-Medien oder bis der Überstand klar ist. Resuspendieren Sie in einem Endvolumen von 1 ml M9-Medien.
- Pipette auf und ab, um zu mischen, dann 100 μL der suspendierten Würmer in ein frisches Röhrchen zu übertragen.
HINWEIS: Diese Stichprobe von ~ 250 Erwachsenen kann später fixiert und gefärbt werden, um die elterliche Wurmfitness und den Infektionsstatus zu bestimmen, wie in Schritt 7 und zu Beginn von Schritt 3 beschrieben. - Um die erwachsenen Würmer aufzubrechen und F1-Embryonen zum Testen freizusetzen, bleichen Sie die verbleibenden 900 μL suspendierter Würmer aus, wie in Schritt 3 beschrieben.
HINWEIS: Dieser Schritt zerstört auch alle N. parisii-Sporen vor nachfolgenden Infektionstests.
6. Prüfung der vererbten Immunität gegen N. parisii bei C. elegans
- Führen Sie Infektionen wie in den Schritten 5.1.-5.6 beschrieben mit den unten genannten Änderungen durch.
HINWEIS: Infektionsassays auf F1s können verkleinert und auf 6 cm NGM-Platten mit ~ 1.000 L1-Würmern und 400 μL von 10x OP50-1 durchgeführt werden. Es muss auch eine "hohe" Dosis von Sporen verwendet werden, so dass ~ 100% der naiven F1s (dh Würmer von nicht infizierten Eltern) infiziert sind und nur ~ 10% der naiven F1s gravid sind. Obwohl Sporenpräparate in Konzentration und Infektiosität variieren, liegt eine geeignete Dosis typischerweise zwischen 5-15 μL (~ 2,5 Millionen Sporen) pro 6-cm-Platte. - Bei 72 hpi fixieren und färben Sie, um die Fitness und den Infektionsstatus des Wurms zu bestimmen, wie in Schritt 7 beschrieben.
7. DY96-Färbung von C. elegans zur Visualisierung von Embryonen und Mikrosporidiensporen
HINWEIS: DY96 ist ein grün fluoreszierender Chitin-bindender Farbstoff, der Wurmembryonen und Mikrosporidien-Sporenwände 19,15,25 färbt. Dies ermöglicht die gleichzeitige Überwachung der Fitness und des Infektionsstatus der Würmer.
- Waschen Sie die Würmer von den Platten in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ml M9-Medien, die 0,1% Tween-20 enthalten. Wenn viele Würmer auf den Platten verbleiben, pelletieren Sie die Würmer durch Zentrifugation bei 1.400 x g für 30 s bei Raumtemperatur, entfernen Sie den Überstand mit einer Pipettenspitze und führen Sie zusätzliche Plattenwäschen durch.
- Zentrifugieren Sie bei 1.400 x g für 30 s bei Raumtemperatur, um die Würmer zu pelletieren, und waschen Sie 2x mit 1 ml M9-Medien mit 0,1% Tween-20 oder bis der Überstand klar ist.
- Entfernen Sie den Überstand, fügen Sie 700 μL Aceton hinzu und lassen Sie die Würmer bei Raumtemperatur für 10 Minuten fixieren.
HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt können die Würmer bei -20 °C gelagert werden, um sie auf Wunsch bis zu mehreren Monaten später zu verarbeiten. - Zentrifizieren Sie bei 10.000 x g für 30 s bei Raumtemperatur, um die festen Würmer zu pelletieren, und waschen Sie 2x mit 1 ml PBS mit 0,1% Tween-20 (PBST).
- Bereiten Sie 50 ml DY96-Arbeitslösung vor: PBST, 0,1% (v/v) Natriumdodecylsulfat (SDS) und 20 μg/ml DY96 (aus einer 5 mg/ml Stammlösung in destilliertem Wasser) (siehe Materialtabelle). Wickeln Sie das Röhrchen in Folie und bewahren Sie es in einer Schublade auf, um Lichteinwirkung zu vermeiden.
HINWEIS: DY96-Lager und Arbeitslösungen können bei > 1 Jahr bei Raumtemperatur gelagert werden, wenn sie im Dunkeln aufbewahrt werden. - Zentrigieren Sie bei 10.000 x g für 30 s bei Raumtemperatur, um die Würmer zu pelletieren und Überstände zu entfernen. 500 μL DY96-Arbeitslösung in das Pellet geben und 30 min bei Raumtemperatur drehen.
