Summary
A infecção da Caenorhabditis elegans pelo parasita microsporidiano Nematocida parisii permite que os vermes produzam descendentes altamente resistentes ao mesmo patógeno. Este é um exemplo de imunidade herdada, um fenômeno epigenético mal compreendido. O presente protocolo descreve o estudo da imunidade herdada em um modelo de verme geneticamente tratável.
Abstract
Imunidade herdada descreve como alguns animais podem passar a "memória" de uma infecção anterior para seus filhos. Isso pode aumentar a resistência ao patógeno em sua descendência e promover a sobrevivência. Embora a imunidade herdada tenha sido relatada em muitos invertebrados, os mecanismos subjacentes a este fenômeno epigenético são amplamente desconhecidos. A infecção de Caenorhabditis elegans pelo patógeno microsporidiano natural Nematocida parisii resulta nos vermes que produzem descendentes que são robustamente resistentes à microsporidia. O presente protocolo descreve o estudo da imunidade intergeracional no modelo de infecção n . parisii -C. elegans simples e geneticamente tratável. O artigo atual descreve métodos para infectar C. elegans e gerar descendentes imuno-primed. Métodos também são dados para avaliar a resistência à infecção por microsporidia, por meio da coloração de microsporidia e da visualização da infecção por microscopia. Em particular, a imunidade herdada impede a invasão de células hospedeiras por microsporidia, e a fluorescência na hibridização in situ (FISH) pode ser usada para quantificar eventos de invasão. A quantidade relativa de esporos de microsporidia produzidos na prole imuno-primed pode ser quantificada pela coloração dos esporos com um corante de ligação de quitina. Até o momento, esses métodos lançaram luz sobre a cinética e a especificidade do patógeno da imunidade herdada, bem como os mecanismos moleculares que a subjacente. Essas técnicas, ao lado das extensas ferramentas disponíveis para a pesquisa de C. elegans , permitirão importantes descobertas no campo da imunidade herdada.
Introduction
A imunidade herdada é um fenômeno epigenético pelo qual a exposição dos pais a patógenos pode permitir a produção de descendentes resistentes a infecções. Esse tipo de memória imunológica tem sido mostrado em muitos invertebrados que não possuem sistemas imunológicos adaptativos e podem proteger contra doenças virais, bacterianas e fúngicas1. Embora a imunidade herdada tenha implicações importantes para entender a saúde e a evolução, os mecanismos moleculares subjacentes a essa proteção são amplamente desconhecidos. Isso ocorre em parte porque muitos dos animais em que a imunidade herdada foi descrita não são organismos modelo estabelecidos para pesquisa. Em contraste, estudos no nematode transparente Caenorhabditis elegans se beneficiam de um extenso kit de ferramentas genéticas e bioquímicas 2,3, um genoma altamente anotado 4,5, e um curto tempo de geração. De fato, a pesquisa em C. elegans permitiu avanços fundamentais nos campos da epigenética e imunidade inata 6,7, e agora é um modelo estabelecido para estudar a memória imunológica 8,9.
Microsporidia são patógenos fúngicos que infectam quase todos os animais e causam infecções letais em humanos imunocomprometidos10. A infecção começa quando um esporo de microsporidia injeta ou "dispara" seu conteúdo celular (sporoplasma) em uma célula hospedeira usando uma estrutura chamada tubo polar. A replicação intracelular do parasita resulta na formação de meronts, que acabam se diferenciando em esporos maduros que podem sair da célula11,12. Embora esses parasitas sejam prejudiciais tanto para a saúde humana quanto para a segurança alimentar, ainda há muito a aprender sobre sua biologia de infecção12. Nematocida parisii é um parasita microsporídano natural que se replica exclusivamente nas células intestinais dos vermes, resultando em redução da fecundidade e, em última instância, morte. O modelo de infecção N. parisii -C. elegans tem sido usado para mostrar: (1) o papel da autofagia no desembaraço do patógeno13, (2) como a microsporidia pode sair das células infectadas nãoapenas 14, (3) como os patógenos podem se espalhar de célula para célula formando sincronia15, (4) as proteínas N. parisii usam para interagir com seu hospedeiro16, e (5) a regulação da resposta transcricional de patógenos intracelulares (IPR)17, 18 anos.
Os protocolos para a infecção de C. elegans são descritos no trabalho atual e podem ser usados para revelar a biologia única da microsporidia e dissecar a resposta do hospedeiro à infecção. A microscopia de vermes fixos manchados com o corante de tingitina Direct Yellow 96 (DY96) mostra a propagação da infecção de esporos de microsporidia contendo quitina em todo o intestino. A coloração DY96 também permite a visualização de embriões de vermes contendo quitina para a avaliação simultânea da gravididade do verme (capacidade de produzir embriões) como uma leitura da aptidão do hospedeiro.
