Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Studera ärftlig immunitet i en Caenorhabditis elegans-modell av mikrosporidiinfektion

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63636
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Molecular Genetics, University of Toronto

Summary

Infektionen av Caenorhabditis elegans av den mikrosporidiska parasiten Nematocida parisii gör det möjligt för maskarna att producera avkommor som är mycket resistenta mot samma patogen. Detta är ett exempel på ärftlig immunitet, ett dåligt förstått epigenetiskt fenomen. Det föreliggande protokollet beskriver studien av ärftlig immunitet i en genetiskt dragbar maskmodell.

Abstract

Ärftlig immunitet beskriver hur vissa djur kan vidarebefordra "minnet" av en tidigare infektion till sina avkommor. Detta kan öka patogenresistensen hos deras avkomma och främja överlevnad. Medan ärftlig immunitet har rapporterats hos många ryggradslösa djur, är mekanismerna bakom detta epigenetiska fenomen i stort sett okända. Infektionen av Caenorhabditis elegans av den naturliga mikrosporidiska patogenen Nematocida parisii resulterar i att maskarna producerar avkommor som är robust resistenta mot mikrosporidier. Det föreliggande protokollet beskriver studiet av immunitet mellan generationer i den enkla och genetiskt lätthanterliga N. parisii -C. elegans-infektionsmodellen . Den aktuella artikeln beskriver metoder för att infektera C. elegans och generera immunprimerade avkommor. Metoder ges också för att analysera resistens mot mikrosporidiinfektion genom färgning för mikrosporidier och visualisering av infektion genom mikroskopi. I synnerhet förhindrar ärftlig immunitet värdcellinvasion av mikrosporidier, och fluorescens in situ hybridisering (FISH) kan användas för att kvantifiera invasionshändelser. Den relativa mängden mikrosporidier som produceras i de immunprimerade avkommorna kan kvantifieras genom att färga sporerna med ett kitinbindande färgämne. Hittills har dessa metoder belyst kinetiken och patogenspecificiteten hos ärftlig immunitet, liksom de molekylära mekanismerna bakom den. Dessa tekniker, tillsammans med de omfattande verktyg som finns tillgängliga för C. elegans forskning, kommer att möjliggöra viktiga upptäckter inom ärftlig immunitet.

Introduction

Ärftlig immunitet är ett epigenetiskt fenomen där föräldrarnas exponering för patogener kan möjliggöra produktion av infektionsresistenta avkommor. Denna typ av immunminne har visats hos många ryggradslösa djur som saknar adaptiva immunförsvar och kan skydda mot virus-, bakterie- och svampsjukdomar1. Medan ärftlig immunitet har viktiga konsekvenser för att förstå både hälsa och evolution, är de molekylära mekanismerna bakom detta skydd i stort sett okända. Detta beror delvis på att många av de djur där ärftlig immunitet har beskrivits inte är etablerade modellorganismer för forskning. Däremot drar studier i den transparenta nematoden Caenorhabditis elegans nytta av en omfattande genetisk och biokemisk verktygslåda 2,3, ett mycket kommenterat genom 4,5 och en kort generationstid. Faktum är att forskning i C. elegans har möjliggjort grundläggande framsteg inom områdena epigenetik och medfödd immunitet 6,7, och det är nu en etablerad modell för att studera immunminne 8,9.

Mikrosporidier är svamppatogener som infekterar nästan alla djur och orsakar dödliga infektioner hos immunförsvagade människor10. Infektion börjar när en mikrosporidispore injicerar eller "avfyrar" sitt cellulära innehåll (sporoplasm) i en värdcell med hjälp av en struktur som kallas ett polärt rör. Intracellulär replikation av parasiten resulterar i bildandet av meronter, som i slutändan differentieras till mogna sporer som kan lämna cellen11,12. Även om dessa parasiter är skadliga för både människors hälsa och livsmedelssäkerhet, finns det mycket kvar att lära sig om deras infektionsbiologi12. Nematocida parisii är en naturlig mikrosporidisk parasit som replikerar uteslutande i tarmcellerna hos maskar, vilket resulterar i minskad fecunditet och i slutändan döden. Infektionsmodellen N. parisii -C. elegans har använts för att visa: (1) autofagiens roll i patogenclearance13, (2) hur mikrosporidier kan lämna infekterade celler icke-lytiskt14, (3) hur patogener kan spridas från cell till cell genom att bilda syncytia15, (4) proteinerna N. parisii använder för att interagera med dess värd16, och (5) regleringen av det transkriptionella intracellulära patogensvaret (IPR)17, 18.

Protokoll för infektion av C. elegans beskrivs i det aktuella arbetet och kan användas för att avslöja den unika mikrosporidibiologin och dissekera värdens svar på infektion. Mikroskopin av fasta maskar färgade med det kitinbindande färgämnet Direct Yellow 96 (DY96) visar infektionsspridningen av kitinhaltiga mikrosporidier i hela tarmen. DY96-färgning möjliggör också visualisering av kitinhaltiga maskembryon för samtidig bedömning av maskens graviditet (förmåga att producera embryon) som en avläsning av värdkonditionen.

Nytt arbete har avslöjat att C. elegans infekterade med N. parisii producerar avkommor som är robust resistenta mot samma infektion19. Denna ärftliga immunitet varar en enda generation och är dosberoende, eftersom avkommor från mer infekterade föräldrar är mer resistenta mot mikrosporidier. Intressant nog är N. parisii-grundade avkommor också mer resistenta mot den bakteriella tarmpatogenen Pseudomonas aeruginosa, även om de inte är skyddade mot den naturliga patogenen Orsay-virus19. Det föreliggande arbetet visar också att immunprimerade avkommor begränsar värdcellsinvasion av mikrosporidier. Metoden beskriver också insamlingen av immunprimerade avkommor och hur FISH kan användas för att detektera N. parisii RNA i tarmceller för att analysera värdcellsinvasion och sporbränning20.