- Zentrigieren Sie bei 10.000 x g für 30 s bei Raumtemperatur, um die Würmer zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 15 μL des Montagemediums mit/ohne DAPI hinzu (siehe Materialtabelle).
- Pipette 10 μL der Lösung, die gefärbte Würmer enthält, auf einen Objektträger und legen Sie ein Deckglas darüber auf.
HINWEIS: Objektträger und zusätzliche Proben können bei 4 °C im Dunkeln zur Langzeitlagerung gelagert werden.
8. Bildgebung und Analyse von DY96-gefärbten Würmern zur Beurteilung der Wurmfitness und des Infektionsstatus
- Um die DY96-gefärbten Würmer (montiert auf Objektträgern, wie in Schritt 7.8) zu analysieren, führen Sie eine Bildgebung mit dem GFP-Kanal eines Fluoreszenzmikroskops durch.
- Um die Fitness der Wurmpopulationen zu bestimmen, verwenden Sie ein 5x- oder 10x-Objektiv, um die Schwerkraft von >100 Würmern pro Bedingung zu bestimmen.
HINWEIS: Würmer, die ≥1 Embryo tragen, gelten als gravid. Mechanische Zellzähler können helfen, menschliche Fehler beim Zählen zu minimieren. Wurmembryonen sind weniger gefärbt (weniger fluoreszierend) als Mikrosporidiensporen19. Embryonen sind eiförmig, ~ 50 μm x ~ 30 μm, und finden sich im Mittelkörper von gesunden C. elegans Erwachsenen. Gesunde, nicht infizierte Erwachsene tragen 10-20 Embryonen, die in Reihen entlang ihrer Körperlängeorganisiert sind 26. - Um subtilere Unterschiede in der Fitness aufzudecken, führen Sie Embryonenzählungen durch. Zählen Sie dazu manuell die Anzahl der Embryonen in 20-30 einzelnen Würmern pro Bedingung.
- Um festzustellen, wie infiziert die Wurmpopulationen sind, verwenden Sie ein 5x-40x-Ziel, um den Infektionsstatus von >100 Würmern pro Zustand zu beurteilen. Würmer, die eine beliebige Anzahl von intrazellulären Darmsporen enthalten, gelten als infiziert.
HINWEIS: Mikrosporidiensporen sind heller als Wurmembryonen. Die bohnenförmigen Sporen von N. parisii sind ~2,2 μm x ~0,8 μm groß und werden in den Darmzellen des Wurms aus ~48 hpi15 produziert. Würmer, bei denen Sporen ausschließlich im Darmlumen und nicht entlang der Darmwände zu sehen sind, gelten nicht als infiziert19. Dies liegt daran, dass diese Sporen wahrscheinlich neu aufgenommene Sporen darstellen, die nicht aus einer Infektion des Individuums resultieren. - Quantifizieren Sie mithilfe von Bildanalysesoftware (siehe Materialtabelle) die Parasitenbelastung und die Wurmgröße gemäß den folgenden Schritten.
- Bild 20-30 Würmer, die auf Objektträgern montiert sind, verwenden ein fluoreszierendes aufrechtes Stereoskop für jede Probe. Erfassen Sie Bilder in Brightfield-, DAPI- und GFP-Kanälen. Wählen Sie eine geeignete Exposition im GFP-Kanal, so dass die Fluoreszenz in den am meisten infizierten Proben nicht gesättigt ist.
HINWEIS: Die Infektion kann immer noch in den am wenigsten infizierten Proben visualisiert werden. Bilder werden in der Regel mit einem 5-fachen Objektiv aufgenommen. - Öffnen Sie Dateien in FIJI/ImageJ. Je nach Dateityp kann das Bio-Formats Importer-Plugin erforderlich sein, um Bilder in ImageJ zu öffnen.
- Skizzieren Sie 20-30 einzelne Würmer in Bildern mit Hellfeld- oder DAPI-Bildern und dem Polygon-Auswahlwerkzeug in der Symbolleiste. Speichern Sie jede Gliederung mit Analyze > Tools > Regions of Interest (ROI) Manager im Dropdown-Menü, indem Sie auf Hinzufügen [t] klicken. Skizzieren Sie Tiere, die im Rahmen vollständig sichtbar sind.