Trabalhos recentes revelaram que C. elegans infectados com N. parisii produzem descendentes que são robustamente resistentes à mesma infecção19. Esta imunidade herdada dura uma única geração e é dependente de doses, pois descendentes de pais mais fortemente infectados são mais resistentes à microsporidia. Curiosamente, os filhotes de N. parisii também são mais resistentes ao patógeno intestinal bacteriano Pseudomonas aeruginosa, embora não estejam protegidos contra o vírus natural orsay19. O presente trabalho também mostra que a prole imuno-preparada limita a invasão de células hospedeiras por microsporidia. O método também descreve a coleção de descendentes imuno-primed e como o PEIXE pode ser usado para detectar N. parisii RNA em células intestinais para avaliar a invasão celular hospedeira e o disparode 20 esporos.
Juntos, esses protocolos fornecem uma base sólida para o estudo da microsporidia e imunidade herdada em C. elegans. Espera-se que o trabalho futuro neste sistema modelo permita importantes descobertas no campo nascente da imunidade herdada. Essas técnicas também são susceptíveis de ser pontos de partida para investigar a imunidade herdada induzida pela microsporídia em outros organismos hospedeiros.
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Protocol
O presente estudo utiliza o tipo selvagem C. elegans Bristol strain N2 cultivado a 21 °C.
1. Preparação de mídia
- Prepare a mídia M9 conforme relatório anterior 21,22.
- Prepare o meio de crescimento do nematoide (GNM) conforme relatório anterior21,22. Despeje 12 mL de NGM por placa de 6 cm ou 30 mL por placa de 10 cm.
- Prepare a cepa Escherichia coli OP50-1 conforme um relatório anterior23.
- Prepare placas de NGM op50-1 semeadas seguindo as etapas abaixo.
- Resuspend 10x concentrado OP50-1 por vórtice.
- Use uma pipeta repetidora para semear as placas no centro. Para placas de 6 cm e 10 cm, sementes com volume de 200 μL ou 500 μL, respectivamente.
- Para placas de 10 cm, use um espalhador de vidro para espalhar o OP50-1 e criar um gramado de bactérias. Não espalhe as bactérias até a borda da placa.
NOTA: O etanol mergulha e inflama o espalhador a cada cinco placas para garantir a esterilidade. Deixe o espalhador esfriar por alguns segundos antes de se espalhar para evitar matar bactérias. - Deixe as placas em temperatura ambiente por 2 dias para secar e para garantir o crescimento do gramado bacteriano.
NOTA: As placas semeadas podem ser armazenadas à temperatura ambiente por 2-3 semanas ou a 4 °C por até 1 mês.
2. Manutenção de C. elegans
- Mantenha vermes em uma fonte de alimento bacteriana constante em placas de NGM OP50-1.
NOTA: A fome pode resultar em fenótipos intergeracionais, o que pode afetar os resultados. Uma placa op50-1 de 10 cm suporta 2.500 L1s (o estágio larval mais antigo de C. elegans) por até 72 h. - Se os vermes morrerem de fome, cresça por três gerações no OP50-1 antes de usar os vermes para experimentos.
3. Sincronização de populações de C. elegans usando hipoclorito de sódio (branqueamento)
NOTA: Esta etapa é muito sensível ao tempo, por isso certifique-se de que a centrífuga esteja disponível antes do início. Protocolos alternativos e menos rápidos de branqueamento estão disponíveis na literatura e podem ser usados se preferirem. Para evitar que 6% de hipoclorito de sódio perca atividade ao longo do tempo, armazene o reagente no escuro a 4 °C e mantenha-o por até 1 ano.
- Prepare 2 mL de solução alvejante para cada amostra misturando 400 μL de 1 M NaOH, 250 μL de hipoclorito de sódio de 6% (ver Tabela de Materiais) e 1350 μL de água destilada.
- Lave vermes adultos (~72 h pós-escotilha) das placas em um tubo de microcentrifuuge usando 1 mL de mídia M9.
NOTA: Se muitos vermes permanecerem nas placas, pelotar os vermes por centrifugação a 1.400 x g para 30 s em temperatura ambiente, remova o supernasce usando uma ponta de pipeta de 1 mL e realize lavagens adicionais de placas. - Centrifugar a 1.400 x g por 30 s à temperatura ambiente para pelotar os vermes, em seguida, lavar 2x com 1 mL de mídia M9 para remover bactérias.
- Retire o supernatante, adicione 1 mL da solução de alvejante preparado (Passo 3.1.), e defina um temporizador para 1 min. Inverta os tubos 3-4x.
NOTA: Sob um microscópio leve, os vermes podem ser vistos para parar de bater. - Depois de 1 min, centrífuga a 3.000 x g por 30 s à temperatura ambiente para pelotar os vermes, em seguida, remover o sobrenante e adicionar 1 mL de solução de alvejante fresco.
- Monitore o tubo de perto sob um microscópio leve para visualizar as carcaças de vermes se abrindo e liberando embriões. Imediatamente avançar para o próximo passo quando ~50%-80% das carcaças se dividiram e muitos embriões foram liberados.
NOTA: Dependendo do número de animais e da cepa de vermes, este passo pode levar de 15 a 4 minutos. Por razões desconhecidas, vermes infectados por N. parisii geralmente levam mais tempo para branquear do que animais não infectados. - Centrifugar a 3.000 x g por 30 s à temperatura ambiente para pelotar os embriões, em seguida, lavar 3x em 1 mL de mídia M9.
