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Immunology and Infection

Microsporidia संक्रमण के एक Caenorhabditis elegans मॉडल में विरासत में मिली प्रतिरक्षा का अध्ययन

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63636
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Molecular Genetics, University of Toronto

Summary

माइक्रोस्पोरिडियन परजीवी नेमाटोसिडा पेरिसी द्वारा Caenorhabditis elegans का संक्रमण कीड़े को संतान पैदा करने में सक्षम बनाता है जो एक ही रोगज़नक़ के लिए अत्यधिक प्रतिरोधी हैं। यह विरासत में मिली प्रतिरक्षा का एक उदाहरण है, एक खराब समझी जाने वाली एपिजेनेटिक घटना। वर्तमान प्रोटोकॉल एक आनुवंशिक रूप से असभ्य कृमि मॉडल में विरासत में मिली प्रतिरक्षा के अध्ययन का वर्णन करता है।

Abstract

विरासत में मिली प्रतिरक्षा का वर्णन है कि कैसे कुछ जानवर अपनी संतानों को पिछले संक्रमण की "स्मृति" पर पारित कर सकते हैं। यह उनकी संतानों में रोगज़नक़ प्रतिरोध को बढ़ावा दे सकता है और अस्तित्व को बढ़ावा दे सकता है। जबकि विरासत में मिली प्रतिरक्षा को कई अकशेरुकी में रिपोर्ट किया गया है, इस एपिजेनेटिक घटना के अंतर्निहित तंत्र काफी हद तक अज्ञात हैं। प्राकृतिक माइक्रोस्पोरिडियन रोगज़नक़ नेमाटोसिडा पेरिसी द्वारा Caenorhabditis elegans के संक्रमण के परिणामस्वरूप कीड़े संतान पैदा करते हैं जो माइक्रोस्पोरिडिया के लिए मजबूत प्रतिरोधी होते हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल सरल और आनुवंशिक रूप से असभ्य एन parisii -C. elegans संक्रमण मॉडल में intergenerational प्रतिरक्षा के अध्ययन का वर्णन करता है। वर्तमान लेख C. elegans को संक्रमित करने और प्रतिरक्षा-प्राइमेड संतानों को उत्पन्न करने के तरीकों का वर्णन करता है। माइक्रोस्पोरिडिया के लिए धुंधला और माइक्रोस्कोपी द्वारा संक्रमण की कल्पना करके माइक्रोस्पोरिडिया संक्रमण के प्रतिरोध को मापने के लिए भी तरीके दिए गए हैं। विशेष रूप से, विरासत में मिली प्रतिरक्षा माइक्रोस्पोरिडिया द्वारा मेजबान सेल आक्रमण को रोकती है, और सीटू संकरण (FISH) में प्रतिदीप्ति का उपयोग आक्रमण की घटनाओं को मापने के लिए किया जा सकता है। प्रतिरक्षा-प्राइम्ड संतानों में उत्पादित माइक्रोस्पोरिडिया बीजाणुओं की सापेक्ष मात्रा को चिटिन-बाइंडिंग डाई के साथ बीजाणुओं को धुंधला करके परिमाणित किया जा सकता है। आज तक, इन विधियों ने विरासत में मिली प्रतिरक्षा की कैनेटीक्स और रोगज़नक़ विशिष्टता के साथ-साथ इसके अंतर्निहित आणविक तंत्र पर प्रकाश डाला है। ये तकनीकें, सी एलिगन्स अनुसंधान के लिए उपलब्ध व्यापक उपकरणों के साथ, विरासत में मिली प्रतिरक्षा के क्षेत्र में महत्वपूर्ण खोजों को सक्षम करेंगी।

Introduction

विरासत में मिली प्रतिरक्षा एक एपिजेनेटिक घटना है जिससे रोगजनकों के लिए माता-पिता के संपर्क में संक्रमण-प्रतिरोधी संतानों के उत्पादन को सक्षम किया जा सकता है। इस प्रकार की प्रतिरक्षा स्मृति को कई अकशेरुकी में दिखाया गया है जिसमें अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली की कमी होती है और वायरल, बैक्टीरियल और फंगल रोग1 से रक्षा कर सकते हैं। जबकि विरासत में मिली प्रतिरक्षा में स्वास्थ्य और विकास दोनों को समझने के लिए महत्वपूर्ण निहितार्थ हैं, इस सुरक्षा के अंतर्निहित आणविक तंत्र काफी हद तक अज्ञात हैं। यह आंशिक रूप से है क्योंकि जिन जानवरों में विरासत में मिली प्रतिरक्षा का वर्णन किया गया है, उनमें से कई अनुसंधान के लिए स्थापित मॉडल जीव नहीं हैं। इसके विपरीत, पारदर्शी सूत्रकृमि Caenorhabditis elegans में अध्ययन एक व्यापक आनुवंशिक और जैव रासायनिक टूलकिट2,3, एक अत्यधिक एनोटेट जीनोम 4,5, और एक छोटी पीढ़ी के समय से लाभ। दरअसल, C. elegans में अनुसंधान ने epigenetics और जन्मजात प्रतिरक्षा 6,7 के क्षेत्र में मौलिक प्रगति को सक्षम किया है, और यह अब प्रतिरक्षा स्मृति 8,9 का अध्ययन करने के लिए एक स्थापित मॉडल है।

माइक्रोस्पोरिडिया फंगल रोगजनक हैं जो लगभग सभी जानवरों को संक्रमित करते हैं और इम्यूनोकॉम्प्रोमाइज्ड मनुष्यों में घातक संक्रमण का कारण बनतेहैं। संक्रमण तब शुरू होता है जब एक माइक्रोस्पोरिडिया बीजाणु ध्रुवीय ट्यूब नामक संरचना का उपयोग करके एक मेजबान सेल में अपनी सेलुलर सामग्री (स्पोरोप्लाज्म) को इंजेक्ट या "आग" लगाता है। परजीवी की इंट्रासेल्युलर प्रतिकृति के परिणामस्वरूप मेरोन्ट का गठन होता है, जो अंततः परिपक्व बीजाणुओं में अंतर करता है जो सेल11,12 से बाहर निकल सकता है। जबकि ये परजीवी मानव स्वास्थ्य और खाद्य सुरक्षा दोनों के लिए हानिकारक हैं, उनके संक्रमण जीव विज्ञानके बारे में जानने के लिए अभी भी बहुत कुछ है। नेमाटोसिडा पेरिसी एक प्राकृतिक माइक्रोस्पोरिडियन परजीवी है जो विशेष रूप से कीड़े की आंतों की कोशिकाओं में दोहराता है, जिसके परिणामस्वरूप कम मल और अंततः मृत्यु होती है। एन parisii -C. elegans संक्रमण मॉडल दिखाने के लिए इस्तेमाल किया गया है: (1) रोगज़नक़ निकासी में autophagy की भूमिका13, (2) कैसे microsporidia संक्रमित कोशिकाओं गैर-lytically14, (3) कैसे रोगजनकों syncytia15 बनाने के द्वारा सेल से सेल से फैल सकते हैं, (4) प्रोटीन N. parisii अपने मेजबान16 के साथ इंटरफ़ेस करने के लिए उपयोग करते हैं, और (5) ट्रांसक्रिप्शनल इंट्रासेल्युलर रोगज़नक़ प्रतिक्रिया (IPR) 17 का विनियमन, १८ ।

C. elegans के संक्रमण के लिए प्रोटोकॉल वर्तमान काम में वर्णित हैं और अद्वितीय microsporidia जीव विज्ञान को प्रकट करने और संक्रमण के लिए मेजबान की प्रतिक्रिया को विच्छेदित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। चिटिन-बाइंडिंग डाई डायरेक्ट येलो 96 (DY96) के साथ दाग वाले निश्चित कीड़े की माइक्रोस्कोपी पूरे आंत में चिटिन युक्त माइक्रोस्पोरिडिया बीजाणुओं के संक्रमण के प्रसार को दर्शाती है। DY96 धुंधला भी मेजबान फिटनेस के एक रीडआउट के रूप में कीड़े गुरुत्वाकर्षण (भ्रूण का उत्पादन करने की क्षमता) के एक साथ मूल्यांकन के लिए चिटिन युक्त कृमि भ्रूण के विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम बनाता है।