HINWEIS: Wurmumrisse können später erneut besucht werden, indem die Datei mit Umrissen als Tiff gespeichert wird. - Klicken Sie im ROI-Manager auf Auswahl aufheben, um alle Umrisse aus dem Bild zu entfernen, und klicken Sie im Dropdown-Menü auf Bild > Duplizieren. Geben Sie die dem interessierenden Kanal entsprechende Nummer in das Feld "Kanäle" ein, um den GFP-Kanal für die Parasitenbelastung zu duplizieren (z. B. 2).
- Schwellen Sie diesen Kanal mit Image > Passen Sie > Schwellenwert auf ein Niveau an, bei dem die helle Parasitenlast erfasst wird, die Dimmerfluoreszenz von Wurmembryonen jedoch nicht, und klicken Sie dann auf Anwenden. Notieren Sie sich die angewandten Schwellenwerte und verwenden Sie diese konsistent für alle Bilder desselben Experiments.
HINWEIS: Überprüfen Sie, ob der Schwellenwert ein geeigneter Wert für die am wenigsten infizierten und die am häufigsten infizierten Proben ist, bevor Sie alle Bilder analysieren. - Wählen Sie Analysieren > Maße festlegen aus, und aktivieren Sie das Kontrollkästchen für Flächenbruch. Wählen Sie abwechselnd einzelne Wurmumrisse aus dem ROI-Manager aus und klicken Sie auf die Funktion Analyze > Measure. Ein Ergebnisfenster liefert die Messung für %Area (d. h. % Parasitenbelastung).
HINWEIS: Wenn die Fluoreszenz der Embryonen so hell ist, dass sie den Schwellenwert überschreitet, kann das Pinselwerkzeug in Schwarz in der Symbolleiste verwendet werden, um diese Bereiche manuell zu löschen, bevor %Area gemessen wird. - Um die Wurmgröße als Auslesung der Fitness zu bestimmen, skizzieren Sie die Würmer wie in Schritt 8.3 beschrieben. Wählen Sie Analysieren > Maße festlegen aus, und aktivieren Sie das Kontrollkästchen für Fläche. Wählen Sie abwechselnd einzelne Wurmumrisse aus dem ROI-Manager aus und klicken Sie auf die Funktion Analyze > Measure. Ein Ergebnisfenster zeigt die Messung für %Area an.
- Bild 20-30 Würmer, die auf Objektträgern montiert sind, verwenden ein fluoreszierendes aufrechtes Stereoskop für jede Probe. Erfassen Sie Bilder in Brightfield-, DAPI- und GFP-Kanälen. Wählen Sie eine geeignete Exposition im GFP-Kanal, so dass die Fluoreszenz in den am meisten infizierten Proben nicht gesättigt ist.
9. FISH-Assay zur Beurteilung der Invasion von C. elegans durch Mikrosporidien und Sporenfeuerung
HINWEIS: Die MicroB FISH-Sonde erkennt eine konservierte Region der mikrosporidianen 18s-rRNA und kann verwendet werden, um intrazelluläre Sporoplasmen (dh eingedrungene Wirtszellen) und das genetische Material in Sporen zu markieren.
- Infizieren Sie 6.000 bleichmittelsynchronisierte L1-Würmer mit 4 Millionen Sporen von N. parisii und 10 μL von 10x OP50-1 in einem Endvolumen von 400 μL, das mit M9-Medien hergestellt wird.
- Die Mischung auf eine 6 cm lange ungesäte NGM-Platte stellen, in einem sauberen Schrank für 10-20 min trocknen und bei 21 °C platzieren.
- Nach 30 Minuten waschen Sie die Tiere mit 1 ml M9-Medien mit 0,1% Tween-20 von den Tellern.
- Pelletieren Sie die Würmer durch Zentrifugieren bei 1.400 x g für 1 min bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipettenspitze, fügen Sie 700 μL Aceton hinzu und lassen Sie ihn 10 Minuten bei Raumtemperatur sitzen.
HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt können die Würmer bei -20 °C gelagert werden, um sie zu einem späteren Zeitpunkt verarbeiten zu können. - Führen Sie einen FISH-Test über Nacht mit der MicroB-Sonde gemäß den zuvor veröffentlichten Berichten27,19 durch.
HINWEIS: Um die Sporenverbrennung zu beurteilen, ergänzen Sie die letzten 500 μL Waschpuffer mit 20 μg/ml DY96 zu den Proben und drehen Sie sie 30 min bei 21 °C, bevor Sie mit dem Protokoll wie gewohnt fortfahren. - Bewahren Sie die Folien in einem Folienkasten bei 4 °C auf. Für die Langzeitlagerung (d. h. mehrere Monate) lagern Sie zusätzliche Proben in Mikrozentrifugenröhrchen bei 4 °C bei Dunkelheit.
- Um die Invasion in FISH-gefärbten Würmern zu beurteilen, betrachten Sie die Würmer mit dem roten Kanal eines Fluoreszenzmikroskops. Visualisieren Sie Infektionsereignisse bei hoher Vergrößerung (63-faches Ziel), da L1-Tiere klein sind und sich Sporoplasmen in den frühen Stadien der Replikation befinden. Um die Sporenbefeuerung zu beurteilen, verwenden Sie ein 63-faches Objektiv und sowohl rote als auch grüne Fluoreszenzkanäle.
HINWEIS: Sporen, in denen GFP und mCherry-Signal kolokalisieren, gelten als unbefeuert; leere GFP-Sporenfälle gelten als gefeuert. - Um die Invasion oder das Sporenfeuern zu untersuchen, zählen Sie manuell die Anzahl der Sporoplasmen (mCherry-Herde in den Darmzellen) oder den Prozentsatz der Sporen, die in 20-30 Würmern pro Zustand abgefeuert werden. Passen Sie den Fokus in der Z-Ebene an, um alle Infektionsereignisse und Sporen zu erfassen, die oft in verschiedenen Ebenen vorkommen.
HINWEIS: Sporoplasmen befinden sich ausschließlich in den Darmzellen. Die höchste Konzentration von Sporoplasmen wird typischerweise unmittelbar nach dem Pharynx gefunden. Wenn Proben auch mit DY96 gefärbt sind, achten Sie auf das Vorhandensein von Sporoplasmen, die nicht mit der Spore kolokalisieren.
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Representative Results
In der vorliegenden Studie wurden elterliche Populationen von C. elegans (P0) im L1-Stadium mit einer niedrigen Dosis von N. parisii-Sporen infiziert. Diese Infektionsbedingungen werden typischerweise verwendet, um eine hohe Anzahl von mikrosporidienresistenten F1-Nachkommen durch Bleichen der Eltern zu erhalten. Infizierte Elternpopulationen und nicht infizierte Kontrollen wurden auf 72 hpi festgelegt und mit DY96 gefärbt, um die Wurmembryonen und Mikrosporidiensporen sichtbar zu machen (Abbildung 1A). Infizierte Tiere sind klein, enthalten viele Mikrosporidiensporidien und produzieren weniger Embryonen als gesunde nicht infizierte Kontrollen. Die Bewertung der Schwerkraft des Wurms zeigte, dass ~ 95% der nicht infizierten Tiere Nachkommen produzierten, verglichen mit weniger als 80% der infizierten Tiere (Abbildung 1B). Quantifizierungen ergaben, dass ~ 90% der mit Mikrosporidien behandelten Population infiziert waren, wie durch die Anzahl der Würmer bestimmt, die DY96-gefärbte Sporen enthielten (Abbildung 1C). Um immunisierte F1-Nachkommen zu erhalten, ist es wichtig, eine Dosis Mikrosporidien zu verwenden, die hoch genug ist, um sicherzustellen, dass die meisten Eltern infiziert sind, aber niedrig genug, um sicherzustellen, dass die Bevölkerung immer noch Nachkommen produzieren kann. Eine Tabelle der Mikrosporidiendosen, die zur Gewinnung der Daten in dieser Studie verwendet wurden, wird bereitgestellt (Tabelle 1).