NOTA: As lavagens diluem a solução de hipoclorito residual dos tubos e devem ser realizadas rapidamente para garantir que a solução de alvejante não danifique os embriões. - Adicione 1 mL de mídia M9 à pelota final e transfira para um tubo cônico de 15 mL contendo 4 mL de mídia M9. Suspenda os embriões em um volume final de 5 mL.
- Gire os tubos em um rotor mecânico (ver Tabela de Materiais) a 21 °C por 18-24 h para chocar os embriões em L1s.
NOTA: Como N. parisii infecta o intestino do verme e não invade a germina, os pais infectados não passam a infecção para sua prole pela transmissão vertical19. O branqueamento de adultos infectados sincroniza animais de F1 e destrói esporos N. parisii , garantindo que a prole da F1 não seja infectada por esporos transportados pelos pais. - Centrifugar os tubos por 1 min a 1.800 x g à temperatura ambiente para pelotar os L1s, e descartar todos menos 1 mL do supernante.
- Pipeta 1-5 μL de mistura L1 em uma placa NGM não semeada, e conte imediatamente o número de L1s na gotícula visualizando sob um microscópio leve. Repita 3x e média das contagens para determinar a concentração e o número total de L1s.
NOTA: A maioria dos embriões deve ser eclodida, e os L1s devem estar se movendo rapidamente na gota líquida. Se uma grande proporção de embriões não esquentes e L1s letárgicos (em movimento lento) permanecerem, isso indica branqueamento por muito tempo.
4. Preparação dos esporos N. parisii
- Prepare os esporos N. parisii seguindo referências publicadas anteriormente19,24.
5. Infecção de C. elegans com N. parisii para produzir prole imuno-primed
- Um dia antes das infecções planejadas, mova o número necessário de placas de NGM não semeadas de 10 cm de 4 °C para temperatura ambiente.
- Imediatamente antes da infecção, centrífuga ~2.500 worms L1 sincronizados a 1.400 x g por 30 s à temperatura ambiente em um tubo de microcentrifuuge para pelotar os vermes. Remova o supernaspe com uma ponta de pipeta para deixar os worms em ~50 μL de mídia M9.
- Adicione 1 mL de 10x OP50-1 aos esporos L1s e N. parisii à concentração desejada (tipicamente ~2,5 milhões de esporos). Como um controle não infectado, prepare um tubo equivalente de L1s e OP50-1 com um volume de mídia M9 equivalente ao volume de preparação de esporos utilizado.
NOTA: Para obter a prole imuno-primed, use uma dose de esporo alta o suficiente para que >90% dos animais sejam infectados por 72 h (medidos pela coloração dy96, Passo 7), mas baixo o suficiente para que >80% dos animais ainda estejam gravid. Isso garante que a maioria dos descendentes venha de pais infectados e que o branqueamento dos pais produz embriões suficientes para testes de F1. Embora as preparações de esporos variem em concentração e infectividade, uma dose parental adequada é tipicamente entre 5-15 μL de preparação de esporos (~2,5 milhões de esporos) por placa de 10 cm. - Vórtice brevemente para misturar e emplacar os mais de 1 mL de vermes em uma placa NGM não semeada de 10 cm. Gire para garantir que o líquido se espalhe por toda a placa.
- Seque as placas em um armário limpo com as tampas desligadas por 10-20 min ou até secar completamente, antes de incubar a 21 °C por 72 h.
- A 72 h pós-infecção (hpi), lave os vermes das placas em um tubo de microcentrifuuge usando 1 mL de mídia M9. Se muitos vermes permanecerem nas placas, pelota os vermes por centrifugação a 1.400 x g por 30 s, remova o supernatante e realize lavagens adicionais de placas.
- Centrifugar a 1.400 x g por 30 s à temperatura ambiente para vermes de pelota, lavar 2x com 1 mL de mídia M9 ou até que o sobrenante esteja claro. Resuspend em um volume final de 1 mL de mídia M9.
- Pipeta para cima e para baixo para misturar, em seguida, transferir 100 μL dos vermes suspensos para um tubo fresco.
NOTA: Esta amostra de ~250 adultos pode ser posteriormente corrigida e manchada para determinar o estado de aptidão e infecção dos vermes parentais, conforme descrito na Etapa 7 e no início do Passo 3. - Para quebrar os vermes adultos e liberar embriões de F1 para testes, alvejar os 900 μL restantes de vermes suspensos, como descrito no Passo 3.
NOTA: Esta etapa também destrói quaisquer esporos N. parisii antes de ensaios subsequentes de infecção.
6. Testar imunidade herdada ao N. parisii em C. elegans
- Realizar infecções conforme descrito nas Etapas 5.1.-5.6., com modificações conforme mencionado abaixo.
NOTA: Os ensaios de infecção em F1s podem ser reduzidos e realizados em placas de NGM de 6 cm usando ~1.000 vermes L1 e 400 μL de 10x OP50-1. Uma dose "alta" de esporos também deve ser usada, de tal forma que ~100% dos F1 ingênuos (ou seja, vermes de pais não infectados) estão infectados, e apenas ~10% dos F1 ingênuos são gravid. Embora as preparações de esporos variem em concentração e infectividade, uma dose adequada é tipicamente entre 5-15 μL (~2,5 milhões de esporos) por placa de 6 cm. - A 72 hpi, correção e mancha para determinar o estado de aptidão e infecção do verme, conforme descrito na Etapa 7.
