Summary
microsporidian 기생충 Nematocida parisii에 의한 Caenorhabditis elegans의 감염은 웜이 동일한 병원균에 매우 저항력이있는 자손을 생산할 수있게합니다. 이것은 유전 된 면역의 예이며, 잘 이해되지 않는 후성 유전 적 현상입니다. 본 프로토콜은 유전적으로 견인성 웜 모델에서 유전된 면역의 연구를 기술한다.
Abstract
유전 된 면역은 일부 동물이 이전 감염의 "기억"을 자손에게 전달할 수있는 방법을 설명합니다. 이것은 자손의 병원균 내성을 높이고 생존을 촉진 할 수 있습니다. 유전 된 면역은 많은 무척추 동물에서보고되었지만,이 후성 유전 적 현상의 기초가되는 메커니즘은 크게 알려지지 않았습니다. 천연 microsporidian 병원균 Nematocida parisii에 의한 Caenorhabditis elegans의 감염은 microsporidia에 강력하게 저항하는 자손을 생산하는 웜을 초래합니다. 본 프로토콜은 단순하고 유전적으로 다루기 쉬운 N. parisii-C. elegans 감염 모델에서 세대 간 면역의 연구를 기술한다. 현재 기사는 C. elegans를 감염시키고 면역 프라이밍 된 자손을 생성하는 방법을 설명합니다. 현미경 검사에 대한 염색 및 현미경 검사에 의한 감염을 시각화하여 microsporidia 감염에 대한 내성을 분석하는 방법도 제공됩니다. 특히, 유전 된 면역은 미세 스포리디아에 의한 숙주 세포 침윤을 방지하고, 계내 혼성화 (FISH)에서의 형광은 침윤 사건을 정량화하는데 사용될 수 있다. 면역-프라이밍된 자손에서 생성된 미세 포자의 상대적 양은 포자를 키틴-결합 염료로 염색함으로써 정량화될 수 있다. 지금까지 이러한 방법은 유전 된 면역의 동역학 및 병원체 특이성뿐만 아니라 그 기초가되는 분자 메커니즘에 대해 밝혀 왔습니다. 이러한 기술은 C. elegans 연구에 사용할 수있는 광범위한 도구와 함께 유전 된 면역 분야에서 중요한 발견을 가능하게합니다.
Introduction
유전 된 면역은 병원균에 대한 부모의 노출로 감염 저항성 자손의 생산을 가능하게하는 후성 유전 적 현상입니다. 이러한 유형의 면역 기억은 적응 면역 체계가 부족하고 바이러스, 박테리아 및 곰팡이 질환으로부터 보호 할 수있는 많은 무척추 동물에서 나타났습니다1. 유전 된 면역은 건강과 진화를 이해하는 데 중요한 영향을 미치지 만,이 보호의 기초가되는 분자 메커니즘은 크게 알려지지 않았습니다. 이것은 부분적으로 유전 된 면역이 묘사 된 많은 동물들이 연구를위한 모델 유기체가 확립되지 않았기 때문입니다. 대조적으로, 투명한 선충류 Caenorhabditis elegans에 대한 연구는 광범위한 유전 및 생화학 적 툴킷 2,3, 고도로 주석이 달린 게놈 4,5 및 짧은 생성 시간의 이점을 얻습니다. 실제로 C. elegans의 연구는 후성 유전학 및 선천적 면역 6,7 분야에서 근본적인 발전을 가능하게했으며, 이제는 면역 기억 8,9을 연구하기위한 확립 된 모델입니다.
Microsporidia는 거의 모든 동물을 감염시키고 면역 저하 된 인간10에서 치명적인 감염을 일으키는 곰팡이 병원체입니다. 감염은 미세 스포리 디아 포자가 극성 튜브 (polar tube)라는 구조를 사용하여 세포 내용물 (스포로 플라즈마)을 숙주 세포에 주입하거나 "발사"할 때 시작됩니다. 기생충의 세포 내 복제는 메론트의 형성을 초래하며, 이는 궁극적으로 세포11,12를 빠져 나올 수있는 성숙한 포자로 분화됩니다. 이러한 기생충은 인간의 건강과 식량 안보 모두에 해롭지 만, 감염 생물학12에 대해 배울 것이 많이 있습니다. Nematocida parisii는 웜의 장 세포에서만 독점적으로 복제되는 천연 미세 스포리디안 기생충으로 번식력을 감소시키고 궁극적으로 사망을 초래합니다. N. parisii-C. elegans 감염 모델은 (1) 병원체 클리어런스에서 자가포식의 역할 13, (2) 미세 스포리디아가 감염된 세포를 비언어적으로 빠져 나올 수있는 방법14, (3) 병원체가 syncytia 15를 형성하여 세포 간 확산 할 수있는 방법, (4) 단백질 N. parisii가 숙주 (16)와 계면하기 위해 사용하는 방법, 및 (5) 전사 세포 내 병원체 반응(IPR)17, 18.
C. elegans의 감염에 대한 프로토콜은 현재 연구에 설명되어 있으며 독특한 microsporidia 생물학을 밝히고 감염에 대한 숙주의 반응을 해부하는 데 사용할 수 있습니다. 키틴 결합 염료 다이렉트 옐로우 96 (DY96)으로 염색된 고정 웜의 현미경 검사는 장 전체에 걸쳐 키틴 함유 미세 스포리디아 포자의 감염 확산을 보여줍니다. DY96 염색은 또한 숙주 적합성의 판독으로서 웜 중량 (배아를 생산하는 능력)의 동시 평가를 위해 키틴 함유 웜 배아의 시각화를 가능하게합니다.
최근 연구에 따르면 N. parisii에 감염된 C. elegans는 동일한 감염에 강하게 저항하는 자손을 생산합니다19. 이 유전 된 면역은 단일 세대에 지속되며 더 심하게 감염된 부모의 자손이 microsporidia에 더 강하기 때문에 용량에 따라 다릅니다. 흥미롭게도, N. parisii-primed 자손은 또한 박테리아 장내 병원균 인 Pseudomonas aeruginosa에 더 내성이 있지만, 천연 병원균 Orsay virus19로부터 보호되지는 않습니다. 본 연구는 또한 면역-프라이밍된 자손이 미세 스포리디아에 의한 숙주 세포 침윤을 제한한다는 것을 보여준다. 이 방법은 또한 면역-프라이밍된 자손의 수집과 FISH가 숙주 세포 침윤 및 포자 발사(20)를 분석하기 위해 장내 세포에서 N. parisii RNA를 검출하는데 어떻게 사용될 수 있는지를 기술한다.
