Method Article

חקר חסינות תורשתית במודל Caenorhabditis elegans של זיהום מיקרוספורידיה

DOI:

10.3791/63636

⸱

April 6th, 2022

 ,  , 
1Department of Molecular Genetics, University of Toronto

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הזיהום של Caenorhabditis elegans על ידי הטפיל המיקרוספורידי Nematocida parisii מאפשר לתולעים לייצר צאצאים שעמידים מאוד לאותו פתוגן. זוהי דוגמה לחסינות תורשתית, תופעה אפיגנטית לא מובנת היטב. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את המחקר של חסינות תורשתית במודל תולעת הניתנת למתיחה גנטית.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חסינות תורשתית מתארת כיצד בעלי חיים מסוימים יכולים להעביר את "הזיכרון" של זיהום קודם לצאצאיהם. זה יכול להגביר את עמידות הפתוגנים בצאצאיהם ולקדם הישרדות. בעוד שחסינות תורשתית דווחה אצל חסרי חוליות רבים, המנגנונים העומדים בבסיס תופעה אפיגנטית זו אינם ידועים במידה רבה. הזיהום של Caenorhabditis elegans על ידי הפתוגן המיקרוספורידיאני הטבעי Nematocida parisii גורם לתולעים לייצר צאצאים עמידים מאוד למיקרוספורידיה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את המחקר של חסינות בין-דורית במודל ההדבקה הפשוט והניתן לגישה גנטית של N. parisii -C. elegans . המאמר הנוכחי מתאר שיטות להדבקת C. elegans ולייצור צאצאים בעלי סיכון. שיטות ניתנות גם לבדיקת עמידות לזיהום מיקרוספורידיה על ידי צביעה למיקרוספורידיה והדמיה של זיהום על ידי מיקרוסקופיה. בפרט, חסינות תורשתית מונעת פלישת תאים מארחים על ידי מיקרוספורידיה, וניתן להשתמש בהכלאה פלואורסצנטית באתרה (FISH) כדי לכמת אירועי פלישה. ניתן לכמת את הכמות היחסית של נבגי מיקרוספורידיה המיוצרים בצאצאים בעלי קדם חיסוני על ידי צביעת הנבגים בצבע הקושר כיטין. עד כה, שיטות אלה שפכו אור על הקינטיקה ועל הספציפיות הפתוגנית של חסינות תורשתית, כמו גם על המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיסה. טכניקות אלה, לצד הכלים הנרחבים העומדים לרשות המחקר של C. elegans , יאפשרו תגליות חשובות בתחום החסינות התורשתית.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חסינות תורשתית היא תופעה אפיגנטית לפיה חשיפה הורית לפתוגנים יכולה לאפשר ייצור של צאצאים עמידים לזיהומים. סוג זה של זיכרון חיסוני הוכח אצל חסרי חוליות רבים חסרי מערכת החיסון הנרכשת ויכולים להגן מפני מחלות ויראליות, חיידקיות ופטרייתיות1. בעוד שלחסינות תורשתית יש השלכות חשובות הן על הבנת הבריאות והן על האבולוציה, המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס הגנה זו אינם ידועים במידה רבה. זאת, בין היתר, משום שרבים מבעלי החיים שבהם תוארה חסינות תורשתית אינם אורגניזמים מבוססים למחקר. לעומת זאת, מחקרים בנמטודה השקופה Caenorhabditis elegans נהנים מארגז כלים גנטי וביוכימי נרחב 2,3, גנום מבואר מא....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר הנוכחי משתמש בזן בריסטול N2 מסוג C. elegans מסוג בר שגדל ב-21 מעלות צלזיוס.