7. Coloração DY96 de C. elegans para visualizar embriões e esporos de microsporidia
NOTA: DY96 é um corante verde fluorescente que mancha embriões de vermes e paredes de esporos de microsporidia 19,15,25. Isso permite o monitoramento simultâneo do estado de aptidão e infecção dos vermes.
- Lave os vermes das placas em um tubo de microcentrifuuge usando 1 mL de mídia M9 contendo 0,1% de Tween-20. Se muitos vermes permanecerem nas placas, pelotar os vermes por centrifugação a 1.400 x g por 30 s em temperatura ambiente, remova o sobrenatante usando uma ponta de pipeta e realize lavagens adicionais de placas.
- Centrifugar a 1.400 x g por 30 s à temperatura ambiente para pelotar os vermes, e lavar 2x com 1 mL de mídia M9 contendo 0,1% Tween-20 ou até que o supernatante esteja claro.
- Remova o supernatante, adicione 700 μL de acetona e deixe os vermes para fixar em temperatura ambiente por 10 minutos.
NOTA: Neste ponto, os worms podem ser armazenados a -20 °C para processamento até vários meses depois, se desejar. - Centrifugar a 10.000 x g por 30 s à temperatura ambiente para pelotar os vermes fixos, e lavar 2x com 1 mL de PBS contendo 0,1% Tween-20 (PBST).
- Prepare 50 mL de solução de trabalho DY96: PBST, 0,1% (v/v) sulfato de dodecilo de sódio (SDS) e 20 μg/mL DY96 (a partir de uma solução de estoque de 5 mg/mL em água destilada) (ver Tabela de Materiais). Enrole o tubo em papel alumínio e guarde-o em uma gaveta para evitar a exposição à luz.
NOTA: O estoque DY96 e as soluções de trabalho podem ser armazenadas por >1 ano à temperatura ambiente, se mantidas no escuro. - Centrifugar a 10.000 x g por 30 s à temperatura ambiente para pelotar os vermes e remover supernanato. Adicione 500 μL de solução de trabalho DY96 à pelota e gire por 30 minutos à temperatura ambiente.
- Centrifugar a 10.000 x g por 30 s à temperatura ambiente para pelotar os vermes. Remova o sobrenatante e adicione 15 μL do meio de montagem com/sem DAPI (ver Tabela de Materiais).
- Pipeta 10 μL da solução contendo vermes manchados em um slide de microscópio e coloque uma mancha de cobertura por cima.
NOTA: Slides e amostras adicionais podem ser armazenados a 4 °C no escuro para armazenamento a longo prazo.
8. Imagem e análise de vermes manchados de DY96 para avaliar a aptidão e o estado de infecção por vermes
- Para analisar os worms manchados de DY96 (montados em slides, como na Etapa 7.8.), execute imagens usando o canal GFP de um microscópio de fluorescência.
- Para determinar a aptidão das populações de vermes, use um objetivo de 5x ou 10x para avaliar a gravididade de >100 vermes por condição.
NOTA: Os vermes que carregam ≥1 embriões são considerados gravid. Contadores de células mecânicas podem ajudar a minimizar o erro humano na contagem. Os embriões de vermes são menos manchados (menos fluorescentes) do que os esporos de microsporidia19. Os embriões são ovoid, ~50 μm x ~30 μm, e encontrados no corpo médio de adultos saudáveis C. elegans . Adultos saudáveis e não infectados carregam de 10 a 20 embriões organizados em fileiras ao longo de seu comprimento corporal26. - Para revelar diferenças mais sutis no condicionamento físico, realize a contagem de embriões. Para isso, conte manualmente o número de embriões em 20-30 vermes individuais por condição.
- Para determinar o quão infectadas são as populações de vermes, use um objetivo de 5x-40x para avaliar o estado de infecção de >100 vermes por condição. Vermes que compõem qualquer número de esporos intestinais intracelulares são considerados infectados.
NOTA: Os esporos de microsporidia são mais brilhantes que os embriões de vermes. Os esporos em forma de feijão de N. parisii são ~2,2 μm x ~0,8 μm e são produzidos nas células intestinais do verme a partir de ~48 hpi15. Vermes em que esporos são vistos exclusivamente no lúmen intestinal e não ao longo das paredes intestinais não são considerados infectados19. Isso porque esses esporos provavelmente representam esporos recém-ingeridos que não resultam da infecção do indivíduo. - Usando o software de análise de imagem (ver Tabela de Materiais), quantifique a carga do parasita e o tamanho do verme seguindo as etapas abaixo.
- Imagem 20-30 worms montados em slides de microscópio usando um estereóscópio fluorescente vertical para cada amostra. Capture imagens nos canais Brightfield, DAPI e GFP. Escolha uma exposição adequada no canal GFP de tal forma que a fluorescência nas amostras mais infectadas não esteja saturada.
NOTA: A infecção ainda pode ser visualizada nas amostras menos infectadas. As imagens são normalmente tiradas usando um objetivo de 5x. - Abra arquivos em FIJI/ImageJ. Dependendo do tipo de arquivo, o plugin do Importador de Bioformiões pode ser necessário para abrir imagens no ImageJ.
- Delineie 20-30 worms individuais em imagens usando imagens brightfield ou DAPI e a ferramenta de seleções Polygon na barra de ferramentas. Salve cada esboço com o Analyze > Tools > Regions of Interest (ROI) Manager no menu suspenso clicando em Adicionar [t]. Delineie animais totalmente visíveis na moldura.
NOTA: Os contornos do worm podem ser revisitados mais tarde, salvando o arquivo com contornos como um Tiff. - Clique em Desmarque no gerenciador de ROI para remover todos os contornos da imagem e clique em Imagem > Duplicar no menu suspenso. Digite o número correspondente ao canal de interesse na caixa "Canais" para duplicar o canal GFP para carga de parasita (por exemplo, 2).
- Limite este canal usando > de imagem Ajuste > Limiar para um nível no qual a carga de parasita brilhante é capturada, mas a fluorescência mais fraca dos embriões de vermes não é e clique em Aplicar. Anote os valores de limiar aplicados e use-os consistentemente para todas as imagens do mesmo experimento.
NOTA: Verifique se o limiar é um valor apropriado para as amostras menos e mais infectadas antes de analisar todas as imagens. - Selecione Analisar > definir medidas e verifique a caixa para fração de área. Selecione contornos de worm único por sua vez no gerenciador de ROI e clique na função Analisar > Medida . Uma janela resultados fornecerá a medição para %Área (ou seja, % carga de parasitas).
NOTA: Se a fluorescência dos embriões for tão brilhante que cruze o limiar, a ferramenta Paintbrush em preto na barra de ferramentas pode ser usada para apagar manualmente essas regiões antes de medir %Area. - Para determinar o tamanho do worm como uma leitura da aptidão, delineie os vermes como descrito na Etapa 8.3. Selecione Analisar > definir medidas e verifique a caixa para Área. Selecione contornos de worm único por sua vez no gerenciador de ROI e clique na função Analisar > Medida . Uma janela Resultados fornecerá a medição para %Area.
- Imagem 20-30 worms montados em slides de microscópio usando um estereóscópio fluorescente vertical para cada amostra. Capture imagens nos canais Brightfield, DAPI e GFP. Escolha uma exposição adequada no canal GFP de tal forma que a fluorescência nas amostras mais infectadas não esteja saturada.
9. Ensaio de peixes para avaliar invasão de C. elegans por microsporidia e disparo de esporos
NOTA: A sonda MicroB FISH reconhece uma região conservada de rRNA microsporidiano 18s e pode ser usada para rotular esporoplasmas intracelulares (ou seja, células hospedeiras invadidas) e o material genético dentro dos esporos.
- Infecte 6.000 vermes L1 sincronizados com 4 milhões de esporos de N. parisii e 10 μL de 10x OP50-1 em um volume final de 400 μL que é feito com mídia M9.
- Coloque a mistura em uma placa de NGM não semeada de 6 cm, seque em um armário limpo por 10-20 min e coloque a 21 °C.
- Após 30 min, lave os animais das placas com 1 mL de mídia M9 contendo 0,1% de Interpol-20.
- Pellet os vermes por centrifugação a 1.400 x g por 1 min à temperatura ambiente.
- Remova o supernatante usando uma ponta de pipeta, adicione 700 μL de acetona e deixe descansar por 10 minutos à temperatura ambiente.
NOTA: Neste ponto, os worms podem ser armazenados a -20 °C para processamento posteriormente. - Realize o ensaio FISH durante a noite usando a sonda MicroB após relatórios publicados anteriormente27,19.
NOTA: Para avaliar o disparo de esporos, suplemente os 500 μL finais de tampão de lavagem com 20 μg/mL de DY96 às amostras e gire por 30 min a 21 °C antes de continuar com o protocolo normalmente. - Armazene os slides em uma caixa de slides a 4 °C. Para armazenamento a longo prazo (ou seja, vários meses), armazene amostras adicionais em tubos de microcentrifuuagem a 4 °C na escuridão.
- Para avaliar a invasão em vermes manchados de PEIXE, olhe para os vermes usando o canal vermelho de um microscópio de fluorescência. Visualize eventos de infecção em alta ampliação (objetivo de 63x) já que os animais L1 são pequenos, e os esporoplasmas estarão nos estágios iniciais da replicação. Para avaliar o disparo de esporos, utilize um objetivo de 63x e canais de fluorescência vermelha e verde.
NOTA: Esporos nos quais o sinal GFP e mCherry são considerados não disparados; esporos GFP vazios são considerados demitidos. - Para avaliar a invasão ou disparo de esporos, conte manualmente o número de esporoplasmas (mCherry focos nas células intestinais) ou a porcentagem de esporos disparados em 20-30 vermes por condição. Ajuste o foco no plano z para capturar todos os eventos de infecção e esporos, que muitas vezes são encontrados em diferentes planos.
NOTA: Os sporoplasmos são encontrados exclusivamente dentro das células intestinais. A maior concentração de esoroplasmos é tipicamente encontrada imediatamente após a faringe. Se as amostras também estiverem manchadas com DY96, procure a presença de esporoplasmos que não se colocam com o esporo.
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Representative Results
No presente estudo, as populações parentais de C. elegans (P0) foram infectadas na fase L1 com uma baixa dose de esporos N. parisii . Essas condições de infecção são tipicamente usadas para obter um alto número de progêneres f1 resistentes a microsporídia através do branqueamento dos pais. Populações parentais infectadas e controles não infectados foram fixados em 72 hpi e manchados com DY96 para visualizar os embriões de vermes e esporos de microsporidia (Figura 1A). Animais infectados são pequenos, contêm muitos esporos de microsporidia e produzem menos embriões do que controles saudáveis não infectados. A avaliação da gravididade dos vermes mostrou que ~95% dos animais não infectados produziram descendentes, em comparação com menos de 80% dos animais infectados (Figura 1B). Quantificações revelaram que ~90% da população tratada com microsporidia foram infectadas, conforme determinado pelo número de vermes contendo esporos manchados de DY96 (Figura 1C). Para obter a prole imuno-primed F1, é importante usar uma dose de microsporidia que é alta o suficiente para garantir que a maioria dos pais sejam infectados, mas baixo o suficiente para garantir que a população ainda possa produzir progênero. Uma tabela das doses de microsporidia utilizadas para a obtenção dos dados neste estudo é fornecida (Tabela 1).
Populações de pais não infectados e infectados (Figura 1) foram tratadas com hipoclorito de sódio a 72 hpi para obter progens ingênuos e imuno-primed F1. Animais de F1 foram expostos a uma alta dose de esporos N. parisii na fase L1 para testar a imunidade herdada à microsporidia. Com 72 hpi, os animais de F1 foram fixados e manchados com DY96 para avaliar a resistência à microsporidia (Figura 2A). Quantificações desses animais fixos revelaram que os vermes preparados continham significativamente mais embriões do que suas contrapartes ingênuas, indicando maior aptidão em face da infecção (Figura 2B). FIJI/ImageJ foi usado para determinar a carga de parasitas de vermes ingênuos e imuno-primed individuais (ou seja, porcentagem do corpo preenchido com esporos fluorescentes N. parisii ) (Figura 2C). As quantificações revelaram uma redução dramática da carga parasita de vermes provenientes de pais infectados (Figura 2D). Além disso, cálculos do tamanho individual do verme revelaram que os vermes preparados tinham uma vantagem significativa de crescimento sobre animais ingênuos em face da infecção de N. parisii (Figura 2E). Esses dados demonstram que pais infectados por N. parisii produzem descendentes com altos níveis de resistência à microsporidia.
Trabalhos anteriores revelaram que a imunidade herdada à microsporidia reduz a invasão de células intestinais por N. parisii19. Para visualizar diferenças na invasão celular hospedeira, animais ingênuos e imuno-preparados (obtidos de pais não infectados ou infectados, como acima) foram expostos a uma dose máxima de N. parisii na fase L1. A 30 dpi, os vermes foram fixados e co-manchados, usando uma sonda FISH para detectar N. parisii RNA e DY96 para detectar paredes de esporos N. parisii . Imagens revelaram que, enquanto animais ingênuos normalmente continham múltiplos esporos e várias células infectadas (esporos), os animais preparados tinham muito menos esporos (ou não) e normalmente não havia esporos (Figura 3).
Figura 1: A coloração do Yellow 96 (DY96) de C. elegans não infectado e n. parisii revela gravididade de vermes e status de infecção. (A-C) N2 C. elegans não foram infectados ou infectados com uma dose baixa de N. parisii na fase L1. Com 72 hpi, os vermes foram fixados, manchados com DY96, e imagens para avaliar a gravididade do verme e o estado de infecção. (A) Imagens representativas são mostradas. Dy96 permite visualização de embriões de vermes e esporos de microsporidia (chitin). Uma imagem inset de um verme infectado é mostrada no lado direito. Os embriões são rotulados como 'E'; N. parisii infecção do intestino é rotulado de 'Np'. Barra de escala para imagens esquerda e média = 500 μm. Barra de escala para a imagem correta = 100 μm. (B) Os vermes que transportam um ou mais embriões foram pontuados como gravid e grafados. (C) Os vermes que carregavam qualquer número de esporos N. parisii nas células intestinais foram pontuados como infectados e gráficos. (B-C) Dados agrupados de 5 experimentos independentes usando n = 100 worms por condição por experimento. Significa ± SEM é mostrado. Os valores p foram determinados pelo teste t do aluno de duas caudas não remunerado. A significância foi definida como: *p < 0,05; p < 0,001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Coloração amarela direta 96 (DY96) de C. elegans ingênuos e imuno-primed para determinar embriões por verme, carga de microsporidia e tamanho de verme. (A) N2 C. elegans foram infectados ou não infectados com uma dose baixa de N. parisii na fase L1. Com 72 hpi, os vermes foram tratados com hipoclorito de sódio para liberar embriões. Os descendentes ingênuos e imunes resultantes foram infectados com uma alta dose de N. parisii na fase L1. Com 72 hpi, os vermes foram fixados, manchados com DY96, e imagens para visualizar embriões de vermes e carga de parasitas. Imagens representativas são mostradas. Barra de escala = 200 μm.