Tillsammans ger dessa protokoll en solid grund för att studera mikrosporidier och ärftlig immunitet i C. elegans. Förhoppningen är att framtida arbete i detta modellsystem kommer att möjliggöra viktiga upptäckter inom det framväxande området ärftlig immunitet. Dessa tekniker kommer sannolikt också att vara utgångspunkter för att undersöka mikrosporidiinducerad ärftlig immunitet hos andra värdorganismer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Den föreliggande studien använder vildtyp C. elegans Bristol stam N2 odlad vid 21 ° C.

1. Förberedelse av media

  1. Förbered M9-media enligt tidigare rapport 21,22.
  2. Förbered nematodtillväxtmedium (NGM) enligt tidigare rapport 21,22. Häll 12 ml NGM per 6 cm platta eller 30 ml per 10 cm platta.
  3. Förbered Escherichia coli stam OP50-1 enligt en tidigare rapport23.
  4. Förbered OP50-1-seedade NGM-plattor enligt stegen nedan.
    1. Resuspend 10x koncentrerad OP50-1 genom virvel.
    2. Använd en repeaterpipett för att fröa plattorna i mitten. För 6 cm och 10 cm plattor, frö med en volym av 200 μL respektive 500 μL.
    3. För 10 cm plattor, använd en glasspridare för att sprida OP50-1 och skapa en gräsmatta av bakterier. Sprid inte bakterierna till kanten av plattan.
      OBS: Etanol doppa och flamma spridaren var femte tallrik för att säkerställa sterilitet. Låt spridaren svalna i några sekunder innan den sprids för att förhindra att bakterier dödas.
    4. Lämna plattorna vid rumstemperatur i 2 dagar för att torka och för att säkerställa tillväxten av bakteriegräsmattan.
      OBS: Sådda plattor kan förvaras i rumstemperatur i 2-3 veckor eller vid 4 °C i upp till 1 månad.

2. Underhåll av C. elegans

  1. Behåll maskar på en konstant bakteriell matkälla på OP50-1-fröade NGM-plattor.
    OBS: Svält kan leda till fenotyper mellan generationerna, vilket kan påverka resultaten. En 10 cm OP50-1-seedad platta stöder 2 500 L1s (det tidigaste larvstadiet av C. elegans) i upp till 72 timmar.
  2. Om maskarna svälter, växa i tre generationer på OP50-1 innan du använder maskarna för experiment.

3. Synkronisering av C. elegans-populationer med natriumhypoklorit (blekning)

OBS: Detta steg är mycket tidskänsligt, så se till att centrifugen är tillgänglig innan du börjar. Alternativa, mindre snabba blekningsprotokoll finns i litteraturen och kan användas om så önskas. För att förhindra att 6% natriumhypoklorit förlorar aktivitet över tid, förvara reagenset i mörkret vid 4 ° C och håll det i upp till 1 år.

  1. Förbered 2 ml blekmedelslösning för varje prov genom att blanda 400 μL 1 M NaOH, 250 μL 6% natriumhypoklorit (se materialtabell) och 1350 μL destillerat vatten.
  2. Tvätta vuxna maskar (~ 72 h efter luckan) från plattorna i ett mikrocentrifugrör med 1 ml M9-media.
    OBS: Om många maskar finns kvar på plattorna, pelletera maskarna genom centrifugering vid 1 400 x g i 30 s vid rumstemperatur, ta bort supernatanten med en 1 ml pipettspets och utför ytterligare platttvättar.
  3. Centrifug vid 1 400 x g i 30 s vid rumstemperatur för att pelletera maskarna och tvätta sedan 2x med 1 ml M9-media för att avlägsna bakterier.
  4. Ta bort supernatanten, tillsätt 1 ml av den beredda blekmedelslösningen (steg 3.1.) och ställ in en timer i 1 min. Invertera rören 3-4x.
    OBS: Under ett ljusmikroskop kan maskarna ses för att sluta krossa.
  5. Efter 1 min centrifugera vid 3000 x g i 30 s vid rumstemperatur för att pelletera maskarna, ta sedan bort supernatanten och tillsätt 1 ml färsk blekmedelslösning.
  6. Övervaka röret / erna noggrant under ett ljusmikroskop för att visualisera maskkropparna som splittras upp och släpper ut embryon. Gå omedelbart vidare till nästa steg när ~ 50% -80% av slaktkropparna har splittrats upp och många embryon har släppts.
    OBS: Beroende på antalet djur och maskstammen kan detta steg ta 15 s till 4 min. Av okända skäl tar N. parisii-infekterade maskar ofta längre tid att bleka än oinfekterade djur.
  7. Centrifug vid 3000 x g i 30 s vid rumstemperatur för att pelletera embryona och tvätta sedan 3x i 1 ml M9-media.
    OBS: Tvättar utspädd den återstående hypokloritlösningen från rören och måste utföras snabbt för att säkerställa att blekmedelslösningen inte skadar embryon.
  8. Tillsätt 1 ml M9-media till den slutliga pelletsen och överför till ett 15 ml koniskt rör innehållande 4 ml M9-media. Suspendera embryon i en slutlig volym av 5 ml.
  9. Snurra rören på en mekanisk rotor (se materialtabell) vid 21 °C i 18–24 timmar för att kläcka embryona till L1.
    OBS: Eftersom N. parisii infekterar masktarmen och inte invaderar bakterien, överför infekterade föräldrar inte infektionen till sin avkomma genom vertikal överföring19. Blekning av infekterade vuxna synkroniserar F1-djur och förstör N. parisii-sporer , vilket säkerställer att F1-avkomman inte smittas av sporer som överförs från föräldrarna.
  10. Centrifugera rören i 1 min vid 1 800 x g vid rumstemperatur för att pelletera L1 och kassera alla utom 1 ml av supernatanten.
  11. Pipettera 1-5 μL L1-blandning på en oseedade NGM-platta och räkna omedelbart antalet L1 i droppen genom att visualisera under ett ljusmikroskop. Upprepa 3x och medelvärdet av räkningarna för att bestämma koncentrationen och det totala antalet L1.
    OBS: Majoriteten av embryona ska kläckas och L1:erna ska röra sig snabbt i vätskedroppen. Om en stor andel okläckta embryon och slöa (långsamma) L1 kvarstår, indikerar detta blekning för länge.

