Summary
L'infezione di Caenorhabditis elegans da parte del parassita microsporidiano Nematocida parisii consente ai vermi di produrre prole altamente resistente allo stesso agente patogeno. Questo è un esempio di immunità ereditaria, un fenomeno epigenetico poco compreso. Il presente protocollo descrive lo studio dell'immunità ereditaria in un modello di verme geneticamente trattabile.
Abstract
L'immunità ereditaria descrive come alcuni animali possono trasmettere la "memoria" di una precedente infezione alla loro prole. Questo può aumentare la resistenza agli agenti patogeni nella loro progenie e promuovere la sopravvivenza. Mentre l'immunità ereditaria è stata riportata in molti invertebrati, i meccanismi alla base di questo fenomeno epigenetico sono in gran parte sconosciuti. L'infezione di Caenorhabditis elegans da parte del patogeno microsporidico naturale Nematocida parisii provoca la produzione di vermi che sono robustamente resistenti ai microsporidi. Il presente protocollo descrive lo studio dell'immunità intergenerazionale nel modello di infezione da N. parisii -C. elegans semplice e geneticamente trattabile. L'articolo attuale descrive i metodi per infettare C. elegans e generare prole immuno-innescata. Vengono inoltre forniti metodi per valutare la resistenza all'infezione da microsporidi mediante colorazione per microsporidi e visualizzazione dell'infezione al microscopio. In particolare, l'immunità ereditaria previene l'invasione delle cellule ospiti da parte dei microsporidi e l'ibridazione fluorescente in situ (FISH) può essere utilizzata per quantificare gli eventi di invasione. La quantità relativa di spore di microsporidi prodotte nella prole immuno-innescata può essere quantificata colorando le spore con un colorante che lega la chitina. Ad oggi, questi metodi hanno fatto luce sulla cinetica e sulla specificità patogena dell'immunità ereditaria, nonché sui meccanismi molecolari alla base. Queste tecniche, insieme agli ampi strumenti disponibili per la ricerca su C. elegans , consentiranno importanti scoperte nel campo dell'immunità ereditaria.
Introduction
L'immunità ereditaria è un fenomeno epigenetico in cui l'esposizione dei genitori agli agenti patogeni può consentire la produzione di prole resistente alle infezioni. Questo tipo di memoria immunitaria è stato dimostrato in molti invertebrati che mancano di sistema immunitario adattativo e possono proteggere dalle malattie virali, batteriche e fungine1. Mentre l'immunità ereditaria ha importanti implicazioni per la comprensione sia della salute che dell'evoluzione, i meccanismi molecolari alla base di questa protezione sono in gran parte sconosciuti. Ciò è in parte dovuto al fatto che molti degli animali in cui è stata descritta l'immunità ereditaria non sono organismi modello stabiliti per la ricerca. Al contrario, gli studi sul nematode trasparente Caenorhabditis elegans beneficiano di un ampio toolkit genetico e biochimico 2,3, un genoma altamente annotato 4,5 e un breve periodo di generazione. In effetti, la ricerca in C. elegans ha permesso progressi fondamentali nei campi dell'epigenetica e dell'immunità innata 6,7, ed è ora un modello consolidato per lo studio della memoria immunitaria 8,9.
I microsporidi sono patogeni fungini che infettano quasi tutti gli animali e causano infezioni letali negli esseri umani immunocompromessi10. L'infezione inizia quando una spora di microsporidi inietta o "accende" il suo contenuto cellulare (sporoplasma) in una cellula ospite utilizzando una struttura chiamata tubo polare. La replicazione intracellulare del parassita provoca la formazione di meronts, che alla fine si differenziano in spore mature che possono uscire dalla cellula11,12. Mentre questi parassiti sono dannosi sia per la salute umana che per la sicurezza alimentare, c'è ancora molto da imparare sulla loro biologia delle infezioni12. Nematocida parisii è un parassita microsporidiano naturale che si replica esclusivamente nelle cellule intestinali dei vermi, con conseguente riduzione della fecondità e, in definitiva, morte. Il modello di infezione da N. parisii -C. elegans è stato utilizzato per mostrare: (1) il ruolo dell'autofagia nella clearance dei patogeni13, (2) come i microsporidi possono uscire dalle cellule infette in modo non litico14, (3) come i patogeni possono diffondersi da cellula a cellula formando sincizia15, (4) le proteine che N. parisii usa per interfacciarsi con il suo ospite16 e (5) la regolazione della risposta patogena intracellulare trascrizionale (IPR)17, 18.
I protocolli per l'infezione di C. elegans sono descritti nel lavoro attuale e possono essere utilizzati per rivelare la biologia unica dei microsporidi e sezionare la risposta dell'ospite all'infezione. La microscopia di vermi fissi colorati con il colorante legante la chitina Direct Yellow 96 (DY96) mostra la diffusione dell'infezione delle spore di microsporidi contenenti chitina in tutto l'intestino. La colorazione DY96 consente anche la visualizzazione di embrioni di vermi contenenti chitina per la valutazione simultanea della gravidità dei vermi (capacità di produrre embrioni) come lettura dell'idoneità dell'ospite.
Lavori recenti hanno rivelato che C. elegans infettato da N. parisii produce prole che è robustamente resistente alla stessa infezione19. Questa immunità ereditaria dura una sola generazione ed è dose-dipendente, poiché la prole di genitori più pesantemente infetti è più resistente ai microsporidi. È interessante notare che la prole innescata da N. parisii è anche più resistente al patogeno batterico intestinale Pseudomonas aeruginosa, sebbene non sia protetta contro il patogeno naturale Orsay virus19. Il presente lavoro mostra anche che la prole immuno-innescata limita l'invasione delle cellule ospiti da parte dei microsporidi. Il metodo descrive anche la raccolta di prole immuno-innescata e come fish può essere utilizzato per rilevare n. parisii RNA nelle cellule intestinali per testare l'invasione delle cellule ospiti e il fuoco delle spore20.
Insieme, questi protocolli forniscono una solida base per lo studio dei microsporidi e dell'immunità ereditaria in C. elegans. Si spera che il lavoro futuro in questo sistema modello consentirà importanti scoperte nel nascente campo dell'immunità ereditaria. Queste tecniche sono anche probabilmente punti di partenza per studiare l'immunità ereditaria indotta da microsporidi in altri organismi ospiti.
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Protocol
Il presente studio utilizza il ceppo N2 wild-type C. elegans Bristol coltivato a 21 °C.
1. Preparazione dei media
- Preparare i media M9 come da rapporto precedente21,22.
- Preparare il mezzo di crescita dei nematodi (NGM) come da precedente rapporto21,22. Versare 12 ml di NGM per piastra da 6 cm o 30 ml per piastra da 10 cm.
- Preparare il ceppo di Escherichia coli OP50-1 come da un precedente rapporto23.
- Preparare le piastre NGM con semi OP50-1 seguendo i passaggi seguenti.
- Risospesso 10x concentrato OP50-1 mediante vortice.
- Utilizzare una pipetta ripetitore per seminare le piastre al centro. Per piastre da 6 cm e 10 cm, seme con un volume di 200 μL o 500 μL, rispettivamente.
- Per piatti da 10 cm, utilizzare uno spandivetro per diffondere l'OP50-1 e creare un prato di batteri. Non diffondere i batteri fino al bordo del piatto.
NOTA: L'etanolo immerge e fiamma lo spargitore ogni cinque piastre per garantire la sterilità. Lasciare raffreddare lo spargitore per alcuni secondi prima di diffondersi per evitare di uccidere i batteri. - Lasciare asciugare le piastre a temperatura ambiente per 2 giorni e per garantire la crescita del prato batterico.
NOTA: i piatti seminati possono essere conservati a temperatura ambiente per 2-3 settimane o a 4 °C per un massimo di 1 mese.
2. Mantenimento di C. elegans
- Mantenere i vermi su una fonte di cibo batterico costante su piastre NGM con semi OP50-1.
NOTA: La fame può provocare fenotipi intergenerazionali, che possono influenzare i risultati. Una piastra con semi OP50-1 di 10 cm supporta 2.500 L1 (il primo stadio larvale di C. elegans) per un massimo di 72 ore. - Se i vermi muoiono di fame, crescono per tre generazioni su OP50-1 prima di usare i vermi per gli esperimenti.
3. Sincronizzazione delle popolazioni di C. elegans mediante ipoclorito di sodio (sbiancamento)
NOTA: questo passaggio è molto sensibile al fattore tempo, quindi assicurarsi che la centrifuga sia disponibile prima di iniziare. Protocolli di sbiancamento alternativi e meno rapidi sono disponibili in letteratura e possono essere utilizzati se si preferisce. Per evitare che l'ipoclorito di sodio al 6% perda attività nel tempo, conservare il reagente al buio a 4 °C e conservarlo per un massimo di 1 anno.
- Preparare 2 mL di soluzione di candeggina per ciascun campione mescolando 400 μL di 1 M NaOH, 250 μL di ipoclorito di sodio al 6% (vedere Tabella dei materiali) e 1350 μL di acqua distillata.
- Lavare i vermi adulti (~ 72 ore post-portello) dalle piastre in un tubo microcentrifuga utilizzando 1 mL di supporto M9.
NOTA: se molti vermi rimangono sulle piastre, pellet i vermi mediante centrifugazione a 1.400 x g per 30 s a temperatura ambiente, rimuovere il surnatante utilizzando una punta di pipetta da 1 mL ed eseguire ulteriori lavaggi a piastre. - Centrifugare a 1.400 x g per 30 s a temperatura ambiente per pellettizzare i vermi, quindi lavare 2 volte con 1 mL di mezzi M9 per rimuovere i batteri.
- Rimuovere il surnatante, aggiungere 1 mL della soluzione di candeggina preparata (Fase 3.1.) e impostare un timer per 1 min. Invertire i tubi 3-4x.
NOTA: Al microscopio ottico, i vermi possono essere visti smettere di battere. - Dopo 1 min, centrifugare a 3.000 x g per 30 s a temperatura ambiente per pellettizzare i vermi, quindi rimuovere il surnatante e aggiungere 1 mL di soluzione di candeggina fresca.
- Monitorare attentamente i tubi al microscopio ottico per visualizzare le carcasse dei vermi che si aprono e rilasciano embrioni. Passare immediatamente al passo successivo quando circa il 50% -80% delle carcasse si è spaccato e molti embrioni sono stati rilasciati.
NOTA: a seconda del numero di animali e del ceppo di vermi, questo passaggio può richiedere da 15 a 4 minuti. Per ragioni sconosciute, i vermi infetti da N. parisii spesso impiegano più tempo a sbiancare rispetto agli animali non infetti. - Centrifugare a 3.000 x g per 30 s a temperatura ambiente per pellettare gli embrioni, quindi lavare 3 volte in 1 mL di terreno M9.
NOTA: I lavaggi diluiscono la soluzione residua di ipoclorito dai tubi e devono essere eseguiti rapidamente per garantire che la soluzione di candeggina non danneggi gli embrioni. - Aggiungere 1 mL di fluido M9 al pellet finale e trasferire in un tubo conico da 15 mL contenente 4 mL di supporto M9. Sospendere gli embrioni in un volume finale di 5 ml.
- Ruotare i tubi su un rotore meccanico (vedi Tabella dei materiali) a 21 °C per 18-24 ore per schiudere gli embrioni in L1.
NOTA: Poiché N. parisii infetta l'intestino del verme e non invade la linea germinale, i genitori infetti non trasmettono l'infezione alla loro progenie per trasmissione verticale19. Lo sbiancamento degli adulti infetti sincronizza gli animali F1 e distrugge le spore di N. parisii , assicurando che la progenie di F1 non sia infettata da spore trasportate dai genitori. - Centrifugare i tubi per 1 minuto a 1.800 x g a temperatura ambiente per pellettificare gli L1 ed eliminare tutti tranne 1 mL del surnatante.
- Pipettare 1-5 μL di miscela L1 su una piastra NGM non seminata e contare immediatamente il numero di L1 nella goccia visualizzando al microscopio ottico. Ripeti 3x e fai la media dei conteggi per determinare la concentrazione e il numero totale di L1.
NOTA: La maggior parte degli embrioni deve essere schiusa e gli L1 dovrebbero muoversi rapidamente nella goccia liquida. Se rimane una grande percentuale di embrioni non schiusi e L1 letargici (a movimento lento), ciò indica uno sbiancamento troppo lungo.
4. Preparazione delle spore di N. parisii
- Preparare le spore di N. parisii seguendo i riferimenti precedentemente pubblicati19,24.
5. Infezione di C. elegans con N. parisii per produrre prole immuno-innescata
- Un giorno prima delle infezioni pianificate, spostare il numero richiesto di piastre NGM senza semi da 10 cm da 4 °C a temperatura ambiente.
- Immediatamente prima dell'infezione, centrifugare ~ 2.500 vermi L1 sincronizzati a 1.400 x g per 30 s a temperatura ambiente in un tubo microcentrifuga per pellettificare i vermi. Rimuovere il surnatante con una punta a pipetta per lasciare i vermi in ~ 50 μL di supporto M9.
- Aggiungere 1 mL di 10x OP50-1 alle spore L1s e N. parisii alla concentrazione desiderata (tipicamente ~ 2,5 milioni di spore). Come controllo non infetto, preparare un tubo equivalente di L1 e OP50-1 con un volume di mezzi M9 equivalente al volume di preparazione delle spore utilizzato.
NOTA: Per ottenere prole immunostimolante, utilizzare una dose di spore sufficientemente alta in modo che >90% degli animali siano infettati da 72 ore (come misurato dalla colorazione DY96, Fase 7) ma abbastanza bassa in modo che >80% degli animali siano ancora gravidi. Ciò garantisce che la maggior parte della prole provenga da genitori infetti e che lo sbiancamento dei genitori produca embrioni sufficienti per il test F1. Sebbene i preparati di spore varino in concentrazione e infettività, una dose parentale adeguata è in genere compresa tra 5-15 μL di preparazione di spore (~ 2,5 milioni di spore) per piastra da 10 cm. - Vortice brevemente per mescolare e placcare il suddetto 1 mL di vermi su una piastra NGM senza semi di 10 cm. Ruotare per assicurarsi che il liquido si diffonda su tutto il piatto.
- Asciugare le piastre in un armadio pulito con i coperchi spenti per 10-20 minuti o fino a completa asciugatura, prima di incubare a 21 °C per 72 ore.
- A 72 ore dopo l'infezione (hpi), lavare i vermi dalle piastre in un tubo microcentrifuga utilizzando 1 mL di supporto M9. Se molti vermi rimangono sulle piastre, pellet i vermi mediante centrifugazione a 1.400 x g per 30 s, rimuovere il surnatante ed eseguire ulteriori lavaggi a piastre.
- Centrifugare a 1.400 x g per 30 s a temperatura ambiente per pellet di vermi, lavare 2x con 1 mL di mezzi M9 o fino a quando il surnatante non è limpido. Riespeso in un volume finale di 1 mL di supporti M9.
- Pipettare su e giù per mescolare, quindi trasferire 100 μL dei vermi sospesi in un tubo fresco.
NOTA: questo campione di ~ 250 adulti può essere successivamente riparato e colorato per determinare l'idoneità del verme parentale e lo stato di infezione, come descritto nel passaggio 7 e all'inizio del passaggio 3. - Per rompere i vermi adulti e rilasciare embrioni F1 per il test, sbiancare i restanti 900 μL di vermi sospesi, come descritto nella fase 3.
NOTA: Questo passaggio distrugge anche tutte le spore di N. parisii prima dei successivi test di infezione.
6. Test dell'immunità ereditaria a N. parisii in C. elegans
- Eseguire infezioni come descritto nei passaggi 5.1.-5.6., con modifiche come indicato di seguito.
NOTA: i test di infezione sulle F1 possono essere ridimensionati ed eseguiti su piastre NGM da 6 cm utilizzando ~ 1.000 vermi L1 e 400 μL di 10x OP50-1. Deve essere utilizzata anche una dose "alta" di spore, in modo tale che ~ 100% di F1 ingenui (cioè vermi di genitori non infetti) siano infetti e solo ~ 10% di F1 ingenui siano gravidi. Sebbene i preparati di spore varino in concentrazione e infettività, una dose adeguata è in genere compresa tra 5-15 μL (~ 2,5 milioni di spore) per piastra da 6 cm. - A 72 hpi, fissare e macchiare per determinare l'idoneità del verme e lo stato di infezione, come descritto nel passaggio 7.