Nicht infizierte und infizierte Elternpopulationen (Abbildung 1) wurden mit Natriumhypochlorit bei 72 HPI behandelt, um naive und immungrundierte F1-Nachkommen zu erhalten. F1-Tiere wurden im L1-Stadium einer hohen Dosis von N. parisii-Sporen ausgesetzt, um die vererbte Immunität gegen Mikrosporidien zu testen. Bei 72 hpi wurden die F1-Tiere fixiert und mit DY96 gefärbt, um die Mikrosporidienresistenz zu beurteilen (Abbildung 2A). Quantifizierungen dieser fixierten Tiere ergaben, dass die grundierten Würmer signifikant mehr Embryonen enthielten als ihre naiven Gegenstücke, was auf eine größere Fitness im Angesicht einer Infektion hindeutet (Abbildung 2B). FIJI/ImageJ wurde verwendet, um die Parasitenbelastung einzelner naiver und immunisierter Würmer zu bestimmen (d.h. Prozentsatz des Körpers, der mit fluoreszierenden N. parisii-Sporen gefüllt ist) (Abbildung 2C). Quantifizierungen zeigten eine dramatische Verringerung der Parasitenbelastung von Würmern, die von infizierten Eltern stammten (Abbildung 2D). Darüber hinaus zeigten Berechnungen der individuellen Wurmgröße, dass grundierte Würmer angesichts einer N. parisii-Infektion einen signifikanten Wachstumsvorteil gegenüber naiven Tieren hatten (Abbildung 2E). Diese Daten zeigen, dass N. parisii-infizierte Eltern Nachkommen mit hoher Mikrosporidienresistenz produzieren.
Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass die vererbte Immunität gegen Mikrosporidien die Invasion von Darmzellen durch N. parisii19 reduziert. Um Unterschiede bei der Invasion von Wirtszellen sichtbar zu machen, wurden naive und immungrundierte Tiere (die von nicht infizierten oder infizierten Eltern erhalten wurden, wie oben) einer maximalen Dosis von N. parisii im L1-Stadium ausgesetzt. Bei 30 dpi wurden die Würmer fixiert und mitgefärbt, wobei eine FISH-Sonde zum Nachweis von N. parisii-RNA und DY96 zum Nachweis von N. parisii-Sporenwänden verwendet wurde . Die Bildgebung ergab, dass naive Tiere zwar typischerweise mehrere Sporen und mehrere infizierte Zellen (Sporoplasmen) enthielten, die grundierten Tiere jedoch weitaus weniger (oder gar keine) Sporen und typischerweise keine Sporoplasmen aufwiesen (Abbildung 3).
Abbildung 1: Direkte gelbe 96 (DY96) Färbung von nicht infizierten und N. parisii-infizierten C. elegans zeigt die Schwerkraft und den Infektionsstatus des Wurms. (A-C) N2 C. elegans wurden im L1-Stadium nicht mit einer niedrigen Dosis von N. parisii infiziert oder infiziert. Bei 72 hpi wurden die Würmer fixiert, mit DY96 gefärbt und abgebildet, um die Schwerkraft des Wurms und den Infektionsstatus zu beurteilen. (A) Repräsentative Bilder werden gezeigt. DY96 ermöglicht die Visualisierung von Wurmembryonen und Mikrosporidiensporinen (Chitin). Auf der rechten Seite wird ein Bild eines infizierten Wurms angezeigt. Embryonen werden mit "E" gekennzeichnet; N. parisii Infektion des Darms wird als "Np" bezeichnet. Maßstabsleiste für linke und mittlere Bilder = 500 μm. Maßstabsleiste für das rechte Bild = 100 μm. (B) Würmer, die einen oder mehrere Embryonen trugen, wurden als gravid bewertet und grafisch dargestellt. (C) Würmer, die eine beliebige Anzahl von N. parisi-Sporen in den Darmzellen trugen, wurden als infiziert eingestuft und grafisch dargestellt. (B-C) Daten aus 5 unabhängigen Experimenten mit n = 100 Würmern pro Bedingung pro Experiment. Der Mittelwert ± SEM wird angezeigt. Die p-Werte wurden durch den ungepaarten zweiseitigen Student's t-Test ermittelt. Die Signifikanz wurde wie folgt definiert: *p < 0,05; S. < 0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Direkte gelbe 96 (DY96) Färbung von naiven und immungrundierten C. elegans zur Bestimmung der Embryonen pro Wurm, Mikrosporidienbelastung und Wurmgröße. (A) N2 C. elegans wurden im L1-Stadium mit einer niedrigen Dosis von N. parisii infiziert oder nicht. Bei 72 hpi wurden die Würmer mit Natriumhypochlorit behandelt, um Embryonen freizusetzen. Die daraus resultierenden naiven und immunisierten Nachkommen wurden im L1-Stadium mit einer hohen Dosis N. parisii infiziert. Bei 72 hpi wurden die Würmer fixiert, mit DY96 gefärbt und abgebildet, um Wurmembryonen und Parasitenbelastung sichtbar zu machen. Repräsentative Bilder werden angezeigt. Maßstabsleiste = 200 μm.