4. Beredning av N. parisii-sporer

  1. Förbered N. parisii sporer efter tidigare publicerade referenser19,24.

5. Infektion av C. elegans med N. parisii för att ge immunprimerade avkommor

  1. En dag före planerade infektioner, flytta det önskade antalet 10 cm oseedade NGM-plattor från 4 ° C till rumstemperatur.
  2. Omedelbart före infektion synkroniserade centrifugen ~ 2 500 L1-maskar vid 1 400 x g i 30 s vid rumstemperatur i ett mikrocentrifugrör för att pelletera maskarna. Ta bort supernatanten med en pipettspets för att lämna maskar i ~ 50 μL M9-media.
  3. Tillsätt 1 ml 10x OP50-1 till L1s och N. parisii sporer till önskad koncentration (typiskt ~ 2,5 miljoner sporer). Som en oinfekterad kontroll, förbered ett ekvivalent rör av L1s och OP50-1 med en volym M9-media som motsvarar volymen av sporberedning som används.
    OBS: För att få immunprimerade avkommor, använd en spordos som är tillräckligt hög så att >90% av djuren är infekterade med 72 timmar (mätt med DY96-färgning, steg 7) men tillräckligt låga så att >80% av djuren fortfarande är gravida. Detta säkerställer att de flesta avkommor kommer från infekterade föräldrar och att blekning av föräldrarna ger tillräckligt med embryon för F1-testning. Även om sporpreparat varierar i koncentration och infektivitet, är en lämplig föräldrados vanligtvis mellan 5-15 μL sporpreparat (~ 2,5 miljoner sporer) per 10 cm platta.
  4. Vortex kort för att blanda och platta ovanstående 1 ml maskar på en 10 cm oröd NGM-platta. Virvla för att säkerställa att vätskan sprider sig över hela plattan.
  5. Torka plattorna i ett rent skåp med locken av i 10-20 min eller tills de är helt torra, innan de ruvs vid 21 °C i 72 timmar.
  6. Vid 72 timmar efter infektion (hpi), tvätta maskarna från plattorna i ett mikrocentrifugrör med 1 ml M9-media. Om många maskar finns kvar på plattorna, pelletera maskarna genom centrifugering vid 1 400 x g i 30 s, ta bort supernatanten och utför ytterligare platttvättar.
  7. Centrifug vid 1 400 x g i 30 s vid rumstemperatur till pelletsmaskar, tvätta 2x med 1 ml M9-media eller tills supernatanten är klar. Resuspend i en slutlig volym på 1 ml M9-media.
  8. Pipett upp och ner för att blanda, överför sedan 100 μL av de suspenderade maskarna till ett nytt rör.
    OBS: Detta prov på ~ 250 vuxna kan senare fixas och färgas för att bestämma föräldramaskens kondition och infektionsstatus, enligt beskrivningen i steg 7 och början av steg 3.
  9. För att bryta upp de vuxna maskarna och släppa ut F1-embryon för testning, blek de återstående 900 μL suspenderade maskarna, enligt beskrivningen i steg 3.
    OBS: Detta steg förstör också alla N. parisii-sporer före efterföljande infektionsanalyser.

6. Testa ärftlig immunitet mot N. parisii i C. elegans

  1. Utför infektioner enligt beskrivningen i steg 5.1.-5.6., med ändringar som nämns nedan.
    OBS: Infektionsanalyser på F1 kan skalas ner och utföras på 6 cm NGM-plattor med ~ 1000 L1-maskar och 400 μL 10x OP50-1. En "hög" dos sporer måste också användas, så att ~ 100% av naiva F1 (dvs maskar från oinfekterade föräldrar) är infekterade, och endast ~ 10% av naiva F1 är gravida. Även om sporpreparat varierar i koncentration och smittsamhet, är en lämplig dos vanligtvis mellan 5-15 μL (~ 2,5 miljoner sporer) per 6 cm platta.
  2. Vid 72 hpi, fixa och fläcka för att bestämma maskkondition och infektionsstatus, enligt beskrivningen i steg 7.

7. DY96 färgning av C. elegans för att visualisera embryon och mikrosporidier sporer

OBS: DY96 är ett grönt fluorescerande kitinbindande färgämne som fläckar maskembryon och mikrosporidier sporidier 19,15,25. Detta möjliggör samtidig övervakning av maskarnas kondition och infektionsstatus.

  1. Tvätta maskarna från plattorna i ett mikrocentrifugrör med 1 ml M9-media innehållande 0,1% Tween-20. Om många maskar finns kvar på plattorna, pelletera maskarna genom centrifugering vid 1 400 x g i 30 s vid rumstemperatur, ta bort supernatanten med en pipettspets och utför ytterligare platttvättar.
  2. Centrifug vid 1 400 x g i 30 s vid rumstemperatur för att pelletera maskarna och tvätta 2x med 1 ml M9-media innehållande 0,1% Tween-20 eller tills supernatanten är klar.
  3. Ta bort supernatanten, tillsätt 700 μL aceton och låt maskarna fixeras vid rumstemperatur i 10 minuter.
    OBS: Vid denna tidpunkt kan maskarna lagras vid -20 ° C för bearbetning upp till flera månader senare, om så önskas.
  4. Centrifug vid 10 000 x g i 30 s vid rumstemperatur för att pelletera de fasta maskarna och tvätta 2x med 1 ml PBS innehållande 0,1% Tween-20 (PBST).
  5. Förbered 50 ml DY96 arbetslösning: PBST, 0,1% (v/v) natriumdodecylsulfat (SDS) och 20 μg/ml DY96 (från en 5 mg/ml stamlösning i destillerat vatten) (se Materialförteckningen). Vik in röret i folie och förvara det i en låda för att förhindra exponering för ljus.
    OBS: DY96 lager- och arbetslösningar kan förvaras i >1 år vid rumstemperatur om de förvaras i mörker.
  6. Centrifug vid 10 000 x g i 30 s vid rumstemperatur för att pelletera maskarna och ta bort supernatant. Tillsätt 500 μL DY96 arbetslösning till pelletsen och rotera i 30 min vid rumstemperatur.
  7. Centrifug vid 10 000 x g i 30 s vid rumstemperatur för att pelletera maskarna. Ta bort supernatanten och tillsätt 15 μL av monteringsmediet med/utan DAPI (se Materialtabell).
  8. Pipett 10 μL av lösningen innehållande färgade maskar på en mikroskopglidning och placera en täckglas över toppen.
    OBS: Diabilder och ytterligare prover kan förvaras vid 4 ° C i mörkret för långvarig lagring.