(B) O número de embriões por verme foi contado e grafado a partir de (A). (C) Uma captura de tela de FIJI/ImageJ mostra vermes ingênuos do painel A que foram limiarados para visualizar a carga de parasitas (mostrada em branco) usando a janela Limiar no canto inferior direito. Aqui, os worms individuais foram descritos usando a ferramenta "Seleções de Polígonos" destacada em vermelho e definida como "Região de interesses" (ROI) usando a janela ROI no canto superior direito. A função Analyze > Measure > Area foi utilizada para quantificar a carga de parasitas de dois vermes de exemplo, que se mostraram 25,02% e 13,49%. (D) A carga do parasita por verme foi determinada e grafada a partir de (A). (E) A partir das imagens acima, o tamanho individual do verme foi calculado a partir de animais descritos como no painel C utilizando a função Analisar > Medida > Área . (B, D e E) Significa ± SEM é mostrado. Os valores p foram determinados pelo teste t-t do aluno de duas caudas não remunerado. A significância foi definida como: *p < 0,05. **p < 0,01, ***p < 0,001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Fluorescência in situ hibridização (FISH) contra N. parisii 18S rRNA revela invasão de células intestinais C. elegans em animais ingênuos, mas não preparados. N2 C. elegans foram infectados ou não infectados com uma dose baixa de N. parisii na fase L1. Com 72 hpi, os vermes foram tratados com hipoclorito de sódio para liberar embriões. Os descendentes ingênuos e imuno-preparados resultantes foram infectados com uma dose máxima de N. parisii na fase L1. A 30 mpi, os vermes foram fixados, submetidos a peixes para detectar esoroplasmos, manchados com DY96 para detectar paredes de esporos de microsporidia, e imagens. Imagens representativas são mostradas. Imagens inset para o verme ingênuo mostram esporoplasmas (vermelho, asteriscos), esporos disparados (verde, pontas de flecha) e um esporo não disparado (amarelo, flecha). O verme infectado ingênuo mostrado exibe 4 esoroplasmos. Barra de escala = 20μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| N. dose de parisii | Concentração de placas (esporos/cm2) | Milhões de esporos por placa de 6 cm | Milhões de esporos por placa de 10 cm |
| Baixo | 35,400 | - | 2.7 |
| Alto | 88,400 | 2.5 | - |
| Máximo | 2,12,000 | 6 | - |
Tabela 1: N. doses de parisii empregadas no estudo.
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Discussion
O presente protocolo descreve o estudo da microsporidia e da imunidade herdada em um modelo de infecção n. parisii-C. elegans simples e geneticamente tratável.
A preparação do esporo é um protocolo intensivo que normalmente produz esporos suficientes para 6 meses de experimentos, dependendo da produtividade24. É importante ressaltar que a infectividade deve ser determinada para cada novo esporo "lote" antes de usá-lo para os experimentos. Devido à variabilidade na infectividade entre as preparações dos esporos, um único lote deve ser usado consistentemente para todas as repetições de um experimento. Alíquotas individuais não devem ser descongeladas e regeladas, pois o descongelamento pode causar o fogo dos esporos e reduzir a infectividade. Como tal, os esporos só devem ser removidos do congelador -80 °C imediatamente antes da infecção e mantidos no gelo enquanto estão no banco.
Nas etapas 5-6, foram delineados os ensaios de infecção. É importante durante ensaios de infecção para evitar contaminação ou fome dos animais, pois isso pode resultar em efeitos intergeracionais adicionais que confundem a imunidade nas F1s. Uma limitação importante do ensaio de imunidade herdado é que mais pais infectados produzem menos descendentes de F1. Portanto, é importante encontrar um equilíbrio cuidadoso entre a geração parental estar suficientemente infectada para passar a imunidade enquanto é saudável o suficiente para produzir descendentes para testes. Embora o protocolo atual descreveu ensaios de infecção para animais L1, o protocolo pode ser modificado para testar o impacto da infecção por microsporidia em pais de diferentes estágios e a persistência da imunidade em descendentes mais velhos. Os métodos também podem ser modificados para testar os efeitos de tensões múltiplas ou distintas (por exemplo, estresse osmótico, estresse metálico pesado, coinfecção com outro patógeno) na imunidade herdada. Embora a imunidade herdada ao N. parisii em C. elegans seja intergeracional (ou seja, dura uma única geração)19, o protocolo pode ser adaptado para estudar outras gerações para testar efeitos transgeracionais. Embora os protocolos fornecidos sejam específicos para a infecção por N. parisii, muitas outras espécies de microsporidia que infectam nematoides existem28. Os protocolos podem ser adaptados para estudar imunidade herdada a outras microsporidias infecciosas intestinais (por exemplo, Nematocida ausubeli) e epidérmicas e musculares (por exemplo, nematocida disploderia) microsporidia29,30. C. elegans também são infectados por muitos outros patógenos naturais e humanos (bacterianos, fúngicos e virais). Os métodos descritos aqui podem ser usados para testar imunidade herdada a outros patógenos em C. elegans e a especificidade do patógeno da resposta imune herdada a N. parisii. C. elegans é um organismo modelo bem estabelecido. No entanto, outros membros do gênero Caenorhabditis, incluindo as espécies hermafroditas C. tropicalis e C. briggsae e a espécie macho-fêmea C. kamaaina também estão infectados em diferentes graus com N. parisii31. Ao fazer pequenas modificações nos protocolos fornecidos, a imunidade herdada também pode ser testada nesses animais.