हाल के काम से पता चला है कि एन पेरिसी से संक्रमित सी एलिगन्स संतानों का उत्पादन करते हैं जो एक ही संक्रमणके लिए मजबूत रूप से प्रतिरोधी हैं। यह विरासत में मिली प्रतिरक्षा एक पीढ़ी तक रहती है और खुराक पर निर्भर होती है, क्योंकि अधिक भारी संक्रमित माता-पिता से संतान माइक्रोस्पोरिडिया के लिए अधिक प्रतिरोधी होती है। दिलचस्प बात यह है कि एन पेरिसी-प्राइम्ड संतानें भी बैक्टीरियल आंत रोगज़नक़ स्यूडोमोनास एरुगिनोसा के लिए अधिक प्रतिरोधी हैं, हालांकि वे प्राकृतिक रोगज़नक़ ओरसे वायरस19 के खिलाफ संरक्षित नहीं हैं। वर्तमान कार्य से यह भी पता चलता है कि प्रतिरक्षा-प्राइमेड संतान माइक्रोस्पोरिडिया द्वारा मेजबान सेल आक्रमण को सीमित करती है। विधि भी प्रतिरक्षा के संग्रह का वर्णन करता है primed संतानों और कैसे FISH आंतों की कोशिकाओं में एन parisii आरएनए का पता लगाने के लिए मेजबान सेल आक्रमण और बीजाणु फायरिंग20 परख करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

साथ में, ये प्रोटोकॉल माइक्रोस्पोरिडिया और सी एलिगेंस में विरासत में मिली प्रतिरक्षा का अध्ययन करने के लिए एक ठोस आधार प्रदान करते हैं। यह आशा की जाती है कि इस मॉडल प्रणाली में भविष्य का काम विरासत में मिली प्रतिरक्षा के नवजात क्षेत्र में महत्वपूर्ण खोजों को सक्षम करेगा। इन तकनीकों को अन्य मेजबान जीवों में माइक्रोस्पोरिडिया-प्रेरित विरासत में मिली प्रतिरक्षा की जांच के लिए शुरुआती बिंदु होने की भी संभावना है।

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Protocol

वर्तमान अध्ययन जंगली-प्रकार के C. elegans ब्रिस्टल स्ट्रेन N2 का उपयोग करता है जो 21 °C पर उगाया जाता है।

1. मीडिया की तैयारी

  1. पिछली रिपोर्ट21,22 के अनुसार M9 मीडिया तैयार करें।
  2. पिछली रिपोर्ट21,22 के अनुसार नेमाटोड ग्रोथ मीडियम (एनजीएम) तैयार करें। प्रति 6 सेमी प्लेट या 30 एमएल प्रति 10 सेमी प्लेट एनजीएम के 12 मिलीलीटर डालें।
  3. एक पिछली रिपोर्ट23 के अनुसार Escherichia कोलाई तनाव OP50-1 तैयार करें।
  4. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए OP50-1-seeded NGM प्लेटें तैयार करें।
    1. भंवर द्वारा 10x केंद्रित OP50-1 Resuspend.
    2. केंद्र में प्लेटों को बीज करने के लिए एक पुनरावर्तक पिपेट का उपयोग करें। 6 सेमी और 10 सेमी प्लेटों के लिए, क्रमशः 200 μL या 500 μL की मात्रा के साथ बीज।
    3. 10 सेमी प्लेटों के लिए, OP50-1 को फैलाने और बैक्टीरिया का एक लॉन बनाने के लिए ग्लास स्प्रेडर का उपयोग करें। प्लेट के बहुत किनारे तक बैक्टीरिया न फैलाएं।
      नोट: इथेनॉल डुबकी और हर पांच प्लेटों में स्प्रेडर लौ बाँझपन सुनिश्चित करने के लिए. बैक्टीरिया को मारने से रोकने के लिए फैलने से पहले स्प्रेडर को कुछ सेकंड के लिए ठंडा करने की अनुमति दें।
    4. सूखने के लिए और बैक्टीरियल लॉन के विकास को सुनिश्चित करने के लिए 2 दिनों के लिए कमरे के तापमान पर प्लेटों को छोड़ दें।
      नोट: बीज वाली प्लेटों को कमरे के तापमान पर 2-3 सप्ताह के लिए या 1 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

2. C. elegans का रखरखाव

  1. OP50-1-seeded NGM प्लेटों पर एक निरंतर जीवाणु खाद्य स्रोत पर कीड़े बनाए रखें।
    नोट: भुखमरी के परिणामस्वरूप अंतःक्रियात्मक फेनोटाइप हो सकते हैं, जो परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं। एक 10 सेमी OP50-1-seeded प्लेट 2,500 L1s ( C. elegans का सबसे पहला लार्वा चरण) का समर्थन करता है 72 h तक के लिए।
  2. यदि कीड़े भूखे रहते हैं, तो प्रयोगों के लिए कीड़े का उपयोग करने से पहले OP50-1 पर तीन पीढ़ियों के लिए बढ़ते हैं।

3. सोडियम hypochlorite (ब्लीचिंग) का उपयोग कर सी elegans आबादी का सिंक्रनाइज़ेशन

नोट:: यह चरण बहुत समय-संवेदनशील है, इसलिए सुनिश्चित करें कि सेंट्रीफ्यूज शुरू करने से पहले उपलब्ध है। वैकल्पिक, कम तेजी से ब्लीचिंग प्रोटोकॉल साहित्य में उपलब्ध हैं और पसंदीदा होने पर इसका उपयोग किया जा सकता है। समय के साथ 6% सोडियम हाइपोक्लोराइट को गतिविधि खोने से रोकने के लिए, अभिकर्मक को 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में स्टोर करें और इसे 1 वर्ष तक रखें।