8. Avbildning och analys av DY96-färgade maskar för att bedöma maskens kondition och infektionsstatus

  1. För att analysera de DY96-färgade maskarna (monterade på bilder, som i steg 7.8.), utför avbildning med GFP-kanalen i ett fluorescensmikroskop.
  2. För att bestämma maskpopulationernas kondition, använd ett 5x eller 10x mål för att analysera graviditeten hos > 100 maskar per tillstånd.
    OBS: Maskar som bär ≥1 embryo anses vara gravida. Mekaniska cellräknare kan hjälpa till att minimera mänskliga fel vid räkning. Maskembryon är mindre färgade (mindre fluorescerande) än mikrosporidiersporer 19. Embryon är äggformiga, ~ 50 μm x ~ 30 μm, och finns i mellankroppen hos friska C. elegans vuxna. Friska, oinfekterade vuxna bär 10-20 embryon organiserade i rader längs deras kroppslängd26.
  3. För att avslöja mer subtila skillnader i kondition, utför embryoräkningar. För detta räknar manuellt antalet embryon i 20-30 enskilda maskar per tillstånd.
  4. För att bestämma hur infekterade maskpopulationerna är, använd ett 5x-40x mål för att bedöma infektionsstatusen för > 100 maskar per tillstånd. Ormar som består av valfritt antal intracellulära tarmsporer anses vara infekterade.
    OBS: Mikrosporidier sporer är ljusare än maskembryon. De bönformade sporerna av N. parisii är ~ 2,2 μm x ~ 0,8 μm och produceras i maskens tarmceller från ~ 48 hpi15. Ormar där sporer ses uteslutande i tarmlumen och inte längs tarmväggarna anses inte vara infekterade19. Detta beror på att dessa sporer sannolikt representerar nyligen ide itade sporer som inte härrör från infektion hos individen.
  5. Använd programvara för bildanalys (se Materialtabell), kvantifiera parasitbelastning och maskstorlek enligt stegen nedan.
    1. Bild 20-30 maskar monterade på mikroskopbilder med hjälp av ett fluorescerande upprätt stereoskop för varje prov. Ta bilder i Brightfield-, DAPI- och GFP-kanaler. Välj en lämplig exponering i GFP-kanalen så att fluorescensen i de mest infekterade proverna inte är mättad.
      OBS: Infektionen kan fortfarande visualiseras i de minst infekterade proverna. Bilder tas vanligtvis med ett 5x-mål.
    2. Öppna filer i FIJI/ImageJ. Beroende på filtyp kan plugin-programmet Bio-Formats Importer krävas för att öppna bilder i ImageJ.
    3. Skissera 20-30 enskilda maskar i bilder med hjälp av ljusfälts- eller DAPI-bilder och polygonvalsverktyget i verktygsfältet . Spara varje disposition med Analyze > Tools > Regions of Interest (ROI) Manager i rullgardinsmenyn genom att klicka på Lägg till [t]. Skissera djur som är fullt synliga i ramen.
      OBS: Maskkonturer kan ses över senare genom att spara filen med konturer som en Tiff.
    4. Klicka på Avmarkera i ROI-hanteraren för att ta bort alla konturer från bilden och klicka på Bild > duplicera i rullgardinsmenyn. Skriv numret som motsvarar kanalen av intresse i rutan "Kanaler" för att duplicera GFP-kanalen för parasitbörda (t.ex. 2).
    5. Tröskel denna kanal med Image > Justera > Threshold till en nivå där den ljusa parasitbördan fångas men dimmerfluorescensen från maskembryon inte är det, och klicka sedan på Apply. Anteckna de tröskelvärden som tillämpas och använd dem konsekvent för alla bilder av samma experiment.
      OBS: Kontrollera att tröskelvärdet är ett lämpligt värde för både de minst och mest infekterade proverna innan du analyserar alla bilder.
    6. Välj Analysera > Ställ in mätningar och markera rutan för Area Fraction. Välj enstaka maskkonturer i sin tur från ROI-hanteraren och klicka på funktionen Analysera > Mät . Ett resultatfönster kommer att ge mätningen för %Area (dvs. % parasitbörda).
      OBS: Om fluorescensen från embryona är så ljus att den passerar tröskeln kan penselverktyget i svart i verktygsfältet användas för att manuellt radera dessa regioner innan du mäter %Area.
    7. För att bestämma maskstorlek som en avläsning av kondition, skissera maskar enligt beskrivningen i steg 8.3. Välj Analysera > Ange mått och markera rutan för Område. Välj enstaka maskkonturer i sin tur från ROI-hanteraren och klicka på funktionen Analysera > Mät . Ett resultatfönster ger mätningen för %Area.

9. FISKANALYS för att bedöma invasion av C. elegans genom mikrosporidier och sporbränning

OBS: MicroB FISH-sonden känner igen en bevarad region av mikrosporidian 18s rRNA och kan användas för att märka intracellulära sporoplasmer (dvs invaderade värdceller) och det genetiska materialet i sporer.