7. Colorazione DY96 di C. elegans per visualizzare embrioni e spore di microsporidi
NOTA: DY96 è un colorante fluorescente verde che lega la chitina che macchia gli embrioni di vermi e le pareti delle spore dei microsporidi 19,15,25. Ciò consente il monitoraggio simultaneo dello stato di idoneità e infezione dei vermi.
- Lavare i vermi dalle piastre in un tubo microcentrifuga utilizzando 1 mL di supporto M9 contenente lo 0,1% di Tween-20. Se molti vermi rimangono sulle piastre, pellet i vermi mediante centrifugazione a 1.400 x g per 30 s a temperatura ambiente, rimuovere il surnatante usando una punta di pipetta ed eseguire ulteriori lavaggi di piastre.
- Centrifugare a 1.400 x g per 30 s a temperatura ambiente per pellettizzare i vermi e lavare 2x con 1 mL di mezzo M9 contenente lo 0,1% di Tween-20 o fino a quando il surnatante non è limpido.
- Rimuovere il surnatante, aggiungere 700 μL di acetone e lasciare che i vermi fissino a temperatura ambiente per 10 minuti.
NOTA: A questo punto, i vermi possono essere conservati a -20 °C per la lavorazione fino a diversi mesi dopo, se lo si desidera. - Centrifugare a 10.000 x g per 30 s a temperatura ambiente per pellettificare i vermi fissi e lavare 2x con 1 mL di PBS contenente lo 0,1% di Tween-20 (PBST).
- Preparare 50 mL di soluzione di lavoro DY96: PBST, 0,1% (v/v) di sodio dodecil solfato (SDS) e 20 μg/mL DY96 (da una soluzione madre da 5 mg/mL in acqua distillata) (vedere Tabella dei materiali). Avvolgere il tubo in un foglio e conservarlo in un cassetto per evitare l'esposizione alla luce.
NOTA: le soluzioni di stock e di lavoro DY96 possono essere conservate per >1 anno a temperatura ambiente se mantenute al buio. - Centrifugare a 10.000 x g per 30 s a temperatura ambiente per pellettizzare i vermi e rimuovere il surnatante. Aggiungere 500 μL di soluzione di lavoro DY96 al pellet e ruotare per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Centrifugare a 10.000 x g per 30 s a temperatura ambiente per pellettizzare i vermi. Rimuovere il surnatante e aggiungere 15 μL del mezzo di montaggio con/senza DAPI (vedere Tabella dei materiali).
- Pipettare 10 μL della soluzione contenente vermi colorati su un vetrino per microscopio e posizionare un coperchio sopra la parte superiore.
NOTA: i vetrini e i campioni aggiuntivi possono essere conservati a 4 °C al buio per la conservazione a lungo termine.
8. Imaging e analisi dei vermi colorati con DY96 per valutare l'idoneità dei vermi e lo stato di infezione
- Per analizzare i vermi colorati dy96 (montati su vetrini, come nel passaggio 7.8.), eseguire l'imaging utilizzando il canale GFP di un microscopio a fluorescenza.
- Per determinare l'idoneità delle popolazioni di vermi, utilizzare un obiettivo 5x o 10x per analizzare la gravidità di >100 vermi per condizione.
NOTA: I vermi portatori di embrioni ≥1 sono considerati gravidi. I contatori di celle meccaniche possono aiutare a ridurre al minimo l'errore umano durante il conteggio. Gli embrioni di verme sono meno macchiati (meno fluorescenti) delle spore di microsporidi19. Gli embrioni sono ovoidali, ~ 50 μm x ~ 30 μm, e si trovano nel midbody di adulti sani di C. elegans . Gli adulti sani e non infetti portano 10-20 embrioni organizzati in file lungo la lunghezza del corpo26. - Per rivelare differenze più sottili nella forma fisica, esegui il conteggio degli embrioni. Per questo, contare manualmente il numero di embrioni in 20-30 singoli vermi per condizione.
- Per determinare quanto sono infette le popolazioni di vermi, utilizzare un obiettivo 5x-40x per valutare lo stato di infezione di >100 worm per condizione. I vermi che comprendono un numero qualsiasi di spore intestinali intracellulari sono considerati infetti.
NOTA: Le spore di Microsporidi sono più luminose degli embrioni di verme. Le spore a forma di fagiolo di N. parisii sono ~ 2,2 μm x ~ 0,8 μm e sono prodotte nelle cellule intestinali del verme da ~ 48 hpi15. I vermi in cui le spore sono viste esclusivamente nel lume intestinale e non lungo le pareti intestinali non sono considerati infetti19. Questo perché queste spore probabilmente rappresentano spore appena ingerite che non derivano dall'infezione dell'individuo. - Utilizzando un software di analisi delle immagini (vedere Tabella dei materiali), quantificare il carico di parassiti e le dimensioni del verme seguendo i passaggi seguenti.
- Immagine 20-30 vermi montati su vetrini per microscopio utilizzando uno stereoscopio verticale fluorescente per ciascun campione. Cattura immagini nei canali Brightfield, DAPI e GFP. Scegli un'esposizione appropriata nel canale GFP in modo tale che la fluorescenza nei campioni più infetti non sia satura.
NOTA: l'infezione può ancora essere visualizzata nei campioni meno infetti. Le immagini vengono in genere scattate utilizzando un obiettivo 5x. - Aprire i file in FIJI/ImageJ. A seconda del tipo di file, potrebbe essere necessario il plug-in Bio-Formats Importer per aprire le immagini in ImageJ.
- Delineare 20-30 singoli worm nelle immagini utilizzando immagini brightfield o DAPI e lo strumento di selezione poligono nella barra degli strumenti. Salva ogni struttura con Analyze > Tools > Regions of Interest (ROI) Manager nel menu a discesa facendo clic su Aggiungi [t]. Delinea gli animali che sono completamente visibili nella cornice.
NOTA: i contorni del worm possono essere rivisitati in un secondo momento salvando il file con i contorni come Tiff. - Fai clic su Deseleziona nel ROI manager per rimuovere tutti i contorni dall'immagine e fai clic su Immagine > Duplica nel menu a discesa. Digitare il numero corrispondente al canale di interesse nella casella "Canali" per duplicare il canale GFP per il carico parassitario (ad esempio, 2).
- Threshold questo canale utilizzando Image > Regola > Threshold a un livello al quale viene catturato il carico parassitario luminoso ma la fluorescenza dimmer dagli embrioni di verme non lo è, quindi fare clic su Applica. Prendi nota dei valori di soglia applicati e usali in modo coerente per tutte le immagini dello stesso esperimento.
NOTA: verificare che la soglia sia un valore appropriato sia per i campioni meno che per quelli più infetti prima di analizzare tutte le immagini. - Selezionare Analizza > Imposta misurazioni e selezionare la casella Frazione area. Selezionare i contorni dei singoli worm a turno dal gestore del ROI e fare clic sulla funzione Analizza > misura. Una finestra Risultati fornirà la misurazione per %Area (cioè % carico parassitario).
NOTA: se la fluorescenza degli embrioni è così brillante da superare la soglia, lo strumento Pennello in nero nella barra degli strumenti può essere utilizzato per cancellare manualmente queste regioni prima di misurare %Area. - Per determinare la dimensione del worm come lettura dell'idoneità, delineare i worm come descritto nel passaggio 8.3. Selezionare Analizza > Imposta misurazioni e selezionare la casella Area. Selezionare i contorni dei singoli worm a turno dal gestore del ROI e fare clic sulla funzione Analizza > misura . Una finestra Risultati fornirà la misurazione per %Area.
- Immagine 20-30 vermi montati su vetrini per microscopio utilizzando uno stereoscopio verticale fluorescente per ciascun campione. Cattura immagini nei canali Brightfield, DAPI e GFP. Scegli un'esposizione appropriata nel canale GFP in modo tale che la fluorescenza nei campioni più infetti non sia satura.
9. Saggio FISH per valutare l'invasione di C. elegans da parte di microsporidi e spari di spore
NOTA: La sonda MicroB FISH riconosce una regione conservata di rRNA microsporidiano 18s e può essere utilizzata per etichettare sporoplasmi intracellulari (cioè cellule ospiti invase) e il materiale genetico all'interno delle spore.
- Infettare 6.000 vermi L1 sincronizzati con candeggina con 4 milioni di spore di N. parisii e 10 μL di 10x OP50-1 in un volume finale di 400 μL costituito da supporti M9.
- Impiattare la miscela su una piastra NGM senza semi di 6 cm, asciugare in un armadio pulito per 10-20 minuti e posizionare a 21 °C.
- Dopo 30 minuti, lavare gli animali dalle piastre con 1 mL di supporto M9 contenente lo 0,1% di Tween-20.
- Pellet i vermi mediante centrifugazione a 1.400 x g per 1 minuto a temperatura ambiente.
- Rimuovere il surnatante con una punta a pipetta, aggiungere 700 μL di acetone e lasciarlo riposare per 10 minuti a temperatura ambiente.
NOTA: A questo punto, i vermi possono essere conservati a -20 °C per la lavorazione in un secondo momento. - Eseguire il test FISH durante la notte utilizzando la sonda MicroB seguendo i rapporti precedentemente pubblicati27,19.
NOTA: Per valutare la cottura delle spore, integrare i 500 μL finali del tampone di lavaggio con 20 μg/mL di DY96 ai campioni e ruotare per 30 minuti a 21 °C prima di continuare con il protocollo normalmente. - Conservare i vetrini in una scatola di scorrimento a 4 °C. Per la conservazione a lungo termine (cioè diversi mesi), conservare campioni aggiuntivi in tubi di microcentrifuga a 4 °C al buio.
- Per valutare l'invasione nei vermi macchiati di FISH, guarda i vermi usando il canale rosso di un microscopio a fluorescenza. Visualizza gli eventi di infezione ad alto ingrandimento (obiettivo 63x) poiché gli animali L1 sono piccoli e gli sporoplasmi saranno nelle prime fasi della replicazione. Per valutare il fuoco delle spore, utilizzare un obiettivo 63x e canali di fluorescenza sia rossi che verdi.
NOTA: le spore in cui il segnale GFP e mCherry si colocalizzano sono considerate non sparate; i casi di spore GFP vuote sono considerati sparati. - Per analizzare l'invasione o il fuoco delle spore, contare manualmente il numero di sporoplasmi (focolai di mCherry nelle cellule intestinali) o la percentuale di spore sparate in 20-30 vermi per condizione. Regola la messa a fuoco nel piano z per catturare tutti gli eventi di infezione e le spore, che si trovano spesso su piani diversi.
NOTA: Gli sporoplasmi si trovano esclusivamente all'interno delle cellule intestinali. La più alta concentrazione di sporoplasmi si trova in genere immediatamente dopo la faringe. Se i campioni sono anche colorati con DY96, cercare la presenza di sporoplasmi che non si colocalizzano con la spora.
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Representative Results
Nel presente studio, le popolazioni parentali di C. elegans (P0) sono state infettate allo stadio L1 con una bassa dose di spore di N. parisii . Queste condizioni di infezione sono tipicamente utilizzate per ottenere un numero elevato di progenie F1 resistente ai microsporidi attraverso lo sbiancamento dei genitori. Le popolazioni parentali infette e i controlli non infetti sono stati fissati a 72 hpi e colorati con DY96 per visualizzare gli embrioni di vermi e le spore di microsporidi (Figura 1A). Gli animali infetti sono piccoli, contengono molte spore di microsporidi e producono meno embrioni rispetto ai controlli sani non infetti. La valutazione della gravidità dei vermi ha mostrato che circa il 95% degli animali non infetti ha prodotto prole, rispetto a meno dell'80% degli animali infetti (Figura 1B). Le quantificazioni hanno rivelato che circa il 90% della popolazione trattata con microsporidi era infetta, come determinato dal numero di vermi contenenti spore colorate con DY96 (Figura 1C). Per ottenere la progenie F1 immuno-innescata, è importante utilizzare una dose di microsporidi che sia abbastanza alta da garantire che la maggior parte dei genitori sia infetta ma abbastanza bassa da garantire che la popolazione possa ancora produrre progenie. Viene fornita una tabella delle dosi di microsporidi utilizzate per ottenere i dati in questo studio (Tabella 1).
Le popolazioni di genitori non infetti e infetti (Figura 1) sono state trattate con ipoclorito di sodio a 72 hpi per ottenere progenie F1 ingenue e immunodeticate. Gli animali di F1 sono stati esposti a un'alta dose di spore di N. parisii allo stadio L1 per testare l'immunità ereditaria ai microsporidi. A 72 hpi, gli animali F1 sono stati fissati e colorati con DY96 per valutare la resistenza ai microsporidi (Figura 2A). Le quantificazioni di questi animali fissi hanno rivelato che i vermi innescati contenevano significativamente più embrioni rispetto alle loro controparti ingenue, indicando una maggiore idoneità di fronte all'infezione (Figura 2B). FIJI/ImageJ è stato utilizzato per determinare il carico parassitario dei singoli vermi naïve e immuno-innescati (cioè la percentuale del corpo piena di spore fluorescenti di N. parisii ) (Figura 2C). Le quantificazioni hanno rivelato una drastica riduzione del carico parassitario dei vermi provenienti da genitori infetti (Figura 2D). Inoltre, i calcoli delle dimensioni dei singoli vermi hanno rivelato che i vermi innescati avevano un significativo vantaggio di crescita rispetto agli animali naïve di fronte all'infezione da N. parisii (Figura 2E). Questi dati dimostrano che i genitori infetti da N. parisii producono prole con alti livelli di resistenza ai microsporidi.
Lavori precedenti hanno rivelato che l'immunità ereditaria ai microsporidi riduce l'invasione delle cellule intestinali da parte di N. parisii19. Per visualizzare le differenze nell'invasione delle cellule ospiti, animali naïve e immuno-innescati (ottenuti da genitori non infetti o infetti, come sopra) sono stati esposti a una dose massima di N. parisii nella fase L1. A 30 dpi, i vermi sono stati fissati e co-macchiati, utilizzando una sonda FISH per rilevare n. parisii RNA e DY96 per rilevare le pareti delle spore di N. parisii . L'imaging ha rivelato che, mentre gli animali naïve in genere contenevano più spore e diverse cellule infette (sporoplasmi), gli animali innescati avevano molte meno (o nessuna) spore e in genere nessun sporoplasma (Figura 3).
Figura 1: La colorazione direct yellow 96 (DY96) di C. elegans non infetti e infetti da N. parisii rivela gravidità dei vermi e stato di infezione. (A-C) N2 C. elegans non è stato infettato o infettato da una bassa dose di N. parisii allo stadio L1. A 72 hpi, i vermi sono stati fissati, colorati con DY96 e ripresi per valutare la gravidità dei vermi e lo stato di infezione. (A) Vengono mostrate immagini rappresentative. DY96 consente la visualizzazione di embrioni di vermi e spore di microsporidi (chitina). Un'immagine inserita di un verme infetto è mostrata sul lato destro. Gli embrioni sono etichettati come "E"; N. parisii infezione dell'intestino è etichettato 'Np'. Barra di scala per immagini sinistra e centrale = 500 μm. Barra della scala per l'immagine giusta = 100 μm. (B) I vermi portatori di uno o più embrioni sono stati valutati come gravidi e rappresentati graficamente. (C) I vermi portatori di un numero qualsiasi di spore di N. parisii nelle cellule intestinali sono stati valutati come infetti e rappresentati graficamente. (B-C) Dati raggruppati da 5 esperimenti indipendenti utilizzando n = 100 worm per condizione per esperimento. Viene mostrata la ± SEM media. I valori p sono stati determinati dal t-test dello studente a due code spaiato. Il significato è stato definito come: *p < 0,05; p < 0,001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Colorazione diretta gialla 96 (DY96) di C. elegans naïve e immuno-innescata per determinare gli embrioni per verme, il carico di microsporidi e le dimensioni del verme. (A) N2 C. elegans è stato infettato o non è stato infettato da una bassa dose di N. parisii nella fase L1. A 72 hpi, i vermi sono stati trattati con ipoclorito di sodio per rilasciare embrioni. La prole naïve e immunostimolante risultante è stata infettata da un'alta dose di N. parisii allo stadio L1. A 72 hpi, i vermi sono stati riparati, colorati con DY96 e ripresi per visualizzare embrioni di vermi e carico di parassiti. Vengono mostrate immagini rappresentative. Barra della scala = 200 μm.(B) Il numero di embrioni per verme è stato contato e rappresentato graficamente da (A). (C) Uno screenshot da FIJI / ImageJ mostra vermi ingenui dal pannello A che sono stati thresholded per visualizzare il carico di parassiti (mostrato in bianco) usando la finestra Soglia in basso a destra. Qui, i singoli worm sono stati delineati utilizzando lo strumento "Selezioni poligonali" evidenziato in rosso e definito come "Regione di interessi" (ROI) utilizzando la finestra ROI in alto a destra. La funzione Analyze > Measure > Area è stata utilizzata per quantificare il carico parassitario di due vermi di esempio, che si sono rivelati essere del 25,02% e del 13,49%. (D) Il carico parassitario per verme è stato determinato e rappresentato graficamente da (A). (E) Dalle immagini di cui sopra, la dimensione individuale del verme è stata calcolata da animali delineati come nel pannello C utilizzando la funzione Analizza > Misura > area . (B, D ed E) Viene mostrata la ± SEM media. I valori p sono stati determinati dal t-test di Student a due code spaiato. La significatività è stata definita come: *p < 0,05. **p < 0,01, ***p < 0,001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: L'ibridazione fluorescente in situ (FISH) contro n. parisii 18S rRNA rivela l'invasione parassitaria delle cellule intestinali di C. elegans in animali naïve ma non innescati. N2 C. elegans è stato infettato o non infettato da una bassa dose di N. parisii allo stadio L1. A 72 hpi, i vermi sono stati trattati con ipoclorito di sodio per rilasciare embrioni. La prole naïve e immuno-innescata risultante è stata infettata con una dose massima di N. parisii allo stadio L1. A 30 mpi, i vermi sono stati fissati, sottoposti a FISH per rilevare sporoplasmi, colorati con DY96 per rilevare le pareti delle spore di microsporidi e ripresi. Vengono mostrate immagini rappresentative. Le immagini inserite per il verme naïve mostrano sporoplasmi (rosso, asterischi), spore sparate (verde, punte di freccia) e una spora non sparata (gialla, freccia). Il verme infetto ingenuo mostrato mostra 4 sporoplasmi. Barra della scala = 20μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| N. parisii dose | Concentrazione della piastra (spore/cm2) | Milioni di spore per piatto da 6 cm | Milioni di spore per piatto da 10 cm |
| Basso | 35,400 | - | 2.7 |
| Alto | 88,400 | 2.5 | - |
| Massimale | 2,12,000 | 6 | - |
Tabella 1: N. parisii dosi impiegate nello studio.
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Discussion
Il presente protocollo descrive lo studio dei microsporidi e dell'immunità ereditaria in un modello di infezione da N. parisii -C. elegans semplice e geneticamente trattabile.
La preparazione delle spore è un protocollo intensivo che in genere produce abbastanza spore per 6 mesi di esperimenti, a seconda della produttività24. È importante sottolineare che l'infettività deve essere determinata per ogni nuovo "lotto" di spore prima di utilizzarlo per gli esperimenti. A causa della variabilità dell'infettività tra i preparati di spore, un singolo lotto deve essere utilizzato in modo coerente per tutte le ripetizioni di un esperimento. Le aliquote individuali non devono essere scongelate e ricongelate, poiché lo scongelamento può causare l'incendio delle spore e ridurre l'infettività. Pertanto, le spore devono essere rimosse dal congelatore a -80 °C solo immediatamente prima dell'infezione e mantenute sul ghiaccio mentre si è sul banco.
Nei passaggi 5-6, sono stati delineati i test di infezione. È importante durante i test di infezione evitare la contaminazione o la fame degli animali, in quanto ciò può comportare ulteriori effetti intergenerazionali che confondono l'immunità nelle F1. Un'importante limitazione del test di immunità ereditaria è che più genitori infetti producono meno prole F1. Pertanto, è importante trovare un attento equilibrio tra la generazione parentale sufficientemente infetta da trasmettere l'immunità pur essendo abbastanza sana da produrre prole per i test. Sebbene l'attuale protocollo descriva saggi di infezione per animali L1, il protocollo può essere modificato per testare l'impatto dell'infezione da microsporidi su genitori diversamente inscenati e la persistenza dell'immunità nella prole più anziana. I metodi possono anche essere modificati per testare gli effetti di sollecitazioni multiple o distinte (ad esempio, stress osmotico, stress da metalli pesanti, coinfezione con un altro agente patogeno) sull'immunità ereditaria. Mentre l'immunità ereditaria a N. parisii in C. elegans è intergenerazionale (cioè dura una sola generazione)19, il protocollo può essere adattato per studiare ulteriori generazioni per testare gli effetti transgenerazionali. Mentre i protocolli forniti sono specifici per l'infezione da N. parisii, esistono molte altre specie di microsporidi che infettano i nematodi28. I protocolli possono essere adattati per studiare l'immunità ereditaria ad altri microsporidi infettivi intestinali (ad esempio, Nematocida ausubeli) e epidermici e infettivi muscolari (ad esempio, Nematocida displodere)29,30. C. elegans sono anche infettati da molti altri agenti patogeni naturali e umani (batterici, fungini e virali). I metodi qui descritti possono essere utilizzati per testare l'immunità ereditaria ad altri agenti patogeni in C. elegans e la patogeno-specificità della risposta immunitaria ereditaria a N. parisii. C. elegans è un organismo modello ben consolidato. Tuttavia, altri membri del genere Caenorhabditis, tra cui le specie ermafrodite C. tropicalis e C. briggsae e la specie maschio-femmina C. kamaaina sono anche infettati a vari livelli con N. parisii31. Apportando piccole modifiche ai protocolli forniti, l'immunità ereditaria può anche essere testata in questi animali.
Nella fase 8 sono stati forniti metodi rapidi e semplici per determinare le differenze nella suscettibilità ai microsporidi nei vermi colorati con DY96 (cioè % animali infetti, % animali gravidi). Tuttavia, a volte questi metodi non sono abbastanza sensibili da rilevare piccoli cambiamenti nell'immunità e nella forma fisica. Questo perché un verme con un embrione e molte cellule infette sarebbe trattato allo stesso modo di un verme con 10 embrioni e una cellula infetta. Pertanto, sono stati forniti anche metodi con una risoluzione più fine per determinare gli esiti dell'infezione in questi animali (vale a dire, % carico di parassiti, numero di embrioni, dimensioni dei vermi). Mentre entrambi i metodi possono essere utilizzati, le differenze fenotipiche sono in genere più pronunciate con quest'ultimo, rendendo più facile rilevare differenze significative. Gli adattamenti futuri a questo metodo potrebbero includere l'utilizzo dell'apprendimento automatico per automatizzare l'analisi.
Nella fase 9, sono state fornite tecniche per valutare l'invasione delle cellule ospiti da parte di microsporidi e il fuoco delle spore utilizzando FISH. Mentre DY96 marca i microsporidi con un forte segnale verde fluorescente, altri coloranti, tra cui la macchia lipofila Nile Red e il Calcofluor White che lega la chitina, possono anche essere usati per macchiare N. parisii 30,32,33. Il presente protocollo descrive la fissazione con acetone e funziona bene per rilevare i microsporidi con colorazione DY96 e FISH. Tuttavia, la fissazione con paraformaldeide al 4% può aiutare a preservare la morfologia dei tessuti e migliorare il segnale in alcuni protocolli di imaging.
I microsporidi sono un agente patogeno poco studiato e gran parte della biologia cellulare dell'infezione rimane sconosciuta. C. elegans è un semplice organismo modello e questi protocolli possono servire come piattaforma per comprendere i processi chiave coinvolti nell'infezione e nella difesa dell'ospite contro questo parassita. L'immunità ereditaria è un campo emergente e molte domande rimangono in sospeso1. In che modo i genitori infetti trasmettono l'immunità alla prole (approvvigionamento materno o regolazione trascrizionale alterata nella progenie)? Cosa media l'immunità nella prole (peptidi antimicrobici o altre proteine immunitarie)? In che modo le risposte immunitarie ereditarie specifiche dei patogeni sono e quanto è conservata l'immunità ereditaria tra le specie? Dati gli ampi strumenti disponibili con C. elegans, gli studi basati sul protocollo qui descritto sono ben pronti a rispondere a queste domande fondamentali sull'immunità ereditaria.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Siamo grati a Winnie Zhao e Yin Chen Wan per aver fornito utili commenti sul manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dal Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (Grant #522691522691).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.0 mm zirconia beads | Biospec Products Inc. | 11079124ZX | |
| 10 mL syringe | Fisher Scientific | 1482613 | |
| 5 μm filter | Millipore Sigma | SLSV025LS | |
| Axio Imager 2 | Zeiss | - | Fluorescent microscope for imaging of DY96- and FISH- stained worms on microscope slides |
| Axio Zoom V.16 Fluorescence Stereo Zoom Microscope | Zeiss | - | For live imaging of fluorescent transgenic animals to visualize the IPR |
| Baked EdgeGARD Horizontal Flow Clean Bench | Baker | - | |
| Bead disruptor, Genie SI-D238 Analog Disruptor Genie Cell Disruptor, 120 V | Global Industrial | T9FB893150 | |
| Cell-VU slide, Millennium Sciences Disposable Sperm Count Cytometers | Fisher Scientific | DRM600 | |
| Direct Yellow 96 | Sigma-Aldrich | S472409-1G | |
| EverBrite Mounting Medium with DAPI | Biotium | 23001 | |
| EverBrite Mounting Medium without DAPI | Biotium | 23002 | |
| Fiji/ImageJ software | ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | |
| Mechanical rotor | Thermo Sceintific | 415110 / 1834090806873 | Used to spin tubes of bleached embryos for overnight hatching |
| MicroB FISH probe | Biosearch Technologies Inc. | - | Synthesized with a Quasar 570 (Cy3) 5' modification and HPLC purified, CTCTCGGCACTCCTTCCTG |
| N2 | Wild-type, Bristol strain | Default strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771-100G | |
| Sodium hydroxide solution (5 N) | Fisher Chemical | FLSS256500 | |
| Sodium hypochlorite solution (6%) | Fisher Chemical | SS290-1 | |
| Stemi 508 Stereo Microscope | Zeiss | - | For daily maintenance of worms and counting of L1 worms for assay set ups |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379-100ML | |
| Vectashield + A16 | Biolynx | VECTH1500 |
References
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