  1. 1 M NaOH के 400 μL, 6% सोडियम हाइपोक्लोराइट के 250 μL ( सामग्री की तालिका देखें), और आसुत पानी के 1350 μL को मिलाकर प्रत्येक नमूने के लिए ब्लीच समाधान के 2 मिलीलीटर तैयार करें।
  2. M9 मीडिया के 1 mL का उपयोग कर एक microcentrifuge ट्यूब में प्लेटों से वयस्क कीड़े (~ 72 ज पोस्ट-हैच) धोएं।
    नोट: यदि कई कीड़े प्लेटों पर रहते हैं, तो कमरे के तापमान पर 30 सेकंड के लिए 1,400 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कीड़े को गोली मारें, 1 एमएल पिपेट टिप का उपयोग करके supernatant को हटा दें, और अतिरिक्त प्लेट वॉश करें।
  3. कीड़े को गोली मारने के लिए कमरे के तापमान पर 30 एस के लिए 1,400 x g पर सेंट्रीफ्यूज, फिर बैक्टीरिया को हटाने के लिए M9 मीडिया के 1 मिलीलीटर के साथ 2x धोएं।
  4. supernatant निकालें, तैयार ब्लीच समाधान (चरण 3.1.) के 1 मिलीलीटर जोड़ें, और 1 मिनट के लिए एक टाइमर सेट करें। 3-4x ट्यूबों को उलटें।
    नोट: एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत, कीड़े को पिटाई को रोकने के लिए देखा जा सकता है।
  5. 1 मिनट के बाद, कीड़े को गोली मारने के लिए कमरे के तापमान पर 30 एस के लिए 3,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज, फिर supernatant को हटाने और ताजा ब्लीच समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
  6. खुले और जारी भ्रूण को विभाजित करने वाले कीड़े के शवों की कल्पना करने के लिए एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत ट्यूब (ओं) की बारीकी से निगरानी करें। तुरंत अगले चरण के लिए अग्रिम जब ~ 50% -80% शव खुले विभाजित हो गए हैं और कई भ्रूण जारी किए गए हैं।
    नोट: जानवरों की संख्या और कीड़े के तनाव के आधार पर, इस चरण में 15 सेकंड से 4 मिनट लग सकते हैं। अज्ञात कारणों से, एन पेरिसी-संक्रमित कीड़े अक्सर असंक्रमित जानवरों की तुलना में ब्लीच करने में अधिक समय लेते हैं।
  7. भ्रूण को गोली मारने के लिए कमरे के तापमान पर 30 s के लिए 3,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज, फिर M9 मीडिया के 1 मिलीलीटर में 3x धोएं।
    नोट: Washes ट्यूबों से अवशिष्ट hypochlorite समाधान पतला और जल्दी से यह सुनिश्चित करने के लिए किया जाना चाहिए कि ब्लीच समाधान भ्रूण को नुकसान नहीं पहुंचाता है।
  8. अंतिम गोली के लिए M9 मीडिया के 1 mL जोड़ें और M9 मीडिया के 4 mL युक्त एक 15 mL शंक्वाकार ट्यूब के लिए स्थानांतरण। भ्रूण को 5 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा में निलंबित करें।
  9. एक यांत्रिक रोटर पर ट्यूबों को स्पिन करें ( सामग्री की तालिका देखें) 21 डिग्री सेल्सियस पर 18-24 घंटे के लिए भ्रूण को एल 1 एस में हैच करने के लिए।
    नोट: जैसा कि एन parisii कृमि आंत को संक्रमित करता है और जर्मलाइन पर आक्रमण नहीं करता है, संक्रमित माता-पिता ऊर्ध्वाधर संचरण19 द्वारा अपनी संतानों को संक्रमण पारित नहीं करते हैं। संक्रमित वयस्कों की ब्लीचिंग F1 जानवरों को सिंक्रनाइज़ करती है और N. parisii बीजाणुओं को नष्ट कर देती है, यह सुनिश्चित करती है कि F1 संतान माता-पिता से किए गए बीजाणुओं से संक्रमित नहीं हैं।
  10. कमरे के तापमान पर 1,800 x g पर 1 मिनट के लिए ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें ताकि L1s को गोली मार सकें, और supernatant के 1 mL को छोड़ दें।
  11. एक गैर-वरीयता प्राप्त NGM प्लेट पर L1 मिश्रण के पिपेट 1-5 μL, और तुरंत एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत visualizing द्वारा बूंद में L1s की संख्या की गिनती। 3x को दोहराएं और एकाग्रता और L1s की कुल संख्या निर्धारित करने के लिए गिनती का औसत करें।
    नोट: अधिकांश भ्रूण ों को हैच किया जाना चाहिए, और L1s को तरल बूंद में तेजी से आगे बढ़ना चाहिए। यदि अनियंत्रित भ्रूण और सुस्त (धीमी गति से चलने वाले) एल 1 एस का एक बड़ा अनुपात बना रहता है, तो यह बहुत लंबे समय तक ब्लीचिंग को इंगित करता है।

4. एन parisii बीजाणुओं की तैयारी

  1. पहले प्रकाशित संदर्भ19,24 के बाद एन parisii बीजाणुओं को तैयार करें।

5. एन parisii के साथ सी elegans के संक्रमण प्रतिरक्षा-primed संतान उपज करने के लिए

  1. नियोजित संक्रमण से एक दिन पहले, कमरे के तापमान पर 4 डिग्री सेल्सियस से 10 सेमी गैर-वरीयता प्राप्त एनजीएम प्लेटों की आवश्यक संख्या को स्थानांतरित करें।
  2. संक्रमण से ठीक पहले, सेंट्रीफ्यूज ~ 2,500 सिंक्रनाइज़ एल 1 कीड़े 1,400 x g पर 30 s के लिए कमरे के तापमान पर कमरे के तापमान पर एक microcentrifuge ट्यूब में कीड़े गोली के लिए कीड़े. M9 मीडिया के ~ 50 μL में कीड़े छोड़ने के लिए एक पिपेट टिप के साथ supernatant निकालें।
  3. वांछित एकाग्रता (आमतौर पर ~ 2.5 मिलियन बीजाणुओं) के लिए L1s और N. parisii बीजाणुओं के लिए 10x OP50-1 के 1 mL जोड़ें। एक असंक्रमित नियंत्रण के रूप में, उपयोग की जाने वाली बीजाणु तैयारी की मात्रा के बराबर एम 9 मीडिया की मात्रा के साथ एल 1 एस और ओपी 50-1 की एक समतुल्य ट्यूब तैयार करें।
    नोट: प्रतिरक्षा-प्राइम्ड संतानों को प्राप्त करने के लिए, एक बीजाणु खुराक का उपयोग करें ताकि >90% जानवर 72 घंटे से संक्रमित हों (जैसा कि DY96 धुंधला, चरण 7 द्वारा मापा जाता है) लेकिन इतना कम है कि >80% जानवर अभी भी गुरुत्वाकर्षण कर रहे हैं। यह सुनिश्चित करता है कि अधिकांश संतानें संक्रमित माता-पिता से आती हैं और माता-पिता की ब्लीचिंग एफ 1 परीक्षण के लिए पर्याप्त भ्रूण पैदा करती है। यद्यपि बीजाणु की तैयारी एकाग्रता और संक्रामकता में भिन्न होती है, एक उपयुक्त माता-पिता की खुराक आमतौर पर बीजाणु तैयारी के 5-15 μL (~ 2.5 मिलियन बीजाणुओं) प्रति 10 सेमी प्लेट के बीच होती है।
  4. भंवर संक्षेप में मिश्रण और एक 10 सेमी गैर-वरीयता प्राप्त NGM प्लेट पर कीड़े के ऊपर 1 मिलीलीटर प्लेट प्लेट करने के लिए। यह सुनिश्चित करने के लिए घुमावदार करें कि तरल पूरी प्लेट पर फैलता है।
  5. 10-20 मिनट के लिए ढक्कन के साथ एक साफ कैबिनेट में प्लेटों को सुखाएं या पूरी तरह से सूखने तक, 72 घंटे के लिए 21 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करने से पहले।
  6. 72 ज पोस्ट-संक्रमण (एचपीआई) पर, एम 9 मीडिया के 1 एमएल का उपयोग करके एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में प्लेटों से कीड़े को धोएं। यदि कई कीड़े प्लेटों पर रहते हैं, तो 30 सेकंड के लिए 1,400 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कीड़े को गोली मारें, supernatant को हटा दें, और अतिरिक्त प्लेट वॉश करें।
  7. गोली कीड़े के लिए कमरे के तापमान पर 30 s के लिए 1,400 x g पर सेंट्रीफ्यूज, M9 मीडिया के 1 mL के साथ 2x धोएं या जब तक supernatant स्पष्ट नहीं है। M9 मीडिया के 1 mL की एक अंतिम मात्रा में resuspend.
  8. पिपेट को मिश्रण करने के लिए ऊपर और नीचे, फिर निलंबित कीड़े के 100 μL को एक ताजा ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    नोट: ~ 250 वयस्कों का यह नमूना बाद में माता-पिता के कीड़े की फिटनेस और संक्रमण की स्थिति निर्धारित करने के लिए तय किया जा सकता है और दाग दिया जा सकता है, जैसा कि चरण 7 और चरण 3 की शुरुआत में वर्णित है।
  9. वयस्क कीड़े को तोड़ने और परीक्षण के लिए F1 भ्रूण जारी करने के लिए, निलंबित कीड़े के शेष 900 μL को ब्लीच करें, जैसा कि चरण 3 में वर्णित है।
    नोट: यह कदम भी बाद के संक्रमण assays से पहले किसी भी एन parisii बीजाणुओं को नष्ट कर देता है।

6. परीक्षण सी elegans में एन parisii के लिए विरासत में मिली प्रतिरक्षा

  1. चरण 5.1.-5.6., में वर्णित के रूप में नीचे उल्लिखित संशोधनों के साथ संक्रमण निष्पादित करें।
    नोट: F1s पर संक्रमण assays नीचे बढ़ाया जा सकता है और ~ 1,000 L1 कीड़े और 10x OP50-1 के 400 μL का उपयोग कर 6 सेमी NGM प्लेटों पर प्रदर्शन किया जा सकता है। बीजाणुओं की एक "उच्च" खुराक का भी उपयोग किया जाना चाहिए, जैसे कि ~ 100% भोले F1s (यानी, असंक्रमित माता-पिता से कीड़े) संक्रमित हैं, और केवल ~ 10% भोले F1s गुरुत्वाकर्षण हैं। हालांकि बीजाणु की तैयारी एकाग्रता और संक्रामकता में भिन्न होती है, एक उपयुक्त खुराक आमतौर पर 5-15 μL (~ 2.5 मिलियन बीजाणुओं) प्रति 6 सेमी प्लेट के बीच होती है।
  2. 72 hpi पर, फिक्स और दाग कीड़ा फिटनेस और संक्रमण की स्थिति निर्धारित करने के लिए, जैसा कि चरण 7 में वर्णित है।

7. DY96 C. elegans के धुंधला भ्रूण और microsporidia बीजाणुओं की कल्पना करने के लिए

नोट: DY96 एक हरे रंग के फ्लोरोसेंट चिटिन-बाइंडिंग डाई है जो कृमि भ्रूण और माइक्रोस्पोरिडिया बीजाणु दीवारों को 19,15,25 दागता है। यह कीड़े की फिटनेस और संक्रमण की स्थिति की एक साथ निगरानी की अनुमति देता है।

  1. 0.1% Tween-20 युक्त M9 मीडिया के 1 mL का उपयोग कर एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में प्लेटों से कीड़े धोएं। यदि कई कीड़े प्लेटों पर रहते हैं, तो कमरे के तापमान पर 30 एस के लिए 1,400 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कीड़े को गोली मार दें, एक पिपेट टिप का उपयोग करके supernatant को हटा दें, और अतिरिक्त प्लेट वॉश करें।
  2. कीड़े को गोली मारने के लिए कमरे के तापमान पर 30 s के लिए 1,400 x g पर सेंट्रीफ्यूज, और 0.1% Tween-20 युक्त M9 मीडिया के 1 mL के साथ 2x धोएं या जब तक supernatant स्पष्ट नहीं है।
  3. supernatant निकालें, एसीटोन के 700 μL जोड़ें और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ठीक करने के लिए कीड़े छोड़ दें।
    नोट: इस बिंदु पर, कीड़े को कई महीनों बाद तक प्रसंस्करण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है, यदि वांछित हो।
  4. निश्चित कीड़े को गोली मारने के लिए कमरे के तापमान पर 30 s के लिए 10,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज, और 0.1% Tween-20 (PBST) युक्त PBS के 1 mL के साथ 2x धोएं।
  5. DY96 काम करने वाले समाधान के 50 मिलीलीटर तैयार करें: PBST, 0.1% (v / v) सोडियम डोडेसिल सल्फेट (SDS), और 20 μg / mL DY96 (आसुत पानी में 5 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक समाधान से) ( सामग्री की तालिका देखें)। पन्नी में ट्यूब लपेटें और प्रकाश के संपर्क को रोकने के लिए इसे एक दराज में स्टोर करें।
    नोट: DY96 स्टॉक और काम कर रहे समाधान कमरे के तापमान पर >1 वर्ष के लिए संग्रहीत किया जा सकता है यदि अंधेरे में रखा जाता है।
  6. कमरे के तापमान पर 30 s के लिए 10,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज कीड़े गोली और supernatant को हटाने के लिए। गोली के लिए DY96 काम समाधान के 500 μL जोड़ें और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए बारी बारी से।
  7. कमरे के तापमान पर 30 s के लिए 10,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज कीड़े गोली. supernatant निकालें और DAPI के साथ / बिना बढ़ते माध्यम के 15 μL जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  8. एक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर दाग कीड़े युक्त समाधान के पिपेट 10 μL और शीर्ष पर एक coverslip जगह.
    नोट: स्लाइड और अतिरिक्त नमूने लंबे समय तक भंडारण के लिए अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए जा सकते हैं।

8. इमेजिंग और DY96-दाग कीड़े के विश्लेषण कीड़े फिटनेस और संक्रमण की स्थिति का आकलन करने के लिए

  1. DY96-दाग वाले कीड़े (स्लाइड पर घुड़सवार, जैसा कि चरण 7.8. में है) का विश्लेषण करने के लिए, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के GFP चैनल का उपयोग करके इमेजिंग करें।
  2. कृमि आबादी की फिटनेस निर्धारित करने के लिए, प्रति स्थिति >100 कीड़े की गुरुत्वाकर्षण परख करने के लिए एक 5x या 10x उद्देश्य का उपयोग करें।
    नोट: ≥1 भ्रूण ले जाने वाले कीड़े गुरुत्वाकर्षण माना जाता है। मैकेनिकल सेल काउंटर गिनती करते समय मानव त्रुटि को कम करने में मदद कर सकते हैं। कृमि भ्रूण माइक्रोस्पोरिडिया बीजाणुओं की तुलना में कम दाग (कम फ्लोरोसेंट)होते हैं। भ्रूण अंडाकार होते हैं, ~ 50 μm x ~ 30 μm, और स्वस्थ C. elegans वयस्कों के मिडबॉडी में पाया जाता है। स्वस्थ, असंक्रमित वयस्क अपने शरीर की लंबाई26 के साथ पंक्तियों में व्यवस्थित 10-20 भ्रूण ले जाते हैं।
  3. फिटनेस में अधिक सूक्ष्म अंतर प्रकट करने के लिए, भ्रूण की गिनती करें। इसके लिए, मैन्युअल रूप से प्रति स्थिति 20-30 व्यक्तिगत कीड़े में भ्रूण की संख्या की गणना करें।
  4. यह निर्धारित करने के लिए कि कीड़े की आबादी कितनी संक्रमित है, प्रति स्थिति >100 कीड़े की संक्रमण स्थिति का आकलन करने के लिए 5x-40x उद्देश्य का उपयोग करें। इंट्रासेल्युलर आंत बीजाणुओं की किसी भी संख्या वाले कीड़े को संक्रमित माना जाता है।
    नोट: माइक्रोस्पोरिडिया बीजाणु कृमि भ्रूण की तुलना में उज्ज्वल होते हैं। एन parisii के बीन के आकार के बीजाणु ~ 2.2 μm x ~ 0.8 μm हैं और ~ 48 hpi15 से कीड़े की आंतों की कोशिकाओं में उत्पादित होते हैं। कीड़े जिनमें बीजाणुओं को विशेष रूप से आंत लुमेन में देखा जाता है और आंतों की दीवारों के साथ नहीं, संक्रमित नहीं माना जाताहै 19। ऐसा इसलिए है क्योंकि ये बीजाणु संभवतः नए अंतर्ग्रहण बीजाणुओं का प्रतिनिधित्व करते हैं जो व्यक्ति के संक्रमण के परिणामस्वरूप नहीं होते हैं।
  5. छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करना ( सामग्री की तालिका देखें), नीचे दिए गए चरणों के बाद परजीवी बोझ और कीड़े के आकार को निर्धारित करें।
    1. छवि 20-30 कीड़े प्रत्येक नमूने के लिए एक फ्लोरोसेंट ईमानदार स्टीरियोस्कोप का उपयोग कर माइक्रोस्कोप स्लाइड पर घुड़सवार। Brightfield, DAPI, और GFP चैनलों में छवियों को कैप्चर करें. जीएफपी चैनल में एक उपयुक्त जोखिम चुनें जैसे कि सबसे संक्रमित नमूनों में प्रतिदीप्ति संतृप्त नहीं है।
      नोट: संक्रमण अभी भी कम से कम संक्रमित नमूनों में विज़ुअलाइज़ किया जा सकता है। छवियों को आमतौर पर 5x उद्देश्य का उपयोग करके लिया जाता है।
    2. FIJI/ImageJ में फ़ाइलें खोलें. फ़ाइल प्रकार के आधार पर, Bio-Formats आयातक प्लगइन ImageJ में छवियों को खोलने के लिए आवश्यक हो सकता है।
    3. Brightfield या DAPI छवियों और उपकरण पट्टी में बहुभुज चयन उपकरण का उपयोग कर छवियों में 20-30 व्यक्तिगत कीड़े रूपरेखा. जोड़ें [t] पर क्लिक करके ड्रॉपडाउन मेनू में > उपकरण > रुचि के क्षेत्रों (ROI) प्रबंधक का विश्लेषण करें के साथ प्रत्येक रूपरेखा सहेजें। उन जानवरों को रेखांकित करें जो फ्रेम में पूरी तरह से दिखाई देते हैं।
      नोट:: वर्म बाह्यरेखाओं को बाद में एक टिफ़ के रूप में बाह्यरेखा के साथ फ़ाइल सहेजकर पुन: देखा जा सकता है।
    4. छवि से सभी रूपरेखाओं को हटाने के लिए ROI प्रबंधक में अचयनित करें पर क्लिक करें और ड्रॉपडाउन मेनू में छवि > डुप्लिकेट पर क्लिक करें। परजीवी बोझ के लिए GFP चैनल को डुप्लिकेट करने के लिए "चैनल" बॉक्स में रुचि के चैनल के अनुरूप संख्या लिखें (उदाहरण के लिए, 2).
    5. दहलीज इस चैनल का उपयोग कर छवि > एक स्तर पर जिस पर उज्ज्वल परजीवी बोझ पर कब्जा कर लिया है, लेकिन कीड़े भ्रूण से dimmer प्रतिदीप्ति पर कब्जा कर लिया है करने के लिए > थ्रेशोल्ड समायोजित करें, और फिर लागू करें पर क्लिक करें. लागू थ्रेशोल्ड मानों पर ध्यान दें और एक ही प्रयोग की सभी छवियों के लिए उन्हें लगातार उपयोग करें।
      नोट:: थ्रेशोल्ड की जाँच करें सभी छवियों का विश्लेषण करने से पहले कम से कम और सबसे संक्रमित दोनों नमूनों के लिए एक उपयुक्त मान है।
    6. का चयन करें विश्लेषण > माप सेट करें और क्षेत्र भिन्न के लिए बॉक्स चेक करें। ROI प्रबंधक से बारी-बारी से एकल वर्म रूपरेखा का चयन करें और > माप फ़ंक्शन का विश्लेषण करें पर क्लिक करें। एक परिणाम विंडो % क्षेत्र (यानी, % परजीवी बोझ) के लिए माप प्रदान करेगी।
      नोट:: यदि भ्रूण से प्रतिदीप्ति इतनी उज्ज्वल है कि यह थ्रेशोल्ड को पार करता है, तो उपकरण पट्टी में काले रंग में पेंटब्रश उपकरण का उपयोग % क्षेत्र को मापने से पहले इन क्षेत्रों को मैन्युअल रूप से मिटाने के लिए किया जा सकता है।
    7. फिटनेस के रीडआउट के रूप में वर्म आकार निर्धारित करने के लिए, चरण 8.3 में वर्णित के रूप में वर्म्स को रेखांकित करें। विश्लेषण का चयन करें > माप सेट करें और क्षेत्र के लिए बॉक्स चेक करें। ROI प्रबंधक से बारी-बारी से एकल कृमि रूपरेखा का चयन करें और विश्लेषण > माप फ़ंक्शन पर क्लिक करें। परिणाम विंडो % क्षेत्र के लिए माप प्रदान करेगी.

9. मछली परख माइक्रोस्पोरिडिया और बीजाणु फायरिंग द्वारा सी elegans के आक्रमण का आकलन करने के लिए

नोट: माइक्रोबी मछली जांच माइक्रोस्पोरिडियन 18s आरआरएनए के एक संरक्षित क्षेत्र को पहचानती है और इसका उपयोग इंट्रासेल्युलर स्पोरोप्लाज्म (यानी, आक्रमण किए गए मेजबान कोशिकाओं) और बीजाणुओं के भीतर आनुवंशिक सामग्री को लेबल करने के लिए किया जा सकता है।

  1. 6,000 ब्लीच सिंक्रनाइज़ L1 कीड़े N. parisii के 4 मिलियन बीजाणुओं और 10x OP50-1 के 10 μL के साथ 400 μL की अंतिम मात्रा में संक्रमित करें जो M9 मीडिया के साथ बना है।
  2. मिश्रण को 6 सेमी गैर-वरीयता प्राप्त एनजीएम प्लेट पर प्लेट करें, 10-20 मिनट के लिए एक साफ कैबिनेट में सूखें, और 21 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  3. 30 मिनट के बाद, 0.1% Tween-20 युक्त M9 मीडिया के 1 mL के साथ प्लेटों से जानवरों को धोएं।
  4. कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 1,400 x g पर centrifuging द्वारा कीड़े गोली.
  5. एक पिपेट टिप का उपयोग करके supernatant को निकालें, एसीटोन के 700 μL जोड़ें, और इसे कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए बैठने की अनुमति दें।
    नोट: इस बिंदु पर, कीड़े को बाद के समय में प्रसंस्करण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  6. पहले प्रकाशित रिपोर्ट27,19 के बाद MicroB जांच का उपयोग कर रातोंरात मछली परख प्रदर्शन.
    नोट: बीजाणु फायरिंग का आकलन करने के लिए, नमूनों के लिए DY96 के 20 μg / mL के साथ धोने के बफर के अंतिम 500 μL को पूरक करें और प्रोटोकॉल के साथ सामान्य रूप से जारी रखने से पहले 21 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए घुमाएं।
  7. स्लाइड्स को स्लाइड बॉक्स में 4 °C पर संग्रहीत करें. लंबी अवधि के भंडारण (यानी, कई महीनों) के लिए, अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूबों में अतिरिक्त नमूने स्टोर करें।
  8. मछली-दाग वाले कीड़े में आक्रमण का आकलन करने के लिए, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के लाल चैनल का उपयोग करके कीड़े को देखें। उच्च आवर्धन (63x उद्देश्य) पर संक्रमण की घटनाओं की कल्पना करें क्योंकि L1 जानवर छोटे होते हैं, और स्पोरोप्लाज्म प्रतिकृति के शुरुआती चरणों में होंगे। बीजाणु फायरिंग का आकलन करने के लिए, एक 63x उद्देश्य और लाल और हरे रंग के दोनों प्रतिदीप्ति चैनलों का उपयोग करें।
    नोट: बीजाणु जिसमें GFP और mCherry सिग्नल colocalize unfired माना जाता है; खाली जीएफपी बीजाणु मामलों को निकाल दिया माना जाता है।
  9. आक्रमण या बीजाणु फायरिंग परख करने के लिए, मैन्युअल रूप से स्पोरोप्लाज्म (आंतों की कोशिकाओं में mCherry foci) की संख्या या प्रति स्थिति 20-30 कीड़े में निकाल दिए गए बीजाणुओं के प्रतिशत की गणना करें। सभी संक्रमण की घटनाओं और बीजाणुओं को पकड़ने के लिए जेड-प्लेन में फोकस को समायोजित करें, जो अक्सर विभिन्न विमानों में पाए जाते हैं।
    नोट: स्पोरोप्लाज्म विशेष रूप से आंतों की कोशिकाओं के भीतर पाए जाते हैं। स्पोरोप्लाज्म की उच्चतम सांद्रता आमतौर पर ग्रसनी के तुरंत बाद पाई जाती है। यदि नमूनों को DY96 के साथ भी दाग दिया जाता है, तो स्पोरोप्लाज्म की उपस्थिति की तलाश करें जो बीजाणु के साथ सह-स्थानीयकरण नहीं करते हैं।

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Representative Results

वर्तमान अध्ययन में, C. elegans (P0) की माता-पिता की आबादी L1 चरण में N. parisii बीजाणुओं की कम खुराक के साथ संक्रमित थी। इन संक्रमण की स्थिति का उपयोग आमतौर पर माता-पिता के विरंजन के माध्यम से माइक्रोस्पोरिडिया-प्रतिरोधी एफ 1 संतानों की उच्च संख्या प्राप्त करने के लिए किया जाता है। संक्रमित माता-पिता की आबादी और असंक्रमित नियंत्रण ों को 72 hpi पर तय किया गया था और कीड़े भ्रूण और माइक्रोस्पोरिडिया बीजाणुओं (चित्रा 1 ए) की कल्पना करने के लिए DY96 के साथ दाग दिया गया था। संक्रमित जानवर छोटे होते हैं, जिनमें कई माइक्रोस्पोरिडिया बीजाणु होते हैं, और स्वस्थ असंक्रमित नियंत्रणों की तुलना में कम भ्रूण का उत्पादन करते हैं। कृमि गुरुत्वाकर्षण के आकलन से पता चला है कि संक्रमित जानवरों के ~ 95% ने संक्रमित जानवरों के 80% से कम की तुलना में संतानों का उत्पादन किया (चित्रा 1 बी)। परिमाणीकरण से पता चला है कि माइक्रोस्पोरिडिया-उपचारित आबादी का ~ 90% संक्रमित था, जैसा कि DY96-दाग वाले बीजाणुओं वाले कीड़े की संख्या द्वारा निर्धारित किया गया था (चित्रा 1 सी)। प्रतिरक्षा-प्राइमेड एफ 1 संतानों को प्राप्त करने के लिए, माइक्रोस्पोरिडिया की एक खुराक का उपयोग करना महत्वपूर्ण है जो यह सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त है कि अधिकांश माता-पिता संक्रमित हैं लेकिन यह सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त कम है कि आबादी अभी भी संतान का उत्पादन कर सकती है। इस अध्ययन में डेटा प्राप्त करने के लिए उपयोग की जाने वाली माइक्रोस्पोरिडिया खुराक की एक तालिका प्रदान की गई है (तालिका 1)।

असंक्रमित और संक्रमित माता-पिता की आबादी (चित्रा 1) को 72 एचपीआई पर सोडियम हाइपोक्लोराइट के साथ इलाज किया गया था ताकि भोले और प्रतिरक्षा-प्राइमेड एफ 1 संतानों को प्राप्त किया जा सके। एफ 1 जानवरों को माइक्रोस्पोरिडिया के लिए विरासत में मिली प्रतिरक्षा के लिए परीक्षण करने के लिए एल 1 चरण में एन पेरिसी बीजाणुओं की एक उच्च खुराक के संपर्क में लाया गया था। 72 hpi पर, F1 जानवरों को तय किया गया था और Microsporidia प्रतिरोध (चित्रा 2A) का आकलन करने के लिए DY96 के साथ दाग दिया गया था। इन निश्चित जानवरों के परिमाणीकरण से पता चला कि प्राइमेड कीड़े में उनके भोले समकक्षों की तुलना में काफी अधिक भ्रूण होते हैं, जो संक्रमण के चेहरे में अधिक फिटनेस का संकेत देते हैं (चित्रा 2 बी)। फिजी / इमेजजे का उपयोग व्यक्तिगत भोले और प्रतिरक्षा-प्राइमेड कीड़े के परजीवी बोझ को निर्धारित करने के लिए किया गया था (यानी, फ्लोरोसेंट एन पेरिसी बीजाणुओं से भरे शरीर का प्रतिशत) (चित्रा 2 सी)। परिमाणीकरण से संक्रमित माता-पिता (चित्रा 2 डी) से आने वाले कीड़े के परजीवी बोझ में नाटकीय कमी का पता चला। इसके अलावा, व्यक्तिगत कीड़े के आकार की गणना से पता चला है कि प्राइमेड कीड़े एन पेरिसी संक्रमण (चित्रा 2 ई) के चेहरे में भोले जानवरों पर एक महत्वपूर्ण विकास लाभ था। इन आंकड़ों से पता चलता है कि एन पेरिसी-संक्रमित माता-पिता माइक्रोस्पोरिडिया प्रतिरोध के उच्च स्तर के साथ संतान पैदा करते हैं।

पिछले काम से पता चला है कि माइक्रोस्पोरिडिया के लिए विरासत में मिली प्रतिरक्षा एन पेरिसी19 द्वारा आंतों की कोशिकाओं के आक्रमण को कम करती है। मेजबान सेल आक्रमण में अंतर की कल्पना करने के लिए, भोले और प्रतिरक्षा-प्राइमेड जानवरों (असंक्रमित या संक्रमित माता-पिता से प्राप्त, जैसा कि ऊपर दिया गया है) को एल 1 चरण में एन पेरिसी की अधिकतम खुराक के संपर्क में लाया गया था। 30 डीपीआई पर, कीड़े तय किए गए थे और सह-दाग दिए गए थे, एन पेरिसी आरएनए और डीवाई 96 का पता लगाने के लिए एक मछली जांच का उपयोग करके एन पेरिसी बीजाणु दीवारों का पता लगाने के लिए। इमेजिंग से पता चला कि, जबकि भोले जानवरों में आमतौर पर कई बीजाणु और कई संक्रमित कोशिकाएं (स्पोरोप्लाज्म) होती हैं, प्राइमेड जानवरों में बहुत कम (या नहीं) बीजाणु होते हैं और आमतौर पर कोई स्पोरोप्लाज्म नहीं होता है (चित्रा 3)।

Figure 1
चित्रा 1: प्रत्यक्ष पीला 96 (DY96) असंक्रमित और एन parisii संक्रमित सी elegans के दाग कीड़े गुरुत्वाकर्षण और संक्रमण की स्थिति से पता चलता है. (A-C) N2 C. elegans L1 चरण में N. parisii की कम खुराक से संक्रमित या संक्रमित नहीं थे। 72 hpi पर, कीड़े तय किए गए थे, DY96 के साथ दाग दिया, और कृमि गुरुत्वाकर्षण और संक्रमण की स्थिति का आकलन करने के लिए imaged। (ए) प्रतिनिधि छवियों को दिखाया गया है। DY96 कृमि भ्रूण और microsporidia बीजाणुओं (chitin) के विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम बनाता है। एक संक्रमित कीड़े की एक इनसेट छवि दाईं ओर दिखाया गया है। भ्रूण को 'ई' लेबल किया जाता है; आंत के एन पेरिसी संक्रमण को 'एनपी' लेबल किया गया है। बाएं और मध्य छवियों के लिए स्केल बार = 500 μm। सही छवि के लिए स्केल बार = 100 μm.(B) एक या अधिक भ्रूण ले जाने वाले कृमि को गुरुत्वाकर्षण और ग्राफ़ के रूप में स्कोर किया गया था। (सी) आंतों की कोशिकाओं में एन पेरिसी बीजाणुओं की किसी भी संख्या को ले जाने वाले कृमि को संक्रमित और ग्राफके रूप में स्कोर किया गया था। (B-C) प्रति प्रयोग एन = 100 कीड़े प्रति स्थिति का उपयोग करके 5 स्वतंत्र प्रयोगों से एकत्रित डेटा। SEM ± माध्य दिखाया गया है। पी मूल्यों unpaired दो पूंछ छात्र के टी परीक्षण द्वारा निर्धारित किए गए थे. महत्व के रूप में परिभाषित किया गया था: * पी < 0.05; पी < 0.001. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: प्रत्यक्ष पीला 96 (DY96) भोले और प्रतिरक्षा-primed सी elegans के दाग प्रति कीड़े, microsporidia बोझ, और कीड़े के आकार के प्रति भ्रूण निर्धारित करने के लिए. (ए) एन 2 सी एलिगन्स संक्रमित थे या एल 1 चरण में एन पेरिसी की कम खुराक से संक्रमित नहीं थे। 72 एचपीआई पर, भ्रूण को छोड़ने के लिए कीड़े का सोडियम हाइपोक्लोराइट के साथ इलाज किया गया था। परिणामस्वरूप भोली और प्रतिरक्षा-प्राइमेड संतानों को एल 1 चरण में एन पेरिसी की उच्च खुराक से संक्रमित किया गया था। 72 hpi पर, कीड़े तय किए गए थे, DY96 के साथ दाग दिया, और कीड़े भ्रूण और परजीवी बोझ की कल्पना करने के लिए imaged। प्रतिनिधि छवियाँ दिखाई जाती हैं. स्केल बार = 200 μm.(B) प्रति कृमि भ्रूण की संख्या की गणना की गई थी और (A) से ग्राफ़ किया गया था। (सी) फिजी / इमेजजे से एक स्क्रीनशॉट पैनल ए से भोले कीड़े दिखाता है जिसे नीचे दाईं ओर थ्रेशोल्डिंग विंडो का उपयोग करके परजीवी बोझ (सफेद में दिखाया गया है) की कल्पना करने के लिए थ्रेशोल्ड किया गया है। यहां, व्यक्तिगत कीड़े को "बहुभुज चयन" उपकरण का उपयोग करके रेखांकित किया गया था, जिसे लाल रंग में हाइलाइट किया गया था और शीर्ष दाईं ओर आरओआई विंडो का उपयोग करके "रुचियों का क्षेत्र" (आरओआई) के रूप में परिभाषित किया गया था। क्षेत्र फ़ंक्शन > विश्लेषण > माप का उपयोग दो उदाहरण कीड़ों के परजीवी बोझ को मापने के लिए किया गया था, जिसे 25.02% और 13.49% दिखाया गया था। (d) प्रति कृमि परजीवी बोझ निर्धारित किया गया था और (ए) से ग्राफ किया गया था। (ई) उपर्युक्त छवियों से, व्यक्तिगत कृमि के आकार की गणना पैनल सी में उल्लिखित जानवरों से की गई थी, जिसमें क्षेत्र फ़ंक्शन का विश्लेषण > माप > उपयोग किया गया था। (B, D और E) SEM ± माध्य दिखाया गया है। पी मूल्यों को अनपेयर्ड दो-पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट द्वारा निर्धारित किया गया था। महत्व के रूप में परिभाषित किया गया था: * पी < 0.05. ** पी < 0.01, *** पी < 0.001. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एन parisii 18S rRNA के खिलाफ सीटू संकरण (FISH) में प्रतिदीप्ति सी elegans आंतों की कोशिकाओं के परजीवी आक्रमण का पता चलता है भोले लेकिन primed जानवरों में नहीं. N2 C. elegans संक्रमित थे या L1 चरण में N. parisii की कम खुराक से संक्रमित नहीं थे। 72 एचपीआई पर, भ्रूण को छोड़ने के लिए कीड़े का सोडियम हाइपोक्लोराइट के साथ इलाज किया गया था। परिणामस्वरूप भोले और प्रतिरक्षा-प्राइमेड संतानों को एल 1 चरण में एन पेरिसी की अधिकतम खुराक से संक्रमित किया गया था। 30 एमपीआई पर, कीड़े तय किए गए थे, स्पोरोप्लाज्म का पता लगाने के लिए मछली के अधीन थे, माइक्रोस्पोरिडिया बीजाणु दीवारों का पता लगाने के लिए DY96 के साथ दाग दिया गया था, और चित्रित किया गया था। प्रतिनिधि छवियाँ दिखाई जाती हैं. भोले कीड़े के लिए इनसेट छवियां स्पोरोप्लाज्म (लाल, तारांकन) दिखाती हैं, बीजाणुओं (हरे, एरोहेड्स) को निकाल दिया जाता है, और एक अनियंत्रित बीजाणु (पीला, तीर)। दिखाया गया भोली संक्रमित कीड़ा 4 स्पोरोप्लाज्म प्रदर्शित करता है। स्केल बार = 20μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

एन parisii खुराक प्लेट एकाग्रता (बीजाणु / सेमी2) प्रति 6 सेमी प्लेट बीजाणुओं के लाखों प्रति 10 सेमी प्लेट बीजाणुओं के लाखों
नीचा 35,400 - 2.7
उच्च 88,400 2.5 -
अधिकतम 2,12,000 6 -

तालिका 1: एन parisii अध्ययन में नियोजित खुराक.

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Discussion

वर्तमान प्रोटोकॉल माइक्रोस्पोरिडिया के अध्ययन का वर्णन करता है और एक सरल और आनुवंशिक रूप से असभ्य एन parisii -C. elegans संक्रमण मॉडल में विरासत में मिली प्रतिरक्षा।

बीजाणु तैयारी एक गहन प्रोटोकॉल है जो आमतौर पर उत्पादकता24 के आधार पर 6 महीने के प्रयोगों के लिए पर्याप्त बीजाणु उत्पन्न करता है। महत्वपूर्ण रूप से, प्रयोगों के लिए इसका उपयोग करने से पहले प्रत्येक नए बीजाणु "बहुत" के लिए संक्रामकता निर्धारित की जानी चाहिए। बीजाणु तैयारी के बीच संक्रामकता में परिवर्तनशीलता के कारण, एक प्रयोग के सभी दोहराव के लिए एक एकल लॉट का लगातार उपयोग किया जाना चाहिए। व्यक्तिगत एलीकोट को पिघलाया और फिर से जमे हुए नहीं किया जाना चाहिए, क्योंकि पिघलने से बीजाणुओं को आग लग सकती है और संक्रामकता कम हो सकती है। इस प्रकार, बीजाणुओं को केवल संक्रमण से ठीक पहले -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से हटा दिया जाना चाहिए और बेंच पर रहते हुए बर्फ पर बनाए रखा जाना चाहिए।

चरण 5-6 में, संक्रमण assays रेखांकित किए गए थे। जानवरों के संदूषण या भुखमरी से बचने के लिए संक्रमण assays के दौरान यह महत्वपूर्ण है, क्योंकि इसके परिणामस्वरूप अतिरिक्त अंतःक्रियात्मक प्रभाव हो सकते हैं जो F1s में प्रतिरक्षा को भ्रमित करते हैं। विरासत में मिली प्रतिरक्षा परख की एक महत्वपूर्ण सीमा यह है कि अधिक संक्रमित माता-पिता कम एफ 1 संतानों का उत्पादन करते हैं। इसलिए, माता-पिता की पीढ़ी के बीच सावधानीपूर्वक संतुलन बनाना महत्वपूर्ण है जो प्रतिरक्षा पर पारित करने के लिए पर्याप्त रूप से संक्रमित है, जबकि परीक्षण के लिए संतान पैदा करने के लिए पर्याप्त स्वस्थ है। हालांकि वर्तमान प्रोटोकॉल ने एल 1 जानवरों के लिए संक्रमण का वर्णन किया है, प्रोटोकॉल को अलग-अलग मंचित माता-पिता पर माइक्रोस्पोरिडिया संक्रमण के प्रभाव और पुरानी संतानों में प्रतिरक्षा की दृढ़ता का परीक्षण करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। विरासत में मिली प्रतिरक्षा पर कई या अलग-अलग तनावों (जैसे, आसमाटिक तनाव, भारी धातु तनाव, किसी अन्य रोगज़नक़ के साथ सह-संक्रमण) के प्रभावों का परीक्षण करने के लिए विधियों को भी संशोधित किया जा सकता है। जबकि C. elegans में N. parisii के लिए विरासत में मिली प्रतिरक्षा intergenerational है (यानी, एक पीढ़ी तक रहता है)19, प्रोटोकॉल को transgenerational प्रभावों का परीक्षण करने के लिए आगे की पीढ़ियों का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। जबकि प्रदान किए गए प्रोटोकॉल एन पेरिसी संक्रमण के लिए विशिष्ट हैं, माइक्रोस्पोरिडिया की कई अन्य नेमाटोड-संक्रमित प्रजातियां मौजूदहैं। प्रोटोकॉल को अन्य आंत-संक्रमित (जैसे, नेमाटोसिडा ऑसुबेली) और एपिडर्मल- और मांसपेशियों को संक्रमित करने (जैसे, नेमाटोसिडा डिसप्लोडोर) माइक्रोस्पोरिडा 29,30 के लिए विरासत में मिली प्रतिरक्षा का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। C. elegans कई अन्य प्राकृतिक और मानव रोगजनकों (जीवाणु, कवक, और वायरल) से भी संक्रमित होते हैं। यहां वर्णित विधियों का उपयोग सी एलिगन्स में अन्य रोगजनकों के लिए विरासत में मिली प्रतिरक्षा का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है और एन पेरिसी के लिए विरासत में मिली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की रोगज़नक़-विशिष्टता। C. elegans एक अच्छी तरह से स्थापित मॉडल जीव है। हालांकि, केनोरहाबडिटिस जीनस के अन्य सदस्य, जिनमें हर्माफ्रोडिटिक प्रजातियां सी. ट्रॉपिकलिस और सी. ब्रिग्सा और नर-मादा प्रजातियां सी. कामैना भी शामिल हैं, एन. पेरिसी31 के साथ अलग-अलग डिग्री तक संक्रमित हैं। प्रदान किए गए प्रोटोकॉल में छोटे संशोधन करके, विरासत में मिली प्रतिरक्षा का भी इन जानवरों में परीक्षण किया जा सकता है।

चरण 8 में, DY96-दाग वाले कीड़े (यानी, % संक्रमित जानवरों, % जानवरों के गुरुत्वाकर्षण) में माइक्रोस्पोरिडिया संवेदनशीलता में अंतर का निर्धारण करने के लिए त्वरित और सरल तरीके दिए गए थे। हालांकि, कभी-कभी ये तरीके प्रतिरक्षा और फिटनेस में छोटे बदलावों का पता लगाने के लिए पर्याप्त संवेदनशील नहीं होते हैं। ऐसा इसलिए है क्योंकि एक भ्रूण और कई संक्रमित कोशिकाओं के साथ एक कीड़े को 10 भ्रूण और एक संक्रमित कोशिका के साथ एक कीड़े के समान माना जाएगा। इस प्रकार, इन जानवरों में संक्रमण के परिणामों को निर्धारित करने के लिए महीन संकल्प के साथ तरीके भी प्रदान किए गए हैं (यानी, % परजीवी बोझ, भ्रूण की संख्या, कृमि का आकार)। जबकि दोनों तरीकों का उपयोग किया जा सकता है, फेनोटाइपिक अंतर आमतौर पर उत्तरार्द्ध के साथ अधिक स्पष्ट होते हैं, जिससे महत्वपूर्ण अंतरों का पता लगाना आसान हो जाता है। इस विधि के लिए भविष्य के अनुकूलन में विश्लेषण को स्वचालित करने के लिए मशीन लर्निंग का उपयोग करना शामिल हो सकता है।

चरण 9 में, माइक्रोस्पोरिडिया द्वारा मेजबान सेल आक्रमण और मछली का उपयोग करके बीजाणु फायरिंग के लिए तकनीकें प्रदान की गई थीं। जबकि DY96 एक मजबूत फ्लोरोसेंट ग्रीन सिग्नल के साथ माइक्रोस्पोरिडिया को चिह्नित करता है, लिपोफिलिक दाग नील लाल और चिटिन-बाइंडिंग कैलकोफ्लोर व्हाइट सहित अन्य रंजक का उपयोग एन. पेरिसी30,32,33 को दागने के लिए भी किया जा सकता है। वर्तमान प्रोटोकॉल एसीटोन का उपयोग करके निर्धारण का वर्णन करता है और DY96 और FISH धुंधला के साथ माइक्रोस्पोरिडिया का पता लगाने के लिए अच्छी तरह से काम करता है। हालांकि, 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड के साथ निर्धारण ऊतक आकृति विज्ञान को संरक्षित करने और कुछ इमेजिंग प्रोटोकॉल में सिग्नल में सुधार करने में मदद कर सकता है।

माइक्रोस्पोरिडिया एक कम अध्ययन किया गया रोगज़नक़ है, और संक्रमण के अधिकांश सेल जीव विज्ञान अज्ञात रहते हैं। C. elegans एक सरल मॉडल जीव है, और ये प्रोटोकॉल संक्रमण में शामिल प्रमुख प्रक्रियाओं को समझने और इस परजीवी के खिलाफ रक्षा की मेजबानी करने के लिए एक मंच के रूप में काम कर सकते हैं। विरासत में मिली प्रतिरक्षा एक उभरता हुआ क्षेत्र है, और कई प्रश्न बकाया रहतेहैं 1। संक्रमित माता-पिता संतानों को प्रतिरक्षा कैसे प्रसारित करते हैं (संतानों में मातृ प्रावधान या परिवर्तित ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन)? संतानों (रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स या अन्य प्रतिरक्षा प्रोटीन) में प्रतिरक्षा की मध्यस्थता क्या है? रोगज़नक़-विशिष्ट कैसे विरासत में मिली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं हैं, और प्रजातियों के बीच विरासत में मिली प्रतिरक्षा को कैसे संरक्षित किया जाता है? C. elegans के साथ उपलब्ध व्यापक उपकरणों को देखते हुए, यहां वर्णित प्रोटोकॉल पर निर्माण करने वाले अध्ययन विरासत में मिली प्रतिरक्षा के इन बुनियादी सवालों का जवाब देने के लिए अच्छी तरह से तैयार हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम पांडुलिपि पर उपयोगी टिप्पणी प्रदान करने के लिए विनी झाओ और यिन चेन वान के आभारी हैं। इस काम को कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (अनुदान # 522691522691) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.0 mm zirconia beads Biospec Products Inc. 11079124ZX
10 mL syringe Fisher Scientific 1482613
5 μm filter Millipore Sigma SLSV025LS
Axio Imager 2 Zeiss - Fluorescent microscope for imaging of DY96- and FISH- stained worms on microscope slides
Axio Zoom V.16 Fluorescence Stereo Zoom Microscope Zeiss - For live imaging of fluorescent transgenic animals to visualize the IPR
Baked EdgeGARD Horizontal Flow Clean Bench Baker -
Bead disruptor, Genie SI-D238 Analog Disruptor Genie Cell Disruptor, 120 V Global Industrial T9FB893150
Cell-VU slide, Millennium Sciences Disposable Sperm Count Cytometers Fisher Scientific DRM600
Direct Yellow 96 Sigma-Aldrich S472409-1G
EverBrite Mounting Medium with DAPI Biotium 23001
EverBrite Mounting Medium without DAPI Biotium 23002
Fiji/ImageJ software ImageJ https://imagej.net/software/fiji/downloads
Mechanical rotor Thermo Sceintific 415110 / 1834090806873 Used to spin tubes of bleached embryos for overnight hatching
MicroB FISH probe Biosearch Technologies Inc. - Synthesized with a Quasar 570 (Cy3) 5' modification and HPLC purified, CTCTCGGCACTCCTTCCTG
N2 Wild-type, Bristol strain Default strain Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich L3771-100G
Sodium hydroxide solution (5 N) Fisher Chemical FLSS256500
Sodium hypochlorite solution (6%) Fisher Chemical SS290-1
Stemi 508 Stereo Microscope Zeiss - For daily maintenance of worms and counting of L1 worms for assay set ups
Tween-20 Sigma-Aldrich P1379-100ML
Vectashield + A16 Biolynx VECTH1500

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 182 Caenorhabditis elegans अकशेरुकी सूत्रकृमि संक्रमण रोगज़नक़ परजीवी microsporidia विरासत में मिली प्रतिरक्षा प्रतिरक्षा स्मृति epigenetic विरासत माइक्रोस्कोपी intergenerational
Microsporidia संक्रमण के एक <em>Caenorhabditis elegans</em> मॉडल में विरासत में मिली प्रतिरक्षा का अध्ययन
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Willis, A. R., Tamim El Jarkass, H., … More

Willis, A. R., Tamim El Jarkass, H., Reinke, A. W. Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection. J. Vis. Exp. (182), e63636, doi:10.3791/63636 (2022).

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