  1. Infektera 6 000 blekmedel synkroniserade L1-maskar med 4 miljoner sporer av N. parisii och 10 μL av 10x OP50-1 i en slutlig volym av 400 μL som består av M9-media.
  2. Platta blandningen på en 6 cm oedad NGM-platta, torka i ett rent skåp i 10-20 minuter och placera vid 21 °C.
  3. Tvätta djuren från plattorna efter 30 minuter med 1 ml M9-media innehållande 0,1% Tween-20.
  4. Pelletera maskarna genom centrifugering vid 1 400 x g i 1 min vid rumstemperatur.
  5. Ta bort supernatanten med en pipettspets, tillsätt 700 μL aceton och låt den sitta i 10 minuter vid rumstemperatur.
    OBS: Vid denna tidpunkt kan maskarna lagras vid -20 ° C för bearbetning vid ett senare tillfälle.
  6. Utför FISH-analys över natten med MicroB-sonden efter tidigare publicerade rapporter 27,19.
    OBS: För att bedöma sporbränning, komplettera den slutliga 500 μL tvättbufferten med 20 μg / ml DY96 till proverna och rotera i 30 min vid 21 ° C innan du fortsätter med protokollet som normalt.
  7. Förvara diabilderna i en diabildslåda vid 4 °C. För långtidsförvaring (dvs. flera månader), förvara ytterligare prover i mikrocentrifugrör vid 4 °C i mörker.
  8. För att bedöma invasion i FISH-färgade maskar, titta på maskarna med hjälp av den röda kanalen i ett fluorescensmikroskop. Visualisera infektionshändelser vid hög förstoring (63x mål) eftersom L1-djur är små och sporoplasmer kommer att vara i de tidiga stadierna av replikation. För att bedöma sporbränning, använd ett 63x mål och både röda och gröna fluorescenskanaler.
    OBS: Sporer där GFP- och mCherry-signal samlokaliseras anses vara obrända; tomma GFP-sporfall anses vara avfyrade.
  9. För att analysera invasion eller sporbränning, räkna manuellt antalet sporoplasmer (mCherry foci i tarmcellerna) eller andelen sporer som avfyras i 20-30 maskar per tillstånd. Justera fokus i z-planet för att fånga alla infektionshändelser och sporer, som ofta finns i olika plan.
    OBS: Sporoplasmer finns uteslutande i tarmcellerna. Den högsta koncentrationen av sporoplasmer finns vanligtvis omedelbart efter svalget. Om prover också färgas med DY96, leta efter närvaron av sporoplasmer som inte samlokaliseras med sporen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I den aktuella studien infekterades föräldrapopulationer av C. elegans (P0) i L1-stadiet med en låg dos av N. parisii-sporer . Dessa infektionsförhållanden används vanligtvis för att erhålla ett stort antal mikrosporidiresistenta F1-avkommor genom blekning av föräldrarna. Infekterade föräldrapopulationer och oinfekterade kontroller fixerades till 72 hpi och färgades med DY96 för att visualisera maskembryon och mikrosporidisporerna (Figur 1A). Infekterade djur är små, innehåller många mikrosporidier sporer och producerar färre embryon än friska oinfekterade kontroller. Bedömning av maskens graviditet visade att ~ 95% av de oinfekterade djuren producerade avkommor, jämfört med mindre än 80% av de infekterade djuren (Figur 1B). Kvantifieringar visade att ~ 90% av den mikrosporidibehandlade populationen var infekterad, vilket bestämdes av antalet maskar som innehöll DY96-färgade sporer (Figur 1C). För att få immunprimerad F1-avkomma är det viktigt att använda en dos mikrosporidier som är tillräckligt hög för att säkerställa att de flesta föräldrar är infekterade men tillräckligt låga för att säkerställa att befolkningen fortfarande kan producera avkomma. En tabell över de mikrosporididoser som använts för att erhålla data i denna studie tillhandahålls (tabell 1).

Oinfekterade och infekterade moderpopulationer (figur 1) behandlades med natriumhypoklorit vid 72 hpi för att erhålla naiva och immunprimerade F1-avkommor. F1-djur utsattes för en hög dos av N. parisii-sporer i L1-stadiet för att testa för ärftlig immunitet mot mikrosporidier. Vid 72 hpi fixerades F1-djur och färgades med DY96 för att bedöma mikrosporidiresistens (figur 2A). Kvantifieringar av dessa fasta djur visade att de grundade maskarna innehöll betydligt fler embryon än deras naiva motsvarigheter, vilket indikerar större kondition inför infektion (figur 2B). FIJI/ImageJ användes för att bestämma parasitbördan hos enskilda naiva och immunprimerade maskar (dvs. procentandel av kroppen fylld med fluorescerande N. parisii-sporer ) (Figur 2C). Kvantifieringar avslöjade en dramatisk minskning av parasitbördan hos maskar som kom från infekterade föräldrar (figur 2D). Vidare avslöjade beräkningar av individuell maskstorlek att grundade maskar hade en signifikant tillväxtfördel jämfört med naiva djur inför N. parisii-infektion (Figur 2E). Dessa data visar att N. parisii-infekterade föräldrar producerar avkommor med höga nivåer av mikrosporidiresistens.

Tidigare arbete har visat att ärftlig immunitet mot mikrosporidier minskar invasionen av tarmceller av N. parisii19. För att visualisera skillnader i värdcellsinvasion utsattes naiva och immunprimerade djur (erhållna från oinfekterade eller infekterade föräldrar, som ovan) för en maximal dos av N. parisii vid L1-stadiet. Vid 30 dpi fixerades maskarna och samfärgades med hjälp av en FISH-sond för att detektera N. parisii RNA och DY96 för att detektera N. parisii-sporväggar . Avbildning avslöjade att medan naiva djur vanligtvis innehöll flera sporer och flera infekterade celler (sporoplasmer), hade de grundade djuren mycket färre (eller inga) sporer och vanligtvis inga sporoplasmer (Figur 3).