1. הכנת מדיה

  1. הכן מדיה M9 לפי הדו"ח הקודם21,22.
  2. להכין מדיום צמיחת נמטודות (NGM) לפי הדו"ח הקודם21,22. יוצקים 12 מ"ל של NGM לכל צלחת 6 ס"מ או 30 מ"ל לכל צלחת של 10 ס"מ.
  3. הכן Escherichia coli זן OP50-1 לפי דו"ח קודם23.
  4. הכן צלחות NGM עם זרעי OP50-1 בהתאם לשלבים הבאים.
    1. Resuspend 10x מרוכז OP50-1 על ידי מערבולת.
    2. השתמשו בפיפטה מהדרת כדי....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקר הנוכחי, אוכלוסיות הורים של C. elegans (P0) נדבקו בשלב L1 עם מינון נמוך של נבגי N. parisii . תנאי זיהום אלה משמשים בדרך כלל להשגת מספר גבוה של צאצאי F1 עמידים למיקרוספורידיה באמצעות הלבנה של ההורים. אוכלוסיות הורים נגועות ובקרות לא נגועות נקבעו ב-72 hpi והוכתמו ב-DY96 כדי לדמיין את עוברי התולעים ואת נבגי המיקרוספורידיה (איור 1A). בעלי חיים נגועים הם קטנים, מכילים נבגי מיקרוספורידיה רבים, ומייצרים פחות עוברים מאשר פקדים בריאים שאינם נגועים. הערכת כוח המשיכה של התולעים ה.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את חקר המיקרוספורידיה והחסינות התורשתית במודל זיהום פשוט וניתן למתיחה גנטית של N. parisii -C. elegans .

הכנת נבגים היא פרוטוקול אינטנסיבי שבדרך כלל מניב מספיק נבגים במשך 6 חודשים של ניסויים, בהתאם לפרודוקטיביות24. חשוב לציין, יש לקבוע את ההדבקה עבור כל "הרבה" נבג חדש לפני השימוש בו לניסויים. בשל השונות בהדבקה בין תכשירי נבגים, יש להשתמש במגרש אחד באופן עקבי לכל החזרות על ניסוי. אין להפשיר ולהקפיא מחדש את האליקוטים הבודדים, שכן הפש.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לוויני ז'או וליין צ'ן וואן על מתן הערות מועילות על כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי המועצה למחקר במדעי הטבע וההנדסה של קנדה (מענק #522691522691).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2.0 מ"מ חרוזי זירקוניהBiospec Products Inc.מזרק 11079124ZX
10 מ"לפישר סיינטיפיק1482613
5 μ m filterMillipore SigmaSLSV025LS
Axio Imager 2Zeiss-מיקרוסקופ פלואורסצנטי להדמיה של תולעים מוכתמות DY96 ו-FISH על שקופיות מיקרוסקופ
Axio Zoom V.16 מיקרוסקופ זום סטריאו פלואורסצנטיחיה של בעלי חיים טרנסגניים פלואורסצנטיים כדי לדמיין את ה-IPR
Baked EdgeGARD Horizontal Flow Clean BenchBaker-
משבש חרוזים, Genie SI-D238 משבש אנלוגי משבש תאי Genie, 120 Vשקופית תא T9FB893150
ציטומטרים של ספירת זרע חד פעמית של Millennium Sciencesפישר מדעיDRM600
צהוב ישיר 96סיגמא-אולדריץ'S472409-1G
EverBrite מדיום הרכבה עם DAPIBiotium23001
מדיום הרכבה EverBrite ללא DAPIBiotium23002
תוכנת Fiji/ImageJImageJhttps://imagej.net/software/fiji/downloads רוטור
מכניThermo Sceintific415110 / 1834090806873משמש לסובב צינורות של עוברים מולבנים לבקיעת לילה
MicroB FISH בדיקהBiosearch Technologies Inc.-מסונתז עם שינוי קוואזר 570 (Cy3) 5' ומטוהר HPLC, CTCTCGGCACTCCTTCCTG
N2סוג בר, זן בריסטולברירת מחדלזן Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
נתרן דודציל סולפט (SDS)Sigma-AldrichL3771-100G
תמיסת נתרן הידרוקסיד (5 N)פישר כימיקל
(6%) )פישר כימיקלSS290-1
סטמי 508 מיקרוסקופ סטריאויומיומית של תולעים וספירת תולעי L1 להגדרות בדיקה
Tween-20Sigma-AldrichP1379-100ML
Vectashield + A16BiolynxVECTH1500
Zeiss-להדמיה תעשייתי גלובלי, תמיסת נתרן היפוכלוריט FLSS256500 Zeiss-לתחזוקה

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tetreau, G., Dhinaut, J., Gourbal, B., Moret, Y. Trans-generational immune priming in invertebrates: current knowledge and future prospects. Frontiers in Immunology. 10, 1938(2019).
  2. Au, V., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Inherited ImmunityCaenorhabditis ElegansMicrosporidia InfectionIntergenerational ImmunityNematocida ParisiiFluorescence MicroscopyDY96 StainingFluorescence In Situ HybridizationParasite BurdenWorm Fitness

Related Articles