함께,이 프로토콜은 C. elegans에서 microsporidia 및 유전 된 면역을 연구하기위한 견고한 토대를 제공합니다. 이 모델 시스템의 향후 연구가 유전 된 면역의 초기 분야에서 중요한 발견을 가능하게하기를 희망합니다. 이러한 기술은 또한 다른 숙주 유기체에서 미세 스포리디아 유도 유전 면역을 조사하기위한 출발점이 될 가능성이 큽니다.
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Protocol
본 연구는 21°C에서 성장한 야생형 C. 엘레간스 브리스톨 균주 N2를 사용한다.
1. 미디어의 제조
- 이전 보고서21,22에 따라 M9 미디어를 준비합니다.
- 이전 보고서21,22에 따라 선충류 성장 배지 (NGM)를 준비하십시오. 6cm 플레이트당 NGM 12mL를 붓거나 플레이트 10cm당 30mL를 붓습니다.
- 이전 보고서23에 따라 대장균 OP50-1 균주를 준비한다.
- 아래 단계에 따라 OP50-1-시딩된 NGM 플레이트를 준비한다.
- 볼텍싱으로 10x 농축 OP50-1을 재현탁합니다.
- 리피터 피펫을 사용하여 중앙에 플레이트를 시드하십시오. 6 cm 및 10 cm 플레이트의 경우, 각각 200 μL 또는 500 μL의 부피를 갖는 시드.
- 10cm 플레이트의 경우 유리 스프레더를 사용하여 OP50-1을 퍼뜨리고 박테리아 잔디를 만듭니다. 박테리아를 판의 가장자리까지 퍼뜨리지 마십시오.
참고 : 에탄올 딥과 스프레더를 다섯 접시마다 화염하여 멸균을 보장합니다. 박테리아를 죽이는 것을 막기 위해 퍼지기 전에 스프레더를 몇 초 동안 식히십시오. - 접시를 2 일 동안 실온에서 방치하여 건조시키고 박테리아 잔디밭의 성장을 보장하십시오.
참고 : 시드 된 플레이트는 실온에서 2-3 주 동안 또는 4 °C에서 최대 1 개월 동안 보관할 수 있습니다.
2. C. elegans의 유지 보수
- OP50-1 시드 NGM 플레이트의 일정한 박테리아 식품 공급원에 웜을 유지하십시오.
참고: 기아로 인해 세대 간 표현형이 발생할 수 있으며, 이는 결과에 영향을 줄 수 있습니다. 10cm OP50-1 시드 플레이트는 최대 72시간 동안 2,500L1s( C. elegans의 초기 애벌레 단계)를 지원합니다. - 웜이 굶주리면 실험에 웜을 사용하기 전에 OP50-1에서 3 세대 동안 자랍니다.
3. 차아염소산나트륨을 이용한 C. 엘레간 개체군의 동기화(표백)
참고: 이 단계는 시간에 매우 민감하므로 시작하기 전에 원심분리기를 사용할 수 있는지 확인하십시오. 대안으로, 덜 신속한 표백 프로토콜이 문헌에서 이용가능하고, 바람직한 경우에 사용될 수 있다. 6% 차아염소산나트륨이 시간이 지남에 따라 활동이 손실되는 것을 방지하려면 시약을 4°C의 어둠 속에 보관하고 최대 1년 동안 보관하십시오.
- 400 μL의 1 M NaOH, 250 μL의 6% 차아염소산나트륨( 물자표 참조) 및 1350 μL의 증류수를 혼합하여 각 시료에 대해 2 mL의 표백액을 제조하였다.
- 성인 웜 (부화 후 ~ 72 시간)을 플레이트에서 1mL의 M9 배지를 사용하여 마이크로 원심 분리 튜브로 씻어냅니다.
참고: 많은 웜이 플레이트에 남아 있는 경우, 실온에서 30초 동안 1,400 x g 에서 원심분리하여 웜을 펠릿화하고, 1mL 피펫 팁을 사용하여 상층액을 제거하고, 추가 플레이트 세척을 수행하십시오. - 실온에서 30초 동안 1,400 x g 에서 원심분리하여 웜을 펠릿화한 다음, 2x를 M9 배지 1 mL로 세척하여 박테리아를 제거하였다.
- 상층액을 제거하고, 준비된 표백액 1 mL를 첨가하고(단계 3.1.), 타이머를 1분 동안 설정하였다. 튜브를 3-4x 반전시킵니다.
참고 : 광학 현미경으로 웜이 스래싱을 멈추는 것을 볼 수 있습니다. - 1분 후, 실온에서 30초 동안 3,000 x g 에서 원심분리하여 웜을 펠릿화한 다음, 상층액을 제거하고 신선한 표백액 1 mL를 첨가한다.
- 광학 현미경으로 튜브를 면밀히 모니터링하여 웜 시체가 열리고 방출되는 배아를 시각화합니다. 시체의 ~ 50 % -80 %가 갈라지고 많은 배아가 방출되면 즉시 다음 단계로 진행하십시오.
참고: 동물의 수와 웜 균주에 따라 이 단계는 15초에서 4분 정도 걸릴 수 있습니다. 알려지지 않은 이유로 N. parisii에 감염된 웜은 감염되지 않은 동물보다 표백제에 더 오래 걸립니다. - 실온에서 30초 동안 3,000 x g 에서 원심분리하여 배아를 펠릿화한 다음, M9 배지 1 mL에서 3x 세척한다.
참고 : 세척은 튜브에서 잔류 차아 염소산염 용액을 희석하고 표백액이 배아를 손상시키지 않도록 신속하게 수행해야합니다. - 1 mL의 M9 배지를 최종 펠렛에 첨가하고, 4 mL의 M9 매질을 함유하는 15 mL 원뿔형 튜브로 옮긴다. 배아를 5 mL의 최종 부피로 현탁시킨다.
- 튜브를 기계적 로터 상에서 18-24시간 동안 21°C에서 회전시켜 배아를 L1s로 부화시킨다.
참고 : N. parisii 는 웜 내장을 감염시키고 생식계열을 침범하지 않으므로 감염된 부모는 수직 전염19에 의해 자손에게 감염을 전달하지 않습니다. 감염된 성인의 표백은 F1 동물을 동기화하고 N. parisii 포자를 파괴하여 F1 자손이 부모로부터 운반 된 포자에 감염되지 않도록합니다. - 튜브를 실온에서 1,800 x g 에서 1분 동안 원심분리하여 L1s를 펠릿화하고, 상청액 1 mL를 제외한 모든 것을 버린다.
- L1 혼합물 1-5 μL를 시딩되지 않은 NGM 플레이트 상에 피펫하고, 즉시 광학 현미경으로 시각화하여 액적 내의 L1s 수를 계수한다. 3x를 반복하고 카운트를 평균하여 L1의 농도와 총 수를 결정합니다.