Figure 1
Figur 1: Direkt gul 96 (DY96) färgning av oinfekterade och N. parisii-infekterade C. elegans avslöjar maskens graviditet och infektionsstatus. (A-C) N2 C. elegans var inte infekterade eller infekterade med en låg dos av N. parisii vid L1-stadiet. Vid 72 hpi fixerades maskarna, färgades med DY96 och avbildades för att bedöma maskens graviditet och infektionsstatus. (A) Representativa bilder visas. DY96 möjliggör visualisering av maskembryon och mikrosporidier (kitin). En infälld bild av en infekterad mask visas på höger sida. Embryon är märkta "E". N. parisii infektion i tarmen är märkt "Np". Skalfält för vänster- och mittbilder = 500 μm. Skalstång för rätt bild = 100 μm. (B) Maskar som bär ett eller flera embryon poängsätts som gravida och graferade. (C) Maskar som bär valfritt antal N. parisii-sporer i tarmcellerna poängsattes som infekterade och graferade. (B-C) Data sammanförda från 5 oberoende experiment med n = 100 maskar per tillstånd per experiment. Medelvärdet ± SEM visas. P-värdena bestämdes av den oparade tvåsvansade studentens t-test. Betydelse definierades som: *p < 0,05; p < 0,001. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Direkt gul 96 (DY96) färgning av naiva och immunprimerade C. elegans för att bestämma embryon per mask, mikrosporidier och maskstorlek. (A) N2 C. elegans var infekterade eller inte infekterade med en låg dos av N. parisii vid L1-stadiet. Vid 72 hpi behandlades maskarna med natriumhypoklorit för att frigöra embryon. De resulterande naiva och immunprimerade avkommorna infekterades med en hög dos av N. parisii vid L1-stadiet. Vid 72 hpi fixerades maskarna, färgades med DY96 och avbildades för att visualisera maskembryon och parasitbörda. Representativa bilder visas. Skalstång = 200 μm.(B) Antalet embryon per mask räknades och graferades från (A). (C) En skärmdump från FIJI/ImageJ visar naiva maskar från panel A som har tröskelats för att visualisera parasitbördan (visas i vitt) med hjälp av fönstret Thresholding längst ned till höger. Här skisserades enskilda maskar med hjälp av verktyget "Polygonval" markerat med rött och definierat som "Intresseområde" (ROI) med hjälp av ROI-fönstret längst upp till höger. Funktionen Analysera > Mät > Area användes för att kvantifiera parasitbördan för två exempelmaskar, som visade sig vara 25,02% och 13,49%. (D) Parasitbördan per mask bestämdes och graferades från (A). (E) Från ovanstående bilder beräknades individuell maskstorlek från djur som beskrivs som i panel C med hjälp av funktionen Analysera > mät > Area . (B, D och E) Medelvärdet ± SEM visas. P-värdena bestämdes av oparade tvåsvansade Studentens t-test. Signifikans definierades som: *p < 0,05. **p < 0,01, ***p < 0,001. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Fluorescens in situ hybridisering (FISH) mot N. parisii 18S rRNA avslöjar parasitinvasion av C. elegans tarmceller hos naiva men inte grundade djur. N2 C. elegans infekterades eller inte smittades med en låg dos av N. parisii vid L1-stadiet. Vid 72 hpi behandlades maskarna med natriumhypoklorit för att frigöra embryon. De resulterande naiva och immunprimerade avkommorna infekterades med en maximal dos av N. parisii vid L1-stadiet. Vid 30 mpi fixerades maskarna, utsattes för FISH för att detektera sporoplasmer, färgade med DY96 för att detektera mikrosporidier sporväggar och avbildades. Representativa bilder visas. Infällde bilder för den naiva masken visar sporoplasmer (röd, asterisker), avfyrade sporer (grön, pilspetsar) och en obränd spore (gul, pil). Den naiva infekterade masken som visas visar 4 sporoplasmer. Skalstång = 20μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

N. parisii dos Plattans koncentration (sporer/cm2) Miljontals sporer per 6 cm platta Miljontals sporer per 10 cm platta
Låg 35,400 - 2.7
Hög 88,400 2.5 -
Maximal 2,12,000 6 -

Tabell 1: N. parisii doser som används i studien.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det föreliggande protokollet beskriver studien av mikrosporidier och ärftlig immunitet i en enkel och genetiskt dragbar N. parisii -C. elegans infektionsmodell .

Sporberedning är ett intensivt protokoll som vanligtvis ger tillräckligt med sporer för 6 månaders experiment, beroende på produktivitet24. Viktigt är att smittsamheten måste bestämmas för varje nytt spore "parti" innan den används för experimenten. På grund av variationen i smittsamhet mellan sporpreparat måste ett enda parti användas konsekvent för alla upprepningar av ett experiment. Enskilda alikvoter bör inte tinas och frysas igen, eftersom upptining kan orsaka sporer att elda och minska smittsamheten. Sporer får därför endast avlägsnas från frysen -80 °C omedelbart före infektion och hållas på is medan de är på bänken.