Na Etapa 8, foram dados métodos rápidos e simples para determinar diferenças na suscetibilidade da microsporidia em vermes manchados de DY96 (ou seja, % animais infectados, % animais gravid). No entanto, às vezes esses métodos não são sensíveis o suficiente para detectar pequenas mudanças na imunidade e no condicionamento físico. Isso porque um verme com um embrião e muitas células infectadas seria tratado como um verme com 10 embriões e uma célula infectada. Como tal, métodos com resolução mais fina também foram fornecidos para determinar os desfechos de infecção nesses animais (ou seja, a carga % do parasita, número de embriões, tamanho do verme). Embora ambos os métodos possam ser usados, as diferenças fenotípicas são tipicamente mais pronunciadas com este último, facilitando a detecção de diferenças significativas. Adaptações futuras a este método podem incluir o uso de aprendizado de máquina para automatizar a análise.
Na Etapa 9, foram fornecidas técnicas para avaliar a invasão de células hospedeiras por microsporidia e disparo de esporos usando FISH. Enquanto dy96 marca microsporidia com um forte sinal verde fluorescente, outros corantes, incluindo a mancha lipofílica Nilo Vermelho e o Calcofluor Branco de ligação de quitina, também podem ser usados para manchar N. parisii 30,32,33. O presente protocolo descreve a fixação usando acetona e funciona bem para detectar microsporidia com coloração DY96 e FISH. No entanto, a fixação com 4% de paraformaldeído pode ajudar a preservar a morfologia tecidual e melhorar o sinal em alguns protocolos de imagem.
Microsporidia é um patógeno subestudado, e grande parte da biologia celular da infecção permanece desconhecida. C. elegans é um organismo modelo simples, e esses protocolos podem servir como uma plataforma para entender os principais processos envolvidos na infecção e na defesa do hospedeiro contra esse parasita. Imunidade herdada é um campo emergente, e muitas perguntas permanecem excelentes1. Como os pais infectados transmitem imunidade aos descendentes (provisionamento materno ou regulação transcricional alterada na prole)? O que media a imunidade na prole (peptídeos antimicrobianos ou outras proteínas imunológicas)? Quão específicas do patógeno são respostas imunes herdadas, e quão conservada é a imunidade herdada entre as espécies? Dadas as extensas ferramentas disponíveis com C. elegans, os estudos baseados no protocolo descrito aqui estão bem preparados para responder a essas questões fundamentais de imunidade herdada.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Somos gratos a Winnie Zhao e Yin Chen Wan por fornecer comentários úteis sobre o manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (Grant #522691522691).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.0 mm zirconia beads | Biospec Products Inc. | 11079124ZX | |
| 10 mL syringe | Fisher Scientific | 1482613 | |
| 5 μm filter | Millipore Sigma | SLSV025LS | |
| Axio Imager 2 | Zeiss | - | Fluorescent microscope for imaging of DY96- and FISH- stained worms on microscope slides |
| Axio Zoom V.16 Fluorescence Stereo Zoom Microscope | Zeiss | - | For live imaging of fluorescent transgenic animals to visualize the IPR |
| Baked EdgeGARD Horizontal Flow Clean Bench | Baker | - | |
| Bead disruptor, Genie SI-D238 Analog Disruptor Genie Cell Disruptor, 120 V | Global Industrial | T9FB893150 | |
| Cell-VU slide, Millennium Sciences Disposable Sperm Count Cytometers | Fisher Scientific | DRM600 | |
| Direct Yellow 96 | Sigma-Aldrich | S472409-1G | |
| EverBrite Mounting Medium with DAPI | Biotium | 23001 | |
| EverBrite Mounting Medium without DAPI | Biotium | 23002 | |
| Fiji/ImageJ software | ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | |
| Mechanical rotor | Thermo Sceintific | 415110 / 1834090806873 | Used to spin tubes of bleached embryos for overnight hatching |
| MicroB FISH probe | Biosearch Technologies Inc. | - | Synthesized with a Quasar 570 (Cy3) 5' modification and HPLC purified, CTCTCGGCACTCCTTCCTG |
| N2 | Wild-type, Bristol strain | Default strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771-100G | |
| Sodium hydroxide solution (5 N) | Fisher Chemical | FLSS256500 | |
| Sodium hypochlorite solution (6%) | Fisher Chemical | SS290-1 | |
| Stemi 508 Stereo Microscope | Zeiss | - | For daily maintenance of worms and counting of L1 worms for assay set ups |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379-100ML | |
| Vectashield + A16 | Biolynx | VECTH1500 |
References
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