참고 : 대부분의 배아는 부화되어야하며 L1은 액체 방울에서 빠르게 움직여야합니다. 부화되지 않은 배아와 무기력 (천천히 움직이는) L1의 상당 부분이 남아 있다면, 이것은 너무 오랫동안 표백을 나타냅니다.
4. N. parisii 포자의 제조
- 이전에 발표된 참고문헌19,24에 따라 N. parisii 포자를 준비한다.
5. C. elegans를 N. parisii 로 감염시켜 면역 유발 자손을 산출합니다.
- 계획된 감염 하루 전에 필요한 10cm 미시드 NGM 플레이트를 4°C에서 실온으로 옮깁니다.
- 감염 직전에, 마이크로원심분리 튜브에서 실온에서 30초 동안 1,400 x g 에서 ~2,500개의 동기화된 L1 웜을 원심분리하여 웜을 펠릿화한다. 피펫 팁으로 상층액을 제거하여 웜을 ~ 50μL의 M9 배지에 남겨 둡니다.
- L1s 및 N. parisii 포자에 10x OP50-1 mL를 원하는 농도(전형적으로 ~2.5백만 포자)에 첨가한다. 감염되지 않은 대조군으로서, 사용된 포자 제제의 부피에 상응하는 M9 배지의 부피를 갖는 L1s 및 OP50-1의 동등한 튜브를 준비한다.
참고: 면역프라이밍된 자손을 얻기 위해서는 동물의 >90%가 72시간(DY96 염색, 7단계로 측정됨)에 감염될 수 있도록 충분히 높은 포자 용량을 사용하되, 동물의 >80%가 여전히 포생되도록 충분히 낮다. 이것은 대부분의 자손이 감염된 부모에게서 나오고 부모의 표백이 F1 검사를위한 충분한 배아를 산출한다는 것을 보장합니다. 포자 제제는 농도와 감염성이 다양하지만, 적합한 부모 용량은 전형적으로 10 cm 플레이트 당 5-15 μL의 포자 제제 (~2.5 백만 포자) 사이이다. - 소용돌이 1 mL의 웜을 간단히 혼합하고 10 cm 시딩되지 않은 NGM 플레이트 상에 플레이트한다. 액체가 접시 전체에 퍼지도록 소용돌이치십시오.
- 플레이트를 뚜껑을 떼어 깨끗한 캐비닛에서 10-20분 동안 건조시키거나 완전히 건조될 때까지 21°C에서 72시간 동안 인큐베이션하기 전에 건조시킨다.
- 72 시간 감염 후 (hpi)에서, 1 mL의 M9 배지를 사용하여 플레이트에서 웜을 마이크로 원심분리 튜브로 세척하십시오. 많은 웜이 플레이트에 남아 있으면 30 초 동안 1,400 x g 에서 원심분리하여 웜을 펠릿화하고 상층액을 제거하고 추가 플레이트 세척을 수행하십시오.
- 실온에서 30초 동안 1,400 x g 에서 원심분리하여 웜을 펠릿화하고, 1 mL의 M9 배지로 또는 상청액이 맑아질 때까지 2x를 세척한다. 1mL의 M9 배지의 최종 부피에 재현탁하십시오.
- 피펫을 위아래로 섞은 다음 부유 한 웜 100 μL를 신선한 튜브로 옮깁니다.
참고: ~250명의 성인을 대상으로 한 이 샘플은 7단계 및 3단계 시작에 설명된 대로 나중에 수정하고 염색하여 부모의 웜 적합성 및 감염 상태를 확인할 수 있습니다. - 성인 웜을 파쇄하고 시험을 위해 F1 배아를 방출하기 위해, 단계 3에 기재된 바와 같이, 나머지 900 μL의 부유 웜을 표백한다.
참고: 이 단계는 또한 후속 감염 분석 전에 모든 N. parisii 포자를 파괴합니다.
6. C. elegans에서 N. parisii에 대한 유전 된 면역 테스트
- 단계 5.1.-5.6.에 설명된 대로 감염을 수행하고 아래에 언급된 대로 수정하여 수행합니다.
참고: F1에 대한 감염 분석은 1,000~1,000개의 L1 웜과 400μL의 10x OP50-1을 사용하여 6cm NGM 플레이트에서 스케일 다운하고 수행할 수 있습니다. 순진한 F1 (즉, 감염되지 않은 부모의 웜)의 ~ 100 %가 감염되고 순진한 F1의 ~ 10 % 만 gravid되도록 포자의 "높은"복용량을 사용해야합니다. 포자 제제는 농도 및 감염성이 다양하지만, 적합한 용량은 전형적으로 6 cm 플레이트 당 5-15 μL (∼2.5 백만 포자) 사이이다. - 72hpi에서 7단계에 설명된 대로 웜 적합성 및 감염 상태를 확인하기 위해 수정 및 얼룩을 만듭니다.
7. 배아와 미세 스포자를 시각화하기 위해 C. elegans 의 DY96 염색
참고 : DY96은 웜 배아와 미세 스포리아 포자 벽 19,15,25를 염색하는 녹색 형광 키틴 결합 염료입니다. 이를 통해 웜의 적합성 및 감염 상태를 동시에 모니터링 할 수 있습니다.
- 플레이트에서 웜을 세척하여 0.1% Tween-20을 함유하는 M9 배지 1mL를 사용하여 마이크로 원심분리 튜브로 세척합니다. 많은 웜이 플레이트에 남아 있으면 실온에서 30 초 동안 1,400 x g 에서 원심분리하여 웜을 펠릿화하고 피펫 팁을 사용하여 상층액을 제거하고 추가 플레이트 세척을 수행하십시오.
- 실온에서 30초 동안 1,400 x g 에서 원심분리하여 웜을 펠릿화하고, 0.1% Tween-20을 함유하는 M9 배지 1 mL로 또는 상청액이 맑을 때까지 2x 세척한다.
- 상층액을 제거하고 아세톤 700μL를 넣고 웜을 실온에서 10 분 동안 고정시킵니다.
참고: 이 시점에서 웜은 원하는 경우 최대 몇 개월 후에 처리하기 위해 -20°C에 저장할 수 있습니다. - 실온에서 30초 동안 10,000 x g 에서 원심분리하여 고정된 웜을 펠릿화하고, 0.1% Tween-20 (PBST)을 함유하는 PBS 1 mL로 2x 세척하였다.
- PBST, 0.1% (v/v) 소듐 도데실 설페이트 (SDS) 및 20 μg/mL DY96 (증류수 중의 5 mg/mL 원액에서) 50 mL의 DY96 작업 용액을 준비 하십시오 (재료 표 참조). 튜브를 호일에 싸서 서랍에 보관하여 빛에 노출되지 않도록하십시오.
참고 : DY96 재고 및 작업 솔루션은 어둠 속에 보관하면 실온에서 >1 년 동안 보관할 수 있습니다. - 실온에서 30초 동안 10,000 x g 에서 원심분리하여 웜을 펠릿화하고 상층액을 제거한다. 500 μL의 DY96 작업 용액을 펠렛에 첨가하고 실온에서 30분 동안 회전시킨다.
- 실온에서 30초 동안 10,000 x g 에서 원심분리하여 웜을 펠릿화한다. 상청액을 제거하고 DAPI 유무에 관계없이 장착 배지 15μL 를 첨가합니다(재료 표 참조).
- 염색된 웜이 포함된 용액 10 μL를 현미경 슬라이드 상에 피펫하고 덮개 슬립을 위쪽에 놓습니다.
참고: 슬라이드 및 추가 샘플은 장기간 보관을 위해 어둠 속에서 4°C에서 보관할 수 있습니다.
8. 웜 적합성 및 감염 상태를 평가하기 위한 DY96 염색된 웜의 이미징 및 분석
- DY96 염색된 웜(단계 7.8에서와 같이 슬라이드에 장착됨)을 분석하려면 형광 현미경의 GFP 채널을 사용하여 이미징을 수행합니다.
- 웜 집단의 적합성을 결정하려면 5x 또는 10x 목표를 사용하여 조건 당 >100 개의 웜의 중력을 분석하십시오.
참고 : ≥1 배아를 운반하는 웜은 gravid로 간주됩니다. 기계식 셀 카운터는 계산할 때 사람의 실수를 최소화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 웜 배아는 미세 스포자19보다 덜 염색 (덜 형광성)됩니다. 배아는 난형, ~ 50 μm x ~ 30 μm이며, 건강한 C. elegans 성인의 중체에서 발견됩니다. 건강하고 감염되지 않은 성인은 몸 길이26을 따라 줄지어 조직 된 10-20 개의 배아를 가지고 있습니다. - 피트니스의 미묘한 차이를 드러내려면 배아 카운트를 수행하십시오. 이를 위해 조건 당 20-30 개의 개별 웜에있는 배아의 수를 수동으로 계산하십시오.
- 웜 개체군이 얼마나 감염되었는지 확인하려면 5x-40x 목표를 사용하여 조건당 >100개의 웜의 감염 상태를 평가합니다. 임의의 수의 세포 내 장 포자를 포함하는 웜은 감염된 것으로 간주됩니다.
참고 : Microsporidia 포자는 웜 배아보다 밝습니다. N. parisii 의 콩 모양의 포자는 ~ 2.2 μm x ~ 0.8 μm이며 ~ 48 hpi15에서 웜의 장 세포에서 생산됩니다. 포자가 장 내강에서만 독점적으로 보이고 장 벽을 따르지 않는 웜은 감염된 것으로 간주되지 않습니다19. 이 포자는 개인의 감염으로 인한 것이 아닌 새로 섭취 된 포자를 나타낼 가능성이 높기 때문입니다. - 이미지 분석 소프트웨어 ( 재료 표 참조)를 사용하여 아래 단계에 따라 기생충 부담과 웜 크기를 정량화하십시오.
- 이미지 20-30 웜은 각 샘플에 대해 형광 직립 스테레오스코프를 사용하여 현미경 슬라이드에 장착됩니다. 브라이트필드, DAPI 및 GFP 채널에서 이미지를 캡처합니다. 가장 감염된 샘플의 형광이 포화되지 않도록 GFP 채널에서 적절한 노출을 선택하십시오.
참고: 감염은 여전히 감염이 가장 적은 샘플에서 시각화할 수 있습니다. 이미지는 일반적으로 5x 목표를 사용하여 촬영됩니다. - FIJI/ImageJ에서 파일을 엽니다. 파일 형식에 따라 ImageJ에서 이미지를 열려면 Bio-Formats Importer 플러그인이 필요할 수 있습니다.
- 브라이트필드 또는 DAPI 이미지와 도구 모음의 다각형 선택 도구를 사용하여 이미지에서 20-30개의 개별 웜을 윤곽을 그립니다. 추가 [t]를 클릭하여 드롭다운 메뉴에서 관심 영역(ROI) 관리자> > 도구 분석을 사용하여 각 개요를 저장합니다. 프레임에서 완전히 볼 수있는 동물을 윤곽을 그립니다.
참고: 웜 윤곽선은 나중에 윤곽선이 있는 파일을 Tiff로 저장하여 다시 방문할 수 있습니다. - ROI 관리자에서 선택 취소를 클릭하여 이미지에서 모든 윤곽선을 제거하고 드롭 다운 메뉴에서 이미지 > 복제를 클릭하십시오. 관심 채널에 대응하는 번호를 "채널" 박스에 입력하여 기생충 부담을 위해 GFP 채널을 복제한다(예를 들어, 2).
- 이미지 >를 사용하여이 채널을 임계 값> 밝은 기생충 부담이 포착되지만 웜 배아의 형광이 조광되지 않는 수준으로 임계 값을 조정 한 다음 적용을 클릭하십시오. 적용된 임계값을 기록하고 동일한 실험의 모든 이미지에 일관되게 사용합니다.
참고: 모든 이미지를 분석하기 전에 임계값이 가장 적게 감염된 샘플과 가장 많이 감염된 샘플 모두에 적합한 값인지 확인하십시오. - 분석 > 측정값 설정을 선택하고 영역 분율 확인란을 선택합니다. ROI 관리자에서 단일 웜 윤곽선을 차례로 선택하고 분석 > 측정 기능을 클릭하십시오. 결과 창은 %Area (즉, 기생충 부담 %)에 대한 측정을 제공합니다.
참고: 배아의 형광이 너무 밝아서 임계값을 넘으면 도구 모음의 검은색 페인트브러시 도구를 사용하여 %Area를 측정하기 전에 이러한 영역을 수동으로 지울 수 있습니다. - 웜 크기를 체력 측정값으로 확인하려면 8.3단계에 설명된 대로 웜의 윤곽을 그립니다. 분석 > 측정값 설정을 선택하고 영역 확인란을 선택합니다. ROI 관리자 에서 단일 웜 윤곽선을 차례로 선택하고 분석 > 측정 기능을 클릭하십시오. 결과 창은 %Area에 대한 측정을 제공합니다.
- 이미지 20-30 웜은 각 샘플에 대해 형광 직립 스테레오스코프를 사용하여 현미경 슬라이드에 장착됩니다. 브라이트필드, DAPI 및 GFP 채널에서 이미지를 캡처합니다. 가장 감염된 샘플의 형광이 포화되지 않도록 GFP 채널에서 적절한 노출을 선택하십시오.
9. 미세 스포리디아 및 포자 발사에 의한 C. elegans 의 침입을 평가하기위한 FISH 분석
참고: MicroB FISH 프로브는 microsporidian 18s rRNA의 보존된 영역을 인식하며 세포 내 스포로플라즈마(즉, 침입한 숙주 세포)와 포자 내의 유전 물질을 표지하는 데 사용할 수 있습니다.
- M9 배지로 구성된 400 μL의 최종 부피에서 N. parisii 의 4 백만 포자 및 10x OP50-1의 10 μL로 6,000 표백제 동기화 L1 웜을 감염시킵니다.
- 혼합물을 6 cm 시딩되지 않은 NGM 플레이트 상에 플레이트하고, 깨끗한 캐비닛에서 10-20분 동안 건조시키고, 21°C에서 놓는다.
- 30분 후, 0.1% Tween-20을 함유하는 M9 배지 1 mL로 플레이트에서 동물을 세척한다.
- 실온에서 1분 동안 1,400 x g 에서 원심분리하여 웜을 펠릿화한다.
- 피펫 팁을 사용하여 상층액을 제거하고 아세톤 700μL를 넣고 실온에서 10 분 동안 앉히십시오.
참고: 이 시점에서 웜은 나중에 처리하기 위해 -20°C에 저장할 수 있습니다. - MicroB 프로브를 사용하여 하룻밤 동안 FISH 분석을 수행하여 이전에 발표된 보고서27,19에 이어진다.
참고: 포자 소성을 평가하려면 최종 500μL의 세척 완충액을 20μg/mL의 DY96으로 시료에 보충하고 프로토콜을 정상적으로 계속하기 전에 21°C에서 30분 동안 회전하십시오. - 슬라이드를 4°C의 슬라이드 박스에 보관합니다. 장기간 보관(즉, 수개월)을 위해, 추가 샘플을 어둠 속에서 4°C의 마이크로원심분리 튜브에 보관한다.
- FISH로 염색 된 웜의 침입을 평가하려면 형광 현미경의 빨간색 채널을 사용하여 웜을보십시오. L1 동물이 작고 스포로 플라스마가 복제 초기 단계에있을 것이므로 높은 배율 (63x 목표)으로 감염 사건을 시각화하십시오. 포자 발사를 평가하려면 63x 목표물과 적색 및 녹색 형광 채널을 모두 사용하십시오.
참고: GFP와 mCherry 신호가 공국소화되는 포자는 소성이 없는 것으로 간주됩니다. 빈 GFP 포자 케이스는 해고된 것으로 간주된다. - 침윤 또는 포자 발사를 분석하려면 수동으로 스포로 플라스마 (장 세포의 mCherry 초점)의 수 또는 조건 당 20-30 개의 웜에서 발사 된 포자의 비율을 계산하십시오. z-비행기의 초점을 조정하여 다른 비행기에서 종종 발견되는 모든 감염 사건과 포자를 캡처하십시오.
참고 : 스포로 플라스마는 장 세포 내에서만 발견됩니다. 스포로 플라즈마의 최고 농도는 일반적으로 인두 직후에 발견됩니다. 샘플도 DY96으로 염색되면 스포어와 공동 국소화되지 않는 스포로 플라즈마의 존재를 찾으십시오.
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Representative Results
본 연구에서, C. elegans (P0)의 부모 집단은 L1 단계에서 낮은 용량의 N. parisii 포자로 감염되었다. 이러한 감염 조건은 일반적으로 부모의 표백을 통해 많은 수의 미세 스포리디아 내성 F1 자손을 얻는 데 사용됩니다. 감염된 부모 집단 및 감염되지 않은 대조군을 72 hpi로 고정시키고, DY96으로 염색하여 웜 배아 및 미세스포리디아 포자를 시각화하였다(도 1A). 감염된 동물은 작고, 많은 미세 스포자를 함유하고, 건강한 감염되지 않은 대조군보다 적은 배아를 생산합니다. 웜 중량의 평가는 감염되지 않은 동물의 ~ 95 %가 감염된 동물의 80 % 미만에 비해 자손을 생산한다는 것을 보여주었습니다 (그림 1B). 정량화에 따르면 DY96 염색된 포자를 함유하는 웜의 수에 의해 결정된 바와 같이, 미세 스포리디아 처리 집단의 ~90%가 감염되었다는 것을 밝혀냈다(도 1C). 면역 프라이밍 F1 자손을 얻으려면 대부분의 부모가 감염되도록 보장 할만큼 충분히 높지만 인구가 여전히 자손을 생산할 수 있도록 충분히 낮은 미세 스포리디아 용량을 사용하는 것이 중요합니다. 본 연구에서 데이터를 얻기 위해 사용된 미세스포리디아 투여량의 표가 제공된다(표 1).
감염되지 않고 감염된 부모 집단(도 1)을 72hpi에서 차아염소산나트륨으로 처리하여 순진하고 면역프라이밍된 F1 자손을 얻었다. F1 동물을 L1 단계에서 고용량의 N. parisii 포자에 노출시켜 미세 스포리디아에 대한 유전 면역을 시험하였다. 72 hpi에서, F1 동물을 고정시키고, 미세스포리디아 내성을 평가하기 위해 DY96으로 염색하였다(도 2A). 이 고정 된 동물의 정량화에 따르면 프라이밍 된 웜은 순진한 동물보다 훨씬 많은 배아를 함유하고 있으며, 이는 감염에 직면했을 때 더 큰 적합성을 나타냅니다 (그림 2B). FIJI/ImageJ는 개별 순진하고 면역-프라이밍된 웜(즉, 형광 N. parisii 포자로 채워진 신체의 백분율)의 기생충 부담을 결정하는 데 사용되었다(그림 2C). 정량화는 감염된 부모에게서 온 웜의 기생충 부담을 극적으로 감소시킨 것으로 나타났습니다 (그림 2D). 또한, 개별 웜 크기의 계산은 프라이밍 된 웜이 N. parisii 감염에 직면 한 순진한 동물에 비해 상당한 성장 이점을 가지고 있음을 보여주었습니다 (그림 2E). 이 데이터는 N. parisii에 감염된 부모가 높은 수준의 미세 스포리디아 저항성을 가진 자손을 생산한다는 것을 보여줍니다.
이전의 연구는 microsporidia에 대한 유전 된 면역이 N. parisii19에 의한 장 세포의 침입을 감소시킨다는 것을 밝혀 냈습니다. 숙주 세포 침윤의 차이를 시각화하기 위해, 순진하고 면역-프라이밍된 동물(위와 같이 감염되지 않거나 감염된 부모로부터 수득됨)을 L1 단계에서 N. parisii 의 최대 용량에 노출시켰다. 30dpi에서, 웜을 고정시키고 공동-염색하고, FISH 프로브를 사용하여 N. parisii RNA 및 DY96을 검출하여 N. parisii 포자 벽을 검출하였다 . 이미징에 따르면 순진한 동물은 일반적으로 여러 포자와 여러 개의 감염된 세포 (sporoplasms)를 포함하고 있지만 프라이밍 된 동물은 포자가 훨씬 적거나 그렇지 않으며 일반적으로 스포로 플라즈마가 없음을 보여주었습니다 (그림 3).
도 1: 감염되지 않은 N. parisii-infected C. elegans의 직접 황색 96 (DY96) 염색은 웜 중력 및 감염 상태를 나타낸다. (A-C) N2C. 엘레간은 L1 단계에서 저용량의 N. parisii로 감염되거나 감염되지 않았다. 72hpi에서, 웜을 고정시키고, DY96으로 염색하고, 웜 중량 및 감염 상태를 평가하기 위해 이미지화하였다. (A) 대표 영상이 도시되어 있다. DY96은 웜 배아와 미세 스포자 (키틴)의 시각화를 가능하게합니다. 감염된 웜의 삽입 이미지가 오른쪽에 표시됩니다. 배아는 'E'로 표지되고; N. 장의 파리 감염은 'Np'로 표시되어 있습니다. 왼쪽 및 중간 이미지의 배율 막대 = 500μm. 우측 이미지에 대한 스케일 막대 = 100 μm. (B) 하나 이상의 배아를 운반하는 웜은 그라비드로서 스코어링되고 그래프화되었다. (c) 장내 세포에 임의의 수의 N. parisii 포자를 운반하는 웜은 감염 및 그래프로 점수화되었다. (B-C) 실험당 조건당 n=100개의 웜을 사용하여 5개의 독립적인 실험에서 풀링된 데이터입니다. 평균 ± SEM이 도시되어 있다. p 값은 짝을 이루지 않은 두 꼬리 스튜던트 t-검정에 의해 결정되었다. 유의성은 다음과 같이 정의되었다: *p < 0.05; p < 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 웜 당 배아, 미세스포리디아 부담 및 웜 크기를 결정하기 위한 순진하고 면역-프라이밍된 C. 엘레간스의 다이렉트 옐로우 96 (DY96) 염색. (A) N2C. 엘레간은 L1 단계에서 저용량의 N. parisii로 감염되거나 감염되지 않았다. 72 hpi에서, 웜은 배아를 방출하기 위해 차아염소산나트륨으로 처리되었다. 그 결과 순진하고 면역이 유발 된 자손은 L1 단계에서 고용량의 N. parisii에 감염되었습니다. 72hpi에서, 웜을 고정시키고, DY96으로 염색하고, 웜 배아와 기생충 부담을 시각화하기 위해 이미지를 촬영했습니다. 대표적인 이미지가 표시됩니다. 스케일 바 = 200 μm.(B) 웜 당 배아의 수를 계수하고 (A)로부터 그래프화하였다. (C) FIJI / ImageJ의 스크린 샷은 오른쪽 하단의 임계 값 창을 사용하여 기생충 부담 (흰색으로 표시)을 시각화하기 위해 임계 값 인 패널 A의 순진한 웜을 보여줍니다. 여기서 개별 웜은 빨간색으로 강조 표시된 "다각형 선택" 도구를 사용하여 윤곽을 표시하고 오른쪽 상단의 ROI 창을 사용하여 "관심 영역"(ROI)으로 정의했습니다. 분석 > 측정 > 면적 기능은 25.02 %와 13.49 %로 밝혀진 두 가지 예제 웜의 기생충 부담을 정량화하는 데 사용되었습니다. (D) 웜 당 기생충 부담을 (A)로부터 결정하고 그래프화하였다. (e) 상기 이미지로부터, 개별 웜 크기는 분석 > 측정 > 영역 함수를 사용하여 패널 C와 같이 윤곽이 그려진 동물로부터 계산되었다. (B, D 및 E) 평균 ± SEM이 도시되어 있다. p 값은 짝을 이루지 않은 두 꼬리 스튜던트 t-검정에 의해 결정되었다. 유의성은 다음과 같이 정의되었다: *p < 0.05. **p < 0.01, ***p < 0.001입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: N. parisii 18S rRNA에 대한 계내 혼성화 (FISH)에서의 형광은 순진하지만 프라이밍되지 않은 동물에서 C. elegans 장 세포의 기생충 침윤을 드러낸다. N2C. 엘레간은 L1 단계에서 저용량의 N. parisii로 감염되거나 감염되지 않았다. 72 hpi에서, 웜은 배아를 방출하기 위해 차아염소산나트륨으로 처리되었다. 그 결과 순진하고 면역이 유발 된 자손은 L1 단계에서 N. parisii의 최대 용량으로 감염되었습니다. 30 mpi에서, 웜을 고정시키고, FISH를 실시하여 스포로 플라즈마를 검출하고, DY96으로 염색하여 미세 스포리아 포자 벽을 검출하고, 영상화하였다. 대표적인 이미지가 표시됩니다. 순진한 웜에 대한 삽입 이미지는 스포로 플라스마 (빨간색, 별표), 발사 된 포자 (녹색, 화살촉) 및 발사되지 않은 포자 (노란색, 화살표)를 보여줍니다. 표시된 순진한 감염된 웜은 4 개의 스포로 플라즈마를 표시합니다. 스케일 바 = 20μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| N. 파리시 복용량 | 플레이트 농도(포자/cm2) | 6cm 플레이트 당 수백만 개의 포자 | 10cm 플레이트 당 수백만 개의 포자 |
| 낮다 | 35,400 | - | 2.7 |
| 높다 | 88,400 | 2.5 | - |
| 최대한 | 2,12,000 | 6 | - |
표 1: N. parisii 투여량이 연구에 채택됨.
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Discussion
본 프로토콜은 단순하고 유전적으로 다루기 쉬운 N. parisii-C. elegans 감염 모델에서 microsporidia 및 유전 된 면역의 연구를 설명합니다.
포자 준비는 생산성24에 따라 일반적으로 6 개월의 실험 동안 충분한 포자를 산출하는 집중적 인 프로토콜입니다. 중요하게도, 감염성은 실험에 사용하기 전에 각각의 새로운 포자 "제비"에 대해 결정되어야 한다. 포자 제제 사이의 감염성의 가변성으로 인해, 단일 로트는 실험의 모든 반복에 대해 일관되게 사용되어야 한다. 해동하면 포자가 발사되고 감염성이 감소 할 수 있으므로 개별 분취량을 해동하거나 다시 얼려서는 안됩니다. 따라서 포자는 감염 직전에 -80 °C 냉동고에서만 제거되어야하며 벤치에있는 동안 얼음 위에 유지되어야합니다.
단계 5-6에서, 감염 분석이 윤곽을 드러냈다. 감염 분석 중에는 동물의 오염이나 굶주림을 피하는 것이 중요한데, 이는 F1s에서 면역력을 혼란스럽게 하는 추가적인 세대 간 효과를 초래할 수 있기 때문입니다. 유전 된 면역 분석의 중요한 한계는 감염된 부모가 더 적은 F1 자손을 생산한다는 것입니다. 따라서 부모 세대가 면역력을 전달하기에 충분히 감염되고 테스트를 위해 자손을 생산할 수있을 정도로 건강하다는 것을 신중하게 균형을 맞추는 것이 중요합니다. 현재의 프로토콜은 L1 동물에 대한 감염 분석을 기술했지만, 프로토콜은 다르게 단계적 인 부모에 대한 미세 스포리디아 감염의 영향과 노인 자손의 면역의 지속성을 테스트하기 위해 수정 될 수 있습니다. 상기 방법은 또한 유전된 면역에 대한 다수의 또는 별개의 스트레스(예를 들어, 삼투 스트레스, 중금속 스트레스, 다른 병원체와의 공감염)의 영향을 시험하기 위해 변형될 수 있다. C. elegans에서 N. parisii에 대한 유전 된 면역은 세대 간 (즉, 단일 세대를 지속)19이지만, 프로토콜은 세대 간 효과를 테스트하기 위해 추가 세대를 연구하도록 적응 될 수 있습니다. 제공된 프로토콜은 N. parisii 감염에 특이적이지만, 많은 다른 선충류 감염 종의 microsporidia가 존재합니다28. 상기 프로토콜은 다른 장-감염(예를 들어, Nematocida ausubeli) 및 표피- 및 근육-감염(예를 들어, Nematocida displodere) microsporidia29,30에 대한 상속된 면역을 연구하도록 적응될 수 있다. C. elegans는 또한 많은 다른 자연 및 인간 병원균 (박테리아, 곰팡이 및 바이러스)에 감염됩니다. 여기에 기술된 방법은 C. elegans의 다른 병원체에 대한 유전된 면역성 및 N. parisii에 대한 유전된 면역 반응의 병원체-특이성을 시험하는데 사용될 수 있다. C. elegans는 잘 정립 된 모델 유기체입니다. 그러나, 헤르마프로디트 종 C. tropicalis 및 C. briggsae 및 수컷-여성 종 C. kamaaina를 포함하는 Caenorhabditis 속의 다른 구성원들도 N. parisii31에 다양한 정도로 감염된다. 제공된 프로토콜을 약간 수정함으로써 유전 된 면역을 이들 동물에서도 테스트 할 수 있습니다.
단계 8에서, DY96-염색된 웜(즉, 감염된 % 동물, % gravid 동물)에서 미세스포리디아 감수성의 차이를 결정하기 위한 빠르고 간단한 방법이 주어졌다. 그러나 때때로 이러한 방법은 면역력과 체력의 작은 변화를 감지 할만큼 민감하지 않습니다. 이것은 하나의 배아와 많은 감염된 세포를 가진 웜이 10 개의 배아와 하나의 감염된 세포가있는 웜과 동일하게 취급되기 때문입니다. 이와 같이, 이들 동물에서 감염 결과(즉, 기생충 부담 %, 배아 수, 웜 크기)를 결정하기 위해 보다 세밀한 분해능을 갖는 방법도 제공되었다. 두 가지 방법을 모두 사용할 수 있지만 표현형 차이는 일반적으로 후자와 더 뚜렷하게 나타나므로 중요한 차이를 쉽게 감지 할 수 있습니다. 이 방법에 대한 향후 적응에는 기계 학습을 사용하여 분석을 자동화하는 것이 포함될 수 있습니다.
단계 9에서, FISH를 이용한 미세스포리디아 및 포자 소성에 의한 숙주 세포 침윤을 검정하기 위한 기술이 제공되었다. DY96은 강한 형광 녹색 신호를 갖는 미세 스포리디아를 표시하는 반면, 친유성 염색 나일 레드 및 키틴 결합 칼코플루오르 화이트를 포함한 다른 염료는 또한 N. parisii30,32,33을 염색하는데 사용될 수 있다. 본 프로토콜은 아세톤을 이용한 고정을 기술하고 DY96 및 FISH 염색으로 미세 스포리디아를 검출하는 데 잘 작동합니다. 그러나 4 % 파라포름 알데히드로 고정하면 조직 형태를 보존하고 일부 이미징 프로토콜에서 신호를 개선하는 데 도움이 될 수 있습니다.
Microsporidia는 연구되지 않은 병원체이며, 감염의 세포 생물학의 대부분은 알려지지 않은 채로 남아 있습니다. C. elegans 는 간단한 모델 유기체이며, 이러한 프로토콜은이 기생충에 대한 감염 및 숙주 방어와 관련된 주요 과정을 이해하는 플랫폼 역할을 할 수 있습니다. 유전 된 면역은 신흥 분야이며, 많은 질문이 여전히 탁월합니다1. 감염된 부모는 자손에게 면역력을 어떻게 전달합니까 (자손의 모성 공급 또는 변경된 전사 조절)? 자손 (항균 펩티드 또는 기타 면역 단백질)의 면역을 매개하는 것은 무엇입니까? 병원체에 특이적인 면역 반응은 어떻게 유전되며, 종간에 유전 된 면역은 얼마나 보존됩니까? C. elegans와 함께 사용할 수있는 광범위한 도구를 감안할 때, 여기에 설명 된 프로토콜을 기반으로하는 연구는 유전 된 면역에 대한 이러한 근본적인 질문에 대답 할 준비가 잘되어 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
원고에 대한 유용한 의견을 제공 한 Winnie Zhao와 Yin Chen Wan에게 감사드립니다. 이 연구는 캐나다 자연 과학 및 공학 연구위원회 (Grant #522691522691)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.0 mm zirconia beads | Biospec Products Inc. | 11079124ZX | |
| 10 mL syringe | Fisher Scientific | 1482613 | |
| 5 μm filter | Millipore Sigma | SLSV025LS | |
| Axio Imager 2 | Zeiss | - | Fluorescent microscope for imaging of DY96- and FISH- stained worms on microscope slides |
| Axio Zoom V.16 Fluorescence Stereo Zoom Microscope | Zeiss | - | For live imaging of fluorescent transgenic animals to visualize the IPR |
| Baked EdgeGARD Horizontal Flow Clean Bench | Baker | - | |
| Bead disruptor, Genie SI-D238 Analog Disruptor Genie Cell Disruptor, 120 V | Global Industrial | T9FB893150 | |
| Cell-VU slide, Millennium Sciences Disposable Sperm Count Cytometers | Fisher Scientific | DRM600 | |
| Direct Yellow 96 | Sigma-Aldrich | S472409-1G | |
| EverBrite Mounting Medium with DAPI | Biotium | 23001 | |
| EverBrite Mounting Medium without DAPI | Biotium | 23002 | |
| Fiji/ImageJ software | ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | |
| Mechanical rotor | Thermo Sceintific | 415110 / 1834090806873 | Used to spin tubes of bleached embryos for overnight hatching |
| MicroB FISH probe | Biosearch Technologies Inc. | - | Synthesized with a Quasar 570 (Cy3) 5' modification and HPLC purified, CTCTCGGCACTCCTTCCTG |
| N2 | Wild-type, Bristol strain | Default strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771-100G | |
| Sodium hydroxide solution (5 N) | Fisher Chemical | FLSS256500 | |
| Sodium hypochlorite solution (6%) | Fisher Chemical | SS290-1 | |
| Stemi 508 Stereo Microscope | Zeiss | - | For daily maintenance of worms and counting of L1 worms for assay set ups |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379-100ML | |
| Vectashield + A16 | Biolynx | VECTH1500 |
References
- Tetreau, G., Dhinaut, J., Gourbal, B., Moret, Y. Trans-generational immune priming in invertebrates: current knowledge and future prospects. Frontiers in Immunology. 10, 1938 (2019).
- Au, V., et al. CRISPR/Cas9 methodology for the generation of knockout deletions in Caenorhabditis elegans. G3 Genes|Genomes|Genetics. 9 (1), 135-144 (2019).
- Kamath, R. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
- The C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).
- Yoshimura, J., et al.
- Weinhouse, C., Truong, L., Meyer, J. N., Allard, P. Caenorhabditis elegans as an emerging model system in environmental epigenetics: C. elegans as an environmental epigenetics model. Environmental and Molecular Mutagenesis. 59 (7), 560-575 (2018).
- Ermolaeva, M. A., Schumacher, B. Insights from the worm: the C. elegans model for innate immunity. Seminars in Immunology. 26 (4), 303-309 (2014).
- Willis, A. R., Sukhdeo, R., Reinke, A. W. Remembering your enemies: mechanisms of within-generation and multigenerational immune priming in Caenorhabditis elegans. TheFEBS Journal. 288 (6), 1759-1770 (2020).
- Burton, N. O., et al. Cysteine synthases CYSL-1 and CYSL-2 mediate C. elegans heritable adaptation to P. vranovensis infection. Nature Communications. 11, 1741 (2020).
- Wadi, L., Reinke, A. W. Evolution of microsporidia: an extremely successful group of eukaryotic intracellular parasites. PLoS Pathogens. 16, 1008276 (2020).
- Han, B., Takvorian, P. M., Weiss, L. M. Invasion of host cells by microsporidia. Frontiers in Microbiology. 11, 172 (2020).
- Tamim El Jarkass, H., Reinke, A. W. The ins and outs of host-microsporidia interactions during invasion, proliferation and exit. Cellular Microbiology. 22 (11), 13247 (2020).
- Balla, K. M., Lažetić, V., Troemel, E. R. Natural variation in the roles of C. elegans autophagy components during microsporidia infection. PLoS ONE. 14, 0216011 (2019).
- Szumowski, S. C., Estes, K. A., Troemel, E. R. Preparing a discreet escape: Microsporidia reorganize host cytoskeleton prior to non-lytic exit from C. elegans intestinal cells. Worm. 1 (4), 207-211 (2012).
- Balla, K. M., Luallen, R. J., Bakowski, M. A., Troemel, E. R. Cell-to-cell spread of microsporidia causes Caenorhabditis elegans organs to form syncytia. Nature Microbiology. 1 (11), 1-6 (2016).
- Reinke, A. W., Balla, K. M., Bennett, E. J., Troemel, E. R. Identification of microsporidia host-exposed proteins reveals a repertoire of rapidly evolving proteins. Nature Communications. 8, 14023 (2017).
- Bakowski, M. A., et al. Ubiquitin-mediated response to microsporidia and virus infection in C. elegans. PLoS Pathogen. 10, 1004200 (2014).
- Reddy, K. C., et al. An intracellular pathogen response pathway promotes proteostasis in C. elegans. Current Biology. 27 (22), 3544-3553 (2017).
- Willis, A. R., et al. A parental transcriptional response to microsporidia infection induces inherited immunity in offspring. Science Advances. 7 (19), (2021).
- Tamim El Jarkass, H., et al. An intestinally secreted host factor promotes microsporidia invasion of C. elegans. eLife. 11, 72458 (2022).
- Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. Journal of Visualized Experiments. 49, 2496 (2011).
- Stiernagle, T.
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
- Estes, K. A., Szumowski, S. C., Troemel, E. R. Non-lytic, actin-based exit of intracellular parasites from C. elegans intestinal cells. PLOS Pathogens. 7, 1002227 (2011).
- Botts, M. R., Cohen, L. B., Probert, C. S., Wu, F., Troemel, E. R. Microsporidia intracellular development relies on myc interaction network transcription factors in the host. G3 Genes|Genomes|Genetics. 6 (9), 2707-2716 (2016).
- Corsi, A. K. A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
- Rivera, D. E., Lažetić, V., Troemel, E. R., Luallen, R. J. RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize microbial colonization and infection in the Caenorhabditis elegans intestines. bioRxiv. , (2022).
- Zhang, G., et al. A large collection of novel nematode-infecting microsporidia and their diverse interactions with Caenorhabditis elegans and other related nematodes. PLoS Pathogens. 12, 1006093 (2016).
- Luallen, R. J., et al. Discovery of a natural microsporidian pathogen with a broad tissue tropism in Caenorhabditis elegans. PLoS Pathogens. 12, 1005724 (2016).
- Troemel, E. R., Félix, M. -A., Whiteman, N. K., Barrière, A., Ausubel, F. M. Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 6, 309 (2008).
- Burton, N. O., et al. Intergenerational adaptations to stress are evolutionarily conserved, stress-specific, and have deleterious trade-offs. eLife. 10, 73425 (2021).
- Jaroenlak, P., et al. 3-Dimensional organization and dynamics of the microsporidian polar tube invasion machinery. PLoS Pathogens. 16, 1008738 (2020).
- Weidner, E., Manale, S. B., Halonen, S. K., Lynn, J. W. Protein-membrane interaction is essential to normal assembly of the microsporidian spore invasion tube. The Biological Bulletin. 188 (2), 128-135 (1995).