I steg 5-6 skisserades infektionsanalyserna. Det är viktigt under infektionsanalyser att undvika kontaminering eller svält av djuren, eftersom detta kan leda till ytterligare intergenerationella effekter som förvirrar immuniteten hos F1. En viktig begränsning av den ärftliga immunitetsanalysen är att fler infekterade föräldrar producerar färre F1-avkommor. Därför är det viktigt att hitta en noggrann balans mellan att föräldragenerationen är tillräckligt infekterad för att överföra immunitet samtidigt som den är tillräckligt frisk för att producera avkommor för testning. Även om det nuvarande protokollet beskrev infektionsanalyser för L1-djur, kan protokollet modifieras för att testa effekten av mikrosporidiinfektion på olika iscensatta föräldrar och persistensen av immunitet hos äldre avkommor. Metoderna kan också modifieras för att testa effekterna av flera eller distinkta spänningar (t.ex. osmotisk stress, tungmetallspänning, saminfektion med en annan patogen) på ärftlig immunitet. Medan ärftlig immunitet mot N. parisii i C. elegans är generationsöverskridande (dvs. varar en enda generation)19, kan protokollet anpassas för att studera ytterligare generationer för att testa generationsöverskridande effekter. Medan de protokoll som tillhandahålls är specifika för N. parisii-infektion, finns det många andra nematodinfekterande arter av mikrosporidier28. Protokollen kan anpassas för att studera ärftlig immunitet mot andra tarminfekterande (t.ex. Nematocida ausubeli) och epidermal- och muskelinfekterande (t.ex. Nematocida displodere) mikrosporidier29,30. C. elegans är också infekterade av många andra naturliga och mänskliga patogener (bakteriella, svampiga och virala). De metoder som beskrivs här kan användas för att testa ärftlig immunitet mot andra patogener i C. elegans och patogenspecificiteten hos det ärftliga immunsvaret mot N. parisii. C. elegans är en väletablerad modellorganism. Andra medlemmar av släktet Caenorhabditis, inklusive de hermafroditiska arterna C. tropicalis och C. briggsae och den manliga-kvinnliga arten C. kamaaina är emellertid också infekterade i varierande grad med N. parisii31. Genom att göra små ändringar i de protokoll som tillhandahålls kan ärftlig immunitet också testas på dessa djur.

I steg 8 gavs snabba och enkla metoder för att bestämma skillnader i mikrosporidiers känslighet hos DY96-färgade maskar (dvs. % djur infekterade, % djur gravida). Men ibland är dessa metoder inte tillräckligt känsliga för att upptäcka små förändringar i immunitet och kondition. Detta beror på att en mask med ett embryo och många infekterade celler skulle behandlas på samma sätt som en mask med 10 embryon och en infekterad cell. Som sådan har metoder med finare upplösning också tillhandahållits för att bestämma infektionsresultat hos dessa djur (dvs. % parasitbörda, antal embryon, maskstorlek). Medan båda metoderna kan användas, är fenotypiska skillnader vanligtvis mer uttalade med den senare, vilket gör det lättare att upptäcka signifikanta skillnader. Framtida anpassningar av den här metoden kan innefatta att använda maskininlärning för att automatisera analyser.

I steg 9 tillhandahölls tekniker för att analysera värdcellinvasion genom mikrosporidier och sporbränning med hjälp av FISH. Medan DY96 markerar mikrosporidier med en stark fluorescerande grön signal, kan andra färgämnen, inklusive den lipofila fläcken Nile Red och den kitinbindande Calcofluor White, också användas för att fläcka N. parisii 30,32,33. Det nuvarande protokollet beskriver fixering med aceton och fungerar bra för att detektera mikrosporidier med DY96 och FISH-färgning. Fixering med 4% paraformaldehyd kan dock hjälpa till att bevara vävnadsmorfologi och förbättra signalen i vissa bildprotokoll.