(B) Die Anzahl der Embryonen pro Wurm wurde gezählt und von (A) grafisch dargestellt. (C) Ein Screenshot von FIJI/ImageJ zeigt naive Würmer aus Panel A, die mit dem Schwellenwertfenster unten rechts zur Visualisierung der Parasitenbelastung (weiß dargestellt) gethresholdt wurden. Hier wurden einzelne Würmer mit dem rot hervorgehobenen Werkzeug "Polygonauswahl" umrissen und über das ROI-Fenster oben rechts als "Region of Interests" (ROI) definiert. Die Funktion Analyze > Measure > Area wurde verwendet, um die Parasitenbelastung von zwei Beispielwürmern zu quantifizieren, die 25,02% und 13,49% beträgt. (D) Die Parasitenbelastung pro Wurm wurde bestimmt und graphisch dargestellt aus (A). (E) Aus den obigen Bildern wurde die individuelle Wurmgröße aus Tieren berechnet, die wie in Panel C mit der Funktion "Analysieren > Messen > Fläche" beschrieben sind. (B, D und E) Der Mittelwert ± SEM wird angezeigt. Die p-Werte wurden durch den ungepaarten zweiseitigen Student's t-Test bestimmt. Die Signifikanz wurde wie folgt definiert: *p < 0,05. **p < 0,01, ***p < 0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) gegen N. parisii 18S rRNA zeigt Parasiteninvasion von C. elegans Darmzellen bei naiven, aber nicht grundierten Tieren. N2 C. elegans wurden im L1-Stadium mit einer niedrigen Dosis von N. parisii infiziert oder nicht infiziert. Bei 72 hpi wurden die Würmer mit Natriumhypochlorit behandelt, um Embryonen freizusetzen. Die daraus resultierenden naiven und immunisierten Nachkommen wurden im L1-Stadium mit einer maximalen Dosis von N. parisii infiziert. Bei 30 mpi wurden die Würmer fixiert, FISH unterzogen, um Sporoplasmen zu erkennen, mit DY96 gefärbt, um Mikrosporidien-Sporenwände zu erkennen, und abgebildet. Repräsentative Bilder werden angezeigt. Eingelassene Bilder für den naiven Wurm zeigen Sporoplasmen (rot, Sternchen), gebrannte Sporen (grün, Pfeilspitzen) und eine ungebrannte Spore (gelb, Pfeil). Der gezeigte naiv infizierte Wurm zeigt 4 Sporoplasmen an. Maßstabsleiste = 20μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| N. parisii Dosis | Plattenkonzentration (Sporen/cm2) | Millionen von Sporen pro 6 cm Platte | Millionen von Sporen pro 10 cm Platte |
| Niedrig | 35,400 | - | 2.7 |
| Hoch | 88,400 | 2.5 | - |
| Maximal | 2,12,000 | 6 | - |
Tabelle 1: N. parisii Dosen, die in der Studie verwendet wurden.
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Discussion
Das vorliegende Protokoll beschreibt die Untersuchung von Mikrosporidien und vererbter Immunität in einem einfachen und genetisch behandelbaren N. parisii-C. elegans-Infektionsmodell.
Die Sporenpräparation ist ein intensives Protokoll, das in der Regel genügend Sporen für 6 Monate Experimente liefert, abhängig von der Produktivität24. Wichtig ist, dass die Infektiosität für jede neue Sporen-"Menge" bestimmt werden muss, bevor sie für die Experimente verwendet wird. Aufgrund der Variabilität der Infektiosität zwischen den Sporenpräparaten muss für alle Wiederholungen eines Experiments konsistent eine einzige Charge verwendet werden. Einzelne Aliquots sollten nicht aufgetaut und wieder eingefroren werden, da das Auftauen dazu führen kann, dass Sporen feuern und die Infektiosität verringern. Daher dürfen Sporen nur unmittelbar vor der Infektion aus dem -80 ° C-Gefrierschrank entfernt und auf Eis gehalten werden, während sie auf der Bank liegen.
In den Schritten 5-6 wurden die Infektionsassays skizziert. Bei Infektionstests ist es wichtig, eine Kontamination oder Verhungerung der Tiere zu vermeiden, da dies zu zusätzlichen intergenerationellen Effekten führen kann, die die Immunität bei F1s beeinträchtigen. Eine wichtige Einschränkung des vererbten Immunitätstests besteht darin, dass mehr infizierte Eltern weniger F1-Nachkommen produzieren. Daher ist es wichtig, ein sorgfältiges Gleichgewicht zwischen der Elterngeneration zu finden, die ausreichend infiziert ist, um Immunität weiterzugeben, während sie gesund genug ist, um Nachkommen für Tests zu produzieren. Obwohl das aktuelle Protokoll Infektionsassays für L1-Tiere beschreibt, kann das Protokoll modifiziert werden, um die Auswirkungen einer Mikrosporidieninfektion auf unterschiedlich inszenierte Eltern und die Persistenz der Immunität bei älteren Nachkommen zu testen. Die Methoden können auch modifiziert werden, um die Auswirkungen mehrerer oder unterschiedlicher Spannungen (z. B. osmotischer Stress, Schwermetallstress, Koinfektion mit einem anderen Erreger) auf die vererbte Immunität zu testen. Während die vererbte Immunität gegen N. parisii bei C. elegans generationenübergreifend ist (d. h. eine einzige Generation anhält)19, kann das Protokoll angepasst werden, um weitere Generationen zu untersuchen, um transgenerationale Effekte zu testen. Während die bereitgestellten Protokolle spezifisch für die N. parisii-Infektion sind, gibt es viele andere Nematoden-infizierende Arten von Mikrosporidien28. Die Protokolle können angepasst werden, um die vererbte Immunität gegen andere darminfizierende (z.B. Nematocida ausubeli) und epidermal- und muskelinfizierende (z.B. Nematocida displodere) Mikrosporidien 29,30 zu untersuchen. C. elegans ist auch mit vielen anderen natürlichen und menschlichen Krankheitserregern (bakteriell, pilzlich und viral) infiziert. Die hier beschriebenen Methoden können verwendet werden, um die vererbte Immunität gegen andere Krankheitserreger in C. elegans und die Erregerspezifität der vererbten Immunantwort auf N. parisii zu testen. C. elegans ist ein etablierter Modellorganismus. Aber auch andere Mitglieder der Gattung Caenorhabditis, darunter die hermaphroditischen Arten C. tropicalis und C. briggsae sowie die männlich-weibliche Art C. kamaaina, sind in unterschiedlichem Maße mit N. parisii 31 infiziert. Durch kleine Änderungen an den bereitgestellten Protokollen kann die vererbte Immunität auch bei diesen Tieren getestet werden.
In Schritt 8 wurden schnelle und einfache Methoden zur Bestimmung von Unterschieden in der Mikrosporidien-Suszeptibilität bei DY96-gefärbten Würmern (d. h. % infizierte Tiere, % Tiere gravid) gegeben. Manchmal sind diese Methoden jedoch nicht empfindlich genug, um kleine Veränderungen der Immunität und Fitness zu erkennen. Dies liegt daran, dass ein Wurm mit einem Embryo und vielen infizierten Zellen genauso behandelt würde wie ein Wurm mit 10 Embryonen und einer infizierten Zelle. Daher wurden auch Methoden mit feinerer Auflösung zur Bestimmung der Infektionsergebnisse bei diesen Tieren bereitgestellt (d. h. prozentuale Parasitenbelastung, Anzahl der Embryonen, Wurmgröße). Während beide Methoden verwendet werden können, sind phänotypische Unterschiede bei letzteren typischerweise ausgeprägter, was es einfacher macht, signifikante Unterschiede zu erkennen. Zukünftige Anpassungen an diese Methode können die Verwendung von maschinellem Lernen zur Automatisierung der Analyse umfassen.
In Schritt 9 wurden Techniken zur Verfügung gestellt, um die Invasion von Wirtszellen durch Mikrosporidien und Sporenfeuerung mit FISH zu untersuchen. Während DY96 Mikrosporidien mit einem starken fluoreszierenden grünen Signal markiert, können andere Farbstoffe, einschließlich der lipophilen Färbung Nilrot und der Chitin-bindenden Calcofluor White, auch zur Färbung von N. parisii30,32,33 verwendet werden. Das vorliegende Protokoll beschreibt die Fixierung mit Aceton und eignet sich gut zum Nachweis von Mikrosporidien mit DY96- und FISH-Färbung. Die Fixierung mit 4% Paraformaldehyd kann jedoch dazu beitragen, die Gewebemorphologie zu erhalten und das Signal in einigen Bildgebungsprotokollen zu verbessern.
Mikrosporidien sind ein wenig untersuchter Erreger, und ein Großteil der Zellbiologie der Infektion bleibt unbekannt. C. elegans ist ein einfacher Modellorganismus, und diese Protokolle können als Plattform dienen, um die Schlüsselprozesse zu verstehen, die an der Infektion und der Abwehr des Wirts gegen diesen Parasiten beteiligt sind. Vererbte Immunität ist ein aufstrebendes Feld, und viele Fragen bleiben offen1. Wie übertragen infizierte Eltern Immunität auf Nachkommen (mütterliche Versorgung oder veränderte transkriptionelle Regulation bei den Nachkommen)? Was vermittelt die Immunität bei Nachkommen (antimikrobielle Peptide oder andere Immunproteine)? Wie pathogenspezifisch sind vererbte Immunantworten und wie konserviert ist die vererbte Immunität zwischen den Arten? Angesichts der umfangreichen Werkzeuge, die mit C. elegans zur Verfügung stehen, sind Studien, die auf dem hier beschriebenen Protokoll aufbauen, gut aufgestellt, um diese grundlegenden Fragen der vererbten Immunität zu beantworten.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Wir danken Winnie Zhao und Yin Chen Wan für ihre hilfreichen Kommentare zum Manuskript. Diese Arbeit wurde vom Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (Grant #522691522691) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.0 mm zirconia beads | Biospec Products Inc. | 11079124ZX | |
| 10 mL syringe | Fisher Scientific | 1482613 | |
| 5 μm filter | Millipore Sigma | SLSV025LS | |
| Axio Imager 2 | Zeiss | - | Fluorescent microscope for imaging of DY96- and FISH- stained worms on microscope slides |
| Axio Zoom V.16 Fluorescence Stereo Zoom Microscope | Zeiss | - | For live imaging of fluorescent transgenic animals to visualize the IPR |
| Baked EdgeGARD Horizontal Flow Clean Bench | Baker | - | |
| Bead disruptor, Genie SI-D238 Analog Disruptor Genie Cell Disruptor, 120 V | Global Industrial | T9FB893150 | |
| Cell-VU slide, Millennium Sciences Disposable Sperm Count Cytometers | Fisher Scientific | DRM600 | |
| Direct Yellow 96 | Sigma-Aldrich | S472409-1G | |
| EverBrite Mounting Medium with DAPI | Biotium | 23001 | |
| EverBrite Mounting Medium without DAPI | Biotium | 23002 | |
| Fiji/ImageJ software | ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | |
| Mechanical rotor | Thermo Sceintific | 415110 / 1834090806873 | Used to spin tubes of bleached embryos for overnight hatching |
| MicroB FISH probe | Biosearch Technologies Inc. | - | Synthesized with a Quasar 570 (Cy3) 5' modification and HPLC purified, CTCTCGGCACTCCTTCCTG |
| N2 | Wild-type, Bristol strain | Default strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771-100G | |
| Sodium hydroxide solution (5 N) | Fisher Chemical | FLSS256500 | |
| Sodium hypochlorite solution (6%) | Fisher Chemical | SS290-1 | |
| Stemi 508 Stereo Microscope | Zeiss | - | For daily maintenance of worms and counting of L1 worms for assay set ups |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379-100ML | |
| Vectashield + A16 | Biolynx | VECTH1500 |
References
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