Mikrosporidier är en understuderad patogen, och mycket av infektionens cellbiologi är fortfarande okänd. C. elegans är en enkel modellorganism, och dessa protokoll kan fungera som en plattform för att förstå de viktigaste processerna som är involverade i infektion och värdförsvar mot denna parasit. Ärftlig immunitet är ett framväxande område, och många frågor kvarstår1. Hur överför infekterade föräldrar immunitet mot avkommor (moderns försörjning eller förändrad transkriptionsreglering i avkomman)? Vad förmedlar immunitet hos avkommor (antimikrobiella peptider eller andra immunproteiner)? Hur patogenspecifika är ärftliga immunsvar, och hur bevarad är ärftlig immunitet mellan arter? Med tanke på de omfattande verktyg som finns tillgängliga med C. elegans är studier som bygger på det protokoll som beskrivs här väl förberedda för att svara på dessa grundläggande frågor om ärftlig immunitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi är tacksamma för Winnie Zhao och Yin Chen Wan för att ge användbara kommentarer till manuskriptet. Detta arbete stöddes av Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (Grant #522691522691).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.0 mm zirconia beads Biospec Products Inc. 11079124ZX
10 mL syringe Fisher Scientific 1482613
5 μm filter Millipore Sigma SLSV025LS
Axio Imager 2 Zeiss - Fluorescent microscope for imaging of DY96- and FISH- stained worms on microscope slides
Axio Zoom V.16 Fluorescence Stereo Zoom Microscope Zeiss - For live imaging of fluorescent transgenic animals to visualize the IPR
Baked EdgeGARD Horizontal Flow Clean Bench Baker -
Bead disruptor, Genie SI-D238 Analog Disruptor Genie Cell Disruptor, 120 V Global Industrial T9FB893150
Cell-VU slide, Millennium Sciences Disposable Sperm Count Cytometers Fisher Scientific DRM600
Direct Yellow 96 Sigma-Aldrich S472409-1G
EverBrite Mounting Medium with DAPI Biotium 23001
EverBrite Mounting Medium without DAPI Biotium 23002
Fiji/ImageJ software ImageJ https://imagej.net/software/fiji/downloads
Mechanical rotor Thermo Sceintific 415110 / 1834090806873 Used to spin tubes of bleached embryos for overnight hatching
MicroB FISH probe Biosearch Technologies Inc. - Synthesized with a Quasar 570 (Cy3) 5' modification and HPLC purified, CTCTCGGCACTCCTTCCTG
N2 Wild-type, Bristol strain Default strain Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich L3771-100G
Sodium hydroxide solution (5 N) Fisher Chemical FLSS256500
Sodium hypochlorite solution (6%) Fisher Chemical SS290-1
Stemi 508 Stereo Microscope Zeiss - For daily maintenance of worms and counting of L1 worms for assay set ups
Tween-20 Sigma-Aldrich P1379-100ML
Vectashield + A16 Biolynx VECTH1500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tetreau, G., Dhinaut, J., Gourbal, B., Moret, Y. Trans-generational immune priming in invertebrates: current knowledge and future prospects. Frontiers in Immunology. 10, 1938 (2019).
  2. Au, V., et al. CRISPR/Cas9 methodology for the generation of knockout deletions in Caenorhabditis elegans. G3 Genes|Genomes|Genetics. 9 (1), 135-144 (2019).
  3. Kamath, R. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
  4. The C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).
  5. Yoshimura, J., et al. Recompleting the Caenorhabditis elegans genome. Genome Research. 29, 1009-1022 (2019).
  6. Weinhouse, C., Truong, L., Meyer, J. N., Allard, P. Caenorhabditis elegans as an emerging model system in environmental epigenetics: C. elegans as an environmental epigenetics model. Environmental and Molecular Mutagenesis. 59 (7), 560-575 (2018).
  7. Ermolaeva, M. A., Schumacher, B. Insights from the worm: the C. elegans model for innate immunity. Seminars in Immunology. 26 (4), 303-309 (2014).
  8. Willis, A. R., Sukhdeo, R., Reinke, A. W. Remembering your enemies: mechanisms of within-generation and multigenerational immune priming in Caenorhabditis elegans. TheFEBS Journal. 288 (6), 1759-1770 (2020).
  9. Burton, N. O., et al. Cysteine synthases CYSL-1 and CYSL-2 mediate C. elegans heritable adaptation to P. vranovensis infection. Nature Communications. 11, 1741 (2020).
  10. Wadi, L., Reinke, A. W. Evolution of microsporidia: an extremely successful group of eukaryotic intracellular parasites. PLoS Pathogens. 16, 1008276 (2020).
  11. Han, B., Takvorian, P. M., Weiss, L. M. Invasion of host cells by microsporidia. Frontiers in Microbiology. 11, 172 (2020).
  12. Tamim El Jarkass, H., Reinke, A. W. The ins and outs of host-microsporidia interactions during invasion, proliferation and exit. Cellular Microbiology. 22 (11), 13247 (2020).
  13. Balla, K. M., Lažetić, V., Troemel, E. R. Natural variation in the roles of C. elegans autophagy components during microsporidia infection. PLoS ONE. 14, 0216011 (2019).
  14. Szumowski, S. C., Estes, K. A., Troemel, E. R. Preparing a discreet escape: Microsporidia reorganize host cytoskeleton prior to non-lytic exit from C. elegans intestinal cells. Worm. 1 (4), 207-211 (2012).
  15. Balla, K. M., Luallen, R. J., Bakowski, M. A., Troemel, E. R. Cell-to-cell spread of microsporidia causes Caenorhabditis elegans organs to form syncytia. Nature Microbiology. 1 (11), 1-6 (2016).
  16. Reinke, A. W., Balla, K. M., Bennett, E. J., Troemel, E. R. Identification of microsporidia host-exposed proteins reveals a repertoire of rapidly evolving proteins. Nature Communications. 8, 14023 (2017).
  17. Bakowski, M. A., et al. Ubiquitin-mediated response to microsporidia and virus infection in C. elegans. PLoS Pathogen. 10, 1004200 (2014).
  18. Reddy, K. C., et al. An intracellular pathogen response pathway promotes proteostasis in C. elegans. Current Biology. 27 (22), 3544-3553 (2017).
  19. Willis, A. R., et al. A parental transcriptional response to microsporidia infection induces inherited immunity in offspring. Science Advances. 7 (19), (2021).
  20. Tamim El Jarkass, H., et al. An intestinally secreted host factor promotes microsporidia invasion of C. elegans. eLife. 11, 72458 (2022).
  21. Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. Journal of Visualized Experiments. 49, 2496 (2011).
  22. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  23. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
  24. Estes, K. A., Szumowski, S. C., Troemel, E. R. Non-lytic, actin-based exit of intracellular parasites from C. elegans intestinal cells. PLOS Pathogens. 7, 1002227 (2011).
  25. Botts, M. R., Cohen, L. B., Probert, C. S., Wu, F., Troemel, E. R. Microsporidia intracellular development relies on myc interaction network transcription factors in the host. G3 Genes|Genomes|Genetics. 6 (9), 2707-2716 (2016).
  26. Corsi, A. K. A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
  27. Rivera, D. E., Lažetić, V., Troemel, E. R., Luallen, R. J. RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize microbial colonization and infection in the Caenorhabditis elegans intestines. bioRxiv. , (2022).
  28. Zhang, G., et al. A large collection of novel nematode-infecting microsporidia and their diverse interactions with Caenorhabditis elegans and other related nematodes. PLoS Pathogens. 12, 1006093 (2016).
  29. Luallen, R. J., et al. Discovery of a natural microsporidian pathogen with a broad tissue tropism in Caenorhabditis elegans. PLoS Pathogens. 12, 1005724 (2016).
  30. Troemel, E. R., Félix, M. -A., Whiteman, N. K., Barrière, A., Ausubel, F. M. Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 6, 309 (2008).
  31. Burton, N. O., et al. Intergenerational adaptations to stress are evolutionarily conserved, stress-specific, and have deleterious trade-offs. eLife. 10, 73425 (2021).
  32. Jaroenlak, P., et al. 3-Dimensional organization and dynamics of the microsporidian polar tube invasion machinery. PLoS Pathogens. 16, 1008738 (2020).
  33. Weidner, E., Manale, S. B., Halonen, S. K., Lynn, J. W. Protein-membrane interaction is essential to normal assembly of the microsporidian spore invasion tube. The Biological Bulletin. 188 (2), 128-135 (1995).

Tags

Immunologi och infektion utgåva 182 Caenorhabditis elegans ryggradslösa djur nematod infektion patogen parasit mikrosporidier ärftlig immunitet immunminne epigenetiskt arv mikroskopi intergenerationell
Studera ärftlig immunitet i en <em>Caenorhabditis elegans-modell</em> av mikrosporidiinfektion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Willis, A. R., Tamim El Jarkass, H., … More

Willis, A. R., Tamim El Jarkass, H., Reinke, A. W. Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection. J. Vis. Exp. (182), e63636, doi:10.3791/63636 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter